專利名稱：一種利用pcr技術(shù)將核酸應(yīng)用于仿偽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)將核酸應(yīng)用于防偽的方法，屬于生物防偽技術(shù)領(lǐng)域。
常用的防偽技術(shù)包括激光全息防偽、磁性防偽、條形碼防偽、熒光防偽、隱形防偽、核隱形防偽、等離子隱形防偽、紫外光防偽、噴碼防偽、溫致變防偽、計(jì)算機(jī)編碼防偽等等。
傳統(tǒng)的防偽標(biāo)記大多是物理或化學(xué)性質(zhì)的制品，如光學(xué)變色膜、圖象擾頻、熱變油墨、磁條、軟件等。
目前國(guó)際上開始將生物技術(shù)利用于防偽上，形成了多樣的生物防偽技術(shù)和相應(yīng)的生物防偽標(biāo)記。這些防偽技術(shù)主要采用抗原抗體反應(yīng)原理，比一般的防偽技術(shù)準(zhǔn)確、靈敏。由于抗原抗體是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性較差，尤其在高溫環(huán)境中容易失活，從而降低防偽的靈敏度和可靠性。此外，抗原抗體反應(yīng)變化少，一旦知道其中一種成分，就容易被仿制。
本發(fā)明的一個(gè)目的是在生物防偽的技術(shù)領(lǐng)域克服已有標(biāo)記容易被仿制的缺陷，設(shè)計(jì)出將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)應(yīng)用于防偽的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的防偽標(biāo)記及檢測(cè)其真?zhèn)蔚姆椒ā?br> 本發(fā)明提供了一種新的防偽技術(shù)和防偽標(biāo)記，其核心是生物大分子——核酸。一切生命的基本遺傳物質(zhì)(基因)都是核酸，也就是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸是由四種堿基交互排列組成，其排列組合的差異，形成地球上生命類型的多樣性。一條含有1000個(gè)堿基對(duì)(1kb)的DNA鏈就可能有10603種排列組合方式?，F(xiàn)在自然界的生物種類(動(dòng)植物和微生物)在一百萬(wàn)種以上，因此可以利用作防偽的天然生物基因數(shù)不勝數(shù)。每個(gè)物種基因級(jí)的長(zhǎng)度一般均大于104至106kb。假若設(shè)定用1kb長(zhǎng)度的核酸作防偽標(biāo)記，則可供選擇的核酸密碼就有105×(104--106)＝1010--1012之多。因此核酸中所包含的的海量信息為防偽技術(shù)提供了取之不盡的來(lái)源。利用核酸密碼序列這樣巨大的信息量可以有數(shù)以億萬(wàn)計(jì)的密碼可用于防偽標(biāo)記。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的原理為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。在由DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中，使用了兩段寡聚核苷酸作為反應(yīng)的引物。一般情況下，這兩段寡聚核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)，而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應(yīng)時(shí)，首先在摩爾數(shù)大大過(guò)量的兩段寡聚核苷酸及4種dNTP參與下對(duì)模板DNA進(jìn)行加熱變性。隨之，將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火。此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反復(fù)進(jìn)行變性、退火和DNA合成這一循環(huán)。由于一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物又充當(dāng)下一輪擴(kuò)增的模板，所以在這一周而復(fù)始的過(guò)程中每完成一個(gè)循環(huán)，就基本上使目的DNA產(chǎn)物增加1倍。
本發(fā)明是將篩選的一段核酸(可以是DNA，或是RNA)，以一定量(可少到10-8克)固定到固相載體上。固相載體可以是各種各樣的材料，如各種天然或人造纖維制成的紙張或薄膜、多孔顆?；蚍勰烊换蚝铣傻钠じ?、塑料或各種有機(jī)或無(wú)機(jī)多聚體和樹脂、固體石臘、天然或合成的無(wú)機(jī)物質(zhì)如陶瓷、玻璃、水晶、金屬、硅藻土等。各種油墨和涂料也可作為防偽核酸的載體。
為了達(dá)到保護(hù)固相載體上作為防偽標(biāo)記的核酸的目的，可以在含有核酸的固相載體表面加上保護(hù)層，例如可用塑料薄膜，海藻糖等制成保護(hù)層。這種核酸防偽標(biāo)記可固定在商品或物件上或其包裝物及附屬物上。
當(dāng)需要檢驗(yàn)辨別真?zhèn)螘r(shí)，將本發(fā)明的防偽標(biāo)記揭去保護(hù)層，用緩沖液溶解附著在載體上的核酸片段。檢測(cè)人員已知檢測(cè)商品或物件上核算防偽標(biāo)記的種類，就可用特定的核酸分子雜交或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)特定引物進(jìn)行探測(cè)。如能顯出雜交信號(hào)或具有正確長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)生(PCR特定引物法)，即能判定檢測(cè)商品或物件為真品，否則為假冒的偽品或贗品。
利用核酸制作防偽標(biāo)記有如下優(yōu)點(diǎn)1.不可仿制性首先核酸密碼無(wú)色，肉眼難以看到，其次，密碼來(lái)自自然界龐大的基因庫(kù)，即使知道是基因的密碼但不知是哪一種，仿冒者也無(wú)法破譯和仿造。而對(duì)檢驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，只要以專用的分析方法測(cè)試，真?zhèn)蝿t一目了然。
2.可靠性只有按預(yù)定的核酸密碼設(shè)計(jì)的探針或PCR引物進(jìn)行檢驗(yàn)，才有可能探測(cè)出密碼的存在與密碼的種類，所以核酸密碼具有極高的專一性。
3.多樣性可以很容易設(shè)計(jì)出千萬(wàn)種核酸密碼作為防偽標(biāo)記，每種都有自身相應(yīng)的探針和引物，互不通用。所以核酸密碼可為多種多樣的商品和物件分別提供獨(dú)特的防偽標(biāo)記體系。
4.穩(wěn)定性核酸(特別是DNA)穩(wěn)定，特別是干燥的DNA存放經(jīng)久，不易分解，適于一些長(zhǎng)期保存物件的防偽。
5.廣泛的適用性核酸密碼只需極微量(10-8-10-10克)存在于商品或物件中即可探測(cè)出來(lái)，因此適用于種類貴重的商品和物件。如科學(xué)儀器和家用電器；高檔服裝、家具及文體、文娛用品；高級(jí)煙酒、食品及營(yíng)養(yǎng)品；農(nóng)業(yè)和園藝的珍奇或重要種子；重要的證件和文件；經(jīng)鑒定的珍貴文物和藝術(shù)品等等，幾乎所有固態(tài)的物件上都可適用。
本發(fā)明提供一張附圖

圖1為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)DNA防偽標(biāo)記真?zhèn)螆D，圖中，A為空白(無(wú)DNA模板)；B為非特異性DNA，1微克；C為lambda噬菌體DNA模板。
下面結(jié)合附圖就利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)將核酸應(yīng)用于防偽提出一項(xiàng)實(shí)施例。
2、反應(yīng)溫度和程序94℃-10秒 50℃-30秒 或 94℃-60秒 55℃-60秒 72℃-120秒重復(fù)20-30次，最后延伸10分鐘。
3、電泳分離取10微升反應(yīng)液，置2％瓊脂糖凝膠(含溴乙啶染料)中，用100V直流電壓進(jìn)行電泳，電泳后將瓊脂糖凝膠取出，置于250-300nm波長(zhǎng)紫外燈下觀察并攝影。
4、鑒定如圖1(C)所示顯示預(yù)定大小的DNA帶，以次條狀帶是否存在以及大小是否正確來(lái)判別鑒定物件的真?zhèn)?。圖2(A，B)未顯示條狀帶則可認(rèn)定為偽品。
需要說(shuō)明的是實(shí)施例只是通例，不是固定的操作程序。實(shí)際操作中，常隨DNA模板和引物設(shè)計(jì)上的不同而有所變化，否則不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果。這種嚴(yán)格的操作條件對(duì)于防偽又極為有利，因防冒者不知反應(yīng)條件，無(wú)從破譯密碼。
權(quán)利要求
1.一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)將核酸應(yīng)用于防偽的方法，其特征在于將核酸或其片斷，固定在固相載體上用來(lái)作為防偽標(biāo)記，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)檢驗(yàn)真?zhèn)巍?br> 2.如權(quán)利要求1所述的防偽標(biāo)記，其特征在于所述的防偽標(biāo)記可直接固定在任何固態(tài)的物體上。
3.如權(quán)利要求1所述的防偽標(biāo)記，其特征在于所述的防偽標(biāo)記可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保護(hù)層。
4.如權(quán)利要求1所述的固相載體，其特征在于所述的固相載體可以是天然或人造纖維、紙張、薄膜、皮革、塑料、多孔顆粒、粉末、樹脂、固體石臘、陶瓷、玻璃等有機(jī)或無(wú)機(jī)的固態(tài)材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于防偽標(biāo)記辨別的探測(cè)檢驗(yàn)方法可以采用核酸分子探針?lè)?，其步驟依次是樣品處理，變性、中和，固相雜交，X光顯影鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的防偽方法，其特征在于核酸分子雜交所用的探針可以用同位素標(biāo)記物，也可以用其他類型非同位素標(biāo)記物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防偽方法，其特征在于防偽標(biāo)記辨別的探測(cè)檢驗(yàn)方法也可以采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物法，探測(cè)檢驗(yàn)時(shí)取下DNA并溶于一定量緩沖液中，在加入專一性引物和TagDNA聚合酶或其他聚合酶及其他反應(yīng)液，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，取出反應(yīng)液進(jìn)入電泳分析，然后用溴乙啶染色，在紫外光下觀察辨別鑒定DNA產(chǎn)物是否在及大小是否正確。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的防偽方法，其特征在于PCR反應(yīng)所用的TagDNA聚合酶，也可以是其他任何一種DNA聚合酶或使DNA擴(kuò)增的任何技術(shù)。
9.如權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)防偽標(biāo)記真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于根?jù)防偽標(biāo)記上核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析結(jié)果與已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果比較，即能判定防偽標(biāo)記的真假。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的將核酸應(yīng)用于防偽的方法,將核酸制成防偽標(biāo)記并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析技術(shù)檢測(cè)出真?zhèn)?。本發(fā)明還公開了以此技術(shù)制作防偽標(biāo)記的方法。本發(fā)明還公開了這種新方法的用途。
文檔編號(hào)G09F3/02GK1360055SQ001279
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月18日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請(qǐng)人:上海博德基因開發(fā)有限公司