專利名稱：一種腫瘤細(xì)胞模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞模型，特別涉及一種腫瘤細(xì)胞模型。
背景技術(shù)：
PC-1基因是本發(fā)明的發(fā)明人首先從前列腺癌細(xì)胞中克隆到的新基因(Zhou etal.，DNA microarray identified a novel PC-1 gene differentially expressedby human prostate tissues and tumor cell lines.The Fifth Asian Congresson Urology，Beijing，2000，51。)，全長cDNA序列已登錄GenBank(AF202897)，因在正常前列腺組織(Prostate)表達(dá)和在結(jié)腸組織(Colon)中微量表達(dá)，因此命名為PC-1基因(Prostate Colon gene-1)。該基因定位于人染色體8q21區(qū)，此區(qū)的基因擴(kuò)增與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌有關(guān)(Rosemary LB，et al.The hD52(TPD52)gene is a candidate target gene for eventsresultingin increased 8q21 copy number in human breast carcinoma.Genes，Chromosomes & Cancer，2000，2948-57.)，但沒有直接證據(jù)可以表明PC-1基因在腫瘤中起重要作用。
惡性腫瘤主要表現(xiàn)為細(xì)胞失去控制而無限制地生長，且癌細(xì)胞在不同時(shí)期的生長狀態(tài)與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞模型在弄清腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程、致病機(jī)理及抗腫瘤藥物的篩選中具有重要作用。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤細(xì)胞模型。
本發(fā)明所提供的腫瘤細(xì)胞模型，是可表達(dá)PC-1蛋白全序列或至少可表達(dá)PC-1蛋白N端前46個(gè)氨基酸殘基的真核宿主細(xì)胞。
該腫瘤細(xì)胞模型優(yōu)選為可表達(dá)PC-1蛋白全序列的真核宿主細(xì)胞；真核宿主細(xì)胞可為小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3、人前列腺癌細(xì)胞LNCaP、C4、C4-2B、人乳腺癌細(xì)胞MCF7等，優(yōu)選為小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3。該腫瘤細(xì)胞模型可為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1并可表達(dá)PC-1蛋白全序列或至少可表達(dá)PC-1蛋白N端前46個(gè)氨基酸殘基的NIH3T3細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)證明PC-1基因表達(dá)具有促使正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力，表明PC-1基因是一個(gè)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的重要分子。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞模型將在腫瘤，特別是前列腺癌的致病機(jī)理研究中起到重要作用；也將在抗腫瘤藥物，特別是抗前列腺癌藥物的篩選中起到重要作用，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。


圖1為重組質(zhì)粒pCDNA3.1(-)/myc-his-pc-1的酶切鑒定圖譜圖2為PCR檢測外源基因整合的電泳圖譜圖3為RT-PCR鑒定內(nèi)參對照GAPDH的擴(kuò)增情況電泳圖譜圖4為RT-PCR檢測PC-1基因mRNA表達(dá)的電泳圖譜圖5為Western blot檢測PC-1蛋白表達(dá)的電泳圖譜圖6A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1的NIH3T3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察照片(HE×200)圖6B為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)/myc-his的NIH3T3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察照片(HE×200)圖6C為母細(xì)胞NIH3T3形態(tài)學(xué)觀察照片(HE×200)圖7為細(xì)胞體外生長曲線圖8接種轉(zhuǎn)染PC-1基因NIH3T3細(xì)胞的裸鼠照片圖9為腫瘤組織切片HE染色照片(HE×200)圖10為癌旁組織切片HE染色照片(HE×100)具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)材料及數(shù)據(jù)分析1、菌株，細(xì)胞株與質(zhì)粒小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，為美國ATCC公司產(chǎn)品(www.atcc.org)。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-his美國INVITRIGEN公司產(chǎn)品(www.invitrigen.com)。真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1(前列腺癌相關(guān)基因PC-1表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位研究，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2001，25(4)255-259)，含有可編碼蛋白分子的人PC-1 cDNA片段。
2、主要試劑及檢測試劑盒限制性內(nèi)切酶、DNA酶I、蛋白酶K，RNase A均為TaKaRa公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Wizard Maxipreps DNA純化系統(tǒng)為Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑Trizol為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；DNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINETM、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、G418均為Gibco/BRL公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；小鼠抗His單克隆抗體為Invitrogen公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG為北京中山生物公司產(chǎn)品；NBT/BCIP染色試劑盒為華美生物公司產(chǎn)品；瓊脂為Difco公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為Sigma公司產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純試劑。
3、引物用于鑒定外源PC-1基因在靶細(xì)胞內(nèi)的整合所需引物
T7引物5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；BGH反向引物5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’；它們分別與pcDNA3.1(-)/myc-his質(zhì)粒部分序列互補(bǔ)，為通用引物；用于鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后PC-1基因轉(zhuǎn)錄所需引物引物15’-GGAATTCCACCATGGATTGTAGAGAGATGGAC-3’；引物25’-CGGGATCCCGCAGGCTCTCCTGTGTCTTTTC-3’；它們分別與PC-1 cDNA編碼區(qū)兩端序列互補(bǔ)，擴(kuò)增片段長693bp。
GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)內(nèi)參對照引物GAPDH15’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；GAPDH25’-TCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，擴(kuò)增片段長450bp。
4、實(shí)驗(yàn)動物6周齡BALB/C系雄性裸鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所繁殖中心。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
實(shí)施例1、穩(wěn)定表達(dá)外源PC-1基因小鼠成纖維細(xì)胞模型的建立1、細(xì)胞培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。
2、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和序列測定重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后電泳結(jié)果如圖1所示，表明酶切產(chǎn)生5.5kb和684bp兩條片段，片段大小正確。圖1中，1為15000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為EcoR I和BamH I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1；3為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。序列測定結(jié)果表明PC-1 cDNA編碼區(qū)段正確克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-his中，而且與標(biāo)簽分子的cDNA正確融合。
3、基因轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞克隆篩選采用Lipofect AMINE基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，具體方法詳見Gibco/BRL公司提供的試劑盒說明書。將純化的pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1(-)/myc-his空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照和NIH3T3細(xì)胞空白對照。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，以1∶10的稀釋度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換成含G418(終濃度450μg/ml)的完全培養(yǎng)基篩選陽性克隆。經(jīng)G418持續(xù)篩選，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞一周內(nèi)全部死亡，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞則呈單個(gè)分散于平皿中，兩周左右存活細(xì)胞局部形成克隆。
4、PCR檢測外源基因的整合提取轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA，使用T7引物和BGH反向引物進(jìn)行PCR，檢測外源基因的整合。PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)平8分鐘。1.5％瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測。結(jié)果如圖2所示，表明轉(zhuǎn)染有PC-1基因的4株細(xì)胞，擴(kuò)增片段長度為910pb；轉(zhuǎn)染空載體的二株細(xì)胞，擴(kuò)增片段長度為270bp。該結(jié)果與理論值完全一致，證明表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1和pcDNA3.1(-)/myc-his已經(jīng)分別在NIH3T3細(xì)胞中穩(wěn)定整合。圖2中，1為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3、4、5為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(-)/myc-his-pc-1的NIH3T3細(xì)胞；6、7為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)/myc-his的NIH3T3細(xì)胞。
5、RT-PCR檢測PC-1基因mRNA的表達(dá)細(xì)胞總RNA提取方法參見Trizol試劑盒說明書?？俁NA提取后，用無RNase活性的DNase消化以去除殘留的痕量基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定RNA的含量，電泳檢測確定RNA的質(zhì)量；cDNA的合成按照Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行；每組cDNA各取2份，分別擴(kuò)增PC-1 mRNA和內(nèi)參照GAPDH mRNA，擴(kuò)增PC-1mRNA的引物為引物1和引物2，擴(kuò)增條件同步驟4中的PCR檢測外源基因整合的條件。產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果如圖4所示，表明在穩(wěn)定整合的四株細(xì)胞中，有兩株細(xì)胞可檢測到PC-1基因的表達(dá)產(chǎn)物693bp的特異性片段，證明有PC-1基因的轉(zhuǎn)錄。而另外兩株細(xì)胞未擴(kuò)增出相應(yīng)長度的片段，提示該細(xì)胞株雖有PC-1基因的整合，但無PC-1基因的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)表明轉(zhuǎn)染空載體的二株細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞均檢測不到PC-1基因的表達(dá)產(chǎn)物，無PC-1基因轉(zhuǎn)錄。圖4中，1為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3、4、5為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1的NIH3T3細(xì)胞；6為NIH3T3細(xì)胞；7、8為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)/myc-his的NIH3T3細(xì)胞。圖3表明內(nèi)參對照GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物片段長為450bp，圖3中，1為2000bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3、4、5為四株轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1的NIH3T3細(xì)胞；6為NIH3T3細(xì)胞；7、8為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)/myc-his的NIH3T3細(xì)胞。選取既有PC-1基因整合又有PC-1基因轉(zhuǎn)錄的一株細(xì)胞，進(jìn)行以后的實(shí)驗(yàn)，稱之為NIH3T3-pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1細(xì)胞。
6、Western blot檢測PC-1蛋白的表達(dá)待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞長至80％-90％時(shí)，胰酶消化，提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)15％SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。一抗雜交用小鼠抗His單克隆抗體(1∶5000稀釋)，二抗堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶800稀釋)，NBT/BCIP顯色。結(jié)果如圖5所示，表明在28kD處轉(zhuǎn)染有PC-1基因的細(xì)胞出現(xiàn)雜交陽性帶，與目的蛋白理論分子量相吻合，即有PC-1蛋白表達(dá)；而未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞未見雜交陽性帶。圖5中，1為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1的NIH3T3細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)/myc-his的NIH3T3細(xì)胞；3為NIH3T3細(xì)胞。
實(shí)施例2、本發(fā)明細(xì)胞模型(PC-1基因表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞)生物學(xué)行為1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變?nèi)√幱趯?shù)生長期各組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染PC-1蛋白全長編碼基因或氨基端前46個(gè)氨基酸殘基編碼序列的NIH3T3細(xì)胞，母細(xì)胞NIH3T3，轉(zhuǎn)染空載體的NIH3T3細(xì)胞)，制備細(xì)胞爬片，95％的酒精固定后，HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果如圖6A-6C所示，表明轉(zhuǎn)染PC-1蛋白全長編碼基因或氨基端前46個(gè)氨基酸殘基編碼序列的細(xì)胞表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型特征，表現(xiàn)為大小不一，排列緊密，呈不規(guī)則的紡錘形；胞核體積增大，有雙核、多核細(xì)胞出現(xiàn)，核質(zhì)比例增大，核分裂象多見；細(xì)胞核染色質(zhì)增多，顆粒粗大。轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞形態(tài)與母細(xì)胞正常NIH3T3相比無明顯差別，表現(xiàn)為細(xì)胞排列疏松，呈纖維狀，核分裂少見。
2、細(xì)胞體外生長曲線采用MTT法測定細(xì)胞生長曲線細(xì)胞傳代于96孔板，每孔2×103/200μl，每種細(xì)胞設(shè)10個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞接種5小時(shí)后，貼壁。加入5mg/ml的MTT溶液20μl/孔，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清液，加入DMSO 150μl/孔，振蕩10分鐘。在490nm波長的酶聯(lián)免疫檢測儀上以空白孔調(diào)零，測定各組吸光度值(OD值)，此值設(shè)為三組細(xì)胞第0天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以后每隔24小時(shí)檢測一次，連續(xù)檢測5天并記錄結(jié)果。將第0天的細(xì)胞數(shù)計(jì)為100％，分別求取每日每組細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)(％)，即相對細(xì)胞數(shù)(％)＝第n天的OD值/第0天OD值×100(n＝1、2、3、4、5)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對細(xì)胞數(shù)(％)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果如圖7所示，表明已轉(zhuǎn)染PC-1蛋白全長編碼基因或氨基端前46個(gè)氨基酸殘基編碼序列的的NIH3T3細(xì)胞生長速度加快，與對照組母細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，均有顯著性差異(P＜0.05)；而母細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，二者生長速度無明顯差別(P＞0.05)，表明空載體的轉(zhuǎn)染對母細(xì)胞的生長狀態(tài)無明顯影響。
3、軟瓊脂集落形成試驗(yàn)軟瓊脂集落形成試驗(yàn)24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)體系為底層瓊脂濃度0.5％，上層瓊脂濃度0.3％(含待測細(xì)胞)。每組細(xì)胞設(shè)四個(gè)濃度梯度，即25個(gè)/孔，50個(gè)/孔，100個(gè)/孔，200個(gè)/孔。每個(gè)細(xì)胞濃度同時(shí)作四個(gè)平行孔。置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)3周，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞集落形成數(shù)及形成率。細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)計(jì)為1個(gè)集落。集落形成率(％)＝集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100。
表1 轉(zhuǎn)染PC-1基因細(xì)胞軟瓊脂集落形成率接種細(xì)胞數(shù)n 集落數(shù) 集落形成率(％)254 0.8±1.0 3.0±3.8*504 1.8±1.0 3.5±1.9*100 4 4.0±0.8 4.0±0.8*200 4 7.3±1.5 3.6±0.8**P＞0.05母細(xì)胞NIH3T3和轉(zhuǎn)染空載體的對照組細(xì)胞不能在軟瓊脂中形成細(xì)胞集落，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC-1基因的細(xì)胞能形成集落，集落形成率為3.5％(表1)。提示外源PC-1基因的穩(wěn)定表達(dá)對NIH3T3細(xì)胞的集落形成有明顯促進(jìn)作用。
4、裸鼠體內(nèi)致瘤性檢測10只6周齡BALB/C系雄性裸鼠，隨機(jī)分成2組，實(shí)驗(yàn)組6只，對照組4只，于背部皮下分別接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PC-1基因的細(xì)胞(細(xì)胞來源于軟瓊脂中形成的細(xì)胞集落)和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞，細(xì)胞用量1×107個(gè)/只(0.2ml)，觀察腫瘤形成情況。5周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織經(jīng)常規(guī)處理后作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)；計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組裸鼠的成瘤率。成瘤率(％)＝成瘤鼠數(shù)/(成瘤鼠數(shù)+未成瘤鼠數(shù))×100。結(jié)果表明在5周觀察期結(jié)束時(shí)，接種轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的4只對照組裸鼠未長出腫瘤，而接種轉(zhuǎn)染PC-1基因細(xì)胞的6只實(shí)驗(yàn)組裸鼠于接種20-27天后，在其接種部位先后出現(xiàn)肉眼可見的腫塊，成瘤率為100％(圖8)。5周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織。經(jīng)固定，切片，HE染色后，顯微鏡下觀察到組織細(xì)胞呈現(xiàn)出惡性增生，細(xì)胞有明顯異型性，證實(shí)為惡性纖維肉瘤組織(圖9)。癌旁組織鏡下觀察未見惡性病變(圖10)。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤細(xì)胞模型，是可表達(dá)PC-1蛋白全序列或至少可表達(dá)PC-1蛋白N端前46個(gè)氨基酸殘基的真核宿主細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞模型，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞模型是可表達(dá)PC-1蛋白全序列的真核宿主細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞模型，其特征在于所述真核宿主細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3、人前列腺癌細(xì)胞LNCaP、C4、C4-2B、人乳腺癌細(xì)胞MCF7。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞模型，其特征在于所述真核宿主細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞模型，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞模型為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1并可表達(dá)PC-1蛋白全序列或至少可表達(dá)PC-1蛋白N端前46個(gè)氨基酸殘基的NIH3T3細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞模型，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞模型為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1并可表達(dá)PC-1蛋白全序列的NIH3T3細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述細(xì)胞模型在腫瘤致病機(jī)理研究中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為前列腺癌。
9.權(quán)利要求1所述細(xì)胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤細(xì)胞模型。本發(fā)明所提供的腫瘤細(xì)胞模型，是可表達(dá)PC－1蛋白全序列或至少可表達(dá)PC－1蛋白N端46個(gè)氨基酸殘基的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞模型可用于研究腫瘤，特別是前列腺癌的致病機(jī)理；也可用于篩選抗腫瘤藥物，特別是抗前列腺癌藥物。
文檔編號G09B23/00GK1601576SQ03154
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者周建光, 常曉彤, 梁瑞霞, 張 浩, 王健, 黃翠芬 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所