專利名稱：一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療評價(jià)、檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說它是一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知能力低下和思維遲鈍，且進(jìn)行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般5～20年。隨著社會老齡化進(jìn)程的加快，AD的發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升，已成為威脅老齡特別是高齡人口身心健康的嚴(yán)重疾病，并帶來了嚴(yán)重的社會、經(jīng)濟(jì)和家庭問題。
AD病人主要腦病理改變是大量NFTs、大量老年斑、突觸和神經(jīng)元丟失，與之相對映的兩大分子標(biāo)志物是β-淀粉樣蛋白和tau蛋白(Dennis J.Selkoe，2000；J.Gtz，2001；Kawabata S，1991)。目前國外學(xué)者已采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在小鼠成功地復(fù)制出β-淀粉樣沉積引起的老年斑病變，使得未來AD治療將減少β淀粉樣蛋白沉積作為藥物干預(yù)的目標(biāo)成為可能，盡管如此，但在臨床上并不能從根本上治療AD。
AD的另一主要腦病理改變NFTs是AD患者神經(jīng)元變性的基礎(chǔ)，其數(shù)量與AD臨床癡呆程度正相關(guān)(Featy MB，1996)。因此，對NFTs干預(yù)顯得尤為重要。蛋白tau屬于一種微管相關(guān)蛋白，主要參與調(diào)與微管組裝、運(yùn)輸和空間結(jié)構(gòu)(Mandelkow EM，1995)，而NFTs的主要成分是異常、過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲。適度磷酸化的tau可與微管結(jié)合，促進(jìn)微管組裝并維持其穩(wěn)定性，從而保證細(xì)胞骨架的完整性及軸漿運(yùn)輸?shù)恼＿M(jìn)行，異常過度磷酸化的tau則失去上述功能(Grundke-Iqbal I，1986；Iqbal K，1986；王建枝，1999)。國內(nèi)外學(xué)者普遍公認(rèn)，骨架蛋白tau的異常、過度磷酸化是NFTs形成的關(guān)鍵步驟。過度磷酸化tau蛋白的聚集不僅以纏結(jié)的形式存在，它也是神經(jīng)氈纖絲和老年斑中的營養(yǎng)不良突起的主要成分。有關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生過度磷酸化的機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究認(rèn)為蛋白激酶(催化磷酸化反應(yīng)，如GSK-3，Cdk5和MAPK等)與磷酸酯酶(催化去磷酸化反應(yīng)，如PP1，PP-2A，PP-2B等)的相對活性失衡，是造成骨架蛋白磷酸化的主要原因。因此，國內(nèi)外學(xué)者通過以蛋白激酶或/和磷酸酯酶為靶點(diǎn)，在體誘導(dǎo)tau蛋白的異常、過度磷酸化而建立諸多的AD樣動(dòng)物模型，從不同的角度探討在此過程中的細(xì)胞病理改變、與動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶的聯(lián)系，其中有代表的動(dòng)物模型有三類，一類是崗田酸(Okadaic acid，OA)慢性損害模型，OA，一種磷酸酯酶抑制劑，通過微滲透泵輸送到側(cè)腦室，持續(xù)六周后，大鼠腦的紋狀體、海馬和皮質(zhì)等部位出現(xiàn)高磷酸化tau蛋白免疫陽性神經(jīng)元，并伴有工作記憶和參考記憶的損害(Arent T，1995)；第二類是轉(zhuǎn)染tau蛋白激酶基因的大鼠模型，該模型能高表達(dá)過度磷酸化的tau蛋白(野生型或人類tau蛋白的突變異構(gòu)體)，可重復(fù)間歇饑餓刺激和對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作用的藥物如atreptozotocin、tolbutamide、LY294002、wortmannin、PD98059等實(shí)驗(yàn)，但無行為學(xué)記憶障礙(JP2000253774)；第三類是通過大鼠側(cè)腦室或海馬注射蛋白激酶激動(dòng)劑或抑制劑，尤其是利用聯(lián)合用藥誘導(dǎo)蛋白tau過度磷酸化的動(dòng)物模型(LIU Shi-jie，2002)。但也存在著難以克服的缺陷，諸如昂貴的成本、對動(dòng)物的損傷性以及作用周期短或局限等(見表一)。
目前作為AD的常用模型有1.損傷性動(dòng)物模型，即依據(jù)膽堿能理論，通過有機(jī)藥物、生物多肽或物理方法，誘導(dǎo)老年性癡呆動(dòng)物模型。例如利用前腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損傷建立模型，Kudo等利用白喉毒素結(jié)合的NGF對小鼠雙側(cè)皮質(zhì)注射，小鼠出現(xiàn)被動(dòng)學(xué)習(xí)及記憶功能減退，或利用興奮性毒素鵝膏覃氨酸對大鼠基底核單側(cè)注射，損毀膽堿能神經(jīng)元，大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，大腦皮層和海馬ChAT活性降低；2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，自從1991年美國3個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘發(fā)鼠淀粉樣病變獲得成功，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究AD得到了很大的發(fā)展，其明顯的優(yōu)點(diǎn)是模擬了AD樣神經(jīng)病理學(xué)特征，包括細(xì)胞外Aβ的沉積，營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎，神經(jīng)膠質(zhì)增生；3.自然衰老的動(dòng)物模型，自然衰老認(rèn)知障礙動(dòng)物模型神經(jīng)系統(tǒng)的改變是自然發(fā)生的，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過行為學(xué)測試的3月-7年齡兔的小腦和海馬的某些腦區(qū)，存在著顯著的神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，但遺憾的是，即使在超過7年齡兔的端腦神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)或很少發(fā)現(xiàn)Aβ的沉積或神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。
上述各種常用動(dòng)物模型都是模擬AD某些方面的改變，其中以損傷膽堿能神經(jīng)元模型研究得最多，但它也只是部分模擬AD行為記憶方面的改變，腦內(nèi)未出現(xiàn)AD樣病理變化。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型為近年來的主要研究進(jìn)展，但家族性AD通常是由多基因異常引起，而目前的轉(zhuǎn)基因模型大多是移植了一個(gè)、或最多兩個(gè)基因或基因片段，尚不能真實(shí)地反映AD的病理改變，同時(shí)在行為實(shí)驗(yàn)方面也需改善，而且流行病學(xué)調(diào)查資料表明80％以上的AD患者不涉及基因變異(BraakH，1997)。故轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，復(fù)制出AD樣大鼠海馬和皮質(zhì)β-淀粉樣蛋白增多、骨架蛋白Tau異常過度磷酸化、NFTs樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對活性失衡和學(xué)習(xí)、記憶障礙的動(dòng)物模型。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，是將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。
在上述技術(shù)方案中，所述光照環(huán)境中的時(shí)間為3～8周。
在上述技術(shù)方案中，所述光照環(huán)境中的時(shí)間為5～6周。
在上述技術(shù)方案中，大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度10～1000Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
在上述技術(shù)方案中，大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
對本發(fā)明方法構(gòu)建的動(dòng)物模型提出進(jìn)行(1)Morris水迷宮訓(xùn)練及測試目的通過訓(xùn)練及測試來判斷造模前后以及與對照組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的變化。
實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學(xué)測試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機(jī)數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機(jī)玻璃平臺直徑10cm，高40cm。大鼠在訓(xùn)練前2小時(shí)移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。整個(gè)背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導(dǎo)大鼠游泳找到平臺的紅色或蘭色標(biāo)記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓(xùn)練時(shí)將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經(jīng)水面上方1.5m處的攝象機(jī)拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過微機(jī)分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺所用的時(shí)間)、路徑、搜索策略等指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)選用潛伏期作為衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶和測試成績的指標(biāo)。每只大鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導(dǎo)其上臺，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。
(2)分子病理學(xué)檢測目的通過免疫印跡和免疫組化來反映造模前后以及與對照組大鼠皮質(zhì)和海馬骨架蛋白的分子病理學(xué)變化。
①免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
②免疫組化法用4％多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進(jìn)行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(3)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測定目的通過同位素標(biāo)記法來檢測造模前后以及對照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthasekinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進(jìn)行測定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應(yīng)管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mMMgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應(yīng)，然后從中取出25μl在液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測。
(4)磷酸酯酶(PP-1，PP-2A，PP-2B)酶活性測定i.反應(yīng)底物的制備在40mM Tris-HCl緩沖液中(pH8.5，20mM β-ME，0.2mM CaCl2，15mM MgCl2)，分別加入0.5mM[32P]ATP、10μg/ml磷酸化酶激酶和磷酸化酶b，在30℃條件下孵育10min.，將磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為32P標(biāo)記的磷酸化酶a，其中游離的ATP通過Sephadex G-50柱去除。
ii.PP-1，PP-2A酶活性測定在20μl反應(yīng)體系(50mM Tris，pH7.0，10mM BME，0.1mM EDTA，7.5mM caffeine，0.06mg/ml組織提取物)中，加入7.5ng/μl[32P]phosphorylase-a開始反應(yīng)，在30℃條件下孵育30min.，然后加入等體積的終止液(4mM coldATP+20％ TCA)終止反應(yīng)。利用上行紙色譜法(5％ TCA+0.2M NaCl)分離游離的32P和反應(yīng)底物。通過液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測其放射量。
(5)統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)均采用X±SD表示，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(6)模型構(gòu)建評估根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，結(jié)果顯示延長大鼠生活環(huán)境中光照時(shí)間，大鼠出現(xiàn)明顯行為學(xué)障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長，并伴有神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降等；與對照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)中β-淀粉樣肽Aβ42、Aβ40的含量明顯增多。酶活性檢測結(jié)果顯示與對照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降。免疫組化和免疫印跡結(jié)果顯示與對照組相比，模型組大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(識別非磷酸化位點(diǎn))和Ser396/404、Ser214、Ser262等識別磷酸化的位點(diǎn)磷酸化明顯增強(qiáng)，而骨架蛋白Tau的這些特殊位點(diǎn)的磷酸化程度與動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶障礙正相關(guān)，即Tau蛋白過度磷酸化程度越高，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越差。病理學(xué)檢測結(jié)果顯示大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)。上述結(jié)果說明模型構(gòu)建成功。
本發(fā)明提出的動(dòng)物模型的構(gòu)建，同時(shí)適用于各種動(dòng)物諸如豬、牛、猴、鼠等，都可以在體直接復(fù)制出AD樣海馬和皮質(zhì)β-淀粉樣蛋白增多、骨架蛋白異常過度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化和學(xué)習(xí)、記憶障礙。
本發(fā)明特點(diǎn)主要是通過延長大鼠生活環(huán)境中日照時(shí)間，不僅出現(xiàn)AD樣異常、β-淀粉樣蛋白增多、過度磷酸化tau蛋白的免疫陽性神經(jīng)元，而且在大鼠腦組織病理學(xué)檢測中觀察到神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)，并伴有學(xué)習(xí)和記憶障礙、蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降以及神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降，且無損傷性，持續(xù)時(shí)間長，所需費(fèi)用十分低廉，模型復(fù)制成功率高，重現(xiàn)性好，適用于研究在AD發(fā)病早期或過程中可能的機(jī)制以及其之間的內(nèi)在聯(lián)系，具體內(nèi)容包括β-淀粉樣蛋白增多及聚集、骨架蛋白Tau AD樣異常過度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對活性失衡及行為異常等，并可以用于篩選相應(yīng)的治療AD藥物，與上述相關(guān)動(dòng)物模型的比較見下表。
表一 幾種早老性癡呆大鼠模型的比較



圖1為正常組大鼠(12h∶12h)腦組織神經(jīng)原纖維；圖2為模型組大鼠(24h∶0h)腦組織神經(jīng)原纖維。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
結(jié)合附圖可知病理學(xué)檢測結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征。
實(shí)例光照大鼠構(gòu)建AD樣大鼠動(dòng)物模型(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性Wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，SPF級，體重50～70克，30只。分兩組，每組15只①正常組，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)(12h∶12h)，即7:00～19:00自然光，19:00～7:00無光；②模型組，大鼠持續(xù)光照方式(24h∶0h)7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；時(shí)間6周，期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
(2)主要試劑丙烯酰胺(Arc)，N，N-亞甲基雙丙烯酰(bis)，四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸鈉(SDS)，甘氨酸(Glycine)，牛血清白蛋白(BSA)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，礬酸鈉(Na3VO4)，β-磷酸甘油(β-PG)，氟化鈉(NaF)，磷酸化酶b，均為Sigma產(chǎn)品；過硫酸銨(AP)及考馬斯亮藍(lán)蛋白顯色液從Pierce(美國)公司購買；預(yù)染的高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)從Gibco公司購買。
(3)主要儀器①WDT-V型腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)②STT-III型三維手動(dòng)推進(jìn)器(西安西北光電儀器廠)③垂直型電泳槽和濕式電轉(zhuǎn)膜槽(Hoefer，USA)④電泳儀(DF-C型，東方特力科貿(mào)中心)⑤轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，北京市六一儀器廠)⑥臺式高速離心機(jī)(Sigma，德國)⑦酶標(biāo)儀(DG-3022型)⑧圖象分析系統(tǒng)(Image pro-plus kodak，USA)⑨衡溫雜交孵育箱(Biometra)(4)Morris水迷宮訓(xùn)練及測試實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學(xué)測試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機(jī)數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測試用圓形水池直徑120cm，高60cm；圓柱形有機(jī)玻璃平臺直徑10cm，高40cm。大鼠在訓(xùn)練前2小時(shí)移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3×3cm2，以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2℃，水以奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。整個(gè)背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導(dǎo)大鼠游泳找到平臺的紅色或蘭色標(biāo)記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓(xùn)練時(shí)將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經(jīng)水面上方1.5m處的攝象機(jī)拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過微機(jī)分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺所用的時(shí)間)、路徑、搜索策略等指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)選用潛伏期作為衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶和測試成績的指標(biāo)。每只大鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導(dǎo)其上臺，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。
(5)分子病理學(xué)檢測目的通過免疫印跡和免疫組化來反映造模前后以及與對照組大鼠海馬骨架蛋白的分子病理學(xué)變化。
①免疫印跡法頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4℃ 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB，PH7.0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
②免疫組化法用4多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進(jìn)行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin，DAB)顯色。
(6)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性測定目的通過同位素標(biāo)記法來檢測造模前后以及對照組大鼠海馬GSK-3的活性改變。
大鼠海馬蛋白勻漿的糖原合成激酶(Glycogen synthasekinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光體GS肽II作為底物進(jìn)行測定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具體方法如下在反應(yīng)管中先一定體積的緩沖液(其組成為30mM Tris，pH7.4，10mMMgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分別加入7.5μg大鼠海馬蛋白勻漿、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，終體積為25μl，在30℃條件下孵育30min，用25μl of 300mM鄰磷酸終止反應(yīng)，然后從中取出25μl在液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測。
(7)磷酸酯酶(PP-1，PP-2A)酶活性測定i.反應(yīng)底物的制備在40mM Tris-HCl緩沖液中(pH8.5，20mM β-ME，0.2mM CaCl2，15mM MgCl2)，分別加入0.5mM[32P]ATP、10μg/ml磷酸化酶激酶和磷酸化酶b，在30℃條件下孵育10min.，將磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為32P標(biāo)記的磷酸化酶a，其中游離的ATP通過Sephadex G-50柱去除。
ii.PP-1，PP-2A酶活性測定在20μl反應(yīng)體系(50mM Tris，pH7.0，10mM BME，0.1mM EDTA，7.5mM caffeine，0.06mg/ml組織提取物)中，加入7.5ng/μl[32P]phosphorylase-a開始反應(yīng)，在30℃條件下孵育30min.，然后加入等體積的終止液(4mM coldATP+20％TCA)終止反應(yīng)。利用上行紙色譜法(5％TCA+0.2M NaCl)分離游離的32P和反應(yīng)底物。通過液態(tài)閃爍記數(shù)分析儀進(jìn)行檢測其放射量。
(8)統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)均采用X±SD表示，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(9)模型構(gòu)建評估根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，結(jié)果顯示延長大鼠生活環(huán)境中光照時(shí)間，大鼠出現(xiàn)明顯行為學(xué)障礙，即水迷宮測試潛伏期明顯延長，并伴有神經(jīng)內(nèi)分泌激素的紊亂如體內(nèi)血液中褪黑素含量的下降等；與對照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)中β-淀粉樣肽Aβ42、Aβ40的含量明顯增多。酶活性檢測結(jié)果顯示與對照組相比，模型組大鼠海馬和皮質(zhì)蛋白激酶活性的升高、磷酸酯酶活性的下降。免疫組化和免疫印跡結(jié)果顯示與對照組相比，模型組大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(識別非磷酸化位點(diǎn))和Ser396/404、Ser214、Ser262等識別磷酸化的位點(diǎn)磷酸化明顯增強(qiáng)，而骨架蛋白Tau的這些特殊位點(diǎn)的磷酸化程度與動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶障礙正相關(guān)，即Tau蛋白過度磷酸化程度越高，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越差。病理學(xué)檢測結(jié)果顯示大鼠腦組織神經(jīng)原纖維增粗，密度加大，出現(xiàn)部分交聯(lián)，呈現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的初始特征(圖1、圖2)。上述結(jié)果說明模型構(gòu)建成功。
權(quán)利要求
1.一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述光照環(huán)境中的時(shí)間為3～8周。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述光照環(huán)境中的時(shí)間為5～6周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度10～1000Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于大鼠持續(xù)光照的方式為7:00～19:00自然光，19:00～7:00燈光；光強(qiáng)度150Lux；期間動(dòng)物可以自由攝食飲水，室溫為20～25℃。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)療評價(jià)、檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種早老性癡呆大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，通過將大鼠置于持續(xù)光強(qiáng)度為10～1000Lux的光照環(huán)境中，光照環(huán)境中的時(shí)間為1～10周。該類模型可用于研究在AD發(fā)病早期或過程中可能的機(jī)制以及其之間的內(nèi)在聯(lián)系，具體內(nèi)容包括β－淀粉樣蛋白增多及聚集、骨架蛋白Tau AD樣異常過度磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)樣病理變化、蛋白激酶與磷酸酯酶的相對活性失衡及行為異常等，并可以用于篩選治療早老性癡呆(Alzheimer’sdisease，AD)藥物、評價(jià)治療早老性癡呆方法以及研究早老性癡呆發(fā)病機(jī)制的非損傷性大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。
文檔編號G09B23/00GK1558383SQ2003101114
公開日2004年12月29日 申請日期2003年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者凌智群, 王建枝 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院