專利名稱：特別用于熒光顯微的載玻片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不顯示出自身熒光的載玻片，特別是適用于熒光顯微或者生物芯片應(yīng)用。本發(fā)明還涉及載玻片在熒光顯微方法上的應(yīng)用，以及涉及具有載玻片支座的熒光顯微鏡，在所述的載玻片支座上可以安置載玻片。
因此當前為了高精度的測量采用了共焦顯微鏡，其焦深很小，以致于只能從要分析的發(fā)出熒光的物質(zhì)層中接收熒光光線。從而有效地遮擋了由其它范圍產(chǎn)生的熒光波長范圍的光線。由此保證了只從受分析的范圍內(nèi)接受熒光光線。但是為了此優(yōu)點付出的代價是相應(yīng)的顯微鏡儀器設(shè)備成本，因為為了在顯微鏡中形成共焦所需要的可聚焦性一般地只有通過激光才能達到。此外對于光源的選擇也有很強的限制。
另一種想法是，在不同的物像景深處取多個位置分辨的圖像，接著對其進行數(shù)學(xué)處理。這種想法卻要求大量的計算，從而取得一個圖像所用時間漫長。此外還可能降低檢測靈敏度。
一般地這種公知的方法只是在某種條件下才適用于進行時間分辨的處理，因為取得需要進行隨后的數(shù)學(xué)處理的多個圖像要求一定的時間。
如果由于成本而不使用共焦測量顯微鏡及所述的數(shù)學(xué)校正，就要承受誤差或者降低測量靈敏度。
在2001年11月20日[電子顯微鏡科學(xué)目錄]在因特網(wǎng)址www.emsdiasum.com/ems/histology/slides.html上公布了訂貨號為71876-0的載玻片，其下側(cè)通過噴砂處理粗糙化。在號碼3的說明書中表明，這種粗糙化處理的作用是保證載玻片下側(cè)更好的可書寫性。
根據(jù)本發(fā)明此目的通過不顯示自身熒光的，平板形構(gòu)成的載玻片完成，這種載玻片至少在一個平板側(cè)有熒光吸收特性，或者設(shè)有熒光光線的抗反射層。
本發(fā)明的目的還通過具有載玻片支座的熒光顯微鏡實現(xiàn)，所述的載玻片支座上側(cè)可以安置載玻片，并且入射到所述上側(cè)的熒光光線不向所述上側(cè)反射，以及通過使用平板形構(gòu)成的并且入射在平板側(cè)上的熒光光線不向此平板側(cè)反射的載玻片，以達到非共焦熒光顯微鏡的熒光顯微。
本發(fā)明從這樣的認識出發(fā)測量精確度主要地是由于受觀察層的相鄰區(qū)域之間的光串擾而削弱。這種串擾除了其它的影響之外還導(dǎo)致在對處于面向著物鏡的載玻片上側(cè)上的熒光物質(zhì)進行光度測量時位置分辨率受限。這里，事實表明是由于在玻璃/空氣界面上的熒光反射造成串擾，其中在熒光物質(zhì)下總是出現(xiàn)反射。
有兩個過程具有意義一個是從具有熒光分子的載玻片物面發(fā)出從而進入載玻片的熒光，在對側(cè)于載玻片/空氣界面上至少部分地受反射然后返回其上有熒光物質(zhì)層的物鏡一側(cè)的表面。在此熒光光線在顯微鏡中受測量并且導(dǎo)致測量的光強的誤差。另一個過程則是載玻片上具有熒光分子的物面發(fā)出的熒光，在所述具有熒光分子的物面與顯微鏡物鏡之間的蓋玻片上受到反射，然后通過在載玻片上再次反射返回顯微鏡。這也同樣導(dǎo)致了光串擾形式的誤差。
本發(fā)明排除了這兩個過程，要么在熒光層下設(shè)有熒光吸收層，要么設(shè)法使之不可能有向上側(cè)的返回反射，也就不可能有向顯微鏡物鏡的返回反射。從而阻斷了相鄰區(qū)域之間的串擾。
在此，吸收熒光或阻止返回反射可以在載玻片自身進行，其中在設(shè)計用于容納熒光物質(zhì)層的表面下方設(shè)置具有適當?shù)臒晒馕仗匦缘妮d玻片。變通地也可通過在與載玻片的用于容納熒光物質(zhì)層的上側(cè)相對的下側(cè)上設(shè)置抗反射層以使進入載玻片的熒光在其下側(cè)離開，而不在此反射。用這樣的載玻片時，必須在承放載玻片的支座上采取適當?shù)拇胧?，使得熒光光線不再不利地反射回載玻片。
因此這樣地擴展根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡，使得入射在載玻片支座上的熒光光線不反射回載玻片。最簡單的做法是吸收地或者不反射地構(gòu)成載玻片支座上側(cè)就足以完成此任。
一般地，熒光顯微鏡的載玻片支座由玻璃體構(gòu)成。為了如所希望地避免熒光光線在其上側(cè)的反射，就必須在其上設(shè)抗反射層。變通地還可以在支承載玻片的支座和載玻片之間設(shè)置具有折光率近于載玻片或者玻璃塊的液體層。這種浸油在顯微方法中公知地用在蓋玻片與顯微鏡物鏡之間。如果打算避免使用按照本發(fā)明觀點難于自動化運用的液體，可以使用透明的，固態(tài)卻又有撓性的具有所要求的光學(xué)特性的材料，也就是說可以避免界面反射。這樣的材料說明于US5.313.264。
如果致力于不讓熒光光線在載玻片支座上側(cè)反射，可以用不同的適當手段達到使入射到載玻片支座上的光線不反射向載玻片。最簡單的做法是所述的熒光吸收特性足擔(dān)此任。
在熒光顯微鏡的一個特別有利的擴展中，讓載玻片支座的與其上承載載玻片的上側(cè)相對置的下側(cè)具有反射特性，并且構(gòu)成得使反射的光線從載玻片移開。對于此變形，優(yōu)選地是其載玻片支座有與上側(cè)不平行地安排的與上側(cè)對置的下側(cè)，特別是所述的下側(cè)與上側(cè)有大于45度的夾角。
這樣設(shè)計的載玻片支座在對入射的熒光光線進行反射時而不會使其再返回載玻片，也就不會再返回顯微鏡物鏡。
盡管所述的顯微鏡具有用常規(guī)的載玻片就能夠提高位置分辨率的優(yōu)點，但根據(jù)本發(fā)明的載玻片的優(yōu)點卻在于，它可以用常規(guī)的標準顯微鏡來明顯改善分辨率，因為熒光的反射在載玻片自身中就被阻斷了。
阻止反射的最簡單的技術(shù)是適當?shù)奈諏印榱诉_到所希望的本發(fā)明所述的效果，所述的吸收層應(yīng)當只在具有熒光發(fā)射特性的物質(zhì)層的下面，其中，“下面”的概念參照的是通過顯微鏡物鏡的觀察方向。對于這個擴展安排，優(yōu)選地對平板形的載玻片上在平板側(cè)進行吸光涂層。
對于在熒光顯微中的應(yīng)用，重要的是載玻片上沒有不符合要求的自身熒光發(fā)射。因為，視應(yīng)用不同在熒光顯微中激發(fā)和檢測寬頻帶的熒光光線，一般的是在300至700nm的波長范圍，所以載玻片的材料在此波長范圍內(nèi)不應(yīng)當顯示出自身的熒光發(fā)射。其中根據(jù)本發(fā)明，“沒有自身熒光發(fā)射”的概念理解成自身熒光發(fā)射只以微小到不由此而影響通常的熒光分析的規(guī)模出現(xiàn)。不然的話就不會如所希望的那樣適于熒光顯微，因為發(fā)射熒光的載玻片會掩蓋測量信號。因此在所述的熒光顯微中適于用玻璃作材料，因為玻璃沒有自身熒光發(fā)射。
所以在一個特別簡單地成功的實現(xiàn)中，在平板形的玻璃體上于平板側(cè)進行光吸收涂層，例如涂黑。所述的涂層可以通過各種適合的方法進行，例如上漆、蒸鍍、噴涂、蝕刻、等離子處理、UV照射、聚合物涂層(例如用賽珞珞產(chǎn)品涂層)或者鋁陽極氧化處理。涂層的一面可以用在載玻片后來的下側(cè)，還可以用在上側(cè)，在上側(cè)上然后再設(shè)熒光發(fā)射層。不論在什么情況下它都在熒光發(fā)射物質(zhì)層的下方。但是出于干凈的理由人們一般地把熒光發(fā)射物質(zhì)層設(shè)在玻璃體的非涂層平板側(cè)，以避免在熒光發(fā)射物質(zhì)與涂層之間出現(xiàn)不利的相互作用。
熒光發(fā)射物質(zhì)放在透明的載玻片上側(cè)的構(gòu)成方式的優(yōu)點是，對于自動聚焦系統(tǒng)還提供了適于聚焦到界面上的空氣/基質(zhì)過渡。
變通地，所述載玻片還可以有吸收熒光的實心體，在此整個載玻片可以構(gòu)成為實心體。對于所述的實心體同樣也可以考慮采用具有填充了吸收熒光的金屬氧化物的玻璃。
這樣的物質(zhì)也適用于光吸收層。因此優(yōu)選地，所述的載玻片具有吸收熒光的物質(zhì)，特別是金屬氧化物。
如果采用其載玻片支座不反射熒光光線的顯微鏡，必須要設(shè)法使載玻片的下側(cè)不出現(xiàn)熒光反射。這可以例如通過適當?shù)目狗瓷鋵舆_到，所述的抗反射層優(yōu)選地是寬帶的，以對不同的熒光團的熒光起作用。
載玻片的吸收特性越好，其抑制光串擾的能力就越強。事實表明，把返回反射抑制約20％就可以顯著改善測量質(zhì)量。因此也就相應(yīng)地提高了位置分辨率。如果把平板下側(cè)除了涂上光吸收涂層之外還附加地構(gòu)成為散射地反射熒光光線，就達到對光吸收的改善。這可以通過適當?shù)卮植诨_到。否則盡管有吸收層也有可能不能夠排除干擾性的反射部分。
為了與材料無關(guān)地達到對受分析的物體的良好附著性和良好的生物相容性，在載玻片的上側(cè)涂覆以改善附著性或者生物相容性的層，例如二氧化硅層是有利的。這樣在選擇載玻片材料上有較大的自由度。
根據(jù)本發(fā)明，不反射入射到平板側(cè)上的熒光光線的載玻片可以不再使用共焦熒光顯微鏡，而又不放棄對位置分辨率的要求。因此，根據(jù)本發(fā)明采用平板形構(gòu)成的并且不把入射在平板側(cè)的熒光光線向此平板側(cè)反射回去的載玻片，以設(shè)計非共焦熒光顯微鏡的熒光顯微。令人驚喜地，采用這樣的載玻片使之達到了能夠避開至今被認為不可放棄使用的，不僅價格不菲而且保養(yǎng)、維修和操作成本也較高的共焦熒光顯微鏡。從而可以用簡單的熒光顯微鏡達到至今不可能達到的位置分辨率和測量靈敏度，因為采用所述的載玻片減少了光學(xué)串擾并且從而提高了位置分辨率。在此可以考慮前述的載玻片用作為載玻片；然而基本上重要的僅在于，所述的載玻片要盡可能地抑制并非直接地從物層發(fā)出的、而是經(jīng)反射達到物鏡的熒光光線。
具體實施例方式


圖1為載玻片1的透視圖，所述載玻片1具有上側(cè)2，在上側(cè)2上設(shè)有熒光發(fā)射層3。為了用顯微鏡進行分析，把載玻片1的下側(cè)4放在載玻片支座上，并且在上側(cè)2用激發(fā)光照射。通過激發(fā)發(fā)射出的熒光光線用安排在上側(cè)2上方的顯微鏡物鏡位置分辨地測量。
載玻片1是吸收熒光的實心體，所述實心體由在300至700nm之間的范圍內(nèi)不顯示顯著的自身熒光發(fā)射的底物構(gòu)成。這種底物與吸收熒光的物質(zhì)例如基于金屬氧化物的物質(zhì)混合成使得底物在模制成平板形的載玻片1后完全地著色。其中完全著色使得在平行于上側(cè)2的整個載玻片1的橫截面上都達到吸收要求。
染色優(yōu)選地是黑色的，但是用吸收熒光光線的其它各種顏色進行染色也是適合的。
這種光吸收的特性導(dǎo)致沒有多少熒光光線可以穿過平板，從而也不會再反射回上側(cè)2。還有由放在熒光發(fā)射層3上的蓋玻片(未示)反射的光線也會由染色的載玻片1吸收從而不能夠達到顯微鏡物鏡。
圖2所示為載玻片1的另一種實施形式，其中與圖1的載玻片的元件相應(yīng)的元件用相同的標號標出。在圖2的載玻片1的上側(cè)2上同樣地有熒光發(fā)射層3。然而在熒光發(fā)射層3的下面，在載玻片1的體5中間有吸收熒光光線的涂層6。所述的涂層通過各種適合的方法進行，例如上漆、蒸鍍、噴涂、蝕刻、等離子處理、或者鋁陽極氧化處理產(chǎn)生，從而使沒有多少熒光光線可以穿過平板形的載玻片1，從而也不會再反射回下側(cè)4。由蓋玻片反射的光也由涂層6吸收。在涂層6的光學(xué)特性方面，這與圖1所述的載玻片染色相當。所述載玻片也可以是不透明的。
圖3所示為圖2的構(gòu)成形式的變形，其中吸收熒光的涂層6處在透明的載玻片1的體5的下側(cè)4上。其余部分與圖2的實施在意義上是相同的。
圖4示出基本上與圖3的載玻片相當?shù)妮d玻片1。然而，取代吸收熒光的涂層6的是在載玻片1的下側(cè)4上設(shè)有抗反射層7。這對于用于熒光分析的熒光團出現(xiàn)熒光發(fā)射性的整個頻帶來說是寬帶的。可選擇地，它們也可以是用于一或者多個在波長上典型的熒光團(例如，Cy3、C5、FGTC)的頻帶?？狗瓷鋵?的作用是，從上側(cè)2的熒光發(fā)射層3向平板形載玻片1入射的熒光，在下側(cè)4離開載玻片1而不反射回上側(cè)2。
圖5示出圖3的構(gòu)成形式的變型。在此在下側(cè)4上的涂層被復(fù)合結(jié)構(gòu)8替代，所述的復(fù)合結(jié)構(gòu)8由粗糙化的下側(cè)4和而后設(shè)置的熒光吸收層構(gòu)成。所述的粗糙化起把從上側(cè)2上的熒光發(fā)射層3射入的熒光在下側(cè)4上加以更加良好地吸收的作用；通過復(fù)合結(jié)構(gòu)8的粗糙化避免了各種情況下的反向漫射。頂多就出現(xiàn)散射的反向漫射，它可以達到較強地抑制在上側(cè)2上的照射強度。
所述的載玻片使在熒光顯微鏡上不用共焦映射成為可能，而不必因此承受在位置分辨率和測量靈敏度上的損失。因此所述載玻片優(yōu)選地用在非共焦的熒光顯微鏡中，如圖6所示意。這樣的熒光顯微鏡9一般地具有光源10，所述的光源10經(jīng)過激發(fā)照射光路12中鏡頭11為激發(fā)濾光器13照明。在此光源10是寬帶的光源，例如象鹵光燈或者弧光燈那樣的白熾光源。激發(fā)濾光器13只透射射入激發(fā)照射光路中的設(shè)計用于激發(fā)熒光的光譜部分。如果光源10采用窄帶的光源，例如激光或者LED時可以取消激發(fā)濾光器13。
激發(fā)光線入射在分光器14上，所述的分光器在激發(fā)波長范圍內(nèi)是反射性的。它把產(chǎn)生的激發(fā)光線引導(dǎo)到物鏡15上，從而照明載玻片1，所述的熒光發(fā)射層(圖1中未示)處在此載玻片1上。變通地，激發(fā)光也可以不由物鏡引導(dǎo)，而是斜向物鏡15的側(cè)面通過并射入到載玻片1中。
物鏡15接收發(fā)射到載玻片1上的熒光發(fā)射，并且把此熒光發(fā)射引導(dǎo)進觀測光路16中。其中分光器14構(gòu)成為能透射過熒光波長的輻射。通過發(fā)射濾光器17和鏡頭18把熒光光線映射到攝像機19上，例如CCD接收器上，所述的發(fā)射濾光器17起消除在觀測光路16中可能出現(xiàn)的激發(fā)光的作用。
盡管相對大面積地激發(fā)和映射熒光團，由于采用了設(shè)計以不把射入其上側(cè)的熒光反射回顯微鏡的載玻片，所以可以不出現(xiàn)光串擾。因此可以在熒光顯微鏡9中取消采用否則就必須使用的共焦映射，而不用承受位置分辨率或者測量靈敏度的損失。與共焦顯微鏡相比，通過較大面積地掃描載玻片1還可以明顯地提高測量速度。
所述的熒光顯微鏡可以用作生物芯片的專門的光讀出器。
圖7為經(jīng)測量顯微鏡的剖面圖，所述顯微鏡的載玻片確保不向顯微鏡物鏡15反射入射到載玻片中的熒光光線。為此，顯微鏡有由玻璃體制造的載玻片支撐塊20。所述的載玻片支撐塊20有上側(cè)21，上側(cè)上有折光層22，所述折光層22確保從熒光層3入射到載玻片1中的熒光光線不在上側(cè)21上反射。所述的折光層22例如可以采用油浸或者具有相似光學(xué)特性的有彈性的透明固體。所述的載玻片支撐塊20的下側(cè)23在第一變型中是反光地構(gòu)成的。從載玻片1射入所述的載玻片支撐塊20中的光線26由此受到偏轉(zhuǎn)并且作為光線27達到出光面24，從而不反射回載玻片1。如果不設(shè)反射膜層25，還可以設(shè)吸收層。在總體上，所述的載玻片支撐塊20與圖1至圖5為載玻片1所描述的情況相似；在那些圖中為了阻止熒光光線在上側(cè)21上反射所實施的可能性，都可以用在所述的載玻片支撐塊20上。特別是下側(cè)23不必須是對于上側(cè)21傾斜的，但為了構(gòu)成把光線26偏轉(zhuǎn)成向著出光面24的光線27，有必要采用傾斜的反射面25。
圖8和圖9為說明避免入射在載玻片上熒光光線向回反射的設(shè)想對位置分辨率及檢測靈敏度的影響的強度曲線圖。在此于圖8和圖9中把強度I一維地在座標X上表示。
圖8示出在出現(xiàn)返回反射時的強度曲線。這用曲線28表示?？梢钥吹剑瑹晒獍l(fā)射成分的實際寬度沿X方向為500個單位。這個寬度卻僅在約1200個強度單位或者更加高的強度閾值29的基礎(chǔ)上獲得。這里較高閾值29卻同時意味著靈敏度較低。有鑒于此，當然值得追求盡可能地大幅度降低強度閾值。然而在降低強度閾值29的同時卻降低了位置分辨率，這是因為對熒光發(fā)射范圍的寬度的感覺比實際要寬。例如如果選擇用30標示出的強度閾值，就會出現(xiàn)沿X方向上幾乎900個長度單位的寬度B。也就是說位置分辨率下降了近于一半。
如果如前所述，阻斷了入射在載玻片的上側(cè)的熒光光線的返回反射，就會得出圖9中曲線31所示的強度曲線。如圖所示，曲線31在0至500的長度單位上的上升緣比曲線28平緩得多。結(jié)果在較低的，強度單位為300的閾值30下測到校正的寬度B。從而在保持同樣的位置分辨率的情況下通過將強度閾值從500降低到300個強度單位從而把檢測極限降低了一半。這里甚至圖9的曲線31還不是在其吸收特性方面取其最優(yōu)化的原型下取得的。
權(quán)利要求
1.載玻片，特別是適用于熒光顯微或者生物芯片應(yīng)用的，不顯示自身熒光的，平板形構(gòu)成的載玻片，并且這種載玻片至少在一個平板側(cè)(4)有熒光吸收特性，或者設(shè)有熒光光線的抗反射層(7)。
2.如權(quán)利要求1所述的載玻片，其特征在于，具有玻璃體(5)，所述的玻璃體(5)在平板側(cè)(4)具有光吸收涂層，特別是涂黑色。
3.如權(quán)利要求1所述的載玻片，其特征在于，所述載玻片構(gòu)成為吸收熒光的實心體。
4.如權(quán)利要求1或3所述的載玻片，其特征在于，所述的載玻片具有熒光吸收物質(zhì)，特別地具有金屬氧化物。
5.如以上權(quán)利要求中任一所述的載玻片，其特征在于，所述載玻片在平板側(cè)(4)上對熒光光線散射地反射。
6.如以上權(quán)利要求中任一所述的載玻片，其特征在于，在平板側(cè)(4)上設(shè)有改善附著性的或者提高生物相容性的層。
7.一種把平板形構(gòu)成的，并且不把入射在平板側(cè)(2)上的熒光光線向此平板側(cè)(2)反射回來的載玻片，用于非共焦熒光顯微鏡(9)中的熒光顯微的方法。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，使用根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的載玻片。
9.熒光顯微鏡，具有載玻片支座(20)，所述載玻片支座(20)有上側(cè)(21)，在所述的上側(cè)(21)上可以支承載玻片(1)，并且不會把入射在上側(cè)(21)上的熒光光線反射回來。
10.如權(quán)利要求9所述的熒光顯微鏡，其特征在于，其載玻片支座(20)具有處在上側(cè)(21)對面的下側(cè)(23)，所述下側(cè)(23)不平行于上側(cè)(21)，特別是與上側(cè)(21)有大于或等于45度的夾角。
全文摘要
為了提高熒光發(fā)射層的位置分辨率及測量靈敏度，提出一種不顯示自身熒光的，平板形構(gòu)成的載玻片，并且所述載玻片至少在一個平板側(cè)有吸收熒光的特性，或者設(shè)有熒光光線的抗反射層。
文檔編號G02B21/16GK1434318SQ0310148
公開日2003年8月6日 申請日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月23日
發(fā)明者彼得·韋斯特法爾, 托比亞斯·諾伊曼, 馬丁·屈納, 迪特爾·格雷費 申請人:卡爾蔡司耶拿有限公司