專利名稱：用于控制聚合物微粒的溶質(zhì)載荷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種方法，其用于控制溶質(zhì)在液體連續(xù)相與固體分散相之間的分配，例如在染色粒子生產(chǎn)中。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
含有一種夾帶溶質(zhì)如染料的聚合物粒子被廣泛用作生物分子的標(biāo)記物，以及用作內(nèi)標(biāo)和校對標(biāo)準(zhǔn)，用于諸如流式血細(xì)胞計數(shù)的化驗(yàn)檢測方法。在生產(chǎn)熒光聚合物粒子的現(xiàn)有技術(shù)中已描述了四種常規(guī)的方法(A)染料和單體的共聚合；(B)水溶性或油溶性染料分配至預(yù)制粒子；(C)預(yù)制粒子的表面功能化；和(D)染料微滴的封裝。另外，也已將聚合方法應(yīng)用于制備核-殼粒子，也就是，由聚合物核和聚合物殼層組成的微粒。
A.依據(jù)共聚合的方法在熒光染料的存在下，用單體單元聚合以形成微粒，可合成熒光微粒。Rembaum(1982年)的美國專利4,326,008描述了通過功能化丙烯酸單體與可聚合熒光共聚單體的共聚合來合成熒光微粒。該方法通常需要可聚合染料分子。這種方法，通常遭遇這些缺點(diǎn)熒光染料導(dǎo)致聚合的可能抑制和/或聚合反應(yīng)的活性組分導(dǎo)致的熒光漂白。
Rembaum(1981年)的美國專利4,267,235描述了使用懸浮聚合法合成聚戊二醛微球。使用共增溶的異硫氰酸熒光素(FITC)制造熒光微球。該單體與共增溶染料分子的懸浮液縮合聚合，盡管大部分防止了染料破壞和聚合抑制，仍產(chǎn)生了較寬的粒徑分布，因此不是用于單分散熒光微球生產(chǎn)的適當(dāng)途徑。
Schwartz等(1991年)的美國專利5,073,498描述了一種通過種子聚合(seeded polymerization)制造熒光微粒的工藝。將一種或多種疏水熒光染料溶于含有單體和引發(fā)劑的溶液中。將該溶液加入預(yù)溶脹的微粒中。該專利公開了使三種不同染料導(dǎo)入粒子的方法。該方法遭遇這樣的缺點(diǎn)熒光染料導(dǎo)致聚合的可能抑制，或者相反聚合工藝導(dǎo)致熒光漂白。
多步乳液聚合已經(jīng)被利用以制備沒有表面官能團(tuán)的核-殼粒子。Kumaceheva等的美國專利5,952,131公開了一種用于制備染色核-殼粒子的方法。該方法是基于兩種單體(甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯)混合物和一熒光染料(4-氨基-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3二唑標(biāo)記的甲基丙烯酸甲酯)的多步半連續(xù)聚合。然后，該粒子在鏈轉(zhuǎn)移劑(十二烷基硫醇)存在下，通過甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯的共聚，用外殼層封裝。Kumaceheva等人沒有制備，也沒有作為目的獲得引入表面官能團(tuán)的核-殼聚合物產(chǎn)品。
Ober等人的美國專利4,613,559公開了一種通過溶脹制備著色調(diào)色劑的方法。在乙醇、聚(丙烯酸)、甲基溶纖劑(methylcellosolve)和過氧化苯甲酰的存在下，用苯乙烯的分散聚合制備聚苯乙烯粒子(5.5微米)。通過將該聚苯乙烯分散在十二烷基硫酸鈉和丙酮的水溶液中實(shí)現(xiàn)溶脹。通過將乳化的染料溶液(用十二烷基硫酸鈉水溶液乳化二氯甲烷中的Passaic油紅2144)加至該粒子分散體系來得到著色粒子。
聚合方法已經(jīng)被用于制備含有表面官能團(tuán)的核-殼粒子。Wang等人的美國專利5,395,688公開了包括用一層含磁響應(yīng)性金屬氧化物的聚合物層包覆的聚合物核的磁響應(yīng)熒光聚合物粒子。該最終的聚合物殼是用功能性單體來合成的，以便于與生物材料共價偶合。Wang等人的工序是基于三步(1)熒光核粒子的制備；(2)在沒有乳化劑但引發(fā)劑過量的條件下，通過自由基聚合，金屬氧化物被封裝在熒光核上形成的聚苯乙烯殼內(nèi)；和(3)用一層功能性聚合物包覆磁性熒光粒子。該功能性聚合物具有羧基、氨基、羥基或者磺酸基。Wang等人沒有描述獲得著色核的方法，而且也沒有說明在自由基聚合過程中染料破壞的問題。
Kraemer等人的美國專利4,829,101公開了通過核-殼聚合法得到2微米熒光粒子。所述的核是通過用過硫酸銨引發(fā)甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯的混合物于80℃聚合得到的。通過在第一步中半連續(xù)地加入含有熒光染料(氟-綠-金)的相同單體的混合物，在核上合成殼。直至反應(yīng)結(jié)束，在1個多小時的時段內(nèi)加入兩種不同的單體混合物第一種混合物，其含有甲基丙烯酸甲酯、乙二醇-雙-(甲基丙烯酸)酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯，第二種混合物，其含有甲基丙烯酰胺和引發(fā)劑。所述的聚合是用4，4′-偶氮雙-(氰基戊酸)引發(fā)的。
Okubo等Colloid Polym.Sci.269222-226(1991年)、Yamashita等Colloids and Surfaces A.，153153-159(1999年)以及美國專利4,996,265描述了通過種子分散聚合法生產(chǎn)微米級大小的單分散聚合物粒子。聚合物種子粒子在種子聚合前用大量的單體預(yù)溶脹。這種溶脹是通過緩慢、連續(xù)、逐滴將水加至含有種子粒子、單體、穩(wěn)定劑和引發(fā)劑的乙醇-水混合物來完成的。水的加入降低了單體在連續(xù)相的溶解度，導(dǎo)致單體沉淀和隨后吸收到該種子聚合物粒子上或進(jìn)入其中。這種被吸收到種子聚合物粒子內(nèi)的單體然后被聚合，以產(chǎn)生大量的單分散聚合物粒子。
B.水溶性或油溶性染料的分配根據(jù)最初由L.B.Bangs(《Uniform Latex Particles》；Seragen Diagnostics公司，1984年，40頁)描述的技術(shù)，通過使染料分子分配至預(yù)溶脹的微粒內(nèi)可生產(chǎn)熒光粒子。該工藝包括染料分子或染料分子混合物溶解于含有聚合物微粒的選擇溶劑或溶劑混合物中。微粒對該溶劑的吸收導(dǎo)致溶脹，使微粒吸收了一部分存在于溶劑混合物中的染料。該染色過程通常用除去溶劑來終止。染料分配的水平是通過調(diào)節(jié)染料的濃度，以及在多種染料的情況下，單個染料的相對豐度來控制的。以這種方式染色的微粒非常穩(wěn)定和均一。但是，在多數(shù)情況下，依賴于選擇的溶劑體系，需要大量的染料過量以獲得想要的分配，導(dǎo)致了昂貴的染料原料大量損失。
Haugland等(1998年)的美國專利5,723,218、Zhang等(1998年)的美國專利5,786,219、Brinkley等(1994年)的美國專利5,326,692和Singer等(1996年)的美國專利5,573,909描述了通過在有機(jī)溶劑和有機(jī)溶劑混合物中溶脹和染料分配以生產(chǎn)各種熒光染色粒子的方案。也描述了各種類型的熒光粒子，例如含有多種染料的熒光粒子、表現(xiàn)可控和提高斯托克司(Stokes)頻移的粒子以及顯示熒光球區(qū)的粒子。
Chandler等(1997年)的國際專利申請WO 99/19515描述了一種用兩種染料生產(chǎn)一系列編碼比率測量(ratiometrically-encoded)微球的改進(jìn)方法。其報道一種生產(chǎn)64種不同編碼微球的方案，也公開了使用有機(jī)溶劑與醇(在無水條件下)的混合物的溶脹浴組合物。
Matsudo等(1993年)的美國專利5,266,497描述了一種用溶于有機(jī)溶劑的疏水性染料在水中乳化以產(chǎn)生染料標(biāo)記聚合物粒子的方法。這種染色的粒子被用于免疫-色譜分析的目的。
Ober等(1986年)的美國專利4,613,559描述了用油溶性染料合成著色聚合物粒子。該公開的方法使用了二氯甲烷染料溶液在水和丙酮混合物中的乳液來著色微粒。
C.內(nèi)或外微粒表面的功能化通過表面功能化生產(chǎn)熒光粒子涉及一種或多種染料共價結(jié)合到在預(yù)制微粒表面上的活潑基團(tuán)。這樣就使得染料分子曝露于環(huán)境下，其能加速染料的分解。另外，表面功能化常常導(dǎo)致粒子表面非常疏水，引起不想要的非特異性吸收，以及，在有些情況下，安放在粒子表面之上或接近粒子表面的生物分子的活性喪失。將染色小粒子(代替染料分子)結(jié)合至載體粒子的表面，可防止這些問題。這種從少量的染料(編碼比率)產(chǎn)生大量的編碼粒子的方法功效還不清楚。
Shih(1984年)的美國專利4,487,855、Cheung(1993年)的美國專利5,194,300以及Schwartz(1988年)的美國專利4,774,189公開了通過將一種或多種染料共價結(jié)合至預(yù)制粒子表面的活潑基團(tuán)，來制備著色或熒光微球的方法。Battersby等，“通向較大的化學(xué)庫在組合化學(xué)中用熒光膠體編碼(Toward Larger Chemical LibrariesEncoding with Fluorescent Colloidsin Combinatorial Chemistry)”J.Am.Chem.Soc.2000年，122，2138-2139；Grondahl等，“編碼組合庫熒光硅膠的新應(yīng)用(Encoding CombinatorialLibrariesA Novel Application of Fluorescent Silica Colloids)”，Langmuir2000年，16，9709-9715；和Chandler等(2001年)的美國專利6,268,222描述了通過將一組較小的、被染色的聚合物粒子結(jié)合至載體微粒表面來生產(chǎn)熒光微球的方法。
D.封裝方法通過封裝形成熒光粒子利用了預(yù)聚物和一種或多種染料的溶液。在一種方法中，用振動噴嘴或噴射器使溶液以液滴的形式分散，而且將溶劑除去，以生產(chǎn)封裝染料的聚合物微粒。這個工藝需要特殊的工藝設(shè)備，而且顯示有限的產(chǎn)量?？蛇x擇地，將聚合物染料混合物在高沸點(diǎn)溶劑中乳化，并且將該溶液蒸發(fā)以得到聚合物封裝的染料粒子。這個工藝常常產(chǎn)生具有寬粒徑分布的非球形粒子。
Fulwyler等(1974年)的美國專利3,790,492公開了一種使用噴射器從預(yù)溶解聚合物和染料溶液中生產(chǎn)均一熒光微球的方法。Fulwyler等(1988年)的美國專利4,717,655公開了一種工藝，其包括在聚合物微粒中預(yù)指定比率的兩種染料，來生產(chǎn)5種可辨的雙色粒子。
生產(chǎn)熒光微粒的各種現(xiàn)有技術(shù)方法都存在某些缺點(diǎn)。當(dāng)使用強(qiáng)溶脹溶劑時，必須將微粒交聯(lián)以防止其在染料溶液中分解和變形。這種制約代表了嚴(yán)重的限制，原因是多數(shù)的染料需要它們以任何合理濃度溶解于溶劑體系中，在該溶劑體系中絕大多數(shù)感興趣的聚合物粒子，特別是聚苯乙烯，也會溶解。這些顧慮限制了將現(xiàn)有技術(shù)中的溶劑溶脹應(yīng)用于化學(xué)穩(wěn)定化(“交聯(lián)”)微粒。這種限制在微粒合成中引起了額外的難度和成本；高度交聯(lián)粒子常常極難于合成。同樣地，對交聯(lián)粒子的約束限制了微粒溶脹的程度以及染料結(jié)合的程度。特別是，在交聯(lián)微粒上實(shí)施現(xiàn)有技術(shù)的溶劑溶脹方案應(yīng)用，常常限制了染料滲透至微粒的外層，據(jù)此阻止了單個粒子的整個內(nèi)部體積均一染色，而且一般也阻止了高水平染料結(jié)合的實(shí)現(xiàn)。這就需要一種能利用非交聯(lián)以及交聯(lián)粒子的方法。就需要這樣一種方法，其將提供載有染料的非交聯(lián)聚合物微粒，其可以用于，例如制備具有包含不同染料和/或不同染料量的染色微粒庫。
在現(xiàn)有技術(shù)的基于溶劑溶脹的染料結(jié)合方法中，粒子溶脹程度決定了染料運(yùn)輸至粒子的速度。擴(kuò)散壁壘導(dǎo)致在微粒中的非均一染料分布?；诖嗽?，為了產(chǎn)生均一染色微粒群，需要劇烈的微量混合(通過有效機(jī)械混合或通過超聲波處理來實(shí)現(xiàn))。這些劇烈混合方法，盡管用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備是有效的，并非毫不費(fèi)力地適用于大規(guī)模。例如，超聲波常常需要特殊設(shè)備如探針超聲波儀(probe sonicators)，而且限制了多重染色反應(yīng)的平行完成。這就需要的是一種染色粒子制造的工藝，其要求很小的劇烈混合或者無混合，并且允許進(jìn)行平行染色反應(yīng)。
通過現(xiàn)有技術(shù)溶脹方法染色的微粒隨后易暴露于于溶劑下，這導(dǎo)致染料的大量損失，并且可能阻止了提供多重連續(xù)染料結(jié)合步驟的方案實(shí)施。
在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，染料分配至聚合物母體的程度是通過染料溶液中染料初始濃度明確變化來控制的。這種方法，當(dāng)允許實(shí)施多種、不同水平染料包覆時，遭遇大量的缺點(diǎn)。例如，高水平的染色經(jīng)常不能獲得，原因是染料在浴中有限的溶解度。即使當(dāng)溶解度不是主要問題時，許多染料的低分配系數(shù)需要在溶液中的染料過量，引起對隨后的生物分析檢驗(yàn)的毒害作用。事實(shí)上，當(dāng)通過現(xiàn)有技術(shù)溶劑-溶脹方法制備羧化物修飾的小球時，羧基功能可能不發(fā)揮作用，并且可能不再適用于通過共價偶合至其它化學(xué)基團(tuán)來功能化。另外，貴重的染料原料大量地?fù)p失。這就需要這樣一種工藝，其用于制備染色的微粒，特別是熒光微粒，即使從溶解性差的染料/溶劑配方中也可實(shí)現(xiàn)染料的結(jié)合。所需要的是這樣一種工藝，其允許在染色過程中準(zhǔn)確地控制在聚合物微粒內(nèi)的溶質(zhì)(染料)載荷水平。
發(fā)明概述根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)在聚合物微粒中的溶質(zhì)載荷的方法。該方法包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物可溶解于其中；(ii)至少一種第二溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者較差地溶解于其中，所述的第一和第二溶劑不混溶或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者較差地溶解其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶；(b)在指定體積的、含有至少一種第二溶劑和至少一種第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；
(c)將含有溶于所述第一溶劑的溶質(zhì)的溶液，加至所述的聚合物微粒懸浮液，由此，該溶質(zhì)被所述的微粒吸收；(d)通過在所述微粒懸浮液或者其小部分中控制所述溶質(zhì)和第二溶劑的相對濃度，以使所述溶質(zhì)從懸浮液液相至所述微粒的完全分配很少發(fā)生，來控制溶質(zhì)在所述聚合物微粒中的濃度。
根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，所選擇的第二溶質(zhì)濃度是通過將選擇量的至少一種第二溶劑加入特征為所述第一溶質(zhì)載荷濃度的微粒懸浮液，來實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)另一個具體實(shí)施方式
，通過將微粒懸浮液分成小部分，并將選擇量的第二溶劑加至所述的小部分，來提供多種選擇溶質(zhì)濃度的微粒小部分。
根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
，一種用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的溶質(zhì)載荷的方法包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者是較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者是較差地溶解其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶的；(b)在指定體積的、含有至少一種第二溶劑和至少一種第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；(c)將溶于所述第一溶劑中的溶質(zhì)的溶液加入所述的聚合物微粒懸浮液，由此，所述溶質(zhì)被所述的微粒吸收；和(d)將第二溶劑連續(xù)或半連續(xù)地加入所述的微粒懸浮液，以連續(xù)或半連續(xù)地調(diào)節(jié)所述的微粒溶質(zhì)濃度，并據(jù)此控制溶質(zhì)在所述微粒中的吸收和最終濃度。
在上述用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的溶質(zhì)載荷方法的一個具體實(shí)施方式
中，該方法進(jìn)一步包括在加入所述的第二溶劑的過程中、以一定時間間隔從所述懸浮液中除去至少一部分所述微粒的步驟，以提供至少兩個溶質(zhì)濃度不同的微粒組。
在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明是一種用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的染料負(fù)荷的方法，其包括(a)提供微粒，其特征為包含在所述微粒中至少一種染料的第一濃度，所述微粒懸浮于含有至少一種染料和一種溶劑體系的染料溶液中，所述溶劑體系包括(i)至少一種第一溶劑，所述染料和所述微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，所述染料和所述聚合物不能或者是較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，染料和該聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與所述第一和第二溶劑可混溶；(b)將一選擇量的所述第二溶劑加入所述的微粒懸浮液，以改變所述染料分配至聚合物微粒的量和在所述微粒中染料的濃度；和(c)培養(yǎng)微粒懸浮液一段時間，使得染料分配至微粒的量，對于在染料溶液中給定初始染料濃度的情況，通過被加至微粒懸浮液的第二溶劑量來控制。
另一個
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明是一種生產(chǎn)染色聚合物微粒的方法，包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，染料和微粒聚合物可溶解其中的；(ii)至少一種第二溶劑，染料和微粒聚合物不能或者是較差地溶解于其中，所述的第一和第二溶劑不混溶地或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，染料和微粒聚合物不能或者是較差地溶解于其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶；(b)在指定體積的、含有至少一種第二溶劑和至少一種第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；
(c)將含有溶于所述第一溶劑中染料的溶液加入所述的聚合物微粒懸浮液，由此，該染料被所述的微粒吸收，以提供在微粒中特征為所述染料第一濃度的微粒母料(master-batch)懸浮液；(d)從含有選定被加入量的第二溶劑的所述微粒母料懸浮液中，制備兩個或多個等分試樣(aliquots)，以改變在所述的等分試樣里分配至聚合物微粒的染料量；和(e)培養(yǎng)微粒懸浮液等分試樣一段時間，使得分配至微粒的染料量，對于在染料溶液中給定初始染料濃度情況下，通過被加至微粒懸浮液等分試樣的第二溶劑量來控制。
本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)染色聚合物微粒的自動方法。該方法包括(a)提供一種含有微粒的微粒母料懸浮液，其特征為以在微粒中第一染料濃度，懸浮于含有至少一種染料和一種溶劑體系的染料溶液中，該溶劑體系包括(i)至少一種第一溶劑，所述染料和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，所述染料和聚合物不能或者是較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶地或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，所述染料和聚合物不能或者是較差地溶解其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶；(b)從所述母料懸浮液中，制備兩個或多個微粒懸浮液等分試樣，每個這種懸浮液等分試樣，其特征為所述第一染料濃度的微粒被懸浮于所述的染料溶液；(c)每個制備的等分試樣至少一次，執(zhí)行下列順序的步驟，以轉(zhuǎn)換在每個等分試樣中的微粒染料狀態(tài)，從所述的第一染料濃度到選定的第二染料濃度(i)計算，對于選定的第二染料濃度(1)染料溶解在所述第一溶劑中的量，和(2)第二溶劑量，其為加入至所述等分試樣以獲得所述選定第二微粒染料濃度所需要的量；和
(ii)將溶于所述第一溶劑的染料量和要求的第二溶劑量分配至所述等分試樣，以獲得所述選定第二微粒染料濃度。
用于生產(chǎn)染色聚合物微粒的設(shè)備包括，運(yùn)行地連接至移液自動裝置的計算機(jī)，其中該計算機(jī)被編程以完成上述自動化方法。
制備所述含有選定加入量第二溶劑的兩種或多種微粒懸浮液等分試樣的步驟可包括，將微粒懸浮母料分成兩個或多個等分試樣，和加入選定數(shù)量第二溶劑至所述等分試樣。作為一種選擇，制備含有選定加入量第二溶劑的兩種或多種微粒懸浮液等分試樣的步驟也可包括，連續(xù)地或半連續(xù)地將第二溶劑加至微粒懸浮液母料，以及在第二溶劑加入過程中以一定時間間隔移除至少一部分該母料。結(jié)果是形成了含有選定加入量的第二溶劑的兩種或多種微粒懸浮液等分試樣。


圖1(a).是用于本發(fā)明的三元溶劑溶液示意1(b).是本發(fā)明一個具體實(shí)施方式
的步驟順序2.是根據(jù)本發(fā)明染料結(jié)合至溶劑浴中聚合物微粒的水平的三維圖，該水平是三個變量的函數(shù)。(X)是染料在浴中的質(zhì)量(代表染料的濃度，C(s)，乘以加入至浴的染料體積，V(s))除以微粒的體積，V(p)。(Y)是在浴中的微粒體積分?jǐn)?shù)，φ(P)，除以溶劑體積分?jǐn)?shù)φ(s)。(Z)是包含在微粒中的染料濃度，C(p)。因此，(Z)軸代表分配至微粒的染料質(zhì)量除以微粒的體積。粒子的體積分?jǐn)?shù)，φ(p)，以方程φ(p)＝(1-φ(s))給出。在(X，Z)平面的直線(P0)代表在沒有調(diào)諧溶劑(tuning solvent)條件下染料分配(作為X的函數(shù))至微粒。直線(P1)代表在調(diào)諧溶劑的體積分?jǐn)?shù)，φ，存在下染料分配至微粒(作為在浴中染料質(zhì)量(X)的函數(shù))。
圖3(a).是平行進(jìn)行本發(fā)明具體實(shí)施方式
的示意圖，用于從n溶劑體系/微粒懸浮液Bn生產(chǎn)熒光染色微粒的n亞群(Fn(Sn))。每個懸浮液含有指定數(shù)量Sn調(diào)諧溶劑。
圖3(b).是順序進(jìn)行本發(fā)明具體實(shí)施方式
的示意圖，用于從單一反應(yīng)生產(chǎn)熒光染色微粒的n亞群。[B]代表溶劑體系/微粒懸浮液的預(yù)培養(yǎng)母料，調(diào)諧溶劑的連續(xù)流輸入至其中。Fn(Sn)代表在時間t＝tFn時從母料移除的微粒懸浮液分?jǐn)?shù)。該分?jǐn)?shù)包括調(diào)諧溶劑的Sn數(shù)量。
圖3(c).是本發(fā)明一個具體實(shí)施方式
的示意圖，用于通過用順序和平行進(jìn)行的組合來生產(chǎn)熒光染色微粒的n亞群Fn(Sn)。[B]代表溶劑體系/微粒懸浮液的預(yù)培養(yǎng)母料，已知量的調(diào)諧溶劑，S(tF)，輸入至其中。然后，母料被分為n個不同的等分試樣，Bn，將n個不同指定數(shù)量的調(diào)諧溶劑，δSn，加入至其中。
圖3(d).是本發(fā)明一具體實(shí)施方式
的示意圖，用于通過用順序然后平行進(jìn)行、使用溶劑調(diào)諧和染料添加的組合來生產(chǎn)熒光染色微粒的mxn亞群Fm(Sm，Dn)。Sm表示調(diào)諧溶劑的數(shù)量，Dn為熒光染料被加至各種亞群Fm(Sm，Dn)的數(shù)量。
圖4.是根據(jù)下面的實(shí)施例1制備粒子收集的熒光圖。
圖5.是根據(jù)下面的實(shí)施例2制備粒子收集的熒光圖。
圖6(a).是熒光標(biāo)定曲線，其為對于溶于乙醇的綠色熒光染料，4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊酸琥珀酰亞胺酯，在發(fā)射波長512nm下的熒光強(qiáng)度相對于染料濃度繪制的圖。
圖6(b).是在粒子中捕獲的綠色熒光染料計算量變化圖，作為用于在實(shí)施例3-6的制備粒子中水體積分?jǐn)?shù)的函數(shù)。
圖6(c).是在粒子中捕獲的綠色熒光染料計算量變化圖，作為用于實(shí)施例3-6粒子綠色熒光染料強(qiáng)度的函數(shù)。
圖6(d).是作為Y函數(shù)(這里，Y＝(1-φs)/φs)的綠色熒光染料的分配系數(shù)變化圖。
圖7.是根據(jù)實(shí)施例26制備粒子收集的熒光圖。
圖8.是根據(jù)實(shí)施例30制備粒子發(fā)射的熒光圖。
圖9.是根據(jù)實(shí)施例31制備粒子發(fā)射的熒光圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述溶質(zhì)在指定為1和2的兩個不混溶相之間的分布是由分配系數(shù)，K，決定的，K代表了在所述兩相中溶質(zhì)(N)平衡量的比率，即，K＝[N1/N2]。
本發(fā)明提供了調(diào)諧分配系數(shù)K的方法，K決定了溶質(zhì)在兩個基本不混溶相之間的分布，也就是，在液體連續(xù)相與分散的固相之間的分布，所述分散的固相包括被分散在該液體連續(xù)相內(nèi)的固體粒子。因此，本發(fā)明提供了用于在溶劑體系中將溶質(zhì)向聚合物微粒內(nèi)的控制導(dǎo)入。所述的溶質(zhì)可包括任何可被分配至聚合物微粒相的任何物質(zhì)，例如染料、顏料、藥物、催化劑、納米粒子，或者任何其他的需要載至聚合物微粒之上或進(jìn)入聚合物微粒內(nèi)的有用物質(zhì)。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，所述的溶質(zhì)是一種染料，并且以下通過染料(溶質(zhì))在兩種基本不混溶相，即總的預(yù)聚物微粒(相1)和均勻三元溶劑混合物(相2)之間的分配來說明本發(fā)明。所述的微粒包括固相。所述的溶劑混合物包括液相。所述的染料可以是任何能將想要的顏色或者想要的熒光給至聚合物微粒的物質(zhì)。因此，所述的染料可包括發(fā)色團(tuán)或者熒光團(tuán)。在所述微粒中結(jié)合的染料數(shù)量通過在給定初始染料濃度情況下調(diào)諧該三元溶劑混合物的組成來準(zhǔn)確地控制。如下面例證的，所述的方法能夠生產(chǎn)大量可辨的染料染色微粒，該微粒含有可再生的預(yù)定水平的染料，即“染料編碼”，具有染料含量的最小樣本內(nèi)變化。
本發(fā)明的方法因此引入溶劑組成作為一種新的控制參數(shù)，用以通過提供分配系數(shù)的定量(寬范圍的)調(diào)節(jié)來制備染色微粒，該分配系數(shù)確定了在染料浴和微粒之間的染料分布。特別是，在溶劑調(diào)諧下的染料分配系數(shù)K遵循下面的關(guān)系K＝a exp(bY)，這里Y＝(1-φs)/φs；φs表示溶劑的體積分?jǐn)?shù)；而(a)和(b)是常數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，染料編碼起因于改變粒子的染料載荷。關(guān)于包含在微粒中的染料，用“載荷”是指染料結(jié)合至微粒內(nèi)的數(shù)量和/或特征。所述的載荷可因此被選自下面的至少一個特性改變，(i)被結(jié)合染料的數(shù)量和(ii)被結(jié)合染料的同一性。編碼可因此采取的形式是改變作為不同組微粒之間的單個染料的數(shù)量，改變?nèi)玖系幕瘜W(xué)性質(zhì)(使用不同的染料或者染料的不同組合)，或者兩者。
根據(jù)本發(fā)明，用于制備染色微粒，特別是熒光染色微粒的均勻三元溶劑混合物圖示在圖1(a)中。#1號溶劑是一種對染料和聚合物(由此形成微粒)而言的強(qiáng)溶劑其。#2號溶劑，這里也視作“調(diào)諧溶劑”，是一種對染料和聚合物而言的弱溶劑或者非溶劑。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，#2號溶劑是一種水溶性溶劑，優(yōu)選水。#1號和#2號溶劑彼此不混溶或者部分混溶。第三種溶劑，#3號溶劑，是一種對染料和聚合物而言的弱溶劑或者非溶劑，但是用作對#1號和#2號溶劑的共溶劑，其中，它與#1號和#2號溶劑都是混溶的。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，#3號溶劑是一種醇。
現(xiàn)有技術(shù)的微粒染料結(jié)合的“溶脹”法受限于用于感興趣染料的可選用的溶劑范圍窄，通常需要使用交聯(lián)粒子。這些現(xiàn)有技術(shù)方法包括確定選用的溶劑(染料在該溶劑中以較寬的濃度范圍溶解)，和制備想要濃度的染料溶液。然后，該染料溶液與聚合物微粒接觸一段時間，以使染料滲透至微粒。
熒光粒子生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)溶脹法，遭遇了染料在染料浴中有限的溶解度。即便是染料的溶解度不是問題，用于聚合物的許多染料的低分配系數(shù)需要大大過量的貴重?zé)晒馊玖?，但是這些熒光染料被損失了。相對照的是，本發(fā)明生產(chǎn)了非常高染料含量的微粒，甚至是從溶解較差的染料/溶劑制劑。本發(fā)明的這個方面反映了這樣的事實(shí)，在浴中的染料可以通過溶劑調(diào)諧完全地消耗掉。
對照現(xiàn)有技術(shù)基于溶劑溶脹的方法，本發(fā)明的染料結(jié)合方法可等效用于非交聯(lián)以及交聯(lián)粒子的染色。用“交聯(lián)”來描述含有微粒的聚合物，是指這樣的聚合物，其中鏈被連接在一起以形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在聚合過程中，通過使用交聯(lián)劑可實(shí)現(xiàn)交聯(lián)，所述的交聯(lián)劑也就是具有兩個或多個能與在聚合物鏈上官能團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的試劑。也可通過聚合具有平均官能度大于2的單體來制備交聯(lián)聚合物。
本發(fā)明因此首次提供了由非交聯(lián)聚合物組成的載有染料的微粒。這是一個重大的改進(jìn)，原因是高交聯(lián)粒子常常是極難合成的。此外，不像許多現(xiàn)有技術(shù)粒子染色方法，依賴于強(qiáng)烈的混合物以在微粒的染料染色中實(shí)現(xiàn)均一化，本發(fā)明的方法僅需要適度的攪拌。這種適度攪拌只是為了保持粒子懸浮所需要的。這是對現(xiàn)有技術(shù)的方法重大的改進(jìn)，原因是強(qiáng)烈混合的那些方法需要特殊的設(shè)備，并且難于大規(guī)?；?br> 聚合物交聯(lián)通常約束了從交聯(lián)聚合物形成微粒的溶脹，并且也阻止了染料滲透至粒子中。結(jié)果是，染料被限于微粒的薄外層，以及限制了染料載荷。利用非交聯(lián)聚合物作微粒材料的能力首次允許染色聚合物微粒的生產(chǎn)，所述微粒的特征是非常均一的染料分布貫穿微粒的全部。所用的“非常均一”是指，在熒光成像的條件下染色粒子產(chǎn)生對稱的而且單峰的熒光強(qiáng)度圖。相對照地，表面染色粒子(這里，熒光劑被束縛在表面或者靠近表面的淺層區(qū))產(chǎn)生對稱的但是雙峰熒光強(qiáng)度圖。
在有些情況下，在微粒中可能想要得到一種控制的非均一染料分布。在微粒相染料已經(jīng)與液相染料達(dá)到平衡之前，通過從染色浴除掉微粒不能實(shí)現(xiàn)完全的染料滲透。染料滲透的程度是由在染色浴中的微粒培養(yǎng)時間決定的。在平衡前，從所述的浴除去微粒導(dǎo)致對稱的但是雙峰的熒光強(qiáng)度圖。粒子熒光強(qiáng)度圖的形狀，特別是強(qiáng)度峰的位置，是預(yù)平衡培養(yǎng)時間的函數(shù)。因此，在染色浴中的微粒培養(yǎng)時間為微粒編碼提供了進(jìn)一步的維數(shù)。在使用相同的染料時，通過改變在染色浴中微粒培養(yǎng)的時間，可產(chǎn)生各種熒光強(qiáng)度圖的微粒組。也可利用多重染料來提供甚至更多的編碼。
根據(jù)本發(fā)明，染料結(jié)合至微粒的數(shù)量通過調(diào)節(jié)涉及聚合物的染料比率，以及調(diào)節(jié)染料浴的組成來控制。特別是，并且對照現(xiàn)有技術(shù)的方法，三元溶劑體系其中一種成份即調(diào)諧溶劑的體積分?jǐn)?shù)是便于改變的，以控制染料在溶劑和含有微粒的聚合物之間的分配。不同于現(xiàn)有技術(shù)的方法，本發(fā)明在染料選擇和溶劑體系配方方面提供非常大的機(jī)動性。使用多組分溶劑體系實(shí)現(xiàn)了非常大的染料分配控制。如以下詳細(xì)闡述的，本發(fā)明的方法利用分配系數(shù)K對溶劑組成的指數(shù)關(guān)系，并據(jù)此得到了比現(xiàn)有技術(shù)“溶脹”法可取得的更大的染料結(jié)合控制?，F(xiàn)有技術(shù)的方法簡單地改變在浴中的初始染料濃度，而不是調(diào)諧分配系數(shù)，并據(jù)此取得了在微粒的染料容量中成比例的變化(比例常數(shù)就是分配系數(shù)K)。
圖2比較了在改變?nèi)玖戏峙渲辆酆衔镂⒘５那闆r下的本發(fā)明溶劑調(diào)諧方法與現(xiàn)有技術(shù)的溶脹法。點(diǎn)X1(1)，X2(1)和X3(1)各自代表在該溶劑體系中的染料質(zhì)量除以包含在體系內(nèi)的微粒體積。點(diǎn)Z1(1)，Z2(1)和Z3(1)各自代表染料結(jié)合至微粒的相應(yīng)濃度。染料結(jié)合至微粒的水平是線性相關(guān)(線P0)于在溶劑體系中的染料質(zhì)量，線的斜率是分配系數(shù)K的函數(shù)。因此，可以看出，現(xiàn)有技術(shù)的溶劑溶脹法限制了用于制備染色微粒的拋射線于XZ平面。只有通過明顯地改變?nèi)軇┰〕跏既玖蠞舛?用于設(shè)定量的微粒染色)，可獲得多重亞群的著色微粒，以在染料結(jié)合至粒子載荷的水平方面產(chǎn)生相應(yīng)比例的變化。
相對照地，本發(fā)明引入溶劑組成作為一個新的變量，以控制生產(chǎn)多種染色微粒的工藝。通過對圖2的思考，可看出，本發(fā)明提供了全部額外參數(shù)空間(Y)的維數(shù)，通過在一個三維參數(shù)空間(XYZ)內(nèi)允許拋射線來制備染色微粒。例如，從組成Z1(1)，Z2(1)和Z3(1)出發(fā)，獨(dú)特粒子亞群表現(xiàn)為準(zhǔn)確定義的，而且通過圖2所示的非線性運(yùn)行曲線來制備可預(yù)測水平的染料結(jié)合Z1(2)，Z2(2)和Z3(2)。在任何固定溶劑組成(固定Y)下，Z和X彼此以線性方式相關(guān)(線OP1，表示具有調(diào)諧溶劑體積分?jǐn)?shù)的溶劑組成＝φ)。
因此，在圖2的三維參數(shù)空間XYZ中任意點(diǎn)可以沿著一個多重拋射線來逼近。反過來，每個拋射線允許以可預(yù)測的方式制備多重亞群染色微粒。本發(fā)明的方法，通過在熱力學(xué)平衡決定的領(lǐng)域內(nèi)運(yùn)行和提供對這些拋射線的定量表達(dá)，允許合理的設(shè)計方案以制備多重亞群染色微粒。
在不希望被任何理論限制下，本發(fā)明的操作，其用于控制溶質(zhì)(染料)在液體連續(xù)相和分散固相(微粒)間的分配，可通過下面的數(shù)學(xué)關(guān)系予以描述。
方程Z＝G(X，Y)決定了體系從第一狀態(tài)，{X1，Y1，Z1}，到想要的第二狀態(tài){X2，Y2，Z2}的轉(zhuǎn)變，這里，在分散(微粒)相中溶質(zhì)(染料)地濃度(Z)是溶質(zhì)濃度(X)和溶劑組成(Y)的函數(shù)。想要的第二狀態(tài){X2，Y2，Z2}是，根據(jù)方程Z＝G(X，Y)，通過按規(guī)定的方式調(diào)節(jié)X和Y，從多種可能的、從給定第一狀態(tài)可得到這種第二狀態(tài)中選擇出來的。這種關(guān)系是由變量(X)、(Y)和(Z)決定的，將其定義如下X＝C(S){φ(S)/φ(P)}Y＝{φ(P)/φ(S)}Z＝C(P)
這里φ(P)＝{V(P)/(V(P)+V(S))}＝粒子相的體積分?jǐn)?shù)φ(S)＝(1-φ(P))＝溶劑相的體積分?jǐn)?shù)C(S)＝平衡時在溶液相中的溶質(zhì)濃度C(P)＝平衡時在粒子相中的溶質(zhì)濃度V(P)＝粒子相的體積V(S)＝溶劑相的體積溶質(zhì)(染料)在粒子相(P)和溶劑相(S)之間分布是由分配系數(shù)K決定的K＝{N(P)/N(S)}這里，N(P)是平衡時溶質(zhì)分子在粒子相中的數(shù)目，和N(S)是平衡時溶質(zhì)分子在溶劑相中的數(shù)目。
因此，在狀態(tài)1中分配系數(shù)K的值為K1＝N(P)1/N(S)1以及在狀態(tài)2中分配系數(shù)K的值為K2＝N(P)2/N(S)2應(yīng)用下列的質(zhì)量平衡方程，NT1＝NT2溶質(zhì)的總量(1)N(P)1+N(S)1+ΔN(S)1＝NT1在狀態(tài)1時溶質(zhì)的總數(shù) (2)N(P)2+N(S)2＝NT2在狀態(tài)2時溶質(zhì)的總數(shù) (3)這里，NTi是在狀態(tài)i時溶質(zhì)分子的總量(數(shù)目)，N(S)i時在狀態(tài)i時被加入到溶劑相的額外溶質(zhì)分子的數(shù)目，導(dǎo)致下列的迭代方程X2＝{(1+K1)/(1+K2)}X1+{1/(1+K2)}ΔX1(4)Y2＝Y(jié)1+ΔY1(5)Z2＝{(1+K1-1)/(1+K2-1)}Z1+{1/(1+K2-1)}ΔX1(6)在保持變量Y為常數(shù)特殊情況下，即，單獨(dú)通過加入溶質(zhì)從狀態(tài)1轉(zhuǎn)變至狀態(tài)2，所以K1＝K2，得到下列方程Z2＝Z1+{1/(1+K-1)}ΔX1(7)此外，Z對X和Y的關(guān)系是以Z＝K(Y)X的形式得到。分配系數(shù)K對Y的關(guān)系反映了這樣的事實(shí)，向溶劑相加入調(diào)諧溶劑削弱了溶劑溶解溶質(zhì)的能力，并因此使得溶質(zhì)重新分布至可用的分散相。特別是，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析支持下列的函數(shù)公式K＝a exp(bY)(8)這里，a和b是常數(shù)，這是從分析如在圖6d中表示出的數(shù)據(jù)確定的。
因此，本發(fā)明提供一組實(shí)現(xiàn)想要的狀態(tài)轉(zhuǎn)換的有效規(guī)定。特別是，全部系列的第二狀態(tài)可通過單一的第一狀態(tài)轉(zhuǎn)換來產(chǎn)生。
上述的轉(zhuǎn)換方程，特別是以如這里提供的它們的迭代形式，便于使用個人計算機(jī)和標(biāo)準(zhǔn)自動化移液裝置(“遙控設(shè)備”)以分配必需計量的、染料或其它溶質(zhì)以及調(diào)諧溶劑的等分試樣，促進(jìn)自動化生產(chǎn)收集的染料修飾微粒。使用以任何標(biāo)準(zhǔn)編程語言，如BASIC或C，開發(fā)的應(yīng)用軟件，以評價所述的迭代轉(zhuǎn)換方程。編程計算機(jī)需要染料和調(diào)諧溶劑的等分試樣。因此，使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室儀器控制界面如GPIB協(xié)議的和標(biāo)準(zhǔn)軟件開發(fā)環(huán)境如LabView(國家工具)，來控制移液遙控設(shè)備計量和分配這些必需的等分試樣。例如，使用如這里公開的母料，染色微粒組是易于制備的，利用這樣的體系和通過執(zhí)行下列的步驟分配一種或多種母料的等分試樣來制造第一狀態(tài)的懸浮液，計算染料和染料溶劑的必需量來得到想要的第二狀態(tài)的懸浮液，分配所述必需量的溶質(zhì)和染料溶劑，以及允許轉(zhuǎn)化發(fā)生。如需要可重復(fù)這些步驟。
通過現(xiàn)有技術(shù)溶脹法來著色官能團(tuán)修飾微粒，可對官能團(tuán)的完整性有不利地影響。如下面實(shí)施例28示例的，官能團(tuán)修飾粒子可根據(jù)本發(fā)明的方式來染色，而不損失官能團(tuán)的完整性。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地利用可用的信息，來根據(jù)這里描述的溶解度參數(shù)選擇微?；瘜W(xué)、溶劑和染料，用于實(shí)施本發(fā)明。
從本發(fā)明的工藝描述，這是很顯然的，如果能得到或制造穩(wěn)定分散的聚合物粒子的穩(wěn)定分散體，可利用任何的聚合物來提供聚合物粒子。材料可包括均聚物或者共聚物，后一術(shù)語是指不僅包括兩個單體單元形成的聚合物，也包括三個或多個單體單元形成的聚合物，有時定義為“三元聚合物”。優(yōu)選疏水性聚合物。聚合物含有乙烯基類單體，也就是含乙烯基基團(tuán)，最特別優(yōu)選苯乙烯基團(tuán)的單體，是特別優(yōu)選的。一組優(yōu)選的聚合物包括聚苯乙烯，或者含有從約50％至約100％重量份的苯乙烯單體單元的聚苯乙烯共聚物。所述的聚合物任選地可以是交聯(lián)的或非交聯(lián)的。在一具體實(shí)施方式
中，微粒是由用1％二乙烯基苯(基于微粒的重量)交聯(lián)的聚苯乙烯形成的。在另一具體實(shí)施方式
中，微粒含有苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物，該共聚物基于微粒的重量，含有從約0.6至約1％的甲基丙烯酸。
適合的聚合物材料包括下列單體的聚合物，以示例而非限制的方式丙烯酸或其任意的酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、2-乙基丙烯酸己酯或者丙烯酸縮水甘油酯；甲基丙烯酸或其任意的酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂醇酯(1aurylmathacrylate)、甲基丙烯酸十六烷醇酯、甲基丙烯酸十八烷醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、四甘醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯或者N，N-(甲基丙烯酰氧羥丙基)-(羥烷基)氨基乙基氮雜環(huán)丁酮酰胺(N，N-(methacryloxy hydroxy propyl)-(hydroxy alkyl)amino ethylamidazolidinone)；烯丙酯如甲基丙烯酸烯丙酯；衣康酸，或者其酯；巴豆酸，或者其酯；馬來酸，或者其酯，如馬來酸二丁酯，馬來酸二辛酯或者馬來酸二乙酯；苯乙烯，或者其取代的衍生物如乙基苯乙烯、丁基苯乙烯或者二乙烯基苯；含有胺官能度的單體單元，如甲基丙烯酸羥二甲氨基乙酯或甲基丙烯酸丁氨基乙酯；含酰胺官能度的單體如丙烯酰胺或者甲基丙烯酰胺；含乙烯基的單體如乙烯醚；乙烯硫醚；乙烯醇；乙烯酮；乙烯鹵代物如氯乙烯；乙烯酯，如乙酸乙烯酯或柯赫酸乙烯酯(vinyl versatate)；乙烯腈類，如丙烯腈或甲基丙烯腈；亞乙烯鹵化物，如二氯乙烯和二氟乙烯；四氟乙烯；二烯烴單體，如丁二烯和異戊二烯；和烯丙醚，如烯丙基縮水甘油醚。
含包括乙烯基單體的特別優(yōu)選的均聚物和共聚物，包括聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚(羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯基甲苯)和聚(二乙烯基苯)。
適合的聚合材料可包括下列聚合物，以示例而非限制的方式聚氧化物，如聚(環(huán)氧乙烷)和聚(環(huán)氧丙烷)；聚酯，如聚(對苯二甲酸乙二酯)；聚氨酯；聚磺酸鹽(polysulfonate)；聚硅氧烷，如聚(二甲基硅氧烷)；聚硫化物；聚乙炔；聚砜；聚磺酰胺；聚酰胺如聚己內(nèi)酰胺和聚己二酰己二胺；聚亞胺(polyimin)；聚脲；雜環(huán)聚合物如聚乙烯吡啶和聚乙烯吡咯烷酮；天然聚合物如天然橡膠、明膠、纖維素；聚碳酸酯；聚酸酐；和聚烯烴如聚乙烯、聚丙烯和乙烯-丙烯共聚物。
所述的聚合物材料可含有官能團(tuán)如羧基、酯、氨基、醛、醇或者鹵素，這些提供了用于化學(xué)或者生物殘基結(jié)合的位點(diǎn)，以此提高粒子在化學(xué)或生物分析中的實(shí)用性。從這些聚合物制備微粒的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的。用于制備微粒以及交聯(lián)微粒的代表性程序?qū)⒃谙旅嬷苽鋵?shí)施例中提出。
本發(fā)明的方法也可用于核-殼微粒的染色。核-殼微粒包括一個一種或多種核聚合物的中心核和一個含有所述核的一種或多種殼聚合物的殼。所述的聚合物殼可以任何聚合物涂層技術(shù)形成。如果殼形成聚合物比核形成聚合物顯示更高的極性或更低的界面張力，那么核-殼形態(tài)是熱動力學(xué)上占優(yōu)的。如果殼形成聚合物的體積分?jǐn)?shù)比核形成聚合物的大，那么核-殼形態(tài)也是占優(yōu)的。因此，以殼/核的重量比大于1，實(shí)現(xiàn)核-殼粒子的合成。在有些具體實(shí)施方式
中，核聚合物是疏水性的，而殼聚合物是相對的親水的并帶有感興趣的官能團(tuán)。
用于核聚合物，苯乙烯和比苯乙烯更親水的單體(例如甲基丙烯酸)的共聚物，比聚苯乙烯均聚物更優(yōu)選。該共聚單體用于降低核的疏水性，以及使其與親水性殼聚合組分更兼容。
在這些約束內(nèi)，任何單體或單體的組合可被選作殼聚合物。優(yōu)選乙烯基單體的混合物。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
，使用一種作為主要成份的甲基丙烯酸甲酯和作為較少成份的甲基丙烯酸羥乙酯以及甲基丙烯酸的單體混合物，以在聚苯乙烯或改性的聚苯乙烯核上形成殼。一種這樣的單體混合物組成為，以重量比，約6％甲基丙烯酸羥乙酯，從約5％至約20％的甲基丙烯酸，其余為甲基丙烯酸甲酯。這些單體比聚苯乙烯更親水。
為了最終的用途，可適當(dāng)?shù)剡x擇微粒的大小。代表性地，粒子直徑的大小為從約0.1至約100微米，更具代表性地，從約0.5至約50微米，甚至更具代表性地，從約2至約10微米。優(yōu)選地，微粒為“單分散的”，即，一組中的微粒具有窄的粒度范圍，優(yōu)選顯示平均直徑的變化系數(shù)(“CV”)不大于約5％的。
根據(jù)已知的方法，在染色前或之后，通過結(jié)合適宜的磁性材料可使微粒產(chǎn)生磁響應(yīng)。根據(jù)一種這樣的方法，用鐵磁流體來充滿粒子，例如根據(jù)實(shí)施例19制備的鐵磁流體。所用的“磁響應(yīng)”是指適應(yīng)應(yīng)用的磁場而改變位置或方位的能力。
所述的染料可包括賦予視覺的、或機(jī)器可觀察的顏色或者熒光的任何的染料。所述的顏色或熒光用肉眼或者借助顯微鏡或其它光學(xué)儀器是可檢測的。優(yōu)選的熒光染料是苯乙烯染料，如對-二(鄰甲基苯乙烯基)苯；焦甲烷(pyromethane)染料如熒光綠染料4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊酸琥珀酰亞胺酯和熒光橙染料4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸琥珀酰亞胺酯；和香豆素染料如甲氧基香豆素。優(yōu)選的那些熒光染料具有發(fā)射波長在從約400nm至約1000nm的范圍內(nèi)。當(dāng)使用一種以上的染料時，可選擇這樣的染料，使它們具有實(shí)質(zhì)上不同的吸收譜、發(fā)射譜或者發(fā)射半衰期。
根據(jù)一
具體實(shí)施例方式
，微粒含有聚苯乙烯聚合物或共聚物，而且染料是疏水性染料。可能選擇的溶劑，例如，從表1。
表1用于聚苯乙烯微粒和疏水性染料組合的候選溶劑

利用極性、水溶性染料的代表體系由在三元溶劑體系中的聚(環(huán)氧乙烷)微粒組成，所述的三元體系包括作為#1號溶劑的水；作為#2號溶劑的己烷；和作為#3號溶劑的二氧六環(huán)。
從上面表中列出的溶劑和標(biāo)準(zhǔn)溶劑混溶性圖表，根據(jù)本發(fā)明，可設(shè)計多個三元溶劑體系，用于組合聚苯乙烯聚合物或共聚物和疏水性染料。例如，可將疏水性染料溶質(zhì)溶解于液相中，并接觸固體聚合物相，所述的液相包括水(調(diào)諧溶劑，#2號溶劑)、醇(共溶劑，#3號溶劑)和二氯甲烷(染料溶劑，#1號溶劑)的均勻三元混合物，所述的固體聚合物相包括聚苯乙烯或聚苯乙烯共聚物微粒。染料分配系數(shù)K，其決定了染料在聚合物相中相對于在三元溶劑混合物中的相對豐度，K隨著液相中調(diào)諧溶劑的體積分?jǐn)?shù)增加而增加，相應(yīng)地，隨著染料溶劑或溶劑的體積分?jǐn)?shù)減少而減少)。除了公開的水/醇/二氯甲烷三元體系之外，其它代表性三元體系包括，例如，水/丙酮/二氯甲烷。
為了示例的目的，已經(jīng)描述了本發(fā)明，如含有每一個的#1號溶劑、#2號溶劑和#3號溶劑，它們的特征已在上面描述了。盡管如此，可能通過包括在每個類別中一種以上的溶劑來實(shí)施本發(fā)明。例如，溶劑混合物可含有單個#1型的溶劑、兩個#2型的溶劑和單個#3型的溶劑。
本發(fā)明的微?？杀还δ芑园ɑ瘜W(xué)的或生物的實(shí)體如，例如，核酸及其片斷，包括智能配體(aptamers)、蛋白質(zhì)、肽和小的有機(jī)分子。使用現(xiàn)有技術(shù)已知的工藝，例如，共價偶合反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)這些分子的結(jié)合。參見，如G.T.Hermanson，《生物共軛技術(shù)》(Bioconjugate Techniques)(學(xué)會出版社(Academic Press)，1996年)和L.Illum，P.D.E.Jones，《在酶學(xué)中的方法》(Methods in Enzymology)112，67-84(1985年)，其全部公開的內(nèi)容被引入這里作為參考。根據(jù)檢驗(yàn)的興趣，可選擇這些實(shí)體。這些檢驗(yàn)的實(shí)例被公開在PCT/US01/20179和美國專利號6,251,691，這里，全部地將其加入作為參考。
在圖1(b)中，以圖表的形式概述了本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
的方法。首先，在任選的穩(wěn)定劑存在的條件下，用含有#2號溶劑和#3號溶劑的溶劑溶液培養(yǎng)微粒，以形成懸浮液。該穩(wěn)定劑的作用是防止微粒懸浮液的去穩(wěn)定化。代表性的穩(wěn)定劑包括聚合物，特別是聚合醇，如聚乙烯醇；聚合氧化物，如聚環(huán)氧乙烷；聚乙烯聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；聚合酸，如聚丙烯酸。其它代表性的穩(wěn)定劑包括離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉和Aeroso OT；和非離子表面活性劑，如聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯和聚乙二醇叔-辛烷基苯基醚。穩(wěn)定劑的濃度可從大約0％至約2％的范圍，以與溶劑/微粒懸浮液的重量比。
優(yōu)選地，對所述的懸浮液進(jìn)行緩慢地攪拌。通常在室溫進(jìn)行培養(yǎng)，只要微粒的完整性不會被不利地影響，并且溶劑的組成保持穩(wěn)定，也可利用較高的溫度或較低的溫度。為了使任選的穩(wěn)定劑吸收到微粒上，而進(jìn)行培養(yǎng)。這種必需的預(yù)培養(yǎng)時間將根據(jù)溶劑和微粒的組成而改變，并可被相應(yīng)地選擇。
在上面首次培養(yǎng)步驟之后，然后將溶解在染料溶劑(#1號溶劑)中的染料加至微粒懸浮液。為了產(chǎn)生可檢測的染料信號，應(yīng)當(dāng)加入足量的染料，以確保染料結(jié)合達(dá)到想要的水平。通常在室溫完成培養(yǎng)，但是，也可使用較高或較低的溫度。為了使染料溶劑(#1號溶劑)滲透至微粒，而進(jìn)行第二次培養(yǎng)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將第一步的培養(yǎng)粒子與#2號溶劑、#3號溶劑和任選穩(wěn)定劑(s)的混合物組合，然后是第二步加入溶解在#1號溶劑的染料，實(shí)質(zhì)上減少了在著色步驟中對強(qiáng)烈機(jī)械或聲波混合的需要，而這是現(xiàn)有技術(shù)方案必需的。在著色過程中，所述的粒子僅需要適度的攪拌以保持它們懸浮。這是一個重大的改進(jìn)，原因是強(qiáng)烈混合需要特定的設(shè)備，并且難于規(guī)?；?。
根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，將在微粒懸浮液中染料的濃度選自這樣的范圍，從大約1μg/g的粒子至大約100μg/g的粒子，基于該粒子懸浮液的重量。在有些應(yīng)用中，根據(jù)溶劑溶液和微粒的組成，在這個范圍之下或之上的濃度也是合適的。
然后，將一定量的調(diào)諧溶劑慢慢地加入以利于染料分配至微粒，同時將懸浮液慢慢地攪拌。選擇調(diào)諧溶劑的體積分?jǐn)?shù)，φ，以沿著在圖2中的拋射線得到想要的終點(diǎn)組成。
應(yīng)當(dāng)以控制速度加入調(diào)諧溶劑，以維持在懸浮液中的相穩(wěn)定性。所用的“相穩(wěn)定性”是指這樣的情形，其特征是存在基本均勻的溶質(zhì)(染料)和液相混合物。在相穩(wěn)定的條件下，染料保持溶解在溶液相中同時被結(jié)合至微粒。染料不從溶劑中沉淀出來。相穩(wěn)定性進(jìn)一步的特征為不存在液-液相分離。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法，必須實(shí)現(xiàn)染料完全吸入微粒相，以便于基于在溶劑浴中的初始染料量和微粒的體積，產(chǎn)生確定的微粒染料載荷。在這些方法中，必須知道準(zhǔn)確的染料載荷水平，以確保發(fā)射的染料信號是在用于檢測這種信號的儀器的動態(tài)范圍內(nèi)。當(dāng)準(zhǔn)備構(gòu)建粒子庫，以及不同粒子組將通過相同染料的不同載荷來分辯的時候，染料載荷的準(zhǔn)確檢測是非常重要的。因此，必須監(jiān)測染料結(jié)合的水平直至在懸浮液連續(xù)相中染料不再明顯，表示實(shí)質(zhì)上所有的被導(dǎo)入系統(tǒng)的染料已經(jīng)被微粒相吸收。
根據(jù)本發(fā)明，通過調(diào)節(jié)加入到微粒懸浮液的調(diào)諧溶劑的量，準(zhǔn)確地控制染料結(jié)合到微粒的數(shù)量，這可用上面討論地迭代方程來確定。染料載荷的預(yù)選定水平可明確地給出，即使不存在染料完全分配至微粒相的情況下。涉及溶質(zhì)(例如染料)所用的“完全分配”是指這樣的狀態(tài)，其特征是溶質(zhì)基本完全地從液相攝入微粒相，并且染料基本完全地不存在液相中。因此，監(jiān)測染料從微粒懸浮液的液相遷移至微粒相的狀況，以確保體系中的所有染料已經(jīng)被微粒吸收，是沒有必要的，原因是完全染料吸收不是控制染料載荷的關(guān)鍵。
應(yīng)當(dāng)將在染色浴中微粒的懸浮液培養(yǎng)一段時間，以提供染料至微粒的非常均一的分配。
為了完成這個過程，將微粒懸浮液離心分離，并任選地沖洗微粒，再懸浮于合適的緩沖液中，代表性地，含有任選的表面活性劑的水溶性緩沖液。得到的微粒含有一組包含預(yù)測定的、特定染料數(shù)量的著色粒子，使得粒子從給定的組鑒別開來。
根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，以平行的方式，可生產(chǎn)含有不同水平被結(jié)合染料的聚合物微粒亞群。將預(yù)算量的調(diào)諧溶劑加入至被預(yù)培養(yǎng)在染料溶液中的微粒懸浮液的獨(dú)立等分試樣中。根據(jù)本發(fā)明，通過調(diào)諧溶劑的最終體積分?jǐn)?shù)和在懸浮液中初始的染料濃度，來決定染料分配至微粒的水平。這種方法被示例在圖3(a)，這里各種預(yù)培養(yǎng)等分試樣被表示為Bn。各自量的、被導(dǎo)入每個等分試樣的調(diào)諧溶劑以Sn表示，在每批中相應(yīng)得到的粒子亞群以Fn(Sn)代表。
根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
，可以連續(xù)的方式生產(chǎn)含有不同水平染料的聚合物微粒亞群。在連續(xù)或半連續(xù)的將調(diào)諧溶劑加入到在染料溶液中的微粒懸浮液的過程中，在不同的經(jīng)歷時間里，從在染料溶液中的母料微粒懸浮液，撤出等分試樣。在“半連續(xù)”添加調(diào)諧溶劑的情況下，短時間內(nèi)中止該過程，例如，以允許從批中取出微粒樣品的操作。在連續(xù)經(jīng)歷時間(tFn)內(nèi)收集的部分懸浮液Fn(Sn)，含有相應(yīng)地不同量的溶劑Sn以及從相同的母料中生產(chǎn)多個亞群染色粒子。這些對應(yīng)于染料結(jié)合水平的亞群將產(chǎn)生相應(yīng)地不同的熒光強(qiáng)度。這個方法被示例在圖3(b)，這里，[B]表示預(yù)培養(yǎng)母料，調(diào)諧溶劑的連續(xù)流輸入其中。Fn(Sn)分別是在連續(xù)經(jīng)歷時間tFn內(nèi)從母料收集的微粒懸浮液的部分。
作為選擇地，當(dāng)經(jīng)過一定的時間(tF)，中止了調(diào)諧溶劑的連續(xù)添加，而且著色微粒的懸浮液被分成兩個或多個等分試樣，用于通過溶劑調(diào)諧來調(diào)節(jié)最終染料含量。將選定量的調(diào)諧溶劑(δSn)加入至每個等分試樣，以在至少兩個等分試樣中產(chǎn)生不同水平的染料結(jié)合，每一個所述的水平是由在溶劑調(diào)諧期間加入的和加入至初始染料濃度的調(diào)諧溶劑的總量決定的。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，加入到每個等分試樣的調(diào)諧溶劑的選定量，可在一個或多個等分試樣中包括零，假設(shè)將一非零量的調(diào)諧溶劑加入到至少一個等分試樣。這種連續(xù)然后平行的處理方法被示例在圖3(c)。
連續(xù)和平行處理的其它變化是可能的。圖3(d)說明了一個組合了連續(xù)和平行處理的工藝，使用了溶劑調(diào)諧和染料濃度的直接調(diào)節(jié)。如圖3(d)所示，將調(diào)諧溶劑連續(xù)流輸入母料[B]。收集微粒懸浮液的小部分Fn(Sn)，其分別包括Sn量的調(diào)諧溶劑。然后將每一個小部分進(jìn)行單獨(dú)的標(biāo)注步驟，開始，例如加入第三種染料Dn，使微粒區(qū)別于以前相同的等分試樣。分別涉及染料D1，D2，…Dn的該標(biāo)注步驟產(chǎn)生了與每個等分試樣可區(qū)別的亞群Fm(Sm，Dn)。
源自每個等分試樣的微粒含有一組包括預(yù)確定的、特定量的一種或多種熒光團(tuán)(或發(fā)色團(tuán))，使得粒子從給定的組中鑒別出來。
通過有序的加入可區(qū)別的熒光染料溶液，本發(fā)明的方法可適于提供一個組合編碼微粒庫。根據(jù)任何一種可用的編碼變化，包括二進(jìn)制編碼，將該微粒編碼。優(yōu)選地，用二進(jìn)制編碼方法對該微粒進(jìn)行編碼，該方法允許原位解碼，例如WO 98/53093的方法，其全部公開的內(nèi)容被引入這里作為參考。
本發(fā)明的實(shí)施是通過下列非限制性實(shí)施例來說明的。
準(zhǔn)備性實(shí)施例1非交聯(lián)聚苯乙烯均聚物粒子將裝有回流冷凝器、入口-出口N2調(diào)節(jié)器和攪拌器的100ml圓底玻璃燒瓶放置在帶夾套的油浴中。將在43.3ml乙醇(Aldrich，200 proof，無水，99.5％)中的0.9475g聚乙烯吡咯烷酮(Aldrich，平均分子量大約29,000)的溶液和18.95g苯乙烯加入到燒瓶。為了除去游離氧，在輕攪拌(50-70rpm)下，用N2對體系吹洗半小時。然后，將溫度升至70℃，攪拌速度達(dá)到350rpm。通過加入10ml在乙醇中的2.4重量％2，2’-氮二異丁腈溶液，引發(fā)苯乙烯單體聚合。在反應(yīng)17小時后，將體系降至室溫。得到具有體積平均直徑4.1μm的單分散聚苯乙烯。單體轉(zhuǎn)化率為96.4％，并且最終膠乳的固體含量為27.9％。
準(zhǔn)備性實(shí)施例2非交聯(lián)共聚粒子應(yīng)用如準(zhǔn)備性實(shí)施例1的相同步驟，來制備含3％甲基丙烯酸的聚苯乙烯共聚物，用10.5g苯乙烯和甲基丙烯酸單體(3重量％甲基丙烯酸單體，基于全部的單體重量)混合物進(jìn)行反應(yīng)。得到單分散的粒子。最終轉(zhuǎn)化率為95.7％，粒徑3.2μm，膠乳含15.9％固體。該共聚物粒子具有2.45μm2/COOH基團(tuán)的排列區(qū)。
準(zhǔn)備性實(shí)施例3交聯(lián)共聚粒子將裝有回流冷凝器、入口-出口N2調(diào)節(jié)器和攪拌器的100ml圓底玻璃燒瓶放置在夾套的油浴中。將1.5g聚乙烯吡咯烷酮(如在準(zhǔn)備性實(shí)施例1中)、0.475g的磺基琥珀酸二辛酯鈉(Aldrich，98％)、53.5ml的乙醇(Aldrich，200proof，無水，99.5％)、9.405g苯乙烯和0.095g二乙烯苯(Aldrich，異構(gòu)體混合物，80％純度)加入燒瓶。用N2吹洗30分鐘，除去游離氧后，將溫度升至70℃。通過加入溶解在10ml乙醇中的0.095g 4，4’-偶氮雙(4-氰基戊酸)(Aldrich，75％)，引發(fā)聚合。在反應(yīng)27小時后，通過降至室溫來停止反應(yīng)。得到單分散粒子。單體轉(zhuǎn)化率為93％，并且粒子體積平均直徑為1.6μm。
準(zhǔn)備性實(shí)施例4非交聯(lián)核-殼粒子將裝有機(jī)械攪拌器、入口-出口N2吹洗和冷凝器的100ml三頸圓底燒瓶放置在70℃的恒溫的水浴中。將5.48g的含有12.3重量％聚苯乙烯單分散粒子(直徑為3.15μm)的膠乳加入燒瓶。將溶解于43.3ml蒸餾的去離子水中的0.009g十二烷基硫酸鈉和0.007g碳酸氫鈉的溶液加入這種膠乳中。以100rpm速度攪拌懸浮液，并在N2吹洗下達(dá)到70℃。當(dāng)反應(yīng)混合物的溫度穩(wěn)定時，加入在0.5ml蒸餾的去離子水中的0.0068g過硫酸鉀。通過用注射泵以0.01ml/分鐘的速度輸入0.676g的74％甲基丙烯酸甲酯、6％甲基丙烯酸羥乙酯與20％甲基丙烯酸的混合物，迅速開始反應(yīng)。在完成輸入(1.2小時)后，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，于70℃再攪拌2小時。然后，通過加入于1ml水中的0.0068g氫醌，使反應(yīng)停止，并迅速冷卻至室溫。得到2.75重量％固體的膠乳，該膠乳具有直徑為3.32μm的單分散核-殼粒子。表面羧基基團(tuán)排列面積為1.522/基團(tuán)。
實(shí)施例1 熒光綠非交聯(lián)微粒(染料/聚合物＝0.334mg/g)的合成在25ml三頸圓底玻璃燒瓶中，加入0.05g凈化的(1ml乙醇、三輪次的離心(6500rpm，室溫)和再分散)并且非交聯(lián)的共聚物粒子，加入0.312ml如準(zhǔn)備性實(shí)施例2中制備的膠乳。將1ml十二烷基硫酸鈉溶液(“SDS”)(0.75重量％)、1.5ml為0.1％水溶液的聚(乙烯醇)(Aldrich，分子量85,000-146,000，水解等級87-89％)和4.75ml乙醇加入到粒子懸浮液。將含有0.0167mg熒光綠染料Bodipy FL C5 SE(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊酸琥珀酸亞胺酯，Mw＝417.22，分子探針)的0.0835ml二氯甲烷(Aldrich，99.9％)溶液加入到該混合物。最后，加入10.6ml蒸餾過的去離子水，并且再攪拌混合物2小時。然后將全部的混合物轉(zhuǎn)移至50ml塑料離心管中，以4500rpm離心1分鐘。除去上清液，用2ml乙醇沖洗含有染色珠的微球三次，并且最后再懸浮于2ml 0.2％的SDS溶液中。綠染料對聚合物的比率為0.334mg/g。用帶有電荷偶合元件(CCD)照像機(jī)和成像獲得軟件的Nikon熒光顯微鏡，檢測綠色熒光的強(qiáng)度和均一度。結(jié)果表示在圖4，為一離散的圖。每個點(diǎn)的縱坐標(biāo)代表相關(guān)單一粒子的綠色熒光的強(qiáng)度；沒有對數(shù)據(jù)進(jìn)行背景信/噪的校正。
實(shí)施例2綠色熒光交聯(lián)微粒(染料/聚合物＝1.667mg/g)的制備本實(shí)施例與實(shí)施例1相似，除了聚合物粒子具有交聯(lián)的結(jié)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)的規(guī)模增加了四倍之外。通過加入1ml乙醇和在6500rpm離心2分鐘，將含有0.2g交聯(lián)核-殼粒子(Bangs實(shí)驗(yàn)室公司，3.2μm，10％固體，12.5％二乙烯苯)的2ml膠乳乳化液凈化，除掉乳化劑。將這種操作重復(fù)3次。將凈化的聚合物粒子轉(zhuǎn)移至100ml圓底燒瓶，該燒瓶裝有6ml 1.0重量％聚乙烯醇水溶液，4ml 0.75重量％SDS水溶液和19ml乙醇。將1.5ml含有0.3334mg熒光綠染料Bodipy FL C5，SE的CH2Cl2加入該混合物。之后，加入53ml蒸餾過的去離子水。然后將粒子懸浮液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在真空(26.5Hg英寸)下除去溶劑，此時將溫度慢慢地升至40℃，然后至56℃，最后至63℃，用于除去有機(jī)溶劑。收集濃縮地染色懸浮液，并于6500離心2分鐘，棄去上清液。通過三輪的離心分離來沖洗微粒小球，并用5ml乙醇再懸浮。最后，將凈化染色珠再懸浮在2ml SDS 0.2重量％中，達(dá)到大約10％固體的濃度。綠染料對聚合物的比率為1.667mg/g。用帶有CCD照像機(jī)和成像獲得軟件的Nikon熒光顯微鏡，檢測綠色熒光的強(qiáng)度和均一度。結(jié)果表示在圖5，為一離散的圖。每個點(diǎn)的縱坐標(biāo)代表相關(guān)單一粒子的綠色熒光強(qiáng)度；沒有對數(shù)據(jù)進(jìn)行背景信/噪的校正。
實(shí)施例2A熒光綠染料編碼的交聯(lián)微粒庫(初始染料/聚合物濃度＝0.833mg/g)遵循實(shí)施例1的方法實(shí)施，除了綠色熒光染料在CH2Cl2溶液中的量是166.67mg和水輸入速度是21ml/小時之外。在加水的過程中，以30分鐘時間的間隔，提取四個分開的小部分。因此，順序運(yùn)行產(chǎn)生5個不同染色粒子群(在開始輸入水之前就收集一小部分)，提取具有獨(dú)特的平均熒光強(qiáng)度的每一個群，該強(qiáng)度是在該小部分加入水的數(shù)量的函數(shù)。根據(jù)在實(shí)施例1中所述的方法，分析這些粒子。將測得的每一類型染色粒子的綠色熒光強(qiáng)度值列于表1a。在表1a和這里的其它地方，“a.u.”是指任意單位的意思。
表1a在實(shí)施例2A中提取樣品的綠色熒光強(qiáng)度值

實(shí)施例2B用綠色和橙色熒光染料編碼的雙染色非交聯(lián)微粒庫(初始染料/聚合物濃度綠色染料/聚合物＝橙色染料/聚合物＝0.75mg/g)通過采用本發(fā)明的順序溶劑調(diào)諧方法，產(chǎn)生了一組可辨的用綠色和橙色熒光染料編碼的雙染色非交聯(lián)粒子，使用了下列的初始染料濃度綠色熒光染料/聚合物＝0.75mg/g；橙色熒光染料/聚合物＝0.75mg/g。根據(jù)上面實(shí)施例2A的方法，除了兩種熒光染料存在于初始的預(yù)培養(yǎng)懸浮液之外，收集三個分開的小部分。直至提取小部分時間所加入的水的數(shù)量和收集到不同小部分的微粒的平均強(qiáng)度，都表示在表1b表1b源自實(shí)施例2B的綠色和橙色熒光強(qiáng)度(輸入水的速度，26.5ml/h)

實(shí)施例3-6在制備綠色熒光交聯(lián)微粒中染料分配的分析根據(jù)在實(shí)施例2中的方案，以與實(shí)施例1的規(guī)模相比更小的規(guī)模，制備四種分開的綠色熒光著色的粒子制劑。加入水的各個量0.833ml，1.74ml，5.31ml和10.59ml，相應(yīng)的水體積分?jǐn)?shù)分別為0.398、0.463、0.623和0.738。在染料結(jié)合完成后，將染色粒子離心。保留上清液以確定，保留在溶液中綠色染料。因此，用醇稀釋(24×)各個等量的四種上清液，記錄熒光光譜。根據(jù)圖6(a)標(biāo)定曲線，用發(fā)射強(qiáng)度值(見表2)來計算保留在每個溶液中的綠色染料的濃度。計算綠色染料濃度結(jié)合至粒子的濃度，即在反應(yīng)中綠色染料的總初始量和保留在上清液中的量之間的差額。這些數(shù)值表示在表2。
表2染料分配明細(xì)

圖6(b)顯示了被結(jié)合染料含量的非線性變異，其作為水體積分?jǐn)?shù)的函數(shù)。
計算的被結(jié)合綠色染料含量也與熒光顯微儀記錄的、來自染色粒子的綠色熒光強(qiáng)度相關(guān)。在圖6(c)中的結(jié)果顯示線性相關(guān)。
6(d)顯示染料分配系數(shù)K對Y的繪圖。該曲線顯示特征的指數(shù)關(guān)系，其示例了，根據(jù)本發(fā)明通過調(diào)節(jié)溶劑組成來精細(xì)調(diào)諧染料結(jié)合。
實(shí)施例7含有綠色熒光染料的交聯(lián)粒子(染料/聚合物＝0.833mg/g)按照實(shí)施例2的方法實(shí)施，除了加入到粒子懸浮液的在CH2Cl2中的綠色染料溶液具有0.1mg/ml的濃度，以及實(shí)驗(yàn)是以一半的規(guī)模、在50ml燒瓶中進(jìn)行之外。因此，在染料溶液加入后，加入水的量為1.765ml。通過重復(fù)的離心和再分散，將染色粒子回收和沖洗。
實(shí)施例8-10含有綠色熒光染料的交聯(lián)粒子按照實(shí)施例7的方法實(shí)施，產(chǎn)生另外三個粒子組，除了水量分別是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
實(shí)施例11含有橙色熒光染料的交聯(lián)粒子(染料/聚合物＝0.334mg/g)按照實(shí)施例7的方法實(shí)施，除了染料是橙色Bodipy 558/568，SE(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸琥珀酰亞胺酯，Mw＝443.23，分子探針)之外。橙色染料在二氯甲烷溶液中的濃度為0.045mg/ml。在加入染料溶液后，加入水的量為1.765ml。橙色染料對聚合物的比率是0.833mg/g。橙色染料在二氯甲烷溶液中的濃度為0.045mg/ml。
實(shí)施例12-14含有橙色熒光染料的交聯(lián)粒子按照實(shí)施例11的方法實(shí)施，以產(chǎn)生另外三個粒子組，除了各自加入水的量分別為5.3ml、10.6ml和21.2ml。
實(shí)施例15含有綠色與橙色熒光染料1∶1摩爾比率的交聯(lián)粒子(綠色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.153mg/g)按照實(shí)施例7的方法實(shí)施，除外的是，代替一種染料，使用實(shí)施例7-14的綠色與橙色染料的等摩爾混合物。特別是含有兩種染料的二氯甲烷溶液具有綠色染料0.20mg/ml和橙色染料0.212mg/ml的濃度。
實(shí)施例16-17含有不同量綠色和橙色熒光染料的交聯(lián)粒子按照實(shí)施例15的方法實(shí)施，以產(chǎn)生另外兩個粒子組，除了各自加入水的量為5.3ml和21.2ml。
實(shí)施例18含有綠色與橙色熒光染料1∶0.5摩爾比率的交聯(lián)粒子(綠色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.765mg/g)按照實(shí)施例15的方法實(shí)施，除外的是，所用的綠色與橙色染料的摩爾比為1∶0.5。特別是，含有兩種染料的二氯甲烷溶液具有綠色染料0.20mg/ml和橙色染料0.10mg/ml的濃度。
實(shí)施例19-21含有綠色與橙色熒光染料的交聯(lián)粒子按照實(shí)施例18的方法實(shí)施，以產(chǎn)生另外三個粒子組，除外的是，加入水的量分別是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
實(shí)施例22含有熒光綠色與橙色染料0.5∶1摩爾比率的交聯(lián)粒子(綠色染料/聚合物＝0.150mg/g；橙色染料/聚合物＝0.765mg/g)按照實(shí)施例15的方法實(shí)施，除外的是，(a)所用的綠色與橙色染料的摩爾比為0.5∶1和(b)加入水的量為1.5ml。含有兩種染料的二氯甲烷溶液具有綠色染料0.10mg/ml和橙色染料0.212mg/ml的濃度。
實(shí)施例23-25含有綠色與橙色熒光染料的交聯(lián)粒子按照實(shí)施例22的方法實(shí)施，以產(chǎn)生另外三個粒子組，除外的是，加入水的量分別是5.3ml、10.6ml和21.2ml。
根據(jù)實(shí)施例7-25制備的著色粒子組，其熒光強(qiáng)度表示在表3。
表3作為初始染料濃度和加入水量函數(shù)的綠色與橙色強(qiáng)度


實(shí)施例26熒光編碼微粒庫的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例7-25，構(gòu)建一含有十九個熒光微粒組的庫。將十九組中十組匯合，并且使用帶有CCD照像機(jī)和成像獲得軟件的Nikon熒光顯微鏡，其可記錄綠色與橙色熒光，來記錄混合物的熒光圖像。在匯合中對應(yīng)于十組的十簇(clusters)顯示在圖7的分散圖(簇圖)中，在橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)上分別使用了橙色和綠色強(qiáng)度的對數(shù)單位。在表4中，概述了這些簇的分析結(jié)果。
表4簇平均強(qiáng)度和相應(yīng)的變異系數(shù)變化系數(shù)


實(shí)施例27編碼磁性粒子的制備A.水溶性鐵磁流體的合成制備在1N HCl中1M FeCl3和在1N HCl中2M FeCl2的備用溶液。在100ml的玻璃瓶中，將4ml的1M FeCl3和1ml的2M FeCl2溶液合并，將400ml的去離子蒸餾水和100ml的30重量％NH4OH混合，以得到500ml約1.7M的NH3水溶液。在劇烈攪拌下，將50ml的氨水溶液慢慢地加入裝有鐵鹽溶液的玻璃瓶。在完成這一步后，加入2ml的25重量％氫氧化四甲基銨溶液，將該溶液超聲波處理大約1小時。此后，允許將該鐵磁流體在磁場的作用下放置過夜。下一步，傾出上清液，并用蒸餾水沖洗沉淀。將在去離子水中的鐵氧化物納米粒子懸浮液均勻化，并允許在重力作用下放置過夜。經(jīng)過放置后，將沉淀棄去，并收集黑色的上清液作為最終的鐵磁流體懸浮液。
B.合成編碼磁性粒子根據(jù)這里描述的方法，制備相同染料含量和直徑大約3微米的染色聚合物微粒，以包含聚苯乙烯的核和甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)以及丙烯酸(MAA)殼。將粒子分散于去離子水中，以提供1ml的大約1％懸浮液。然后，將50微升鐵磁流體懸浮液的等分試樣加入到上述的懸浮液。用翻滾轉(zhuǎn)動(end-over-end rotation)來將懸浮液混合，48小時，室溫。將得到的溶液以大約200g離心分離10分鐘。將棕黃色粒子小球與含有大量納米粒子的棕紅色上清液分開。棄去上清液，并將小球再懸浮于1％SDS溶液中，再一次離心分離。重復(fù)這一步兩次，最終將小球再分散于含有0.5％吐溫-20的PBS緩沖液中。以一標(biāo)準(zhǔn)的1.5ml標(biāo)準(zhǔn)Eppendorf管，取1ml粒子懸浮液，并將這個管裝在Promega多管磁性臺架上。在大約10分鐘內(nèi)，發(fā)生懸浮粒子(如管壁上的小球)的完全分離。
實(shí)施例28抗生物素偶合至熒光編碼的、羧基功能化微粒的表面根據(jù)實(shí)施例1的方法將準(zhǔn)備性實(shí)施例4制備的羧基功能化聚合物微粒賦予熒光，以提供綠色熒光微粒(染料/聚合物＝0.334mg/g)。在一個2ml的小瓶中，將含有10mg綠色熒光微粒的等分試樣與1ml的10mM硼酸鹽緩沖液(pH＝8.5)混合。然后，用離心分離來分離該粒子，將上清液吸走。隨后，在0.1M MES緩沖液(pH＝4.5)中將分離到的小球沖洗2次，最后再懸浮在600μl同樣的溶液中。在一個單獨(dú)小瓶中，將3mg Neutravidin(一種生物素結(jié)合的蛋白，Pierce Chemicals，Rockford，IL)溶解于300μl的該MES緩沖液中，并且將該溶液緩慢地加入到聚合物微粒的懸浮液。用探針超聲波儀將該懸浮液進(jìn)行簡單地超聲波處理。然后，將150μl的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(Aldrich-Sigma，Milwaukee，WI)(EDAC)溶液(200mg/ml)加入該粒子溶液。使該混合物在室溫反應(yīng)2小時，此后，分離NeutrAvidin-功能化的聚合物微粒，在偶合緩沖液中沖洗一次、在硼酸鹽緩沖液中沖洗兩次，并且最終于2-8℃下再懸浮和儲存于貯藏緩沖液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)吐溫20，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及0.02％(w/v)NaN3)中。
實(shí)施例29抗生物素偶合至熒光編碼的、甲苯磺?；δ芑⒘５谋砻嬖诒緦?shí)施例中，使用商業(yè)上可獲得的交聯(lián)的、甲苯磺酰基功能化的熒光核-殼微粒(Bangs實(shí)驗(yàn)室公司，3.2μm，10％固體，12.5％二乙烯基苯)。該微粒包括載有大約0.3mg染料/g微粒的綠色熒光染料。用500μl 100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)將200μl含1％微粒的懸浮液沖洗3次，并再懸浮于500μl該緩沖液。隨后，加入20μl 5mg/ml NeutrAvidin并于37℃使反應(yīng)進(jìn)行，過夜。在完成培養(yǎng)后，用含有10mg/ml BSA的500μl PBS(pH7.4)沖洗該功能化粒子一次，再懸浮于500μl的該緩沖液中，并于37℃反應(yīng)1小時，以阻滯微粒表面未反應(yīng)的位點(diǎn)。在阻滯步驟之后，用含有10mg/mlBSA的500μl PBS(pH7.4)沖洗該微粒三次，并儲存于含有10mg/ml BSA的200μl PBS(pH7.4)中。
實(shí)施例30用熒光微粒進(jìn)行NeutrAvidin-生物素結(jié)合的檢驗(yàn)將100微升含有1％實(shí)施例28固體的NeutrAvidin-功能化熒光微粒放置于1.5ml小瓶中，并用900μl含有0.01％(w/v)吐溫-20(PBST)的PBS稀釋該懸浮液。用渦流來混合該微粒，然后離心分離。吸去上清液，將小球再懸浮于980μl的PBS中。加入20μl一定濃度(26.7ng/ml)的生物素-Oligo(dT)5-CY5.5(用熒光染料Cy5.5標(biāo)記oligo)(IDT，Coralville，IA)，而且將該混合物室溫培養(yǎng)30分鐘。在這之后，分離該微粒和在PBST中沖洗兩次，并再懸浮于1ml的PBST中。然后，將該微粒裝配在芯片上，通過直接測定生物素-Oligo(dT)5-CY5.5結(jié)合至NeutrAvidin-功能化粒子的量，來檢測它們表面的熒光。顯示在圖8中的結(jié)果表明了，使用本發(fā)明方法著色的兩種不同粒子(標(biāo)記為樣品)的生物素化(biotinylated)探針捕獲效率，以及用作正調(diào)節(jié)的非著色微粒的捕獲效率。
實(shí)施例31使用熒光微粒進(jìn)行雜化分析將生物素化并具有已知堿基序列的寡核苷酸附著到，用NeutrAvidin(如在實(shí)施例30中制備的)功能化的熒光編碼微粒，如下。將50微升含1％NeutrAvidin功能化微粒的溶液，置于0.1ml含有0.4μM生物素化寡核苷酸和約7×105微粒的反應(yīng)緩沖液(150mM NaCl，0.05M EDTA，0.5％牛血清清蛋白，0.5mM Tris-HCl，和100mM磷酸鈉，pH7.2)中。在渦流的條件下，將該反應(yīng)混合物室溫培養(yǎng)30分鐘。在完成反應(yīng)后，通過離心分離來收集粒子，用PBST(150mM NaCl，100mM磷酸鈉，pH7.2和0.05％Tween 20)沖洗三次，并再懸浮于0.2ml PBS(150mM NaCl，100mM磷酸鈉，pH7.2)中?？衫蒙鲜龇椒ǎ瑢⑷魏胃信d趣的生物素化寡核苷酸偶合到NeutrAvidin功能化微粒。
用19μl的1×TMAC(4.5M氯化四甲基銨，75mM Tris pH8.0，3mMEDTA，0.15％SDS)將1微升在去離子水中的10μM合成靶(5′-/CY5.5/SEQID NO1/-3′)溶液稀釋至20μl的最終體積。將兩種類型的寡核苷酸-功能化熒光微粒裝配至在硅基片上的平面陣列。用匹配的探針序列5′-生物素/(TEG間隔)/SEQ ID NO2/-3′，將第一種類型的微粒功能化。用錯配的探針序列生物素/(TEG間隔)/SEQ ID NO3/-3′)，將第二種類型的微粒功能化。將20微升的合成靶加入到基片的表面，并且將該基片置于53℃的加熱器中15分鐘、以30rpm搖動。然后，從加熱器中除去載片(slide)，吸取靶溶液。用1×TMAC在室溫沖洗基片一次。隨后，將10μl的1×TMAC放置在基片表面上，用玻璃蓋片覆蓋，并且使用上述的儀器記錄陣列的熒光強(qiáng)度。圖9中的結(jié)果表明雜化是特異性的。
實(shí)施例32用熒光微粒進(jìn)行免疫測定在本實(shí)施例中，使用商業(yè)上可獲得的交聯(lián)的、甲苯磺?；δ芑臒晒夂?殼微粒(Bangs實(shí)驗(yàn)室公司，3.2μm，10％固體，12.5％二乙烯基苯)。該微粒包括載有大約0.3mg染料/g微粒的綠色熒光染料。將1毫升PBST(pH7.4，含有0.1％吐溫-20的PBS)和50μL的1％著色的甲苯磺酰基功能化微粒(0.5mg)的懸浮液合并至eppendorf管中，并通過渦旋混勻。隨后，將該懸浮液以7500rpm離心分離2分鐘，并傾出上清液。用1mL的PBST重復(fù)該操作一次，以及用1mL的PBS重復(fù)一次。微粒最終被懸浮在1mL的PBS中。加入預(yù)算量的抗-TNF-α抗體(R&D Systems)，以50μg蛋白質(zhì)/mg微粒的濃度，并且用翻滾轉(zhuǎn)動來將懸浮液混合，室溫，過夜。然后，沖洗微粒，并再懸浮于1ml阻滯/貯藏緩沖液(含有0.1％BSA，0.1％吐溫20以及0.1％NaN3的0.1M PBS pH7.4)中。將10微升抗體-功能化微粒懸浮液置于1.5mL Eppendorf管中。用1mL的PBST沖洗該粒子兩次，以及用1mL的PBS(pH7.2)一次。通過加入1470μl的PBS(1∶50)，將30微升的Cy5.5標(biāo)記山羊抗小鼠IgG貯備溶液稀釋。將500微升的該溶液轉(zhuǎn)移至微粒懸浮液，并且通過翻轉(zhuǎn)混合來培養(yǎng)抗體-結(jié)合反應(yīng)，室溫，60分鐘。經(jīng)過培養(yǎng)之后，用1mL的PBST沖洗粒子兩次，然后再懸浮于10μl的PBS中。然后，將微粒的平面陣列裝配在硅基片上，用于如在實(shí)施例31中的分析。應(yīng)用如上所述的條件和儀器，記錄6,500的平均Cy5.5強(qiáng)度。
這里討論的所有文獻(xiàn)都引入作參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會很容易地認(rèn)識到，本發(fā)明適于很好地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)和獲得上述的結(jié)果與優(yōu)點(diǎn)，以及其中固有的那些。本發(fā)明也可以在沒有背離其精神或?qū)嵸|(zhì)特征的情況下，以其它特定的形式具體實(shí)施，因此，應(yīng)當(dāng)參照附后的權(quán)利要求書，而不是上面的說明書，來表示本發(fā)明的范圍。
序列表42970-2 PCSEQUENCE LISTING<110>BioArray Solutions，Ltd.
Banerjee，SukantaGeorgescu，CeciliaSeul，Michael<120>METHOD FOR CONTROLLING SOLUTE LOADING OFPOLYMER MICROPARTICLES<130>42970-2 PC<150>US 10/348,165<151>2003-01-21<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的溶質(zhì)載荷的方法，其包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者僅較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶；(b)在指定體積的、含有至少一種所述第二溶劑和至少一種所述第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；(c)將含有溶于所述第一溶劑溶質(zhì)的溶液，，加入所述的聚合物微粒懸浮液，由此，所述溶質(zhì)被所述的微粒吸收；(d)通過在所述微粒懸浮液或者其小部分中控制所述溶質(zhì)和所述第二溶劑的相對濃度，來控制在所述聚合物微粒中溶質(zhì)的濃度，以使很少發(fā)生所述溶質(zhì)從懸浮液液相完全分配至微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的溶質(zhì)是一種染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過將微粒懸浮液分成小部分，并將選定量的所述第二溶劑加入所述的小部分，來提供多種選定溶質(zhì)濃度的微粒小部分。
4.一種用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的溶質(zhì)載荷的方法，其包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者僅較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，溶質(zhì)和微粒聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與第一和第二溶劑可混溶；(b)在指定體積的、含有至少一種所述第二溶劑和至少一種所述第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；(c)將溶于所述第一溶劑中的溶質(zhì)溶液加入所述的聚合物微粒懸浮液，由此，所述溶質(zhì)被所述的微粒吸收；和(d)將所述第二溶劑連續(xù)或半連續(xù)地加入所述的微粒懸浮液，以連續(xù)或半連續(xù)地調(diào)節(jié)所述的微粒溶質(zhì)濃度，并據(jù)此控制溶質(zhì)在所述微粒中的吸入和最終濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其進(jìn)一步包括在加入第二溶劑的過程中、以一定時間間隔從所述的懸浮液中除去至少一部分所述微粒的步驟，以提供溶質(zhì)濃度不同的至少兩個微粒組。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的溶質(zhì)是一種染料。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的溶質(zhì)是一種染料。
8.一種用于調(diào)節(jié)聚合物微粒的染料負(fù)荷的方法，其包括(a)提供微粒，其特征為包含在所述微粒中至少一種染料的第一濃度，所述微粒懸浮于含有至少一種染料和一種溶劑體系的染料溶液中，該溶劑體系包括(i)至少一種第一溶劑，染料和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，染料和所述聚合物不能或者僅較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，染料和所述聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與所述第一和第二溶劑可混溶；(b)將一選擇量的所述第二溶劑加入所述的微粒懸浮液，以改變所述染料分配至聚合物微粒的量和在所述微粒中染料的濃度；和(c)培養(yǎng)微粒懸浮液一段時間，使得染料分配至微粒的數(shù)量，對于在染料溶液給定初始染料濃度情況，通過被加至微粒懸浮液的第二溶劑數(shù)量來控制。
9.一種生產(chǎn)染色聚合物微粒的方法，包括(a)提供(i)至少一種第一溶劑，染料和微粒聚合物是可溶解其中的；(ii)至少一種第二溶劑，染料和微粒聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶或者至多部分混溶；(iii)至少一種第三溶劑，染料和微粒聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與所述第一和第二溶劑可混溶；(b)在指定體積的、含有至少一種第二溶劑和至少一種第三溶劑的混合物中，形成所述聚合物微粒的懸浮液；(c)將含有溶于所述第一溶劑中染料的溶液加入所述的聚合物微粒懸浮液，由此，所述染料被所述的微粒吸收，以提供微粒的母料懸浮液，所述微粒特征為微粒中所述染料的第一濃度；(d)從含有選定加入量的第二溶劑的所述微粒母料懸浮液中，制備兩個或多個等分試樣，以改變?nèi)玖显谒龅牡确衷嚇永锓峙渲辆酆衔镂⒘５牧?；?e)培養(yǎng)微粒懸浮液等分試樣一段時間，使得染料分配至微粒的量，對于在染料溶液給定初始染料濃度情況下，通過被加至微粒懸浮液等分試樣的第二溶劑量來控制。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中制備所述兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣的步驟，包括將微粒懸浮液母料分成兩個或多個等分試樣，并將選定量的第二溶劑加入所述的等分試樣。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中制備所述兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣的步驟，包括連續(xù)地或半連續(xù)地將第二溶劑加入微粒懸浮液母料，并在所述第二溶劑加入的過程中、以一定的時間間隔除去至少一部分所述的母料，以形成兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的染料是一種熒光染料。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的染料是一種疏水性染料。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的染料選自苯乙烯基染料、pyrromethane染料、香豆素染料，以及它們的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的微粒包括一種疏水性聚合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的聚合物是一種含有具有乙烯基單體的均聚物和共聚物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，選自聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(乙烯基甲苯)、聚(二乙烯基苯)的均聚物或者共聚物及其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的聚合物是聚苯乙烯或者其含有至少50％重量苯乙烯單體單元的共聚物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的聚合物是一種苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的聚合物是交聯(lián)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的微粒具有直徑約0.1至約100微米。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的粒子是單分散的。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中存在于微粒懸浮液中的所述染料濃度為從約10μg/g至約100μg/g，基于所述微粒懸浮液的重量，所述微粒懸浮液是通過將所述的染料溶液接觸微粒形成的。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的含有一種溶劑的方法，其中所述第一溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二氧己環(huán)、環(huán)己烷、苯、甲苯、乙酸丁酯、低氯代脂肪烷烴以及它們的組合；所述的第二溶劑是水，和所述的第三溶劑選自丙酮、低級醇及其它們的組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的第一溶劑是二氯甲烷，和所述第二溶劑是醇。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的第三溶劑是醇。
27.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的微粒是一種含有一個中心核的核-殼微粒，所述中心核含有一個或多個被含有一種或多種殼聚合物的殼包圍的核聚合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的核聚合物包含苯乙烯和比苯乙烯更親水的單體的共聚物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的核聚合物包含甲基丙烯酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中至少一部分的所述微粒是磁響應(yīng)性的。
31.一種用于生產(chǎn)染色聚合物微粒的自動化方法，其包括(a)提供一種含有微粒的微粒母料懸浮液，其特征為微粒中第一染料濃度，所述微粒懸浮于含有至少一種染料和一種溶劑體系的染料溶液中，所述溶劑體系包括(i)至少一種第一溶劑，所述染料和微粒聚合物可溶解其中；(ii)至少一種第二溶劑，所述染料和聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第一和第二溶劑不混溶的或者至多部分混溶的；(iii)至少一種第三溶劑，所述染料和聚合物不能或者是僅較差地溶解其中，所述的第三溶劑與所述第一和第二溶劑可混溶；(b)從所述母料懸浮液，制備兩個或多個微粒懸浮液等分試樣，每個這種懸浮液等分試樣，其特征為所述第一染料濃度的微粒被懸浮于所述的染料溶液中；(c)每個制備的等分試樣至少一次，執(zhí)行下列順序的步驟，以轉(zhuǎn)換在每個等分試樣中的微粒染料狀態(tài)，在該微粒中從所述的第一染料濃度到選定的第二染料濃度(i)計算，用于選定的第二染料濃度(1)染料溶解在所述第一溶劑的量，和(2)第二溶劑的量，其為加入至所述等分試樣以獲得所述選定第二微粒染料濃度所需要的量；和(ii)將溶于所述第一溶劑的染料量和所需要的第二溶劑量分散至所述等分試樣，以獲得所述選定第二微粒染料濃度。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中制備所述兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣的步驟，包括將微粒懸浮液母料分成兩個或多個等分試樣，并將選定量的第二溶劑加入所述的等分試樣。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中制備所述兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣的步驟，包括連續(xù)地或半連續(xù)地將第二溶劑加入微粒懸浮液母料，并在所述第二溶劑加入的過程中、以一定的時間間隔除去至少一小部分所述的母料，以形成兩個或多個含有選定加入量第二溶劑的微粒懸浮液等分試樣。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的染料是一種熒光染料。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的染料是一種疏水性染料。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的染料選自苯乙烯染料、pyrromethane染料、香豆素染料，以及它們的組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的微粒包括一種疏水性聚合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中至少一部分的所述微粒是磁響應(yīng)性的。
39.一種用于生產(chǎn)染色聚合物微粒的儀器，其包括運(yùn)行地連接至移液自動儀的計算機(jī)，所述的計算機(jī)被編程以完成權(quán)利要求31的方法。
全文摘要
通過將微粒浸入含有溶于三元溶劑體系的選定溶質(zhì)的浴中，得到溶質(zhì)載荷的聚合物微粒。該三元體系的第一溶劑是一種對于溶質(zhì)和形成微粒的聚合物而言都強(qiáng)的溶劑。第二溶劑是一種對于溶質(zhì)和聚合物而言的弱溶劑或者非溶劑(調(diào)諧溶劑)。第三溶劑是一種對于溶質(zhì)和聚合物而言的弱溶劑或者非溶劑，但是用作共溶劑，對于第一和第二溶劑而言，其與第一和第二溶劑都是混溶的。通過調(diào)節(jié)溶質(zhì)相對于微粒聚合物的比率、和通過調(diào)節(jié)三元溶劑體系的組成，特別是調(diào)諧溶劑的數(shù)量，來控制溶質(zhì)結(jié)合至微粒的數(shù)量。本方法用于提供含有可辨染料載荷，特別是可辨熒光染料載荷的組合編碼微粒庫，是特別有用的。
文檔編號G03C1/12GK1761535SQ200480007017
公開日2006年4月19日 申請日期2004年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月21日
發(fā)明者蘇堪塔·本納吉, 賽希勒·喬治思古, 邁克爾·休 申請人:佰爾瑞溶液有限公司