專利名稱：物鏡和顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡，其中照明光和探測光均通過該物鏡傳導(dǎo)，而且在物鏡光瞳的平面上的照明光具有一個(gè)焦點(diǎn)。另外，本發(fā)明還涉及一種具有物鏡和光源的、尤其被用于短暫地照明樣品的顯微鏡，其中所述照明光優(yōu)選地利用相應(yīng)的物鏡而在所述物鏡光瞳的平面上具有一個(gè)焦點(diǎn)。
背景技術(shù)：
在全內(nèi)反射顯微鏡中，利用了光從光密介質(zhì)過渡到光疏介質(zhì)時(shí)的折射特性。因此，例如對(duì)于從蓋玻片(n1＝1.518)過渡到水(n2＝1.33)將產(chǎn)生61°的臨界角、也即全反射的角度。在全反射的條件下(角度≥61°)，在具有較小折射率的介質(zhì)內(nèi)形成一種短暫的駐波。該波的強(qiáng)度與離邊界面的間隔成指數(shù)下降。據(jù)此，離邊界面更遠(yuǎn)的熒光團(tuán)不會(huì)被激發(fā)。背面熒光被大大減少。在此情形下，圖像對(duì)比度被改善，同時(shí)分辨率也明顯被提高。利用上述現(xiàn)象的前提條件是，蓋玻片與介質(zhì)的折射率有足夠大的差。
在US 2002/0097489A1中已經(jīng)公開一種具有樣品暫時(shí)照明的顯微鏡。該顯微鏡包含一個(gè)白光源，其光線通過一孔隙光闌穿過顯微鏡物鏡被耦合輸入到承載樣品的載物臺(tái)上，以用于暫時(shí)照明。該照明光在載物臺(tái)內(nèi)通過全內(nèi)反射被傳播，其中樣品的照明只在從載物臺(tái)突出來的暫時(shí)區(qū)域的范圍內(nèi)進(jìn)行。這種顯微鏡以名稱TIRFM(全內(nèi)反射熒光顯微鏡)而被公知。由于伸入樣品內(nèi)僅僅約100nm的暫時(shí)區(qū)域，TIRFM的z分辨率非常良好。
DE 10108796A1公開了一種尤其用于TIRF應(yīng)用的高孔徑物鏡。該物鏡包括具有正折射率的第一透鏡和具有負(fù)折射率的第二透鏡，其中兩個(gè)透鏡的焦距比位于-0.4和-0.1的范圍，而且總折射率大于0。另外，該物鏡還包括兩個(gè)正透鏡，其外徑與焦距之比大于0.3且小于0.6。另外，該物鏡還包括一個(gè)負(fù)透鏡和一個(gè)會(huì)聚透鏡，其中所述負(fù)透鏡面對(duì)前組，而且所述負(fù)透鏡和所述會(huì)聚透鏡的焦距比在-0.5和-2之間。
在DE 10217098A1中公開了一種用于TIRF顯微鏡的入射照明裝置。該入射照明裝置包括一個(gè)照明源和一個(gè)偏轉(zhuǎn)裝置，所述照明源在工作時(shí)發(fā)出一被極化過的與光軸成一個(gè)角度進(jìn)行傳播的照明輻射束，所述偏轉(zhuǎn)裝置偏轉(zhuǎn)所述的照明輻射束并與光軸平行地將之耦合輸入到物鏡中。在該入射照明裝置中規(guī)定，由照明源發(fā)出的照明輻射束包括具有相差的s極化方向和p極化方向，并且由所述偏轉(zhuǎn)裝置反射所述照明輻射束x次，其中x＝(n×180°-d)/60°。
DE 10143481A1公開了一種用于TIRM(全內(nèi)反射顯微術(shù))的顯微鏡。該顯微鏡具有一個(gè)顯微鏡外殼和一個(gè)物鏡。從照明裝置發(fā)出的照明光可以通過一個(gè)能移入該顯微鏡外殼的適配器被耦合輸入。
US 2004/0001253A1公開了一種具有光學(xué)照明系統(tǒng)的顯微鏡，該系統(tǒng)能在暫時(shí)照明和反射照明之間進(jìn)行簡單的切換。該照明系統(tǒng)包括一個(gè)激光光源，其光線被耦合輸入到一個(gè)光纖中。另外還設(shè)有耦合輸出鏡組，其把從光纖出來的光線聚焦到顯微鏡物鏡的后部焦點(diǎn)上。所述的光纖可以在一個(gè)與顯微鏡物鏡的光軸垂直的平面上移動(dòng)。
DE 10229935A1公開了一種用于在顯微鏡中耦合輸入光線的裝置。那里，在明場光闌平面上通過一個(gè)被實(shí)施為閘門的光導(dǎo)纖維耦合輸入器把激光指到標(biāo)本上。該發(fā)明尤其適合于TIRF方法。
在電子光柵顯微鏡中，利用光輻射照明一個(gè)樣品，以便觀察從該樣品發(fā)出的作為發(fā)射光或熒光形式的探測光。照明光輻射束的焦點(diǎn)借助于可控的輻射偏轉(zhuǎn)裝置、通常是通過翻轉(zhuǎn)兩個(gè)反射鏡而在樣品平面內(nèi)移動(dòng)，其中偏轉(zhuǎn)軸大多數(shù)是相互垂直的，使得一個(gè)反射鏡在x方向偏轉(zhuǎn)，而另一個(gè)在方向上偏轉(zhuǎn)。反射鏡的翻轉(zhuǎn)例如借助于檢流計(jì)-調(diào)節(jié)元件來實(shí)現(xiàn)。來自于物體的探測光的功率根據(jù)掃描輻射的位置被測量。通常，所述的調(diào)節(jié)元件裝有用于測定當(dāng)前反射鏡位置的傳感器。特別是在共焦電子光柵顯微鏡中，物體是利用光輻射的焦點(diǎn)被三維地掃描的。
共焦電子光柵顯微鏡通常包括一個(gè)光源、一個(gè)用于將光源的光聚焦到孔眼光闌(所謂的激發(fā)光闌)上的聚焦鏡組、一個(gè)輻射分配器、一個(gè)用于輻射控制的輻射偏轉(zhuǎn)裝置、一個(gè)顯微鏡鏡組、一個(gè)探測光闌和用于檢測所述探測光或熒光的探測器。照明光通過一個(gè)輻射分配器被耦合輸入。來自于物體的熒光或發(fā)射光通過所述輻射偏轉(zhuǎn)裝置回到所述的輻射分配器，經(jīng)過該輻射分配器，以便隨后被聚焦到后面設(shè)有探測器的探測光闌上。該探測裝置被稱為DESCAN裝置。非直接來源于焦點(diǎn)區(qū)的探測光采取另一個(gè)光路，并且不經(jīng)過所述的探測光闌，使得獲得一種點(diǎn)信息，該點(diǎn)信息通過用所述照明光輻射束的焦點(diǎn)順序地掃描物體而產(chǎn)生三維的圖像。三維圖像大都通過逐層地獲取圖像數(shù)據(jù)來實(shí)現(xiàn)。
所述由現(xiàn)有技術(shù)公開的系統(tǒng)具有這樣的缺點(diǎn)在顯微鏡的光程中部分地需要非常昂貴且需要空間的鏡組，以便耦合輸入TIRF照明光。這不利地影響了尤其是探測光程，并經(jīng)常導(dǎo)致探測光功率的損耗。
如同在前面已經(jīng)講述的，這里圍繞的是顯微的TIRF檢查，其中以非常平的角度照明樣品，也即為了在樣品表面上產(chǎn)生全反射。在現(xiàn)有技術(shù)中，人們?yōu)榇瞬捎镁哂蟹浅４罂讖降奈镧R，以便實(shí)現(xiàn)大的照明孔徑。熒光激發(fā)通過激光源實(shí)現(xiàn)，其中激光被規(guī)則地投射到物鏡的瞳孔邊緣的一個(gè)點(diǎn)上。從現(xiàn)有技術(shù)還已經(jīng)知道，為熒光激發(fā)而采用氣體放電燈。在此，在照明光程的孔徑平面上安裝一個(gè)環(huán)形光闌，使得只有物鏡的瞳孔邊緣才被照明。
在迄今為止所實(shí)現(xiàn)的用于TIRF顯微術(shù)的技術(shù)中，缺點(diǎn)是需要極準(zhǔn)確地校準(zhǔn)偏轉(zhuǎn)鏡、光闌或類似物。為了消色差地投影物鏡光瞳中的孔徑光闌，需要被極好地校正的照明鏡組。因此，迄今為止是采用非常特殊的顯微鏡，其具有外部熒光照明和激光裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)在于給出一種實(shí)施簡單的用于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡，其可以被用于照明光和探測光的常規(guī)光程中。另外還應(yīng)該給出一種相應(yīng)的顯微鏡。
本發(fā)明的物鏡通過權(quán)利要求1的特征來解決上述任務(wù)。據(jù)此，形成前序部分的物鏡的特征在于在所述物鏡光瞳的附近或其平面上設(shè)置一個(gè)光闌，而且所述的光闌具有一個(gè)所述照明光不能透過而所述探測光能透過的中心區(qū)和一個(gè)所述照明光能透過的邊緣區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，穿越物鏡的樣品的暫時(shí)照明可以用建設(shè)性的簡單方式來實(shí)現(xiàn)，也即通過以下方式來實(shí)現(xiàn)在所述物鏡光瞳的附近或其平面上采取一種特殊的建設(shè)性措施，即設(shè)置一個(gè)特殊的光闌。所述的光闌被如此地構(gòu)造或設(shè)計(jì)，使得其具有一個(gè)所述照明光不能透過而所述探測光能透過的中心區(qū)和一個(gè)所述照明光能透過的邊緣區(qū)。換句話說，激發(fā)光在所述的中心區(qū)內(nèi)被阻擋，而只能在瞳孔邊緣通過，然后以一個(gè)平的角度輸入所述的樣品。來自于樣品的探測光、例如熒光可以通過全物鏡孔徑接收，因?yàn)樵撎綔y光能夠透過所述的中心區(qū)。在最簡單的情況下，也即對(duì)觀察孔徑?jīng)]有限制的情況下，所述的邊緣區(qū)同樣是可以透過該探測光的。
只要希望減小觀測孔徑，則有利的是，所述邊緣區(qū)不能透過該探測光，也即不能透過來自于樣品的熒光。通過該措施來進(jìn)行物鏡孔徑或觀測孔徑的減小。由樣品發(fā)出的熒光不能經(jīng)過所述的邊緣區(qū)，并相應(yīng)地在該邊緣區(qū)內(nèi)被阻擋。
以進(jìn)一步有利的方式，尤其是為了實(shí)現(xiàn)對(duì)稱的照明情況，阻擋照明光的所述光闌的中心區(qū)被構(gòu)造為圓形面。以進(jìn)一步有利的方式，該邊緣區(qū)緊接著所述圓形面的周圍，并圍繞所述圓形面延伸成環(huán)形面。根據(jù)上述的實(shí)施方案，該環(huán)形面可以透過所述的探測光(全物鏡孔徑)或不透過所述的探測光(減小的物鏡孔徑)。
在非常簡單的結(jié)構(gòu)的范疇內(nèi)，所述光闌的不同透射區(qū)-中心區(qū)和邊緣區(qū)-被實(shí)施為薄的、優(yōu)選被涂敷在一個(gè)透光載體上的層。所述的層可以被蒸鍍在所述的載體上。所述的層可以通過不同的光刻處理來產(chǎn)生。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的層是干涉層，由此得出一種依賴于波長的光學(xué)作用。因此，所述的層可以是多帶干涉層，使得同時(shí)可以產(chǎn)生多個(gè)熒光激發(fā)。這種設(shè)計(jì)有利于物鏡的通用性。
具體地可以想見，非常一般地采用一個(gè)玻璃表面作為所述層的載體。在此，所述的玻璃表面可以是被集成在物鏡中的小玻片的表面。同樣可以想見，一個(gè)透鏡的表面被用作所述層的載體，其中所述的透鏡在承載所述層的那一面上可以被修平。將所述的層涂敷到拱形的表面是也同樣是可以被想見的，由此可以達(dá)到類似的效果。
另外，所述層可以被構(gòu)造在所述載體的背向物體的一側(cè)，但也可以被構(gòu)造在所述載體的面向物體的一側(cè)，其中需要確保所述層被布置得靠近于物鏡光瞳的平面。
就本發(fā)明的顯微鏡而言，上述的任務(wù)通過權(quán)利要求15的特征來解決。據(jù)此，對(duì)于形成前序部分的具有物鏡和光源的顯微鏡，其尤其用于樣品的暫時(shí)照明，其中在物鏡光瞳的平面上的照明光具有一個(gè)焦點(diǎn)，其特征在于在所述物鏡光瞳的附近或其平面上設(shè)置一個(gè)光闌，而且所述的光闌具有一個(gè)所述照明光不能透過而所述探測光能透過的中心區(qū)和一個(gè)所述照明光能透過的邊緣區(qū)。
在此需要指出，本發(fā)明的顯微鏡使用了非常特別的物鏡，也即是一種根據(jù)權(quán)利要求15的特征組合的物鏡，優(yōu)選地是本發(fā)明的物鏡，也即具有與該物鏡有關(guān)的權(quán)利要求的特征的物鏡。為避免重復(fù)，在此省去了對(duì)與該物鏡有關(guān)的特征的單獨(dú)論述。
就本發(fā)明物鏡在本發(fā)明顯微鏡范疇內(nèi)的具體應(yīng)用而言，進(jìn)一步的改進(jìn)是有利的。重要所述顯微鏡在照明光程中布置有照明濾光器或激發(fā)濾光器，那么所述的照明濾光器可以與所述光闌或載體的邊緣區(qū)具有相同的涂層。因此，只有被規(guī)定用于激發(fā)的照明光-根據(jù)照明濾光器的設(shè)計(jì)-通過所述的照明濾光器，該照明光在物鏡內(nèi)可以經(jīng)過所述的邊緣區(qū)以暫時(shí)地照明樣品。因此，照明濾光器和光闌邊緣區(qū)之間的協(xié)調(diào)可以簡單地被實(shí)現(xiàn)。所述照明濾光器優(yōu)選地被布置在一個(gè)照明光闌(明場光闌)及必要時(shí)的鏡組與一個(gè)輻射分配器之間，優(yōu)選地是在平行定向的照明光的區(qū)域內(nèi)。
另外有利的是，在探測光程中在探測器之前布置一個(gè)探測濾光器。從樣品返回的、在物鏡中可能經(jīng)過光闌中心區(qū)的發(fā)射光穿過所述的輻射分配器到達(dá)該探測濾光器。優(yōu)選地，所述探測濾光器與所述光闌或載體的中心區(qū)具有相同的涂層，使得也在這一點(diǎn)上進(jìn)行協(xié)調(diào)。該探測濾光器還避免了不希望的散光達(dá)到探測器。觀測孔徑通過所述中心區(qū)的大小以及通過探測光不能穿過的所述邊緣區(qū)的大小來定義。
另外需要指出，所述探測光程中的探測濾光器可以被布置在所述輻射分配器和一個(gè)探測器之間的任何位置。
現(xiàn)在有不同的可能性用有利的方式來擴(kuò)展和改進(jìn)本發(fā)明的教導(dǎo)。為此，一方面可以參考位于權(quán)利要求1和14之后的權(quán)利要求，另一方面可以參考下面借助于附圖對(duì)優(yōu)選實(shí)施例的闡述。結(jié)合借助于附圖對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的闡述，也一般地闡述了該教導(dǎo)的優(yōu)選的擴(kuò)展和改進(jìn)。


在附圖中，
唯一的圖用示意的視圖示出了本發(fā)明物鏡的一個(gè)實(shí)施例，該物鏡位于同樣是根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的光程之中。
具體實(shí)施例方式
該唯一的圖示出了在同樣按照本發(fā)明的顯微鏡的光程2之中的本發(fā)明物鏡1的實(shí)施例，其中這里只示出了顯微鏡的單個(gè)組成部分。
照明光3來自于附圖沒有示出的激光光源，并且通過照明光闌4穿越使光線平行化的鏡組5，并在穿越照明濾光器6后到達(dá)輻射分配器7。
通過輻射分配器7使照明光3沿著光軸8偏轉(zhuǎn)以通過物鏡1。
物鏡1被簡化地示出，并且除了物鏡外殼9外還包括一個(gè)被示出的前透鏡10和另一個(gè)透鏡11。
物鏡光瞳的平面通過用附圖標(biāo)記12表征的箭頭給出。在這里所選的實(shí)施例中，在物鏡光瞳的平面上設(shè)有一個(gè)光闌13，其中所述光闌13具有一個(gè)照明光3不能透過而探測光14能透過的中心區(qū)15和一個(gè)照明光3能透過的邊緣區(qū)16。
由附圖未示出的樣品發(fā)出的熒光沿著光軸8穿過前透鏡10和所述的另一個(gè)透鏡11并且穿過玻璃體17，其中該玻璃體17以其平表面18用作為蒸鍍層19、20的載體。該層19、20最后形成所述的光闌13，其中發(fā)出的光、也即探測光14可以通過中心區(qū)15并在穿越那里的蒸鍍層19后從物鏡1中出來到達(dá)輻射分配器7，并在穿越該輻射分配器7后經(jīng)過一個(gè)探測濾光器21。探測光14從那里出來到達(dá)圖中未示出的探測器。
另外，在該單個(gè)的附圖中可以看出，照明濾光器6和探測濾光器21都被鍍膜，也即敷設(shè)有與在物鏡1的玻璃體17上所蒸鍍的層相同的層。因此，照明濾光器6具有與被蒸鍍在玻璃體7的邊緣區(qū)16中的層相同的蒸鍍層。
探測濾光器21具有與在玻璃體17的中心區(qū)所蒸鍍的層相同的蒸鍍層19。對(duì)于從該單個(gè)的附圖不能得出的其它特征和優(yōu)點(diǎn)信息，為避免重復(fù)可以參看說明書的一般部分。
最后需要非常特別地指出，上面解釋的實(shí)施例只是被用來說明需要保護(hù)的教導(dǎo)，但該教導(dǎo)并不局限于該實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.用于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡(1)，其中照明光(3)和探測光(14)通過所述物鏡(1)傳導(dǎo)，且在物鏡光瞳的平面上的照明光(3)具有一個(gè)焦點(diǎn)，其特征在于在所述物鏡光瞳的附近或其平面上設(shè)置一個(gè)光闌(13)，而且所述的光闌(13)具有一個(gè)所述照明光(3)不能透過而所述探測光(14)能透過的中心區(qū)(15)和一個(gè)所述照明光(3)能透過的邊緣區(qū)(16)。
2.如權(quán)利要求1所述的物鏡，其特征在于所述邊緣區(qū)(16)對(duì)于所述探測光(14)是不能透過的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的物鏡，其特征在于所述中心區(qū)(15)被構(gòu)造為圓形面。
4.如權(quán)利要求3所述的物鏡，其特征在于所述邊緣區(qū)(16)被構(gòu)造為直接圍繞所述圓形面延伸的環(huán)形面。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的物鏡，其特征在于所述光闌(13)的不同透射區(qū)(15，16)被實(shí)施為薄的、被涂敷在一個(gè)透光載體(17)上的層(19，20)。
6.如權(quán)利要求5所述的物鏡，其特征在于所述的層(19，20)被蒸鍍在所述的載體(17)上。
7.如權(quán)利要求5或6所述的物鏡，其特征在于所述的層(19，20)是干涉層。
8.如權(quán)利要求7所述的物鏡，其特征在于所述的層(19，20)是多帶干涉層。
9.如權(quán)利要求5-8之一所述的物鏡，其特征在于一個(gè)玻璃表面被用作所述層(19，20)的載體(17)。
10.如權(quán)利要求9所述的物鏡，其特征在于一個(gè)小玻片的表面被用作所述層(19，20)的載體(17)。
11.如權(quán)利要求9所述的物鏡，其特征在于一個(gè)透鏡的表面被用作所述層(19，20)的載體(17)。
12.如權(quán)利要求5-11之一所述的物鏡，其特征在于所述載體(17)在承載所述層(19，20)的那一面上被構(gòu)造成平的。
13.如權(quán)利要求5-12之一所述的物鏡，其特征在于所述層(19，20)被構(gòu)造在所述載體(17)的背向物體的一側(cè)。
14.如權(quán)利要求5-12之一所述的物鏡，其特征在于所述層(19，20)被構(gòu)造在所述載體(17)的面向物體的一側(cè)。
15.具有物鏡(1)和光源的顯微鏡，尤其用于優(yōu)選地利用權(quán)利要求1-14之一所述的物鏡進(jìn)行樣品的暫時(shí)照明，其中在物鏡光瞳的平面上的照明光(3)具有一個(gè)焦點(diǎn)，其特征在于在所述物鏡光瞳的附近或其平面上設(shè)置一個(gè)光闌(13)，而且所述的光闌(13)具有一個(gè)所述照明光(3)不能透過而所述探測光(14)能透過的中心區(qū)(15)和一個(gè)所述照明光(3)能透過的邊緣區(qū)(16)。
16.如權(quán)利要求15所述的顯微鏡，其中在照明光程(3)中布置有一個(gè)照明濾光器(6)，其特征在于所述的照明濾光器與所述光闌(13)或載體(17)的邊緣區(qū)(16)具有相同的涂層。
17.如權(quán)利要求16所述的顯微鏡，其特征在于所述照明濾光器(6)被布置在一個(gè)照明光闌(4)及必要時(shí)的鏡組(5)與一個(gè)輻射分配器(7)之間，優(yōu)選地是在平行照明光(3)的區(qū)域內(nèi)。
18.如權(quán)利要求15-17之一所述的顯微鏡，其中在探測光程中布置一個(gè)探測濾光器(21)，其特征在于所述探測濾光器(21)與所述光闌(13)或載體(17)的中心區(qū)(15)具有相同的涂層。
19.如權(quán)利要求18所述的顯微鏡，其特征在于所述探測光程中的探測濾光器(21)被布置在所述輻射分配器(7)和一個(gè)探測器之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡(1)，其中照明光(3)和探測光(14)通過所述物鏡(1)傳導(dǎo)，且在物鏡光瞳的平面上的照明光(3)具有一個(gè)焦點(diǎn)。所述物鏡(1)的特征在于在所述物鏡光瞳的附近或其平面上設(shè)置一個(gè)光闌(13)，而且所述的光闌(13)具有一個(gè)所述照明光(3)不能透過而所述探測光(14)能透過的中心區(qū)和一個(gè)所述照明光(3)能透過的邊緣區(qū)(16)。另外本發(fā)明還涉及具有本發(fā)明物鏡(1)的顯微鏡。
文檔編號(hào)G02B21/00GK1828357SQ200610019819
公開日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日
發(fā)明者A·韋斯, M·岡澤 申請(qǐng)人:萊卡微系統(tǒng)Cms有限責(zé)任公司