專利名稱：可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)及成像方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光顯微以及內(nèi)窺成像領(lǐng)域。具體涉及通過(guò)可留置的熒光顯微 內(nèi)窺成像系統(tǒng)獲得人或動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)熒光標(biāo)記目標(biāo)的圖像的方法。
背景技術(shù)：
通常，為了觀察使用熒光標(biāo)記的生物組織或細(xì)胞，需要使用熒光顯微鏡、 熒光照相、或者熒光斷層成像系統(tǒng)。為了介入觀察體內(nèi)空腔組織，需要使用醫(yī) 用內(nèi)窺鏡。
熒光顯微鏡可以觀察生物組織微觀結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞，但局限于觀察離體的 生物組織切片或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，無(wú)法進(jìn)行在體或者活體的熒光成像。
熒光照相以及熒光斷層成像系統(tǒng)可以進(jìn)行在體或者活體的熒光成像，但 只能夠觀察熒光的宏觀分布，無(wú)法觀察生物組織微觀結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞。
醫(yī)用內(nèi)窺鏡可以插入人或動(dòng)物的空腔器官內(nèi)進(jìn)行觀察，但不能觀察生物 組織微觀結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞，也不能夠進(jìn)行熒光成像。
基于激光共聚焦掃描顯微鏡的顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)近年來(lái)有國(guó)外期刊報(bào)道 使用激光共聚焦掃描顯微鏡改裝的顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)在體或活體情況 下對(duì)生物組織微觀結(jié)構(gòu)或細(xì)胞的熒光成像。但成本較高，技術(shù)復(fù)雜，難以快速 調(diào)節(jié)，難于推廣；而且只能進(jìn)行一次觀察，難于長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)對(duì)同一特定位置進(jìn) 行觀察，因此無(wú)法進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)觀察和對(duì)比研究。因此可見(jiàn)，實(shí)際應(yīng)用中，有著對(duì)于進(jìn)行在體或活體觀察生物組織微觀結(jié)構(gòu) 以及細(xì)胞熒光標(biāo)記圖像，以及長(zhǎng)期、反復(fù)的觀察的實(shí)際需要。因此新型可留置 的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)及成像方法在實(shí)際應(yīng)用中具有切實(shí)的意義和需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提出一種新的熒光成像系統(tǒng)。
本發(fā)明的特征在于，含有激發(fā)光產(chǎn)生部、主光路及熒光拍攝部、激發(fā)光 及熒光傳遞部、以及介入及留置部，其中
激發(fā)光產(chǎn)生部，含有光源、激發(fā)光濾光片以及透鏡組，其中-光源，為大功率LED，
激發(fā)光濾光片，為帶通濾光片，中心波長(zhǎng)與帶寬和待觀察熒光目標(biāo)的激發(fā) 譜相匹配，
透鏡組，用以實(shí)現(xiàn)由所述大功率LED發(fā)出，并經(jīng)過(guò)所述激發(fā)光濾光片后的
光束的準(zhǔn)直，
主光路與熒光拍攝部，含有依次水平放置且和所述傳像光纖束后端面一 起組成主光路的CCD器件、熒光濾光片、二向色鏡以及顯微物鏡，其中
CCD器件，為低溫制冷CCD器件，用于對(duì)微弱熒光信號(hào)的探測(cè)， 熒光濾光片，為帶通濾光片，中心波長(zhǎng)、帶寬與活體動(dòng)物待觀測(cè)熒光目標(biāo)
的熒光發(fā)射譜相匹配，且其通帶范圍與所述激發(fā)光濾光片的通帶范圍不交疊，
以便濾除激發(fā)光波段的光線，
二向色鏡，在與所述主光路光軸成45度的同時(shí)也與所述激發(fā)光產(chǎn)生部產(chǎn)生
的用于激發(fā)熒光標(biāo)記目標(biāo)的窄譜帶激發(fā)光光軸成45度角，使得所述主光路光軸與所述窄譜帶激發(fā)光光軸成正交，該二向色鏡的轉(zhuǎn)折波長(zhǎng)介于所述激發(fā)光濾光 片和所述熒光濾光片的通帶范圍的間隔內(nèi)，以便反射所述激發(fā)光波段的光子且 透射所述熒光波段的光子，
激發(fā)光及熒光傳遞部，含有傳像光纖束、傳像光纖束固定裝置、傳像光 纖束連接件外套、以及傳像光纖束連接件內(nèi)卡環(huán)，其中
傳像光纖束，為20cm 100cm長(zhǎng)的柔性傳像光纖束，兩端各有3cm 5cm 長(zhǎng)的硬質(zhì)護(hù)套，外徑小于lmm，兩端光學(xué)平面拋光處理，內(nèi)部纖絲間距小于 10跳
傳像光纖束固定裝置，開(kāi)有中心孔，用于固定所述傳像光纖束的后端面， 光纖連接件外套與所述傳像光纖束內(nèi)卡環(huán)之間通過(guò)精密螺紋連接，以保證 活體動(dòng)物的被觀察位置與插入所述傳像光纖束連接件外套之內(nèi)的所述傳像光纖 束的前端面共軛，使得活體動(dòng)物的組織內(nèi)被觀察位置的熒光圖像能清晰成像于 所述傳像光纖束的前端面，
介入及留置部，是一個(gè)自聚焦透鏡，外徑小于lmm，插入所述光纖連接件 外套的孔內(nèi)，介入活體動(dòng)物體內(nèi)，與所述組織上被觀察部位直接接觸，由所述 傳像光纖束前端面把激發(fā)光匯聚到所述組織的被觀察部位，同時(shí)，把所述組織 被觀察部位的熒光成像于所述傳像光纖束前端面，該自聚焦透鏡是通過(guò)一個(gè)穿 刺產(chǎn)生的小于lmm的微創(chuàng)口置于活體動(dòng)物的體內(nèi)被觀察部位的，
所述的CCD器件、傳像光纖束后端面，相對(duì)于所述的顯微物鏡共軛。 相比于現(xiàn)有的熒光成像系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用，新的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)具有 明顯的優(yōu)勢(shì)。和熒光顯微鏡一樣，新的系統(tǒng)能夠觀察組織微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。和 常規(guī)的熒光照相和熒光斷層成像系統(tǒng)一樣，新的系統(tǒng)能夠進(jìn)行在體或者活體的觀察。而且新系統(tǒng)單位面積激發(fā)光能量更高，因此易于實(shí)現(xiàn)高速視頻采集，以 觀察熒光標(biāo)記目標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。新的系統(tǒng)的可留置設(shè)計(jì)，可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)人 或動(dòng)物同一位置進(jìn)行觀察。相比于常規(guī)的熒光照相和熒光斷層成像系統(tǒng)，在激 發(fā)光源與熒光探測(cè)器方面有著明顯的節(jié)省。相比于已有的各類系統(tǒng)，本發(fā)明具
有若干優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)還可以通過(guò)更換GRIN透鏡、傳像光纖束以及物鏡調(diào)整放 大倍數(shù)和空間分辨率；可以通過(guò)切換激發(fā)光源、激發(fā)光濾光片、二向色鏡、和 熒光濾光片支持各種熒光染料、量子點(diǎn)、熒光蛋白等熒光標(biāo)記物的成像應(yīng)用。


圖1示出了本發(fā)明的部件示意圖，其中各部件說(shuō)明如下
1、 GRIN透鏡(或稱自聚焦透鏡、梯度折射率透鏡)
2、 光纖連接件外套，
3、 光纖連接件內(nèi)卡環(huán)，
4、 傳像光纖束，
5、 光纖固定裝置，
6、 顯微物鏡，
7、 二向色鏡(或稱分色片)、或者分光平片(或稱半透射半反射鏡)，
8、 熒光濾光片，
9、 透鏡或透鏡組，
10、 光源，
11、 激發(fā)光濾光片，
12、 CCD (電荷耦合器件
具體實(shí)施例方式
該系統(tǒng)包含至少一個(gè)或多個(gè)光源(光源為激光器、大功率LED (發(fā)光二極
管)、激光二極管或其他燈具，也可以是光纖從外部其他光源導(dǎo)入的光，優(yōu)選的
為大功率LED)、激發(fā)光濾光片、熒光濾光片、和二向色鏡組。所述光源、激發(fā) 光濾光片、熒光濾光片、與二向色鏡共同配合，將在與對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記物的激 發(fā)波長(zhǎng)下工作。
該系統(tǒng)在應(yīng)用時(shí)，通過(guò)手術(shù)器械的工作腔或注射器針頭的內(nèi)腔，將GRIN 透鏡插入待觀察的人或動(dòng)物組織內(nèi)。需要長(zhǎng)期固定觀察位置時(shí)，可將GRIN透 鏡插入端留置于人或動(dòng)物組織內(nèi)，另一端暴露于人或動(dòng)物組織外，與人或動(dòng)物 組織之間通過(guò)外科手術(shù)固定(使用骨水泥、生物膠、或者縫合等方法)。
該系統(tǒng)通過(guò)光源前方的透鏡和顯微物鏡的配合，將激發(fā)光匯聚導(dǎo)入傳像光 纖束，并通過(guò)傳像光纖束傳遞進(jìn)入GRIN透鏡，進(jìn)而照射到生物組織表面，激 發(fā)熒光。熒光再通過(guò)GRIN透鏡和傳像光纖束，經(jīng)由顯微物鏡放大，并最終由 CCD (電荷耦合器件)探測(cè)。
該系統(tǒng)通過(guò)GRIN透鏡與傳像光纖束之間的固定和調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，完成GRIN 透鏡與傳像光纖束端面距離的調(diào)節(jié)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于成像物距(人或動(dòng)物組織與 GRIN透鏡插入端面可能存在的間隙)的適應(yīng)。并且可以通過(guò)該固定和調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)， 實(shí)現(xiàn)GRIN透鏡與系統(tǒng)其他部分的快速分離與組裝，方便GRIN透鏡的留置以及 反復(fù)觀察。
圖1示意性表示了本發(fā)明的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，具體各部分說(shuō)明如下 激發(fā)光產(chǎn)生模塊
此模塊包括光源IO、激發(fā)光濾光片ll、透鏡或透鏡組9，產(chǎn)生用于激發(fā)熒光標(biāo)記目標(biāo)的窄譜帶激發(fā)光，整形為合適的光束形狀并送入系統(tǒng)主光路(下文 介紹)，送入系統(tǒng)主光路的激發(fā)光束與主光路光軸正交。
其中光源10可以為激光器、大功率LED (發(fā)光二極管)、激光二極管、或 其他燈具，也可以是光纖從外部其他光源導(dǎo)入的光，優(yōu)選的為大功率LED。
其中激發(fā)光濾光片11為帶通濾光片，其中心波長(zhǎng)以及帶寬的選擇應(yīng)當(dāng)與待 觀測(cè)熒光目標(biāo)的激發(fā)譜相適應(yīng)。
其中透鏡或透鏡組9，在使用激光器作為光源時(shí)，需要實(shí)現(xiàn)光束的擴(kuò)束， 為透鏡組構(gòu)成的激光擴(kuò)束鏡；在使用其他光源時(shí)，需要實(shí)現(xiàn)光束的準(zhǔn)直，為單 透鏡或透鏡組。
主光路及熒光拍攝模塊
此模塊包括CCD (電荷耦合器件)12、熒光濾光片8、 二向色鏡7、顯微 物鏡6，用于將激發(fā)光匯聚導(dǎo)入傳像光纖束4，并同時(shí)將傳像光纖束傳出的熒光
圖像放大成像并采集。
其中包括CCD (電荷耦合器件)12可以為科學(xué)用低溫制冷CCD、或者民 用CCD，優(yōu)選的為科學(xué)用低溫制冷CCD，以提供更寬的動(dòng)態(tài)范圍、更高的信噪 比以及更高的感光效率，更加有利于對(duì)于微弱熒光信號(hào)的探測(cè)。
其中熒光濾光片8為帶通濾光片，其中心波長(zhǎng)與帶寬的選擇應(yīng)當(dāng)與待觀測(cè) 熒光目標(biāo)的熒光發(fā)射譜相適應(yīng)，并且其通帶范圍與激發(fā)光濾光片的通帶范圍不 可交疊，用以濾除激發(fā)光波段的光線。
其中二向色鏡(或者分光平片)7在光路中成45度放置(與主光路光軸和 激發(fā)光產(chǎn)生模塊的光軸均成45度角)，用以反射激發(fā)光波段的光子并且透射熒 光波段的光子，當(dāng)使用二向色鏡時(shí)，其轉(zhuǎn)折波長(zhǎng)應(yīng)介于激發(fā)光濾光片和熒光濾光片的通帶范圍之間，優(yōu)選的為二向色鏡。 激發(fā)光及熒光傳遞模塊
此模塊包括傳像光纖束4、光纖固定裝置5、光纖連接件外套2、和光纖連 接件內(nèi)卡環(huán)3。以下說(shuō)明中，以"前端面"表示傳像光纖束靠近GRIN透鏡1的一 端端面，以"后端面"表示傳像光纖束靠近顯微物鏡的一端端面。
傳像光纖束4為20cm 100cm長(zhǎng)的柔性成像光纖束，兩端各有長(zhǎng)度為 3cm 5cm的硬質(zhì)護(hù)套，以便于夾持和固定，外徑小于lmm，兩端光學(xué)平面拋 光處理，內(nèi)部纖絲間距小于lO)om，優(yōu)選為2拜或以下，以實(shí)現(xiàn)更高的空間分辨 率。在特殊應(yīng)用場(chǎng)合下傳像光纖束長(zhǎng)度可以為100cm以上，但是過(guò)長(zhǎng)的光纖長(zhǎng) 度將導(dǎo)致更多的光強(qiáng)衰減以及加工時(shí)更高的斷絲率。
光纖連接件外套2和光纖連接件內(nèi)卡環(huán)3為配套結(jié)構(gòu)，外套可以與GRIN 透鏡l實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快速的固定或拆除，內(nèi)卡環(huán)與傳像光纖束4固定，外套與內(nèi)卡 環(huán)之間通過(guò)精密螺紋連接，同時(shí)借助此精密螺紋保證人或動(dòng)物組織被觀察位置 與傳像光纖束4的前端面共軛，也即保證組織被觀察位置的熒光圖像能夠清晰 成像于傳像光纖束前端面。
介入及留置模塊
此模塊只包括GRIN透鏡1，外徑小于lmm，長(zhǎng)度依被觀察組織的深度而 定，用以介入人或動(dòng)物體內(nèi)，與組織被觀察部位直接接觸，從傳像光纖束4前 端面將激發(fā)光匯聚到組織被觀察部位，同時(shí)將組織被觀察部位的熒光成像于傳 像光纖束4的前端面，將此模塊通過(guò)一個(gè)穿剌產(chǎn)生的小于lmm的微創(chuàng)口置于人 或動(dòng)物體內(nèi)的被觀察部位，如需要留置以便長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)觀察，則使用骨水泥、 生物膠或者手術(shù)縫合等方式固定于微創(chuàng)口內(nèi)，保持一端與被觀察部位接觸，另一端暴露于微創(chuàng)口之外，以方便光纖連接外套2與其連接。 成像操作方法
1、 根據(jù)成像針對(duì)的熒光標(biāo)記目標(biāo)光譜學(xué)特征，切換為對(duì)應(yīng)的光源、激發(fā)光 濾光片、熒光濾光片和二向色鏡。
2、 使用穿刺針或注射器對(duì)人或動(dòng)物待觀察部位進(jìn)行穿刺，如果進(jìn)行動(dòng)物腦 部觀察，需要進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)操作。通過(guò)穿剌針或注射器的內(nèi)腔將GRIN透鏡送 達(dá)待觀測(cè)部位，取出穿剌針或注射器，將GRIN透鏡留置于待觀察部位。
3、 如果需要長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)觀察此特定部位，則使用骨水泥、生物膠、或者手 術(shù)縫合等方法將GRIN透鏡固定于微創(chuàng)口處；如果只需要進(jìn)行單次觀察，則可 以跳過(guò)此步驟。
4、 將光纖連接件外套安裝于GRIN透鏡暴露于微創(chuàng)口外的一端，通過(guò)光纖 連接件外套與內(nèi)卡環(huán)之間的精密調(diào)節(jié)螺紋調(diào)焦(調(diào)節(jié)人或動(dòng)物被觀測(cè)組織與傳 像光纖束的前端面相對(duì)于GRIN透鏡共軛)。
5、 使用CCD (電荷耦合器件)進(jìn)行單幀圖像的拍攝或連續(xù)的視頻采集。
權(quán)利要求
1、可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，其特征在于，含有激發(fā)光產(chǎn)生部、主光路及熒光拍攝部、激發(fā)光及熒光傳遞部、以及介入及留置部，其中激發(fā)光產(chǎn)生部，含有光源、激發(fā)光濾光片以及透鏡組，其中光源，為大功率LED，激發(fā)光濾光片，為帶通濾光片，中心波長(zhǎng)與帶寬和待觀察熒光目標(biāo)的激發(fā)譜相匹配，透鏡組，用以實(shí)現(xiàn)由所述大功率LED發(fā)出，并經(jīng)過(guò)所述激發(fā)光濾光片后的光束的準(zhǔn)直，主光路與熒光拍攝部，含有依次水平放置且和所述傳像光纖束后端面一起組成主光路的CCD器件、熒光濾光片、二向色鏡以及顯微物鏡，其中CCD器件，為低溫制冷CCD器件，用于對(duì)微弱熒光信號(hào)的探測(cè)，熒光濾光片，為帶通濾光片，中心波長(zhǎng)、帶寬與活體動(dòng)物待觀測(cè)熒光目標(biāo)的熒光發(fā)射譜相匹配，且其通帶范圍與所述激發(fā)光濾光片的通帶范圍不交疊，以便濾除激發(fā)光波段的光線，二向色鏡，在與所述主光路光軸成45度的同時(shí)也與所述激發(fā)光產(chǎn)生部產(chǎn)生的用于激發(fā)熒光標(biāo)記目標(biāo)的窄譜帶激發(fā)光光軸成45度角，使得所述主光路光軸與所述窄譜帶激發(fā)光光軸成正交，該二向色鏡的轉(zhuǎn)折波長(zhǎng)介于所述激發(fā)光濾光片和所述熒光濾光片的通帶范圍的間隔內(nèi)，以便反射所述激發(fā)光波段的光子且透射所述熒光波段的光子，激發(fā)光及熒光傳遞部，含有傳像光纖束、傳像光纖束固定裝置、傳像光纖束連接件外套、以及傳像光纖束連接件內(nèi)卡環(huán)，其中傳像光纖束，為20cm～100cm長(zhǎng)的柔性傳像光纖束，兩端各有3cm～5cm長(zhǎng)的硬質(zhì)護(hù)套，外徑小于1mm，兩端光學(xué)平面拋光處理，內(nèi)部纖絲間距小于10um，傳像光纖束固定裝置，開(kāi)有中心孔，用于固定所述傳像光纖束的后端面，光纖連接件外套與所述傳像光纖束內(nèi)卡環(huán)之間通過(guò)精密螺紋連接，以保證活體動(dòng)物的被觀察位置與插入所述傳像光纖束連接件外套之內(nèi)的所述傳像光纖束的前端面共軛，使得活體動(dòng)物的組織內(nèi)被觀察位置的熒光圖像能清晰成像于所述傳像光纖束的前端面，介入及留置部，是一個(gè)自聚焦透鏡，外徑小于1mm，插入所述光纖連接件外套的孔內(nèi)，介入活體動(dòng)物體內(nèi)，與所述組織上被觀察部位直接接觸，由所述傳像光纖束前端面把激發(fā)光匯聚到所述組織的被觀察部位，同時(shí)，把所述組織被觀察部位的熒光成像于所述傳像光纖束前端面，該自聚焦透鏡是通過(guò)一個(gè)穿刺產(chǎn)生的小于1mm的微創(chuàng)口置于活體動(dòng)物的體內(nèi)被觀察部位的，所述的CCD器件、傳像光纖束后端面，相對(duì)于所述的顯微物鏡共軛。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，其特征在于， 所述自聚焦透鏡使用骨水泥粘接、生物膠粘接、或手術(shù)縫合方式中任何一種方 式固定在活體動(dòng)物的微創(chuàng)口內(nèi)的。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，其特征在于， 所述傳像光纖束內(nèi)各纖絲間距小于2um。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，其特征在于， 所述光源為激光器、激光二極管、燈、以及外部導(dǎo)入光中的任何一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，其特征在于， 所述的CCD器件為民用CCD器件。
全文摘要
可留置的熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)屬于熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域，介入和留置部，是一個(gè)自聚焦透鏡，插入活體動(dòng)物的微創(chuàng)口內(nèi)；激發(fā)光和熒光傳遞部，由光纖連接裝置、傳像光纖束、光纖束固定裝置依次連接而成，該傳像光纖束前端面與組織內(nèi)被觀察區(qū)域，相對(duì)于自聚焦透鏡共軛；熒光拍攝部，依次由沿?zé)晒獍l(fā)射主軸水平排列的顯微物鏡、二向色鏡、熒光濾光片、及CCD器件組成，CCD器件與傳像光纖束后端面相對(duì)于顯微物鏡共軛；激發(fā)光產(chǎn)生部，由光源、激發(fā)光濾光片、透鏡組依次構(gòu)成，激發(fā)光主軸與熒光發(fā)射光主軸正交，且均與二向色鏡成45度角。本發(fā)明具有易于實(shí)現(xiàn)高速視頻采集，以觀察熒光標(biāo)記目標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，也可長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活體動(dòng)物同一位置進(jìn)行連續(xù)觀察。
文檔編號(hào)G02B6/06GK101609207SQ20091008899
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者碩 毛, 凈 白, 陳欣瀟 申請(qǐng)人:清華大學(xué)