專(zhuān)利名稱(chēng)：一種顯微光學(xué)掃描層析成像裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光學(xué)顯微成像技術(shù)，更具體的說(shuō)，涉及一種結(jié)合了精密機(jī)械加工技術(shù)， 以獲取樣品連續(xù)斷層圖片為目標(biāo)的三維光學(xué)顯微成像裝置。
背景技術(shù)：
光學(xué)顯微鏡是最重要的顯微成像技術(shù)，它是利用光學(xué)原理把人眼所不能分辨的微小物體 放大成像，以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器。早在公元前l(fā)世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過(guò) 球形透明物體去觀察微小物體時(shí)可以使其放大成像。1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已 經(jīng)造出類(lèi)似顯微鏡的放大儀器。17世紀(jì)中葉，英國(guó)的R.胡克和荷蘭的A. van列文胡克都對(duì)顯 微鏡的發(fā)展做出了卓越的貢獻(xiàn)，開(kāi)始了現(xiàn)代顯微鏡發(fā)展之路。直至今日，雖然電鏡等超精密 顯微技術(shù)已經(jīng)成熟，但光學(xué)顯微鏡仍然生機(jī)勃勃，不斷有新的創(chuàng)新，比如多光子顯微鏡、共 聚焦顯微鏡、相襯顯微鏡、暗場(chǎng)顯微鏡、全內(nèi)反顯微鏡等等，其中，部分技術(shù)甚至突破了傳 統(tǒng)的光學(xué)成像極限。
光學(xué)顯微鏡是觀察10—hl02ym尺度微小物體和結(jié)構(gòu)的首選工具，它具有成本低、易操作 、活體成像等諸多有點(diǎn)，但光鏡技術(shù)有三個(gè)極限問(wèn)題。第一個(gè)問(wèn)題是光學(xué)成像的分辨極限， 常稱(chēng)為"阿貝極限"，對(duì)于可見(jiàn)光成像，這個(gè)值為200nm。第二個(gè)問(wèn)題是高分辨率時(shí)的視場(chǎng)極 限，也就是說(shuō)越是想看小的目標(biāo)，視場(chǎng)越小。第三個(gè)問(wèn)題是成像深度極限，對(duì)于高分辨光學(xué) 成像，存在一個(gè)lmm的〃軟極限〃，如共聚焦顯微鏡的穿透深度只有大約O. 5mm。以上三個(gè)極 限限制了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用范圍，因此，不斷有人希望改進(jìn)光學(xué)顯微鏡。
考慮到成像視場(chǎng)和成像深度的限制，無(wú)法單獨(dú)使用光學(xué)顯微鏡對(duì)一個(gè)較大三維樣品的內(nèi) 部進(jìn)行完整成像，這喪失了一塊很大的應(yīng)用領(lǐng)域，包括胚胎發(fā)育研究、數(shù)字化小動(dòng)物臟器、 腦圖譜獲取等。通常的改進(jìn)做法是，利用切片技術(shù)解決成像深度極限，用機(jī)械掃描解決成像 視場(chǎng)極限，也誕生了一大批〃三維顯微鏡〃方法。其中，最常見(jiàn)的方法是先將樣品切片，再制 片，最后放置在帶有掃描機(jī)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡上成像，如此往復(fù)，對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行成像。此外 ，還有切片后對(duì)已樣品上表面進(jìn)行掃描成像的方法。
上述常見(jiàn)的〃三維顯微鏡〃技術(shù)用低廉的成本實(shí)現(xiàn)了對(duì)較大三維樣品的完整成像，但仍然 存在一些問(wèn)題。第一個(gè)問(wèn)題是過(guò)程繁瑣，切片和成像的過(guò)程很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。第二個(gè)問(wèn)題是 層與層之間的數(shù)據(jù)很難配準(zhǔn)，在海量數(shù)據(jù)條件下更加嚴(yán)重。第三個(gè)問(wèn)題是效率低，用持續(xù)數(shù) 月的時(shí)間來(lái)完成一次成像也不足為奇。因此，如果能找到一種自動(dòng)化的方法，在切片的同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行成像，即可解決上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種顯微光學(xué)掃描層析成像方法，通過(guò)精密機(jī)械加工技術(shù)將大型樣品逐 行逐層切片，并在機(jī)械加工的同時(shí)對(duì)切片進(jìn)行掃描成像，以此獲取樣品完整的斷層圖像數(shù)據(jù)集。
為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一種顯微光學(xué)掃描層析成像裝置，其特征在于，該系統(tǒng) 包括機(jī)械加工模塊，成像模塊和數(shù)據(jù)采集模塊；所述機(jī)械加工模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的掃描式 切片，成像模塊用于對(duì)刀具刀刃附近的樣品成像，數(shù)據(jù)采集模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的成像掃描 和記錄。
所述機(jī)械加工模塊，包括數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)、刀具和刀具連接、加工槽、加工液循環(huán)裝 置、移動(dòng)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)器和控制電腦；所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)底部固定在防震工作臺(tái)面上，由三 個(gè)一維直線移動(dòng)平臺(tái)沿豎直方向?qū)盈B，在所述移動(dòng)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)器和所述控制電腦的控制下，三 維移動(dòng)平臺(tái)分別實(shí)現(xiàn)左右(X軸向)、前后(Y軸向)和升降(Z軸向)三個(gè)正交方向的運(yùn)動(dòng) ;所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)上還安裝一個(gè)垂直工作臺(tái)，它與所述防震工作臺(tái)面牢固固定，能夠 承載重物；所述防震工作臺(tái)的需要根據(jù)加工精度和三維移動(dòng)平臺(tái)的工作條件選擇，可以為普 通金屬臺(tái)、光學(xué)隔震臺(tái)、大理石隔震平臺(tái)，以及各種特種隔震平臺(tái)。樣品固定在所述加工槽 中，加工槽底部固定在所述三維移動(dòng)平臺(tái)頂部，加工槽中盛放加工液，加工槽底部設(shè)置兩個(gè) 通孔，用于排空加工液和接收凈化后的加工液；所述刀具由刀體和刀柄組成，所述刀體固定 在刀柄上，而刀柄通過(guò)所述刀具連接固定在所述垂直工作臺(tái)上，所述刀柄中設(shè)計(jì)一個(gè)通孔， 所述通孔底部出口位于所述刀刃上方，通孔頂部出口用作所述加工液循環(huán)裝置的取水口，所 述刀具刀刃寬度大于成像模塊的視場(chǎng)大小，刀刃方向平行于所述Y方向，刀背與水平面的夾 角？為銳角；所述加工液循環(huán)裝置通過(guò)微型水泵驅(qū)動(dòng)，從所述刀柄上的取水口吸取加工液， 在完成一次過(guò)濾后，通過(guò)所述加工液回流口送回加工槽中；所述刀具與所述樣品發(fā)生相對(duì)運(yùn) 動(dòng)，X方向的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)切片，Y方向的位移實(shí)現(xiàn)逐行掃描，Z方向的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)逐層掃描。切片 時(shí)，因?yàn)樗龅毒叩倪\(yùn)動(dòng)和所述加工液循環(huán)裝置的泵吸作用，會(huì)在在所述刀具刀體的上方產(chǎn) 生穩(wěn)定的水流場(chǎng)，壓迫切片產(chǎn)生的樣品薄片緊貼刀背滑動(dòng)，越靠近刀刃，這種滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)越穩(wěn) 定。
所述成像模塊，包括一臺(tái)顯微鏡照明器，以及反射鏡、物鏡、光源、光闌、濾光片、分 束鏡等若干獨(dú)立光學(xué)元器件；所述顯微鏡照明器通過(guò)特制支架固定在所述垂直工作臺(tái)上，使 照明和成像光路均平行于XZ平面；所述顯微鏡照明器包括連接光源、CCD、目鏡鏡筒的標(biāo)準(zhǔn)固定接口，所述濾光片、光闌、分束鏡放置在該顯微鏡照明器中；所述物鏡固定在所述垂直 工作臺(tái)上，其光軸垂直于所述刀具刀背平面，并處于所述顯微鏡照明器的照明和成像平面上 ，與X軸的夾角為e，滿足關(guān)系式(1 + |3=90° 。物鏡成像焦平面幾乎與刀背平面重合，焦點(diǎn) 落在靠近刀刃的位置；所述反射鏡固定在所述垂直工作臺(tái)上，其鏡面垂直于XZ平面，與XY平 面的夾角為丫=45° +6/2，反射鏡將照明光反射到所述物鏡，將成像光反射進(jìn)所述照明器中 ;所述光源產(chǎn)生的照明光經(jīng)過(guò)所述光闌后成為一個(gè)片狀光束，在所述照明器內(nèi)部分束鏡的反 射下沿Z方向落射到所述反射鏡上，再由反射鏡將光束沿光軸方向射入所述物鏡中，實(shí)現(xiàn)對(duì) 所述樣品的照明；所述樣品經(jīng)照明后沿原路返回的后向散射光用來(lái)成像， 一部分光會(huì)透過(guò)所 述分束鏡，并最后在所述顯微鏡照明器上方形成像平面；顯微鏡照明器可以為各大顯微鏡廠 商的定型產(chǎn)品，也可以用開(kāi)架的光學(xué)元器件代替，但需要另外為所述光源和所述CCD相機(jī)單 獨(dú)定制支架。所述光源可以為汞燈、鹵素?zé)簟⒔饘冫u化物燈、激光器這樣的常見(jiàn)光源。配置 不同的光源，可以實(shí)現(xiàn)不同的白光成像、熒光成像等不同成像方法。所述物鏡為浸液物鏡， 具體選擇與加工液類(lèi)型和成像需求有關(guān)。
所述數(shù)據(jù)采集模塊，包括線掃描CCD相機(jī)、視頻記錄卡和圖形工作站；所述CCD相機(jī)的傳 感器位于所述顯微鏡照明器的成像平面上，用于數(shù)據(jù)采集；所述CCD相機(jī)通過(guò)數(shù)據(jù)線與所述 視頻記錄卡相連，視頻記錄卡安裝在所述圖形工作站中；在所述視頻記錄卡配套軟件的控制 下，CCD相機(jī)采集到的圖片可以永久被保存在圖形工作站硬盤(pán)中。所述CCD相機(jī)通過(guò)信號(hào)線與 所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)同步，CCD相機(jī)的每一次曝光需要等待所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)發(fā)出的 觸發(fā)信號(hào)。
當(dāng)所述機(jī)械加工模塊、成像模塊、數(shù)據(jù)采集模塊協(xié)調(diào)工作時(shí)，即可掃描式地對(duì)一個(gè)完整 樣品進(jìn)行斷層層析成像。
作為更加優(yōu)化的技術(shù)方案，所述刀具刀背與水平面的夾角a為30。 45° 。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述CCD相機(jī)為線掃描，某一時(shí)刻，僅對(duì)掃描線處的樣品薄 片成像，該掃描線與XZ平面垂直，并經(jīng)過(guò)物鏡成像焦點(diǎn)。
本發(fā)明不限制樣品的大小，它僅受水槽尺寸限制，而水槽大小受三維移動(dòng)平臺(tái)承載能力 的限制。本發(fā)明不限制獲取數(shù)據(jù)的精度。Z方向的精度和三維移動(dòng)平臺(tái)有關(guān)，Y方向的精度與 顯微成像模塊的配置有關(guān)，而X方向的精度與上述兩個(gè)因素都有關(guān)系，可以根據(jù)具體的精度 要求選擇配置。
在較低的精度要求下(比如〉100ym時(shí))，對(duì)樣品材料屬性、刀具選擇均無(wú)特殊限制。 但對(duì)于微米級(jí)和亞微米級(jí)切片與成像，必須使用材質(zhì)均勻的樣品，并配置特制的金剛石刀具本發(fā)明采用切片和成像同步的模式，整個(gè)過(guò)程自動(dòng)化程度極高，不存在不同層之間圖片 配準(zhǔn)難的問(wèn)題，整個(gè)數(shù)據(jù)獲取的效率很高。因此，本發(fā)明是對(duì)傳統(tǒng)的切片后掃描成像方法的 重大改進(jìn)。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
圖l是本發(fā)明機(jī)械加工模塊的組成示意圖。
圖2是本發(fā)明成像原理圖。
圖3是本發(fā)明成像模塊的光路圖。
圖4是本發(fā)明掃描方式示意圖。
具體實(shí)施例方式
機(jī)械加工模塊如圖l所示。
所有組成部分均固定或間接連接在防震工作臺(tái)1以及垂直工作臺(tái)2上。防震工作臺(tái)面要保 持水平，垂直工作臺(tái)上布置了大量安裝孔用來(lái)固定儀器和元器件。防震工作臺(tái)和垂直工作臺(tái) 一般是一體化設(shè)計(jì)，材質(zhì)相同。數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)3的底座固定在防震工作臺(tái)上，由三個(gè)一 維直線移動(dòng)平臺(tái)組成，它們沿豎直方向?qū)盈B，在移動(dòng)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)器和控制電腦的控制下，各自 實(shí)現(xiàn)左右(X)、前后(Y)和升降(Z)三個(gè)正交方向的運(yùn)動(dòng)。在這里XY平面即水平面，Z為 豎直方向，成為整個(gè)系統(tǒng)的坐標(biāo)系。
在數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)頂端固定了一塊安裝板4，上面布置了大量螺孔，安裝板表面要求 平整，保證安裝上去元器件的坐標(biāo)準(zhǔn)確。加工槽5底部平整，通過(guò)螺絲固定在安裝板上。樣 品ll通過(guò)夾具或者特制強(qiáng)力膠固定在樣品臺(tái)上，樣品臺(tái)再通過(guò)螺絲固定在加工槽底部中央。 加工槽中盛放水、油等加工液14，液面高度以沒(méi)過(guò)樣品頂部5 10mm為宜。加工槽底部設(shè)置兩 個(gè)通孔， 一個(gè)用于排放加工液12，另一個(gè)作為所述加工液循環(huán)裝置的回流口13，除這兩個(gè)通 孔以外，加工槽絕對(duì)不允許有漏孔。在不影響走刀的前提下，加工槽容積應(yīng)盡量設(shè)計(jì)得小一 些，并采用鋁合金等輕質(zhì)材料制作，以減少數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)的總負(fù)載。
刀具由刀體7和刀柄6組成，刀體固定在刀柄上，而刀柄通過(guò)刀具連接8固定在垂直工作 臺(tái)上。刀具連接的作用是給刀具一個(gè)牢固的垂直安裝面，可以設(shè)計(jì)為一個(gè)多維調(diào)節(jié)裝置，對(duì) 于高精密加工非常必要。刀體一般較小，刀柄一般通過(guò)焊接或者鉚接固定刀體。刀柄中設(shè)計(jì) 一個(gè)通孔，孔底部出口10位于刀刃上方，為加工液循環(huán)裝置的取水口，孔頂部出口9用于插 接塑料軟管。加工液循環(huán)裝置通過(guò)微型水泵15驅(qū)動(dòng)，從刀柄上的取水口16吸取加工液，在完成一次過(guò) 濾后，將加工液通過(guò)加工槽下方的回流口13送回加工槽中。整個(gè)水路的水管可以是普通塑料 軟管，如果考慮過(guò)濾器回流的通暢性，可以將17處的管道設(shè)計(jì)為大口徑橡皮管。加工液循環(huán) 裝置的作用有兩個(gè)，第一是凈化回收利用加工液，維持加工槽內(nèi)水位平衡，第二是在取水口 16附近產(chǎn)生必要的水流。在所述三維移動(dòng)平臺(tái)開(kāi)始運(yùn)動(dòng)前，應(yīng)先注入加工液，再開(kāi)啟加工液 循環(huán)裝置并等待片刻，直至液面穩(wěn)定。加工槽內(nèi)液面是否穩(wěn)定直接影響精密加工的精度。
通過(guò)上述配置，在數(shù)控程序的控制下，刀具與樣品發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，X方向的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)切 片，Y方向的位移實(shí)現(xiàn)逐行掃描，Z方向的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)逐層掃描。圖4解釋了對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行逐 行逐層掃描的過(guò)程。 一般情況下，切片的寬度AY要小于顯微成像的視場(chǎng)寬度，而刀具7刀刃 的寬度W要大于AY。根據(jù)AY，在樣品同一層中，可以分成若干個(gè)樣品條帶34，進(jìn)一步分為 已加工表面30和未加工表面20。切片時(shí)，因?yàn)樗龅毒叩倪\(yùn)動(dòng)和所述加工液循環(huán)裝置的泵吸 作用，會(huì)在在所述刀具刀體的上方產(chǎn)生穩(wěn)定的水流場(chǎng)，壓迫切片產(chǎn)生的樣品薄片29緊貼刀背 滑動(dòng)。越靠近刀刃，這種滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)越穩(wěn)定；越遠(yuǎn)離刀刃，樣品薄片運(yùn)動(dòng)將不受控制。
圖3為成像模塊和機(jī)械加工模塊的偶聯(lián)部分，它是本專(zhuān)利的核心部分。圖中，樣品ll和 刀具7在X方向上發(fā)生相對(duì)位移，實(shí)現(xiàn)刀具對(duì)樣品頂層部分的切片，切片厚度AZ由三維移動(dòng) 平臺(tái)在Z方向上步進(jìn)有關(guān)。切片時(shí)，待切片的樣品部分28逐漸被刀具切割脫離，成為薄片29 ，因?yàn)樗鏊鲌?chǎng)作用，樣品會(huì)貼在刀具背面滑動(dòng)。這時(shí)，刀具可以看成是一個(gè)"載玻片"， 承載了一塊樣品薄片，而物鏡18靠近這個(gè)載玻片到合適位置成像。結(jié)合圖4，由于是線采集 ，成像的區(qū)域是一條線，稱(chēng)為掃描線32，它離切割線31越近越好。這里，刀背與水平面的夾 角a控制在30。 45° ，物鏡光軸垂直于刀具刀背平面，與X軸的夾角為f3見(jiàn)圖2，因此有關(guān) 系式(1 + 6=90° 。成像時(shí)，照明光26從物鏡中射出，被物鏡匯聚在掃描線附近，產(chǎn)生后向散 射光，這些光只有部分27原路返回進(jìn)入物鏡鏡頭。所以，也只有當(dāng)(1 + {3=90°時(shí)，成像的效 率最高。
由圖3的物鏡向外延伸，將過(guò)渡到圖2，即本發(fā)明的成像光路圖。成像光路的主體部分是 一個(gè)被虛線框住的顯微鏡照明器，它可以為各大顯微鏡廠商的定型產(chǎn)品，也可以用開(kāi)架的光 學(xué)元器件代替。當(dāng)使用直接采購(gòu)的顯微鏡照明器時(shí)，它將為光源21、 CCD20、目鏡鏡筒25等 提供標(biāo)準(zhǔn)固定接口 (連接時(shí)可能需要添加額外的連接器件)。同時(shí)，在該照明器中可以放置 濾光片、光闌23、分束鏡22等光學(xué)元器件。顯微鏡照明器通過(guò)特制支架固定在工作臺(tái)的垂直 工作臺(tái)上，而且要保證照明和成像光路均平行于XZ平面。
所述光源21可以為汞燈、鹵素?zé)簟⒔饘冫u化物燈、激光器這樣的常見(jiàn)光源。所述反射鏡21獨(dú)立固定在垂直工作臺(tái)上，鏡面垂直于XZ平面，與XY平面的夾角為y二45。 +{3/2。反射鏡 將照明光反射到物鏡18 ，也將成像光反射進(jìn)所述照明器中。
通過(guò)上述配置，照明光由所述光源21產(chǎn)生，經(jīng)過(guò)所述光闌23后成為一個(gè)片狀光束，在所 述照明器內(nèi)部分束鏡22的反射下沿Z方向落射到所述反射鏡21上，再由反射鏡將光束沿光軸 方向射入所述物鏡18中，實(shí)現(xiàn)對(duì)所述樣品的照明。成像光原路返回回到物鏡中，透過(guò)分束鏡 22，并最后在照明器上方形成像平面。CCD相機(jī)20的傳感器位于這個(gè)成像平面上，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù) 采集。在成像過(guò)程中，照明光在光闌23、分束鏡22和物鏡18處會(huì)發(fā)生損失，成像光在分束鏡 22和24處會(huì)發(fā)生損失。
所述CCD相機(jī)為線掃描，某一時(shí)刻，僅對(duì)掃描線32處的樣品薄片成像，該掃描線與XZ平 面垂直，并經(jīng)過(guò)物鏡成像焦點(diǎn)。CCD相機(jī)通過(guò)數(shù)據(jù)線與所述圖像記錄卡相連，視頻記錄卡安 裝在所述圖形工作站中。在視頻記錄卡配套軟件的控制下，CCD相機(jī)采集到的圖片最后被保 存在圖形工作站硬盤(pán)中。CCD相機(jī)、視頻記錄卡的傳輸協(xié)議必須一致，它們與圖形工作站的 速度必須匹配，否則會(huì)丟失數(shù)據(jù)。
另外，CCD相機(jī)必須通過(guò)一根信號(hào)線與所述三維移動(dòng)平臺(tái)同步，CCD相機(jī)的每一次曝光需 要等待三維移動(dòng)平臺(tái)發(fā)出的觸發(fā)信號(hào)。這里提出兩個(gè)要求， 一是三維移動(dòng)平臺(tái)必須能夠產(chǎn)生 與運(yùn)動(dòng)狀態(tài)耦合的觸發(fā)信號(hào)，二是CCD相機(jī)可以由外部信號(hào)觸發(fā)拍照。當(dāng)所述機(jī)械加工模塊 、成像模塊、數(shù)據(jù)采集模塊協(xié)調(diào)工作時(shí)，即可掃描式地對(duì)一個(gè)完整樣品進(jìn)行斷層層析成像。
樣品大小與刀具寬度和成像視場(chǎng)無(wú)關(guān)，僅受水槽尺寸限制，而水槽大小受三維移動(dòng)平臺(tái) 承載能力的限制。Y方向的成像精度與成像模塊的分辨力有關(guān)，Z方向的精度和三維移動(dòng)平臺(tái) 有關(guān)，而X方向的成像精度與上述兩個(gè)因素都有關(guān)系，可以根據(jù)具體的精度要求選擇配置。 本發(fā)明在較低的精度要求下，比如〉50ym時(shí)，對(duì)樣品、刀具均無(wú)特殊限制，但對(duì)于微米級(jí)和 亞微米級(jí)切片與成像，必須使用材質(zhì)均勻的樣品，并配置特制的金剛石刀具。
具體實(shí)施例
下面給出的示例在樹(shù)脂包埋的生物組織上實(shí)現(xiàn)亞微米級(jí)切片和成像。 示例采用一套組合的大理石工作臺(tái)，垂直工作臺(tái)也為大理石材質(zhì)，與平臺(tái)一體。三維移 動(dòng)平臺(tái)采用加拿大Aerotech公司生產(chǎn)的系列精密移動(dòng)平臺(tái)組合而成，第一級(jí)為X方向上的空 氣軸承移動(dòng)平臺(tái)，第二級(jí)為Z方向上的升降臺(tái)，第三級(jí)為Y方向上的靜壓導(dǎo)軌平移臺(tái)，三套一 維移動(dòng)平臺(tái)均達(dá)到了100nm的編程精度。刀具選用是瑞士安東麥耶爾公司生產(chǎn)的系列金剛石 刀具，金剛石刀刃角度為40。，其刀刃長(zhǎng)度為3mm，刀柄用螺釘固定在刀具連接上，而刀具連接牢固固定在大理石垂直工作臺(tái)上。加工液循環(huán)裝置中的水泵采用深圳市精密微型齒輪泵 有限公司生產(chǎn)的微型齒輪泵，額定電壓為直流24V，最大排量10mL;過(guò)濾器為普通家用飲水 機(jī)過(guò)濾器。加工液為普通去離子水，樣品為樹(shù)脂包埋的小昆蟲(chóng)。
成像模塊的所有光學(xué)主件均來(lái)自日本01ympus公司，夾具和平移臺(tái)等配件來(lái)自北京賽凡 光電公司。其中，顯微鏡照明器來(lái)自BX61系列熒光顯微鏡，光源采用高壽命的金屬鹵化物燈 ，物鏡采用復(fù)消色差40X水鏡。
CCD采用加拿大Dalsa公司的系列線CCD，像素達(dá)到4096，色深10bit。視頻記錄卡為加拿 大Matrox公司的Solios系列，并使用配套的控制軟件。圖形工作站使用HP xw6200，內(nèi)存達(dá) 到2GByte，硬盤(pán)空間lTByte。
用本發(fā)明中的方法對(duì)所述樹(shù)脂樣本(尺寸為lXlX2cm)進(jìn)行掃描切片，薄片寬度為 0.5mm，厚度為0.5ym，因此每層至少要20次進(jìn)刀才能切完，整個(gè)樣品會(huì)被切成4萬(wàn)層。
先連接系統(tǒng)，打開(kāi)除水泵之外的所有電源。在樣本槽中加水至沒(méi)過(guò)樣本lcm，調(diào)整物鏡 直到觀察到清晰的刀刃圖像，再將刀刃調(diào)節(jié)到偏離視場(chǎng)中心20ym的刀背上。用三維移動(dòng)平 臺(tái)的控制軟件將刀具移動(dòng)到起始對(duì)刀位置，保證第一次進(jìn)刀時(shí)刀具在Y方向剛好切到樣品。 然后開(kāi)啟水泵，等待水位穩(wěn)定，如水位變化太大，補(bǔ)充或排掉差額部分。運(yùn)行控制三維移動(dòng) 平臺(tái)運(yùn)行的G語(yǔ)言程序，開(kāi)始加工樣本。在該程序中已設(shè)置好切片寬度(0.5mm)，切片厚度 (0.5ym) ， X方向行程(20mm)和每一層的進(jìn)刀數(shù)(22，多余的2個(gè)為了確保安全)。
系統(tǒng)完全開(kāi)動(dòng)以后，樣本隨平臺(tái)沿X方向運(yùn)動(dòng)，刀具固定不動(dòng)。刀具完成一個(gè)X方向的相 對(duì)進(jìn)刀(刀具為靜止)，再退回該次進(jìn)刀起始位置，Y移動(dòng)平臺(tái)緊接著由內(nèi)向外偏移0.5mm， 繼續(xù)下一次進(jìn)刀，即逐行切片。22次進(jìn)刀之后，這一層的樣本將被切完，刀具回到該層起始 坐標(biāo)。接著，Z移動(dòng)平臺(tái)上升0.5um，繼續(xù)下一層的切片，以此循環(huán)往復(fù)，逐層切片。加工 過(guò)程產(chǎn)生的樣本殘?jiān)鼤?huì)被加工液循環(huán)裝置抽走并過(guò)濾回收，保證加工槽中加工液的清潔。
成像與切片同步。在視頻記錄卡配套軟件的控制下，每一次進(jìn)刀將產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，保存 在計(jì)算機(jī)的主存中，同時(shí)，計(jì)算機(jī)用另一個(gè)進(jìn)程將主存中的數(shù)據(jù)壓縮保存到計(jì)算機(jī)硬盤(pán)中， 保存格式為JPEG。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1一種顯微光學(xué)掃描層析成像裝置，其特征在于，該系統(tǒng)包括機(jī)械加工模塊，成像模塊和數(shù)據(jù)采集模塊，所述機(jī)械加工模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的掃描式切片，成像模塊用于對(duì)刀具刀刃附近的樣品成像，數(shù)據(jù)采集模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的成像結(jié)果的采集和記錄；所述機(jī)械加工模塊，包括數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)、刀具和刀具連接、加工槽、加工液循環(huán)裝置、移動(dòng)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)器和控制電腦；所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)底部固定在防震工作臺(tái)面上，由三個(gè)一維直線移動(dòng)平臺(tái)沿豎直方向?qū)盈B，在所述移動(dòng)平臺(tái)驅(qū)動(dòng)器和所述控制電腦的控制下，三維移動(dòng)平臺(tái)分別實(shí)現(xiàn)左右(X軸向)、前后(Y軸向)和升降(Z軸向)三個(gè)正交方向的運(yùn)動(dòng)；所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)上還安裝一個(gè)垂直工作臺(tái)，它與所述防震工作臺(tái)面牢固固定，能夠承載重物；樣品固定在所述加工槽中，加工槽底部固定在所述三維移動(dòng)平臺(tái)頂部，加工槽中盛放加工液，加工槽底部設(shè)置兩個(gè)通孔，用于排空加工液和接收凈化后的加工液；所述刀具由刀體和刀柄組成，所述刀體固定在刀柄上，而刀柄通過(guò)所述刀具連接固定在所述垂直工作臺(tái)上，所述刀柄中設(shè)計(jì)一個(gè)通孔，所述通孔底部出口位于所述刀刃上方，通孔頂部出口用作所述加工液循環(huán)裝置的取水口，所述刀具刀刃寬度大于成像模塊的視場(chǎng)大小，刀刃方向平行于所述Y方向，刀背與水平面的夾角？為銳角；所述加工液循環(huán)裝置通過(guò)微型水泵驅(qū)動(dòng)，從所述刀柄上的取水口吸取加工液，在完成一次過(guò)濾后，通過(guò)所述加工液回流口送回加工槽中；所述成像模塊，包括一臺(tái)顯微鏡照明器，以及反射鏡、物鏡、光源、光闌、濾光片、分束鏡等若干獨(dú)立光學(xué)元器件；所述顯微鏡照明器通過(guò)特制支架固定在所述垂直工作臺(tái)上，使照明和成像光路均平行于XZ平面；所述顯微鏡照明器包括連接光源、CCD、目鏡鏡筒的標(biāo)準(zhǔn)固定接口，所述濾光片、光闌、分束鏡放置在該顯微鏡照明器中；所述物鏡固定在所述垂直工作臺(tái)上，其光軸垂直于所述刀具刀背平面，并處于所述顯微鏡照明器的照明和成像平面上，與X軸的夾角為β，滿足關(guān)系式α+β＝90°。物鏡成像焦平面幾乎與刀背平面重合，焦點(diǎn)落在靠近刀刃的位置；所述反射鏡固定在所述垂直工作臺(tái)上，其鏡面垂直于XZ平面，與XY平面的夾角為γ＝45°+β/2，反射鏡將照明光反射到所述物鏡，將成像光反射進(jìn)所述照明器中；所述光源產(chǎn)生的照明光經(jīng)過(guò)所述光闌后成為一個(gè)片狀光束，在所述照明器內(nèi)部分束鏡的反射下沿Z方向落射到所述反射鏡上，再由反射鏡將光束沿光軸方向射入所述物鏡中，實(shí)現(xiàn)對(duì)所述樣品的照明；所述樣品經(jīng)照明后沿原路返回的后向散射光用來(lái)成像，一部分光會(huì)透過(guò)所述分束鏡，并最后在所述顯微鏡照明器上方形成像平面；所述數(shù)據(jù)采集模塊，包括線掃描CCD相機(jī)、視頻記錄卡和圖形工作站；所述CCD相機(jī)的傳感器位于所述顯微鏡照明器的成像平面上，用于數(shù)據(jù)采集；所述CCD相機(jī)通過(guò)數(shù)據(jù)線與所述視頻記錄卡相連，視頻記錄卡安裝在所述圖形工作站中；所述CCD相機(jī)通過(guò)信號(hào)線與所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)同步，CCD相機(jī)的每一次曝光需要等待所述數(shù)控三維移動(dòng)平臺(tái)發(fā)出的觸發(fā)信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的顯微光學(xué)掃描層析成像裝置，其特征在于， 所述刀具刀背與水平面的夾角a為30。 45° 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的顯微光學(xué)掃描層析成像裝置，其特征在 于，所述CCD相機(jī)為線掃描，某一時(shí)刻，僅對(duì)掃描線處的樣品薄片成像，該掃描線與XZ平面 垂直，并經(jīng)過(guò)物鏡成像焦點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三維光學(xué)顯微成像裝置，旨在提供一種顯微光學(xué)掃描層析成像方法，通過(guò)精密機(jī)械加工技術(shù)將大型樣品逐行逐層切片，并在機(jī)械加工的同時(shí)對(duì)切片進(jìn)行掃描成像，以此獲取樣品完整的斷層圖像數(shù)據(jù)集。該系統(tǒng)包括機(jī)械加工模塊，成像模塊和數(shù)據(jù)采集模塊；機(jī)械加工模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的掃描式切片，成像模塊用于對(duì)刀具刀刃附近的樣品成像，數(shù)據(jù)采集模塊用于實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的成像掃描和記錄。上述三個(gè)模塊協(xié)調(diào)工作，實(shí)現(xiàn)顯微光學(xué)掃描層析成像裝置的功能。本發(fā)明采用切片和成像同步的模式，整個(gè)過(guò)程自動(dòng)化程度極高，不存在不同層之間圖片配準(zhǔn)難的問(wèn)題，整個(gè)數(shù)據(jù)獲取的效率很高。
文檔編號(hào)G02B21/00GK101477241SQ20091030048
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者斌 張, 李安安, 楊中琴, 駱清銘, 輝 龔 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)