專利名稱：一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于超分辨顯微領域，特別涉及一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置。
背景技術：
共焦顯微鏡最早是由M. Minsky于1957年提出，最初目的是為了消除普通光學顯微鏡在探測樣品時產生的散射光影響。之后，共焦顯微術因其出色的三維層析能力和高分辨率等特點迅速得到推廣。然而，盡管共焦顯微鏡使其橫向分辨率提高到相同孔焦比的普通光學顯微鏡的I. 4倍，但與其軸向分辨率相比仍差兩個數(shù)量級，橫向分辨率和軸向分辨率之間存在著極大的不平衡，因此進一步改善共焦顯微系統(tǒng)的成像分辨率特別是橫向分辨率變得尤為迫切。起初，人們通過增大物鏡數(shù)值孔徑NA和減小光波波長等方法來改善共焦系統(tǒng)的成像分辨能力，但是很快發(fā)現(xiàn)了這類方法的局限性，光學衍射極限制約了共焦顯微系統(tǒng)成像分辨率的進一步提高。超分辨思想最先于1952年由Francia提出，但是直到共焦顯微技術的出現(xiàn)和針孔的使用才使光學超分辨真正具有了實際意義。為了打破光學衍射極限的限制，從根本上改善共焦顯微鏡的成像分辨率，人們嘗試了許多方法，例如4PI共焦顯微鏡、共焦干涉顯微鏡、基于非線性效應的雙光子或多光子顯微鏡和基于針孔差分的差動共焦顯微鏡等方法。國內學者針對基于針孔差分的差動共焦顯微鏡也做了比較深入的研究，例如，趙維謙等人提出了具有高空間分辨力的差動共焦掃描檢測方法，并申請了相關專利(申請專利號CN200410006359. 6)。但是基于針孔的超分辨方法并不僅僅局限于上述專利中的方法，本發(fā)明提出一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置，與上述專利中通過移動針孔進行差分的差動共焦顯微術不同，本發(fā)明通過對兩個在不同大小針孔的濾波作用下的共焦信號進行分析和處理，橫向分辨率得到顯著改善，實現(xiàn)了橫向超分辨。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置，裝置結構簡單，易于操作，共焦顯微系統(tǒng)的橫向分辨率顯著改善，實現(xiàn)了橫向超分辨，可用于光學顯微領域以及納米高精度檢測、測試和制造等領域?！N基于雙針孔的超分辨顯微方法，包括激光器發(fā)射出的光束聚焦到樣品的表面形成信號光，將該信號光分為強度相等的兩束光，這兩束光分別通過第一針孔和第二針孔后進入相應探測器并進行對應的處理，所述第一針孔面積為0. 5 2個愛里斑，所述第二針孔面積為2 5個愛里斑。針對非熒光樣品，信號光為光束聚焦到樣品表面產生的反射光和散射光，針對熒光樣品，信號光為光束聚焦到樣品表面激發(fā)的熒光。優(yōu)選的，所述第一針孔面積為I. 5個愛里斑，所述第二針孔面積為4. 5個愛里斑。、
所述第一針孔面積選擇I. 5個愛里斑的原因是為了與聚焦到樣品表面的光斑大小匹配從而構成標準的共聚焦系統(tǒng)，所述第二針孔的面積選擇4. 5個愛里斑的原因是為了與所述第一針孔的I. 5個愛里斑的大小匹配以獲得最好的處理結果。優(yōu)選的，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑。 第二針孔可替換為環(huán)形孔，環(huán)形孔的中心不透光面積在0. 5 2個愛里斑之間，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和在2 5個愛里斑之間，環(huán)形孔所在平面與于第二針孔所在平面重合，環(huán)形孔中心與于第二針孔中心重合。針對非熒光樣品，本發(fā)明提供了一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括用于發(fā)出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透鏡和用于承載待測樣品的納米平移臺，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透鏡和分束器，分別用于對所述分束器射出的第一測量光和第二測量光進行濾波的第一針 孔和第二針孔，以及收集通過所述第一針孔和第二針孔的光強信號的探測系統(tǒng)，所述第一針孔面積為0. 5 2個愛里斑，所述第二針孔面積為2 5個愛里斑。探測系統(tǒng)由第一探測光纖、第一探測器、第二探測光纖、第二探測器和計算機組成。其中，第一探測光纖和第二探測光纖參數(shù)和性能完全相同，且兩光纖端面面積足夠收集通過兩針孔的全部光強。優(yōu)選的，所述第一針孔面積為I. 5個愛里斑，所述第二針孔面積為4. 5個愛里斑。所述第一針孔面積選擇I. 5個愛里斑的原因是為了與聚焦到樣品表面的光斑大小匹配從而構成標準的共聚焦系統(tǒng)，所述第二針孔的面積選擇4. 5個愛里斑的原因是為了與所述第一針孔的I. 5個愛里斑的大小匹配以獲得最好的處理結果。優(yōu)選的，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑。第二針孔可替換為環(huán)形孔，環(huán)形孔的中心不透光面積在0.5 2個愛里斑之間，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和在2 5個愛里斑之間，環(huán)形孔所在平面與于第二針孔所在平面重合，環(huán)形孔中心與于第二針孔中心重合。優(yōu)選的,所述激光器與偏振片之間依次設有用于對光束進行稱合的單模光纖和對光束進行準直的準直透鏡。激光器發(fā)出的激光具有一定發(fā)散角，準直后的激光具有更好的平行性。針對非熒光樣品，本發(fā)明的裝置工作步驟如下(I)激光器發(fā)射出光束經單模光纖耦合和第一準直透鏡準直，得到準直光束準直光束經偏振片調制為平行偏振光(P光)，平行偏振光經由偏振分束器全部透射后，再經四分之一波片調制為圓偏振光；圓偏振光經第一透鏡聚焦到非熒光樣品表面；(2)非熒光樣品表面發(fā)生反射和散射，得到的反射光和散射光沿原光路逆向返回，先被第一透鏡收集，再經過四分之一波片調制為垂直偏振光(s光)；垂直偏振光經由偏振分束器全部反射形成第一反射光，第一反射光經由第二透鏡聚焦后，通過分束器分為強度相等的第一測量光和第二測量光，第一測量光通過第一針孔濾波后聚焦于第一探測光纖的光纖端面，第二測量光通過第二針孔濾波后聚焦于第二探測光纖的光纖端面，第一探測光的焦點與第一探測光纖的光纖端面中心重合，第二探測光的焦點與第二探測光纖的光纖端面中心重合，第一針孔所在平面緊貼第一探測光纖的光纖端面，且第一探測光光軸垂直通過第一針孔中心，第二針孔所在平面緊貼第二探測光纖的光纖端面，且第二探測光光軸垂直通過第二針孔中心；(3)第一探測光纖另一端連接第一探測器，第二探測光纖連接第二探測器，第一探測器和第二探測器與計算機相連，第一探測光纖通過耦合將經第一針孔濾波的測量光傳至第一探測器，第一探測器將光信號轉化為電信號傳至計算機，信號設為I1 ;第二探測光纖通過耦合將經第二針孔濾波的測量光傳至第二探測器，第二探測器將光信號轉化為電信號傳至計算機，信號設為I2;(4)計算機將兩信號進行數(shù)據(jù)處理，完成一點掃描；(5)樣品所在納米平移臺與計算機相連，通過計算機來控制納米平移臺使樣品在垂直光軸面內移動完成二維掃描成像。 偏振分束器用于使經偏振片調制的平行偏振光全部透射通過，四分之一波片用于將透射后的平行偏振光調制為圓偏振光，第一透鏡用于聚焦圓偏振光以及用于收集聚焦后樣品反射和散射的光束，四分之一波片還用于將第一透射收集的返回的反射光和散射光調制為垂直偏振光，偏振分束器還用于使垂直偏振光(垂直偏振光是由四分之一波片將第一透鏡收集的返回的反射光和散射光調制得到的)通過后全部反射。第二透鏡用于對垂直偏振光在偏振分束器的反射光進行聚焦，分束器用于將聚焦反射光分離為兩束強度相等的測量光，第一針孔和第二針孔用于分別對兩束測量光進行濾波。第一探測光纖和第二探測光纖用于分別對兩束濾波后的測量光進行耦合并各獲取一個光強信號。第一探測器和第二探測器用于將兩個光強信號轉換為電信號，兩探測器參數(shù)和性能完全相同，計算機用于接收電信號并進行分析處理，同時用于控制納米平移臺移動；納米平移臺用于根據(jù)計算機發(fā)出的信號對樣品二維掃描。本發(fā)明中偏振分束器的作用一是對于由偏振片調制的平行偏振光透射，二是對于由四分之一波片基于第一透射收集的反射光和散射光所調制的垂直偏振光反射，因此，偏振分束器的反射光路即為垂直偏振光在偏振分束器發(fā)生反射的光路。針對熒光樣品，本發(fā)明提供了一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括用于發(fā)出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的第一透鏡和用于承載待測樣品的納米平移臺，用于將所述樣品表面發(fā)出的信號光分為第一測量光和第二測量光的分束器，分別用于對所述分束器射出的第一測量光和第二測量光進行濾波的第一針孔和第二針孔，以及收集通過所述第一針孔和第二針孔的光強信號的探測系統(tǒng)，所述第一透鏡和激光器之間設有用于反射所述樣品表面發(fā)出的信號光二向色鏡，所述二向色鏡與所述分束器之間設有帶通濾光片。二向色鏡用于全部透射準直激光和全部反射由所述第一透鏡收集的樣品熒光；帶通濾光片用于透射所述二向色鏡反射的樣品熒光并濾去其他波段的雜散光。探測系統(tǒng)由第一探測光纖、第一探測器、第二探測光纖、第二探測器和計算機組成。其中，第一探測光纖和第二探測光纖參數(shù)和性能完全相同，且兩光纖端面面積足夠收集通過兩針孔的全部光強；第一探測器和所述第二探測器參數(shù)和性能完全相同。優(yōu)選的，所述激光器與二向色鏡之間依次設有用于對光束進行耦合的單模光纖和對光束進行準直的準直透鏡。激光器發(fā)出的激光具有一定發(fā)散角，準直后的激光具有更好的平行性。針對熒光樣品，本發(fā)明的裝置工作步驟如下(I)激光器發(fā)射出光束經單模光纖耦合和第一準直透鏡準直，得到準直光束準直光束經二向色鏡全部透射后，經第一透鏡聚焦到突光樣品表面，對樣品進行突光激發(fā)；(2)熒光樣品被激發(fā)熒光，得到熒光先被第一透鏡收集，再經過二向色鏡全部反射形成第一反射光，第一反射光經過帶通濾光片，帶通濾光片僅允許激發(fā)熒光波段通過，濾波后第一反射光由第二透鏡聚焦后，通過分束器分為強度相等的第一測量光和第二測量光，第一測量光通過第一針孔后聚焦于第一探測光纖的光纖端面，第二測量光通過第二針孔后聚焦于第二探測光纖的光纖端面，第一探測光的焦點與第一探測光纖的光纖端面中心重合，第二探測光的焦點與第二探測光纖的光纖端面中心重合，第一針孔所在平面緊貼第一 探測光纖的光纖端面，且第一探測光光軸垂直通過第一針孔中心；第二針孔所在平面緊貼第二探測光纖的光纖端面，且第二探測光光軸垂直通過第二針孔中心；(3)第一探測光纖另一端連接第一探測器，第二探測光纖連接第二探測器，第一探測器和第二探測器與計算機相連；第一探測光纖通過耦合將經第一針孔濾波的測量光傳至第一探測器，第一探測器將光信號轉化為電信號傳至計算機，信號設為I1 ;第二探測光纖通過耦合將經第二針孔濾波的測量光傳至第二探測器，第二探測器將光信號轉化為電信號傳至計算機，信號設為I2;(4)計算機將兩信號進行數(shù)據(jù)處理，完成一點掃描；(5)樣品所在納米平移臺與計算機相連，通過計算機來控制納米平移臺使樣品在垂直光軸面內移動完成二維掃描成像。第二透鏡用于對帶通濾光片濾波的反射光進行聚焦，分束器用于將第二透鏡的聚焦光分離為兩束強度相等的測量光，第一針孔和第二針孔用于分別對兩測量光進行濾波。二向色鏡用于全部透射準直激光和全部反射由第一透鏡收集的樣品熒光，帶通濾光片用于透射二向色鏡反射的樣品熒光并濾去其他波段的雜散光，第二透鏡用于對帶通濾光片濾波的反射光進行聚焦，分束器用于將第二透鏡的聚焦光分離為兩束強度相等的測量光，第一針孔和第二針孔用于分別對兩測量光進行濾波。第一針孔和第二針孔面積大小不同，第一針孔面積在0. 5 2個愛里斑之間，第二針孔面積在2 5個愛里斑之間，第一針孔面積小于第二針孔面積；其中，第二針孔可替換為環(huán)形孔，環(huán)形孔的中心不透光面積在0. 5 2個愛里斑之間，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和在2 5個愛里斑之間，環(huán)形孔所在平面與于第二針孔所在平面重合，環(huán)形孔中心與于第二針孔中心重合。第一探測光纖和第二探測光纖參數(shù)和性能完全相同，且兩光纖端面面積足夠收集通過兩針孔的全部光強；第一探測光纖和第二探測光纖用于分別對兩束濾波后的測量光進行耦合并各獲取一個光強信號；第一探測器和第二探測器用于將兩個光強信號轉換為電信號，兩探測器參數(shù)和性能完全相同，計算機用于接收電信號并進行分析處理，同時用于控制納米平移臺移動；納米平移臺用于根據(jù)計算機發(fā)出的信號對樣品二維掃描。本裝置中二向色鏡的作用有一是對于準直后的激光完全透射，二是對于由第一透鏡收集的樣品熒光完全反射，因此，二向色鏡的反射光路即為樣品熒光在二向色鏡發(fā)生反射的光路。本發(fā)明的工作原理如下在共焦系統(tǒng)中，對于熒光樣品或者非熒光樣品進行點對點掃描成像。由于聚焦到樣品上的激光并不是理想的無限小的點而是一個有受光學衍射限制的有一定大小的愛里斑，因而由此愛里斑產生的樣品信號光中包含了大量焦外點信息(理想聚焦照明點以外的信息)，使得成像的分辨率下降。將信號光分成強度相同的兩束測量光，同時將共焦系統(tǒng)的探測光路分成除了針孔不同其他參數(shù)完全相同的兩測量光路并將兩束測量光分別導入，當使用兩針孔濾波時，由于兩針孔的面積大小不同(以第一針孔面積小于第二針孔面積為例子說明)，則兩測量光的點擴散函數(shù)受到的調制不同。設第一探測器探測的光強大小為I1，第二探測器探測的光強大小為I2，第一探測器的光強主要包含焦內信息和少量的焦外信息，第二探測器的光強則除了包含第一探測器的所有焦內信息外，還包含比第一探測器強度更強和更多的焦外信息，則兩者之差I2-I1主 要包含信號光的焦外信息，對于共焦顯微系統(tǒng)來說，真正有用的信號為焦內信息，焦外信息屬于干擾，則我們可以將兩針孔相減分離出的焦外信息從第一探測器探測的光強I1中減去以獲得更高的橫向分辨率。一般第一針孔面積在0. 5 2個愛里斑之間，第二針孔面積在2 5個愛里斑之間，優(yōu)選的方案中，第一個針孔面積為I. 5個愛里斑，第二個針孔為4. 5個愛里斑，則最終信號強度為I3 = Ira (I2-I1), a是為了使I1中的焦外信息強度和相應的I2-I1中的焦外信息強度匹配，優(yōu)選的a大小為0.5，結果如圖3所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。若第二針孔被環(huán)形孔替代，則通過環(huán)形孔的光強則本身就具有I2-I1的特性，即有I' S = I2-I1，同時I' : = I' 3=I'「a I' 2，優(yōu)選的方案為第一個針孔面積為
I.5個愛里斑，環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑，a大小為0.5，結果如圖4所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。其中，若13和1' 3出現(xiàn)負值部分，我們采取將負值部分舍去(歸0)，舍去原則是不使信號失真，負值部分的大小可由a來控制，優(yōu)選的a可以保證信號的不失真。其中，本發(fā)明中的第一針孔和第二針孔大小可以互換，互換后只是數(shù)據(jù)處理上有差異，有I3 = I2- a (I1-I2)，若此時要以環(huán)形孔替換，此時需要替換針孔較大的第一針孔，則有r 3 = I' 2-ar 10因為兩測量光路共軛，所以互換無特別實際意義，所以本發(fā)明以第一針孔為小針孔和第二針孔為大針孔為例說明。本發(fā)明具有以下有益的技術效果(I)橫向分辨率顯著提高，打破橫向光學衍射極限的限制；(2)裝置結構簡潔，數(shù)據(jù)處理方便，特別適用于共焦顯微系統(tǒng)；(3)與現(xiàn)有基于針孔的超分辨顯微方法相比，無需對針孔進行移動，操作簡單，且可以在保持高信噪比的情況下提高系統(tǒng)的橫向分辨率。


圖I為本發(fā)明針對非熒光樣品的一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置示意圖。
圖2為本發(fā)明針對熒光樣品的一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置示意圖。圖3為本發(fā)明的第一針孔示意圖。圖4為本發(fā)明的第二針孔示意圖。圖5為本發(fā)明的環(huán)形孔示意圖。圖6為本發(fā)明的兩不同大小針孔下兩點擴散函數(shù)歸一化曲線以及它們處理后的信號歸一化曲線，I1對應小針孔，I2對應大針孔，I3 = I1-O^(I2-I1)。圖7為本發(fā)明的第一針孔和環(huán)形孔下兩點擴散函數(shù)歸一化曲線以及它們處理后的信號歸一化曲線，I':對應小針孔，I' 2對應環(huán)形孔，I' 3=1' 1-0. 51; 2。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實施例I如圖I所示，一種針對非熒光樣品的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括激光器I，單模光纖2,準直透鏡3,偏振片4,偏振分束器5,四分之一波片6,第一透鏡7,納米平移臺9，第二透鏡10，分束器11，第一針孔12，第一探測光纖13，第一探測器14，第二針孔15，第二探測光纖16，第二探測器17，計算機18。其中，激光器I發(fā)出激光光束，單模光纖2、準直透鏡3、偏振片4、偏振分束器5、四分之一波片6和第一透鏡7依次設置在激光光束光路的光軸上。單模光纖2的出射端面位于準直透鏡3的物方焦點處，單模光纖2和準直透鏡3對激光光束進行準直，偏振片4將準直后光束調制為平行偏振光，偏振分束器5使該平行偏振光全部透射通過，四分之一波片6將透射后的平行偏振光調制為圓偏振光，第一透鏡7聚焦該圓偏振光并收集聚焦后反射和散射的光束，四分之一波片6還將第一透射7收集的返回的反射光和散射光調制為垂直偏振光，偏振分束器5還使該垂直偏振光通過后全部反射。第二透鏡10,分束器11,第一針孔12和第一探測光纖13依次設置在偏振分束器5的反射光路(垂直偏振光經過偏振分束器5反射出來的光路)的光軸上,且第一探測光纖14的光纖端面放置在第二透鏡10的焦平面，第二探測光纖16的光纖端面放置在第二透鏡10的焦平面關于分束器11所成的鏡像平面上；第一針孔12緊貼第一探測光纖13的光纖端面放置，光軸依次通過第一針孔12中心和第一探測光纖13的光纖端面中心；第二針孔15緊貼第二探測光纖16的光纖端面放置，光軸依次通過第二針孔15中心和第二探測光纖16的光纖端面中心；第一探測光纖13和第二探測光纖16能夠分別完全收集第一針孔12和第二針孔15透射過來的測量光；第一探測光纖13與第一探測器14相連，第二探測光纖16與第二探測器17相連；第一探測器14和第二探測器17分別與計算機18相連，計算機18同時連接納米平移臺9，納米平移臺9用于接收計算機18的信號來水平掃描待測樣品8，樣品8放置在第一透鏡7的焦平面上。第二透鏡10將通過偏振分束器5的反射光進行聚焦，分束器11將聚焦后的反射光為兩束測量光，第一針孔12和第二針孔15分別對這兩束測量光進行濾波，第一探測光纖13和第二探測光纖16分別對這兩束濾波后的測量光進行耦合并各獲取一個光強信號，第一探測器14和第二探測器17分別將這兩個光強信號轉化為電信號，計算機18收到兩電信號后進行分析處理，并同時輸出指令信號給納米平移臺9，納米平移臺9根據(jù)該指令進行移動，從而精確完成樣品掃描。
如圖I所示的裝置，其工作步驟如下(I)激光器I發(fā)射出光束，經單模光纖2耦合和準直透鏡3準直，得到準直光束；準直光束經偏振片4調制為平行偏振光(p光)，平行偏振光經由偏振分束器5全部透射后，再經四分之一波片6調制為圓偏振光；圓偏振光經第一透鏡7聚焦到樣品8表面；(2)圓偏振光在樣品表面發(fā)生反射和散射，得到的反射光和散射光沿原光路逆向返回，先被第一透鏡7收集，再經過四分之一波片6調制為垂直偏振光(s光)；垂直偏振光經由偏振分束器5全部反射形成第一反射光，第一反射光經由第二透鏡10聚焦后，通過分束器11分為強度相等的第一測量光和第二測量光，第一測量光通過第一針孔12后聚焦于第一探測光纖13的光纖端面，第二測量光通過第二針孔16后聚焦于第二探測光纖17的光纖端面；第一探測光的焦點與第一探測光纖13的光纖端面中心重合，第二探測光的焦點與第二探測光纖16的光纖端面中心重合；第一針孔12所在平面緊貼第一探測光纖13的光纖端面，且第一探測光光軸垂直通過第一針孔12中心；第二針孔15所在平面緊貼第二探測光纖16的光纖端面，且第二探測光光軸垂直通過第二針孔15中心；第一探測光纖13和第二探測光纖16能夠分別完全收集第一針孔12和第二針孔15透射過來的信號光； (3)第一探測光纖13另一端連接第一探測器14，第二探測光纖16連接第二探測器17，第一探測器14和第二探測器17分別與計算機18相連；第一探測光纖13通過耦合將經第一針孔12濾波的測量光傳至第一探測器14，第一探測器14將光信號轉化為電信號傳至計算機18，信號設為I1 ;第二探測光纖16通過耦合將經第二針孔15濾波的測量光傳至第二探測器17，第二探測器17將光信號轉化為電信號傳至計算機18，信號設為I2 ；(4)計算機18將兩信號進行數(shù)據(jù)處理，完成一點掃描；(5)樣品8所在納米平移臺9與計算機18相連，通過計算機18來控制納米平移臺9使樣品8在垂直光軸面內移動完成二維掃描成像。分析系統(tǒng)的點擴散函數(shù)，已知第一探測器14探測的光強大小為I1，第二探測器17探測的光強大小為12，優(yōu)選的方案中，第一個針孔面積為I. 5個愛里斑(如圖3所示)，第二個針孔為4. 5個愛里斑(如圖4所示)。則最終信號強度為I3 = I「a (I2-I1),優(yōu)選的a大小為0. 5，理論結果如圖6所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。實施例2采用圖I所示的裝置針對非熒光樣品進行基于雙針孔的超分辨顯微成像，與實施例I的區(qū)別在于將實施例I中的第二針孔15換為環(huán)形孔，其他裝置不變。環(huán)形孔形狀優(yōu)選的方案中，第一針孔12面積為I. 5個愛里斑(如圖3所示)，環(huán)形孔的中心不透光面積為
I.5個愛里斑，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑(如圖5所示)。設第一探測器探測的光強大小為I' i，環(huán)形孔15探測的光強大小為I' 2，則最后點擴散函數(shù)的處理變?yōu)镮' 3 = I' rar 2，優(yōu)選的a大小為0.5，理論結果如圖7所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。實施例3如圖2所示，一種針對熒光樣品的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括激光器1，單模光纖2，準直透鏡3，二向色鏡19，第一透鏡7，納米平移臺9，第二透鏡10，分束器11，第一針孔12，第一探測光纖13，第一探測器14，第二針孔15，第二探測光纖16，第二探測器17，計算機18,帶通濾光片20。
其中，激光器I發(fā)出激光光束，單模光纖2、準直透鏡3、ニ向色鏡19、和第一透鏡7依次設置在激光光束光路的光軸上。單模光纖2的出射端面位于準直透鏡3的物方焦點處，單模光纖2和準直透鏡3對激光光束進行準直，ニ向色鏡19使準直激光全部透射通過，第一透鏡7聚焦準直激光并收集樣品被激發(fā)的熒光，第一透鏡7收集返回的熒光，ニ向色鏡19將熒光全部反射。帶通濾光片20，第二透鏡10，分束器11，第一針孔12和第一探測光纖13依次設置在ニ向色鏡19的反射光路(熒光經過ニ向色鏡19反射出來的光路)的光軸上，且第一探測光纖13的光纖端面放置在第二透鏡10的焦平面，第二探測光纖16的光纖端面放置在第ニ透鏡10的焦平面關于分束器11所成的鏡像平面上；第ー針孔12緊貼第一探測光纖13的光纖端面放置，光軸依次通過第一針孔12中心和第一探測光纖13的光纖端面中心；第二針孔15緊貼第二探測光纖16的光纖端面放置，光軸依次通過第二針孔15中心和第二探測光纖16的光纖端面中心；第一探測光纖13與第一探測器14相連，第二探測光纖16與第二探測器17相連；第一探測器14和第二探測器17與計算機18相連，計算機18同時連接納 米平移臺9，納米平移臺9用于待測樣品8，樣品8放置在第一透鏡7的焦平面上。第二透鏡10對樣品8的熒光在帶通濾光片20濾波的透射光進行聚焦，分束器11分離為兩束測量光，第一針孔12和第二針孔15分別對這兩束測量光進行濾波，第一探測光纖13和第二探測光纖16分別對這兩束濾波的測量光進行耦合并各獲取一個光強信號，第一探測器14和第二探測器17分別將這兩個光強信號轉化為電信號，計算機18收到兩電信號后進行分析處理，并同時輸出指令信號給納米平移臺9，納米平移臺9根據(jù)該指令信號進行移動，從而精確完成樣品掃描。如圖2所示的裝置，其工作步驟如下(I)激光器I發(fā)射出光束，經單模光纖2耦合和準直透鏡3準直，得到準直光束；準直光束經ニ向色鏡19全部透射后，經第一透鏡7聚焦到樣品8表面；(2)樣品8熒光被激發(fā)，得到的激發(fā)熒光沿原光路逆向返回，先被第一透鏡7收集，再由ニ向色鏡19全部反射形成第一反射光，第一反射光先經帶通濾光片20濾除非信號光波段，后經由第二透鏡10聚焦后，通過分束器11分為強度相等的第一測量光和第二測量光，第一測量光通過第一針孔12后聚焦于第一探測光纖13的光纖端面,第二測量光通過第ニ針孔15后聚焦于第二探測光纖16的光纖端面；第一探測光的焦點與第一探測光纖13的光纖端面中心重合，第二探測光的焦點與第二探測光纖16的光纖端面中心重合；第ー針孔12所在平面緊貼第一探測光纖13的光纖端面，且第一探測光光軸垂直通過第一針孔12中心；第ニ針孔15所在平面緊貼第二探測光纖16的光纖端面，且第二探測光光軸垂直通過第ニ針孔15中心；(3)第一探測光纖13另一端連接第一探測器14，第二探測光纖16連接第二探測器17，第一探測器14和第二探測器17與計算機18相連；第一探測光纖13通過耦合將經第一針孔12濾波的測量光傳至第一探測器14，第一探測器14將光信號轉化為電信號傳至計算機18，信號設為I1 ;第二探測光纖16通過耦合將經第二針孔15濾波的測量光傳至第ニ探測器17，第二探測器17將光信號轉化為電信號傳至計算機18，信號設為I2 ；(4)計算機18將兩信號進行數(shù)據(jù)處理，完成一點掃描；(5)樣品8所在納米平移臺9與計算機18相連，通過計算機18來控制納米平移臺9使樣品8在垂直光軸面內移動完成ニ維掃描成像。分析系統(tǒng)的點擴散函數(shù)，已知第一探測器14探測的光強大小為I1，第二探測器17探測的光強大小為I2，優(yōu)選的方 案中，第一針孔12面積為I. 5個愛里斑(如圖3所示)，第ニ個針孔15為4. 5個愛里斑(如圖4所示)，則最終信號強度為I3 = I1- a (I2-I1)，優(yōu)選的α大小為O. 5，，理論結果如圖6所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。實施例4采用圖2所示的裝置針對熒光樣品進行基于雙針孔的超分辨顯微成像，與實施例3的區(qū)別在于將實施例3中的第二針孔15換為環(huán)形孔，其他裝置不變。優(yōu)選的方案中，第一針孔12面積為I. 5個愛里斑(如圖3所示)，環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑(如圖5所示)，設第一探測器探測的光強大小為Γ i，環(huán)形孔探測的光強大小為Γ 2，則最后點擴散函數(shù)的處理變?yōu)棣?3=Γ rar 2，優(yōu)選的a大小為O. 5，理論結果如圖7所示，可以看到處理后的信號具有更高的橫向分辨率。
權利要求
1.ー種基于雙針孔的超分辨顯微方法，包括激光器發(fā)射出的光束聚焦到樣品的表面形成信號光，將該信號光分為強度相等的兩束光，這兩束光分別通過第一針孔和第二針孔后進入相應探測器并進行對應的處理，其特征在于，所述第一針孔面積為0. 5 2個愛里斑，所述第二針孔面積為2 5個愛里斑。
2.如權利要求I所述的基于雙針孔的超分辨顯微方法，其特征在于，所述第一針孔面積為I. 5個愛里斑，所述第二針孔面積為4. 5個愛里斑。
3.如權利要求2所述的基于雙針孔的超分辨顯微方法，其特征在干，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑。
4.一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括用于發(fā)出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透鏡和用于承載待測樣品的納米平移臺，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透鏡和分束器，分別用于對所述分束器射出的第一測量光和第二測量光進行濾波的第一針孔和第二針孔，以及收集通過所述第一針孔和第二針孔的光強信號的探測系統(tǒng)，其特征在于，所述第一針孔面積為0. 5 2個愛里斑，所述第二針孔面積為2 5個愛里斑。
5.如權利要求4所述的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，其特征在干，所述第一針孔面積為I. 5個愛里斑，所述第二針孔面積為4. 5個愛里斑。
6.如權利要求5所述的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，其特征在干，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為I. 5個愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4. 5個愛里斑。
7.如權利要求4所述的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，其特征在于，所述激光器與偏振片之間依次設有用于對光束進行耦合的單模光纖和對光束進行準直的準直透鏡。
8.一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括用于發(fā)出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的第一透鏡和用于承載待測樣品的納米平移臺，用于將所述樣品表面發(fā)出的信號光分為第一測量光和第二測量光的分束器，分別用于對所述分束器射出的第一測量光和第二測量光進行濾波的第一針孔和第二針孔，以及收集通過所述第一針孔和第二針孔的光強信號的探測系統(tǒng)，其特征在于，所述第一透鏡和激光器之間設有用于反射所述樣品表面發(fā)出的信號光的ニ向色鏡，所述ニ向色鏡與所述分束器之間設有帶通濾光片。
9.如權利要求8所述的基于雙針孔的超分辨顯微裝置，其特征在干，所述激光器與ニ向色鏡之間依次設有用于對光束進行耦合的單模光纖和對光束進行準直的準直透鏡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于雙針孔的超分辨顯微方法以及應用此方法的裝置，其中方法包括激光器發(fā)射出的光束聚焦到樣品的表面形成信號光，將該信號光分為強度相等的兩束光，這兩束光分別通過第一針孔和第二針孔后進入相應探測器并進行對應的處理，所述第一針孔面積為0.5～2個愛里斑，所述第二針孔面積為2～5個愛里斑，且第一針孔的面積小于第二針孔。本發(fā)明通過對兩個在不同針孔大小濾波作用下的共焦信號進行分析和處理，橫向分辨率得到顯著改善，實現(xiàn)了橫向超分辨。
文檔編號G02B21/06GK102735670SQ201210226309
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年6月29日
發(fā)明者匡翠方, 李帥, 王軼凡, 顧兆泰 申請人:浙江大學