專利名稱：一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微成像方法及系統(tǒng)，具體地說是指一種適用于大樣本的，基于結(jié)構(gòu)光三維層析的顯微光學成像方法及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在光學顯微鏡領(lǐng)域，人們一直追求能在更大的成像區(qū)域內(nèi)對獲取樣本的三維細節(jié)信息。但這一目標受到三方面的因素的制約，一是散射光的存在會導致背景光的產(chǎn)生，導致傳統(tǒng)顯微鏡成像除了得到物鏡焦面上的信息，還會疊加上來自其它區(qū)域的模糊背景，無法獲得樣本的三維層析圖像；二是受限于顯微物鏡的視場和成像速度，對于厘米級大樣本的顯微成像通常需要數(shù)十天，這不僅是對成像系統(tǒng)穩(wěn)定性和壽命本身是一個很大的挑戰(zhàn)，成像樣本也很難在成像環(huán)境下長時間保持性狀不變；三是標記樣本的成像信號強度會由于蛋白的光漂白效應而在整個成像過程中不斷下降，成像時 間越長，曝光量越大，光漂白對成像的負面影響越大。
美國專利US6376818中描述結(jié)構(gòu)光顯微成像作為一種具有獲得光學斷層成像數(shù)據(jù)的成像技術(shù)，基于面掃探測方式使其具有對樣本進行快速成像的潛力。目前的結(jié)構(gòu)光顯微鏡的大都基于光柵作為光源的調(diào)制器，使用壓電位移的方式實現(xiàn)對結(jié)構(gòu)照明光的相移， 這使得結(jié)構(gòu)光顯微鏡的成像速度嚴重受限于光柵機械位移的速度，一般情況只有I赫茲左右。另一類基于數(shù)字微鏡陣列的結(jié)構(gòu)光顯微鏡中(例如中國專利，申請?zhí)?00810071628. 5， 201110448980. 8)，探測器進行曝光期間，數(shù)字微鏡驅(qū)動版通過產(chǎn)生一系列的脈寬調(diào)制信號 (PWM)控制每個微鏡開關(guān)狀態(tài)的占空比，數(shù)字微鏡時刻在翻轉(zhuǎn)，在不同的兩個狀態(tài)下不停切換，產(chǎn)生256級不同亮度灰度圖案。雖然數(shù)字微鏡陣列中單個微鏡的切換速度可達數(shù)萬赫茲，但這種灰度調(diào)制方式將其有效調(diào)制速度限制在數(shù)十赫茲的水平上。且微型反射鏡不斷的翻轉(zhuǎn)，使得即使在最亮的灰度級數(shù)下，灰度調(diào)制的微鏡陣列也無法將照明光全部反射至， 照明光的利用率較低，降低了結(jié)構(gòu)光照明圖案的調(diào)制深度，影響了成像速度和成像效果。
綜上所述，現(xiàn)存的針對大樣本的三維顯微成像方法和系統(tǒng)存在以下不足(1)成像速度慢，對于結(jié)構(gòu)光顯微鏡，其成像速度主要受限于調(diào)制器的有效調(diào)制頻率；(2)光漂白影響成像質(zhì)量。這些問題在實際應用中限制了此類方法的發(fā)展和應用，因此發(fā)展一種適用于大樣本的快速三維顯微成像方法和系統(tǒng)很有必要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的提供一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統(tǒng)，目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中成像速度慢，對樣本光漂白嚴重，機械加工對樣本形態(tài)的影響的缺點。
一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟
(I)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動平移臺之上；
(2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，作為結(jié)構(gòu)光顯微鏡中的空間光調(diào)制器，對于照明光進行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米的深度內(nèi)的圖像；
(3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；
(4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務。
所述步驟(2 )具體方法為
(a)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下指當面陣相機進行曝光時，數(shù)字微鏡陣列中的每個微型反射鏡都工作在穩(wěn)定狀態(tài)下，不進行任何翻轉(zhuǎn)，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態(tài)，分別對應微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態(tài)，不存在灰度的變化；
(b)當曝光完成后，數(shù)字微鏡陣列的微鏡進行翻轉(zhuǎn)，改變至下一相位圖案，同時觸發(fā)面陣相機進行再次曝光，重復該過程直到完成結(jié)構(gòu)光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集；
(c)步驟(b)完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡統(tǒng)一翻轉(zhuǎn)至入射光非出射的角度上， 阻擋照明光照射到樣本上；
(d)壓電位移器帶動物鏡進行軸向移動，使物鏡焦面對準同一個成像子區(qū)域的更深層樣本進行成像。
(e)采集得到的圖像存儲在計算機硬盤或者內(nèi)存中，利用公式
權(quán)利要求
1.一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動平移臺之上； (2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，對照明光進行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米深度內(nèi)的圖像； (3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分； (4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于所述步驟(2)具體方法為 (a)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下指當面陣相機進行曝光時，數(shù)字微鏡陣列中的每個微型反射鏡都工作在穩(wěn)定狀態(tài)下，不進行任何翻轉(zhuǎn)，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態(tài)，分別對應微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態(tài)，不存在灰度的變化； (b)當曝光完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡進行翻轉(zhuǎn)，改變至下一相位圖案，同時觸發(fā)面陣相機進行再次曝光，重復該過程直到完成結(jié)構(gòu)光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集； (c)步驟(b)完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡統(tǒng)一翻轉(zhuǎn)至入射光非出射的角度上，阻擋照明光照射到樣本上； (d)壓電位移器帶動物鏡進行軸向移動，使物鏡焦面對準同一個成像子區(qū)域的更深層樣本進行成像； Ce)采集得到的圖像存儲在計算機硬盤或者內(nèi)存中，利用公式
3.一種大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，包括光源、光導、一塊激發(fā)濾光片、一塊發(fā)射濾光片、三塊透鏡、數(shù)字微鏡陣列、二塊反射鏡、一塊二向色鏡、壓電位移器、物鏡、精密三維電動平移臺、面陣相機、數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動板、壓電位移驅(qū)動器、平臺控制器、圖像采集卡、計算機、金剛石或硬質(zhì)合金刀具，其特征在于計算機分別與數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動板、壓電位移驅(qū)動器、平臺控制器、圖像采集卡相連，數(shù)字微鏡陣列與數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動板相連，壓電位移器與壓電位移驅(qū)動器相連，精密三維電動平移臺與平臺控制器相連，面陣相機與圖像采集卡相連，面陣相機受數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動板輸出的觸發(fā)脈沖信號控制采集時刻；由光源出射的光耦合入光導中，均勻化后經(jīng)由激發(fā)濾光片、第一透鏡進行準直，第一反射鏡將光束反射至數(shù)字微鏡陣列中，當數(shù)字微鏡陣列中的微鏡處于12狀態(tài)時，被微鏡反射的光線經(jīng)由第二反射鏡被第二透鏡收集，經(jīng)過二向色鏡反射后進入固定在壓電位移器上的物鏡中；樣本固定在精密三維電動平移臺之上，樣本接受激發(fā)光后發(fā)出的光經(jīng)物鏡、二向色鏡，第三透鏡和發(fā)射濾光片，最后在面陣相機上成像；金剛石或硬質(zhì)合金刀具固定在鋼制刀架上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的光源為LED、鹵素燈或汞燈。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的光導為光纖或液態(tài)光導。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的面陣相機為電荷耦合元件CCD相機或互補金屬氧化物半導體CMOS相機。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大樣本快速三維顯微成像的方法及系統(tǒng)，本發(fā)明方法(1)樣本包埋在樣本塊中固定在精密三維電動平移臺上；(2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，對照明光進行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層1－100微米深度內(nèi)的圖像；(3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；(4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務。本發(fā)明的數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，有效加快成像速度；通過數(shù)字微鏡陣列與面陣相機的曝光同步方法，使得只有在面陣相機曝光時樣本才會接受到激發(fā)光的照射，進一步降低樣本的曝光量，避免光漂白效應對成像帶來負面影響。
文檔編號G02B21/06GK102928970SQ201210402820
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者駱清銘, 龔輝, 許冬力, 李安安 申請人:華中科技大學