多模式光學(xué)高分辨顯微鏡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多模式光學(xué)高分辨顯微鏡，集成了多種先進顯微光學(xué)成像技術(shù)，可以在一臺顯微系統(tǒng)里同時實現(xiàn)共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED顯微成像和STED雙光子融合成像，形成一個多功能的高分辨光學(xué)顯微鏡，能夠適用于多種研究領(lǐng)域，成為生物醫(yī)學(xué)強有力的研究工具。
【專利說明】多模式光學(xué)高分辨顯微鏡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微物鏡光學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種多模式光學(xué)高分辨顯微鏡。
【背景技術(shù)】
[0002]高分辨顯微光學(xué)成像技術(shù)是人們從宏觀轉(zhuǎn)向微觀，在細(xì)胞分子水平實時動態(tài)揭示生命的構(gòu)成和調(diào)控機制，獲得一系列原創(chuàng)性科學(xué)發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)生命科學(xué)與物理、化學(xué)等學(xué)科的全面交叉融合的重要手段。
[0003]激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanning Confocal Microscopy,LSCM)是一款高分辨光學(xué)顯微鏡，在生物和工業(yè)檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，共聚焦顯微鏡采用精密針孔濾波技術(shù)，使得只有處于焦平面位置上的信息能夠被探測，最大限度地抑制了非聚焦平面的雜散光，具有很高的成像分辨率和信噪比；同時系統(tǒng)沿Z軸方向可以實現(xiàn)無損光學(xué)斷層掃描，從而實現(xiàn)對樣本的三維成像。
[0004]雙光子顯微鏡可以看著是在共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一款高端光學(xué)顯微鏡，它利用超短脈沖激光作為激發(fā)光源，熒光分子同時吸收兩個長波長的光子發(fā)射出一個短波長的光子，實現(xiàn)了對深層組織高分辨觀察成像，成像深度達到600 μ m左右，克服了共聚焦顯微鏡觀測樣本深度淺的缺點。
[0005]受激福射損耗(Stimulated emission depletion, STED)顯微鏡是在共聚焦顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的超分辨顯微鏡，它克服了光學(xué)衍射極限的限制，分辨率可以達到10-60納米，遠(yuǎn)高于共聚焦和雙光子顯微鏡的分辨率。
[0006]STED雙光子顯微鏡結(jié)合了 STED顯微技術(shù)分辨率高和雙光子顯微技術(shù)成像深度深的特點，可以實現(xiàn)對較深組織的超分辨成像。
[0007]以上所列的高分辨顯微鏡各有優(yōu)缺點，分別適用于不同的研究領(lǐng)域。這些高分辨顯微鏡均是從共聚焦顯微成像技術(shù)發(fā)展起來的，如果把這些顯微成像技術(shù)集成起來，在一臺顯微鏡里可以實現(xiàn)共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED顯微成像和STED雙光子顯微成像，則將形成一個多功能的高分辨光學(xué)顯微鏡，能夠適用于多種研究領(lǐng)域，成為生物醫(yī)學(xué)強有力的研究工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是:提供一種多模式光學(xué)高分辨顯微鏡，該多模式光學(xué)高分辨顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED顯微成像和STED雙光子融合成像，可以適用于多種研究領(lǐng)域。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種光學(xué)掃描顯微系統(tǒng)，包括第一 STED照明單兀、第二STED照明單元、飛秒激光、合束分束二色鏡單元、物鏡、三維納米位移臺、熒光成像單元和控制單元；
[0010]所述第一 STED照明單兀包括第一損耗光激光、第一潤旋相位片、第一 1/4玻片、第一二色鏡和第一激發(fā)光激光，所述第一渦旋相位片用于在損耗光激光束中引入0-2位的渦旋相位分布，所述第一 1/4玻片用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光；
[0011]所述第二 STED照明單元包括第二損耗光激光、第二渦旋相位片、第二 1/4玻片、第二二色鏡和第二激發(fā)光激光，所述第二渦旋相位片用于在損耗光激光束中引入0-2 π位的渦旋相位分布，所述第二 1/4玻片用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光；
[0012]所述合束分束二色鏡包括與所述第一 STED照明單元和所述第二 STED照明單元的光路連接的第三二色鏡、與所述第一 STED照明單元和所述飛秒激光光路連接的第四二色鏡及第五二色鏡；
[0013]所述熒光成像單元包括帶通濾波片、成像透鏡、針孔及光電倍增管；
[0014]所述控制單元與所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光、第二激發(fā)光激光、飛秒激光、三維納米位移臺及光電倍增管電性連接，所述控制單元用于控制所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光、第二激發(fā)光激光及飛秒激光的開啟和關(guān)閉、控制所述三維納米位移臺沿X Y Z方向的移動；
[0015]所述控制單元控制關(guān)閉所述第一損耗光激光、所述第二損耗光激光和所述飛秒激光并控制開啟所述第一激發(fā)光激光和/或所述第二激發(fā)光激光，所述第一激發(fā)光激光出射的光束經(jīng)所述第一二色鏡反射后進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成艾里斑狀光斑，所述艾里斑狀光斑激發(fā)所述樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)共聚焦顯微成像；
[0016]所述控制單元控制關(guān)閉所述飛秒激光并控制開啟所述第一損耗光激光和所述第一激發(fā)光激光，所述第一損耗光激光出射的光束經(jīng)所述第一渦旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色鏡進入所述第四二色鏡，經(jīng)所述第四二色鏡反射后的光束再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成面包圈狀光斑；所述第一激發(fā)光激光出射的光束所述第一二色鏡反射后進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成艾里斑狀光斑；所述艾里斑狀光斑和所述面包圈狀光斑重疊，以使位于所述艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被所述第一損耗光激光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，所述艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)STED成像；
[0017]所述控制單元控制關(guān)閉所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光和第二激發(fā)光激光，并控制開啟所述飛秒激光，所述飛秒激光出射的光束依次經(jīng)所述第四二色鏡、第三二色鏡及第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡焦面處形成艾里斑狀光斑，所述艾里斑狀光斑激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)雙光子成像；
[0018]所述控制單元控制關(guān)閉所述第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光和第二激發(fā)光激光并控制開啟所述飛秒激光和第一損耗光激光，所述第一損耗光激光出射的光束經(jīng)所述第一渦旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色鏡進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成面包圈狀光斑；所述飛秒激光出射的光束依次經(jīng)所述第四二色鏡、第三二色鏡及第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡焦面處形成艾里斑狀光斑；所述艾里斑狀光斑和所述面包圈狀光斑重疊，以使位于所述艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被所述第一損耗光激光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，所述艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)STED雙光子融合成像。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0020]本發(fā)明提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡，集成了多種先進顯微光學(xué)成像技術(shù),可以在一臺顯微系統(tǒng)里同時實現(xiàn)共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED顯微成像和STED雙光子融合成像，形成一個多功能的高分辨光學(xué)顯微鏡，能夠適用于多種研究領(lǐng)域，成為生物醫(yī)學(xué)強有力的研究工具。
[0021]另外，本發(fā)明提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡可以實現(xiàn)兩路STED同時成像，可以對樣本中的兩種熒光成分同時進行超分辨光學(xué)成像，擴大了 STED顯微成像的適用范圍；同時，把雙光子成像技術(shù)和STED成像技術(shù)融合在一起，可以實現(xiàn)對較深組織的光學(xué)超分辨成像，將開拓新的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]其中:第一 STED照明單元110、第二 STED照明單元120、飛秒激光130、合束分束二色鏡單元140、物鏡150、三維納米位移臺160、熒光成像單元170、控制單元180、第一損耗光激光111、第一潤旋相位片112、第一 1/4玻片113、第一二色鏡114、第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121、第二渦旋相位片122、第二 1/4玻片123、第二二色鏡124、第二激發(fā)光激光125、第三二色鏡141、第四二色鏡142、第五二色鏡143、帶通濾波片171、成像透鏡172、針孔173、光電倍增管174?！揪唧w實施方式】
[0024]請參考圖1，圖1為本發(fā)明實施例提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡100的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]多模式光學(xué)高分辨顯微鏡100包括第一 STED照明單元110、第二 STED照明單元120、飛秒激光130、合束分束二色鏡單元140、物鏡150、三維納米位移臺160、熒光成像單元170和控制單元180。
[0026]第一 STED照明單兀110包括第一損耗光激光111、第一潤旋相位片112、第一 1/4玻片113、第一二色鏡114和第一激發(fā)光激光115,其中,第一潤旋相位片112用于在損耗光激光束中引入0-2 π位的渦旋相位分布，第一 1/4玻片113用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光。
[0027]第二 STED照明單元120包括第二損耗光激光121、第二渦旋相位片122、第二 1/4玻片123、第二二色鏡124和第二激發(fā)光激光125，第二渦旋相位片122用于在損耗光激光束中引入0-2 π位的渦旋相位分布，第二 1/4玻片123用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光。
[0028]合束分束二色鏡140包括與第一 STED照明單元110和第二 STED照明單元120的光路連接的第三二色鏡141、與第一 STED照明單元110和飛秒激光130光路連接的第四二色鏡142及第五二色鏡143。
[0029]熒光成像單元170包括帶通濾波片171、成像透鏡172、針孔173及光電倍增管174。
[0030]控制單兀180與第一損耗光激光111、第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121、第二激發(fā)光激光125、飛秒激光130、三維納米位移臺160及光電倍增管174電性連接，控制單兀180用于控制第一損耗光激光111、第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121、第二激發(fā)光激光125及飛秒激光130的開啟和關(guān)閉、及控制三維納米位移臺160沿X Y Z方向的移動。
[0031]控制單兀180控制關(guān)閉第一損耗光激光111、第二損耗光激光121和飛秒激光130并控制開啟第一激發(fā)光激光115和/或第二激發(fā)光激光125，第一激發(fā)光激光115出射的光束經(jīng)第一二色鏡114反射后進入第四二色鏡142，光束經(jīng)第四二色鏡142反射后再分別經(jīng)第三二色鏡141、第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150的焦面處形成艾里斑狀光斑，艾里斑狀光斑激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)物鏡150收集后被第五二色鏡143反射后進入帶通濾波片171，帶通濾波片171對熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)成像透鏡172后聚焦在針孔173處，透過針孔173的熒光經(jīng)光電倍增管174收集，光電倍增管174將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，電信號被控制單?80采集，控制單元180根據(jù)三維納米位移臺160的位置坐標(biāo)和電信號實現(xiàn)共聚焦顯微成像。可以理解，在控制單元180控制第二激發(fā)光激光125的開啟時，可以實現(xiàn)兩路共聚焦顯微成像模式。
[0032]控制單元180控制關(guān)閉飛秒激光130并控制開啟第一損耗光激光111和第一激發(fā)光激光115,第一損耗光激光111出射的光束經(jīng)第一潤旋相位片112和第一 1/4玻片113后再透射第一二色鏡114進入第四二色鏡142，經(jīng)第四二色鏡142反射后的光束再分別經(jīng)第三二色鏡141、第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150的焦面處形成面包圈狀光斑；第一激發(fā)光激光115出射的光束第一二色鏡114反射后進入第四二色鏡142，光束經(jīng)第四二色鏡142反射后再分別經(jīng)第三二色鏡141、第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150的焦面處形成艾里斑狀光斑；艾里斑狀光斑和面包圈狀光斑重疊，以使位于艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被第一損耗光激光111退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)物鏡150收集后被第五二色鏡143反射后進入帶通濾波片171，帶通濾波片171對熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)成像透鏡172后聚焦在針孔173處，透過針孔173的熒光經(jīng)光電倍增管174收集，光電倍增管174將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺娦盘柋豢刂茊卧?80采集，控制單元180根據(jù)三維納米位移臺160的位置坐標(biāo)和電信號實現(xiàn)STED成像。可以理解，在控制單元180開啟第二損耗光激光121和第二激發(fā)光激光125,可以實現(xiàn)第二路STED成像；同時開啟第一損耗光激光111、第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121和第二激發(fā)光激光125，可以實現(xiàn)兩路STED同時成像。
[0033]控制單兀180控制關(guān)閉第一損耗光激光111、第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121和第二激發(fā)光激光125，并控制開啟飛秒激光130，飛秒激光130出射的光束依次經(jīng)第四二色鏡142、第三二色鏡141及第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150焦面處形成艾里斑狀光斑，艾里斑狀光斑激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)物鏡150收集后被第五二色鏡143反射后進入帶通濾波片171，帶通濾波片171對熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)成像透鏡172后聚焦在針孔173處，透過針孔173的熒光經(jīng)光電倍增管174收集，光電倍增管174將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，電信號被控制單?80采集，控制單元180根據(jù)三維納米位移臺160的位置坐標(biāo)和電信號實現(xiàn)雙光子成像。
[0034]控制單元180控制關(guān)閉第一激發(fā)光激光115、第二損耗光激光121和第二激發(fā)光激光125并控制開啟飛秒激光130和第一損耗光激光111，第一損耗光激光111出射的光束經(jīng)第一渦旋相位片112和第一 1/4玻片113后再透射第一二色鏡114進入第四二色鏡142，光束經(jīng)第四二色鏡142反射后再分別經(jīng)第三二色鏡141、第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150的焦面處形成面包圈狀光斑；飛秒激光130出射的光束依次經(jīng)第四二色鏡142、第三二色鏡141及第五二色鏡143透射后進入物鏡150，并在物鏡150焦面處形成艾里斑狀光斑；艾里斑狀光斑和面包圈狀光斑重疊，以使位于艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被第一損耗光激光111退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光111退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)物鏡150收集后被第五二色鏡143反射后進入帶通濾波片171，帶通濾波片171對熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)成像透鏡172后聚焦在針孔173處，透過針孔173的熒光經(jīng)光電倍增管174收集，光電倍增管174將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，電信號被控制單?80采集，控制單元180根據(jù)三維納米位移臺160的位置坐標(biāo)和電信號實現(xiàn)STED雙光子融合成像。
[0035]本發(fā)明提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡100,集成了多種先進顯微光學(xué)成像技術(shù)，可以在一臺顯微系統(tǒng)里同時實現(xiàn)共聚焦顯微成像、雙光子顯微成像、STED顯微成像和STED雙光子融合成像，形成一個多功能的高分辨光學(xué)顯微鏡，能夠適用于多種研究領(lǐng)域，成為生物醫(yī)學(xué)強有力的研究工具。
[0036]另外，本發(fā)明提供的多模式光學(xué)高分辨顯微鏡可以實現(xiàn)兩路STED同時成像，可以對樣本中的兩種熒光成分同時進行超分辨光學(xué)成像，擴大了 STED顯微成像的適用范圍；同時，把雙光子成像技術(shù)和STED成像技術(shù)融合在一起，可以實現(xiàn)對較深組織的光學(xué)超分辨成像，將開拓新的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。
[0037]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種多模式光學(xué)高分辨顯微鏡，其特征在于，包括第一 STED照明單元、第二 STED照明單元、飛秒激光、合束分束二色鏡單元、物鏡、三維納米位移臺、熒光成像單元和控制單元; 所述第一 STED照明單元包括第一損耗光激光、第一渦旋相位片、第一 1/4玻片、第一二色鏡和第一激發(fā)光激光，所述第一渦旋相位片用于在損耗光激光束中引入0-2 π位的渦旋相位分布，所述第一 1/4玻片用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光； 所述第二 STED照明單元包括第二損耗光激光、第二渦旋相位片、第二 1/4玻片、第二二色鏡和第二激發(fā)光激光，所述第二渦旋相位片用于在損耗光激光束中引入0-2 π位的渦旋相位分布，所述第二 1/4玻片用于將損耗光激光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光； 所述合束分束二色鏡包括與所述第一 STED照明單元和所述第二 STED照明單元的光路連接的第三二色鏡、與所述第一 STED照明單元和所述飛秒激光光路連接的第四二色鏡及第五二色鏡； 所述熒光成像單元包括帶通濾波片、成像透鏡、針孔及光電倍增管； 所述控制單元與所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光、第二激發(fā)光激光、飛秒激光、三維納米位移臺及光電倍增管電性連接，所述控制單元用于控制所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光、第二激發(fā)光激光及飛秒激光的開啟和關(guān)閉及控制所述三維納米位移臺沿X Y Z方向的移動； 所述控制單元控制關(guān)閉所述第一損耗光激光、所述第二損耗光激光和所述飛秒激光并控制開啟所述第一激發(fā)光激光和/或所述第二激發(fā)光激光，所述第一激發(fā)光激光出射的光束經(jīng)所述第一二色鏡反射后進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成艾里斑狀光斑，所述艾里斑狀光斑激發(fā)所述樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射 后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)共聚焦顯微成像； 所述控制單元控制關(guān)閉所述飛秒激光并控制開啟所述第一損耗光激光和所述第一激發(fā)光激光，所述第一損耗光激光出射的光束經(jīng)所述第一潤旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色鏡進入所述第四二色鏡，經(jīng)所述第四二色鏡反射后的光束再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成面包圈狀光斑；所述第一激發(fā)光激光出射的光束所述第一二色鏡反射后進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成艾里斑狀光斑；所述艾里斑狀光斑和所述面包圈狀光斑重疊，以使位于所述艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被所述第一損耗光激光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，所述艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)STED成像； 所述控制單元控制關(guān)閉所述第一損耗光激光、第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光和第二激發(fā)光激光，并控制開啟所述飛秒激光，所述飛秒激光出射的光束依次經(jīng)所述第四二色鏡、第三二色鏡及第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡焦面處形成艾里斑狀光斑，所述艾里斑狀光斑激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控制單元根?jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)雙光子成像； 所述控制單元控制關(guān)閉所述第一激發(fā)光激光、第二損耗光激光和第二激發(fā)光激光并控制開啟所述飛秒激光和第一損耗光激光，所述第一損耗光激光出射的光束經(jīng)所述第一渦旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色鏡進入所述第四二色鏡，所述光束經(jīng)所述第四二色鏡反射后再分別經(jīng)所述第三二色鏡、第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡的焦面處形成面包圈狀光斑；所述飛秒激光出射的光束依次經(jīng)所述第四二色鏡、第三二色鏡及第五二色鏡透射后進入所述物鏡，并在所述物鏡焦面處形成艾里斑狀光斑；所述艾里斑狀光斑和所述面包圈狀光斑重疊，以使位于所述艾里斑狀光斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子，被所述第一損耗光激光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，所述艾里斑狀光斑中央?yún)^(qū)域未被所述第一損耗光激光退激發(fā)的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，所述熒光經(jīng)所述物鏡收集后被所述第五二色鏡反射后進入所述帶通濾波片，所述帶通濾波片對所述熒光中殘留的激光進行截止，同時透射熒光，透射出的熒光經(jīng)所述成像透鏡后聚焦在所述針孔處，透過所述針孔的熒光經(jīng)所述光電倍增管收集，所述光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，所述電信號被所述控制單元采集，所述控?單元根據(jù)所述三維納米位移臺的位置坐標(biāo)和所述電信號實現(xiàn)STED雙光子融合成像。
【文檔編號】G02B21/00GK103676123SQ201310697916
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】張運海, 姜琛昱 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所