擴(kuò)展容積的高分辨率成像的制作方法
【專利摘要】一種光片光學(xué)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括用于使用無衍射或近似無衍射和/或傳播不變性的光束形成光片的裝置，所述光束具有垂直于傳播方向的非對稱強(qiáng)度光束分布，例如艾里光束。
【專利說明】擴(kuò)展容積的高分辨率成像

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及擴(kuò)展容積的高分辨率成像的方法及系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002]容積成像的應(yīng)用可以在可以從醫(yī)療到制造業(yè)、基礎(chǔ)研究及防御的各行各業(yè)中找至IJ。通常，現(xiàn)有技術(shù)限制了能夠在給定的時(shí)間幀內(nèi)捕捉的收集容積和分辨率。以光學(xué)顯微鏡為例，共焦掃描是直到最近的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但是其收集時(shí)間受限于掃描速度，該掃描速度反過來受限于激光功率和樣本的損傷閾值。各種形式的光片顯微鏡如正交平面光學(xué)切片、選擇性平面照射顯微鏡(SPIM),超高倍顯微儀(ultramicroscopy)或數(shù)字掃描的激光片顯微鏡(DSLM)，解決了這一問題。通過以分段的方式照射待成像容積同時(shí)從被照射部分快速捕獲盡可能多的信息，例如，使用充足放置的檢測器陣列諸如電荷耦合器件相機(jī)(CCD)，防止了多余的背景信號和光損傷。隨著它的各種實(shí)現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)使快速高反差四維光學(xué)切片成為可能，并且已經(jīng)徹底改變活生物體的研究。
[0003]基于高斯光束的傳統(tǒng)光片顯微鏡的問題是高的各向同性分辨率需要嚴(yán)格聚焦的光片，因此具有高數(shù)值孔徑(NA)的照射。但是，這限制了嚴(yán)格聚焦的光片能夠保持的距離，從而限制了可用視場。因此，使用標(biāo)準(zhǔn)高斯光片的單一掃描有效地使大容積成像的能力與高分辨率成像是矛盾的。
[0004]以最大分率使大容積成像是許多研究領(lǐng)域的關(guān)鍵，諸如，生物學(xué)研究成像，無論這是原始細(xì)菌，原核生物還是真核生物，以及在亞細(xì)胞、細(xì)胞、組織以及在所有有機(jī)體中。示例包括在干細(xì)胞研究和在發(fā)育生物學(xué)中的胚胎學(xué)、細(xì)胞命運(yùn)映射(cell fate mapping)、神經(jīng)生物學(xué)、球狀體細(xì)胞。大容積的高分辨率成像也可以用在膠體物理學(xué)領(lǐng)域中，以及用于使納米結(jié)構(gòu)(比如三維超材料)成像。
[0005]已經(jīng)提出了若干解決方案。一般地，對于可能阻礙重復(fù)掃描的成像速度和光損傷的相關(guān)聯(lián)結(jié)果，這些是受限制的雙光子激發(fā)或需要大量樣本曝光。在光片顯微鏡中貝塞爾光束已經(jīng)被用來擴(kuò)展成像容積。零貝塞爾光束的橫向強(qiáng)度分布具有中心光斑和一系列遠(yuǎn)離光束中心的同心圓環(huán)。這些圓環(huán)顯著惡化了軸向分辨率。
[0006]貝塞爾光束中心的共焦檢測可以改善軸向分辨率。但是，它優(yōu)于常規(guī)的共焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是很小的，因?yàn)橥ㄟ^光片光束的共焦檢測一大部分光被遮擋，并且由于圖像是逐行獲取而不是逐平面，掃描速度受限于相機(jī)。同時(shí)先前工作表明通過使用傳播不變性、無衍射貝塞爾光束掃描容積可以被擴(kuò)展，對于單個(gè)光子激發(fā)，權(quán)衡是信噪比中的重大損失，并且分辨能力達(dá)到與生物成像相兼容的照射水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種用于創(chuàng)建在掃描方向中具有非對稱強(qiáng)度分布的光片的裝置，例如，平方艾里函數(shù)。這種光片可以是非平面的并且可以用于光學(xué)操控或者用于擴(kuò)展容積的高分辨率成像。該非對稱光片可以從無衍射、傳播不變性的光束中被創(chuàng)建，這里定義為在垂直于其傳播方向的平面保持幾乎相同的強(qiáng)度分布的任何光束。該分布可以垂直于傳播方向平移或加速。本發(fā)明的光片的無衍射性質(zhì)可以被用于擴(kuò)展視場，以及由此使光片顯微鏡的容積成像。
[0008]非對稱光片的使用能夠使高分辨率遍及整個(gè)成像容積。完全無衍射、傳播不變性的光束只存在于理論中。但是，足夠類似非衍射近似值的這種光束的存在仍然使得視場顯著擴(kuò)展。例如，使用立方相位調(diào)制的傅里葉變換簡單地生成的非對稱艾里光束，能夠擴(kuò)展一個(gè)數(shù)量級的視場，同時(shí)保持高各向同性分辨率。
[0009]可選擇的，通過在光片生成后調(diào)制照射路徑，非對稱和/或傳播不變性的光片可以從任何對稱光片中被創(chuàng)建。調(diào)制元件的位置可以被放置在照射路徑中任意方便的地方，包含在任意光學(xué)組件中，照射物鏡、光片生成元件，或者激光源的形成部分中。通過時(shí)間調(diào)制對稱和/或傳播不變性的光片強(qiáng)度同時(shí)垂直于傳播方向掃描它，非對稱強(qiáng)度分布(profile)也可以被創(chuàng)建。
[0010]本發(fā)明的光片光學(xué)系統(tǒng)可以被配置用作光片成像系統(tǒng)和/或光片光譜學(xué)系統(tǒng)，例如拉曼光譜學(xué)系統(tǒng)，和/或光片顯微鏡系統(tǒng)和/或在諸如任何惰性的顆?；蛏锏念w?；蚣?xì)胞的顆粒上施加光作用力的光片系統(tǒng)，例如光學(xué)捕獲系統(tǒng)或光引導(dǎo)系統(tǒng)。
[0011]在照射或輻射圖案(pattern)或圖案集的一般意義下，術(shù)語“光片”用于本發(fā)明的描述。術(shù)語“光片顯微鏡”或“光片成像”被使用，與“光片”如何投入到容積中或信息從被輻射部分如何被采集無關(guān)，盡管這在微小范圍內(nèi)是不必要的。
[0012]更可取的，傳播不變性、無衍射非對稱光束具有自愈性能，例如，在穿過障礙物后該光束可以自身修復(fù)(參見例如 “Optically mediated particle clearing using Airywavepackets，，by Baumgartl et al Nature Photonics, 2, November 2008)。理想地，在其調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF)中，針對低空間頻率光束應(yīng)該沒有或有最小數(shù)目零值。
[0013]光片具有非對稱的橫向強(qiáng)度分布，諸如平方艾里函數(shù)。傳播不變性、無衍射非對稱場可以具有包括相位項(xiàng)的傅里葉變換，該相位項(xiàng)在其多項(xiàng)式泰勒展開式中具有二階或更高階分量，例如三階或更高階分量。例如，艾里光束在其傅里葉變換中具有立方相位項(xiàng)。對稱強(qiáng)度分布應(yīng)該具有實(shí)數(shù)光學(xué)傳遞函數(shù)，其在失焦下將變成震蕩的并通過零點(diǎn)。這些零點(diǎn)代表無法復(fù)原的圖像信息損失，從而限制了對稱光片的視場。與此相反，任何非對稱分布產(chǎn)生復(fù)數(shù)值的光學(xué)傳遞函數(shù)，使得實(shí)數(shù)和虛數(shù)部分同時(shí)為零很少發(fā)生，即使在失焦下傳遞函數(shù)變成震蕩的。
[0014]當(dāng)用于成像時(shí)，本發(fā)明的光片可以增加缺少M(fèi)TF零點(diǎn)的視場，從而保留盡可能多的信息。對于人類觀察者，記錄的圖像序列并不需要是清晰(sharp)的并且可以顯得模糊不清的。如果它包含必要的信息，通過數(shù)字裝置(諸如典型的實(shí)時(shí)處理的簡單的一維線性反卷積)可以重建清晰圖像。通過這個(gè)混合的光學(xué)數(shù)字方式給出的附加自由度可以被利用以設(shè)計(jì)光片，以使最終處理的圖像的質(zhì)量最大化。圖象反卷積步驟只有當(dāng)人類觀察者獲取圖像時(shí)必要。機(jī)器視覺應(yīng)用，諸如樣本的自動(dòng)化檢查，可以跳過圖像反卷積步驟而直接從記錄的數(shù)據(jù)中獲得需要的信息。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，于此提供一種用于使容積成像的光片顯微鏡，包括用于使用傳播不變性、無衍射非對稱光束諸如艾里光束形成光片的裝置。盡管多光子激發(fā)光片顯微鏡學(xué)可以得益于非對稱光束，更可取地是使用單個(gè)光子激發(fā)。
[0016]為光片成像使用艾里光束為單個(gè)光子激發(fā)提供高分辨率以及大視場。只需要每一圖像分段的單個(gè)曝光；但是，一組相鄰的記錄的圖像分段包含關(guān)于重建的圖像容積的每個(gè)二維薄片(slice)的信息。因此，最理想的清晰度只有通過使用數(shù)字反卷積獲得。該技術(shù)使得例如樣本以亞細(xì)胞分辨率被研究，同時(shí)提供交互的整體視圖。該技術(shù)的線性特性促進(jìn)它的擴(kuò)展超出熒光成像到其它成像形式，這種散射和光譜學(xué)如拉曼成像和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)。
[0017]Berry, M.V.& B a I a z s , N.L.Nonspreading wave packetsAm.J.Phys.47，264-267(1979)已經(jīng)從理論上表明艾里波群是自由粒子的薛定諤方程的“無衍射”解決方法。在不存在任何外部電勢時(shí)，波群可以垂直于其傳播方向自由加速。如最近證明的，在光學(xué)領(lǐng)域，薛定諤方程和傍軸近似方程之間的數(shù)學(xué)類比可以被用于實(shí)現(xiàn)有限能量的艾里光束，參見 Siviloglou, G.A., Broky, J., Dogariu, A.&Christodoulides, D.N.“Observat1n of Accelerating Airy Beams’Thys.Rev.Lett.99，213901 (2007)。光束具有中央極大和多個(gè)表現(xiàn)出橫向運(yùn)動(dòng)的旁瓣的形式。
[0018]與直觀相反，艾里光束具有垂直于與其光場有關(guān)的傳播方向的加速[Berry, M.V.&Balazs, N.L.Nonspreading wave packets Am.J.Phys., 47, 264-267 (1979)]。相應(yīng)于橫向加速，粒子軌跡可以被誘導(dǎo)以遵循拋物線軌跡。與艾里光束一樣，其它拋物線型的光束，或者光束/光束陣列/掃描光束的適當(dāng)組合可以被使用。拋物線型的光束的示例在Davis, J.A.et al, Observat1n of accelerating parabolic beams.0pt.Express 16,12866-12871(2008)中被描述。
[0019]使用任何形式的靜態(tài)的或動(dòng)態(tài)的折射、反射或衍射光學(xué)元件或者從特定激光中直接發(fā)出的光束，本發(fā)明的非對稱光片可以被形成。使用例如空間光調(diào)制器的動(dòng)態(tài)調(diào)制提供附加優(yōu)點(diǎn)，光片可以為系統(tǒng)或樣本校正誘發(fā)畸變；但是，靜態(tài)調(diào)制可低成本的以具有適當(dāng)?shù)谋砻?折射率調(diào)制或衍射光柵的傳播或反射的光學(xué)元件的形式獲得。調(diào)制元件可以執(zhí)行多種功能，例如，其可以集成到光片生成元件、激光、透鏡、或其它任何被輻射的組件中。
[0020]可以提供用于移動(dòng)和定位非對稱光片的裝置以遍及樣本容積在不同位置捕獲圖像，以及確保檢測物鏡的焦平面關(guān)于非對稱光束光片是放置好的。
[0021]光片可以由光片的橫向結(jié)構(gòu)形成的多個(gè)光表面組成，使用檢測器陣列可以從其中并行收集信息。多個(gè)表面可以由諸如由艾里光片創(chuàng)建的非對稱光片的旁瓣形成。
[0022]為了有助于對準(zhǔn)，第二物鏡和檢測器可以被放置在照射軸上的光片路徑中。
[0023]盡管選擇的光片可能是彎曲的，但擴(kuò)展成像系統(tǒng)的視場是不必要的。但是，該彎曲可以被用于將光學(xué)‘彎曲’力施加至微觀體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]本發(fā)明的各個(gè)方面現(xiàn)在將通過舉例的方式并參考附圖進(jìn)行說明，其中:
[0025]圖1示出了艾里光束光片顯微鏡的簡單原理圖；
[0026]圖2例證了具有若干可選元件的艾里光束光片顯微鏡的可選擇的幾何結(jié)構(gòu)；
[0027]圖3示出了不同光片類型的調(diào)制傳遞函數(shù)；
[0028]圖4同樣示出了四種不同的光片及由其各自的光片類型獲得的仿真的和實(shí)驗(yàn)的圖像。該圖像示出了對于記錄的原始數(shù)據(jù)和反卷積數(shù)據(jù)量的y軸最大強(qiáng)度的投影；
[0029]圖5示出了由各種光片成像的一組人體胚胎腎臟細(xì)胞的熒光線粒體；以及
[0030]圖6示出了可以用于擴(kuò)展光片顯微鏡的成像容積的各種可供選擇的非對稱光片類型。

【具體實(shí)施方式】
[0031]圖1是光片顯微鏡的操作原理的簡單原理圖。這示出了照射傳播方向(X)、光束被擴(kuò)展以形成光片的方向(y)、以及檢測軸(z)。當(dāng)光片相對于樣本被置換的時(shí)候，沿z軸放置的檢測器從被照平面記錄一系列的圖像。
[0032]激光器的輸出光束穿過透鏡L1和L2并且被可以是柱面透鏡或者掃描裝置諸如聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)的光片生成元件(LSG)轉(zhuǎn)換為光片。透鏡L1和L2針對LSG的直徑調(diào)整光束。之后光束穿過透鏡L3和L4并且借助于遮罩MK1形成擴(kuò)展光片的成像容積。這可以是靜態(tài)的或動(dòng)態(tài)的可移動(dòng)的或可切換的空間光調(diào)制器(SLM)。這種調(diào)制可以在照射路徑中的任意點(diǎn)被引入，之前，之后，或者與諸如光片生成元件的其它光學(xué)元件結(jié)合。在這個(gè)特定配置中，透鏡L3和L4調(diào)整光束以適應(yīng)遮罩MK1的尺寸。透鏡L5和L6調(diào)整遮罩MK1輸出的光束以適應(yīng)物鏡OBJ1。
[0033]通過空間光調(diào)制器M1傳播的光照射樣本，并通過物鏡OBJ1被聚焦到特定的樣本區(qū)域。使用相同的或第二物鏡OBJ2和相機(jī)(CAM1)捕獲樣本的圖像棧。可選擇的，第三物鏡OBJ3和第二相機(jī)(CAM2)可以被用于系統(tǒng)的校正。鏡筒透鏡(TL1和TL2)可以被用來使來自物鏡(OBJ2和OBJ3)的光分別聚焦到相機(jī)(CAMi和CAM2)的有效區(qū)域(active area)。遮罩MK1創(chuàng)建例如艾里光束的光束，其為類似無衍射的(即傳播不變性的)和自愈的(selfhealing)。相對于使用傳統(tǒng)高斯光片實(shí)現(xiàn)的,這允許了沿著x軸的成像容積的至少一個(gè)數(shù)量級的擴(kuò)展。
[0034]可選擇的遮罩MK2，可以被插在或者靠近第二物鏡OBJ2的后孔徑以增加檢測路徑的景深，從而促進(jìn)對準(zhǔn)并且這可以使得制造成本減少。附加的光學(xué)元件也可以有意地引進(jìn)焦平面曲率以改善光片的檢測焦點(diǎn)的一致性。
[0035]圖2描述了可供選擇的幾何結(jié)構(gòu)的原理圖，其允許在諸如標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載片或者載盤的水平表面上的浸入樣本的水成像。如圖2所示，通過相對于水平的樣本臺45度放置的照射和檢測物鏡，這是可行的。通過如箭頭“掃描方向(scan dir.)”指示的對角地平移樣本，三維容積成像可以如先前圖1所描述的被記錄。
[0036]更具體地，圖2示出了發(fā)射光束通過透鏡L1和L2被擴(kuò)展以匹配遮罩MK1 (在這個(gè)示例中沒有使用遮罩MK2)的激光器。如前，遮罩可以是靜態(tài)的或動(dòng)態(tài)的可以移動(dòng)或可切換的空間光調(diào)制器(SLM)。穿過遮罩MK1以后，之后光束穿過透鏡L3，在這聚焦到虹膜I1并穿過另一透鏡L4，在這使其適合于光片生成元件(LSG)的直徑形成。LSG可以是柱面透鏡或者掃描裝置，諸如聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)。之后被LSG形成的光片穿過透鏡L5，在這被聚焦到虹膜I2并穿過另一透鏡L6，透鏡L6使光片對準(zhǔn)提供偏振控制的四分之一波片。從這，光片從第一反光鏡(HiiiT0r)M1被反射到第二反光鏡M2,并且從這反射到相對于水平樣本臺45度放置的照射物鏡OBJp已經(jīng)穿過臺上樣本的光穿過檢測物鏡OBJ2到第三反光鏡M3,并且從這到第四反光鏡M4，其中直接到相機(jī)CAMp
[0037]平面鏡M1到仏可以被用來促進(jìn)樣本的物鏡垂直對準(zhǔn)。在以防萬一示例中，反光鏡M2和M3可以關(guān)于物鏡OBJ1和OBJ2的軸分別被固定。反光鏡M1和M4的適當(dāng)對準(zhǔn)使得物鏡OBJ1和OBJ2和反光鏡M2和M3相對于樣本臺垂直升降而不需要改變對準(zhǔn)。
[0038]圖2的照射路徑是圖1所示的變形。各種可選擇的元件被包括以控制偏振并過濾光。在圖1和圖2中的MK1和LSG的不同順序說明許多光學(xué)元件的順序可以被重新排列。在圖2中的可選擇的虹膜I1和I2選擇了第一衍射級以使得更靈活并且阻止了樣本的不需要的照射。如圖1所示，透鏡L1至L6形成望遠(yuǎn)鏡以傳遞不同組件之間的光?？蛇x擇的偏振控制元件，λ/4，可以被引入以控制光的偏振，如，通過使線性偏振光轉(zhuǎn)換為圓偏振光，其產(chǎn)生更多相同的熒光激發(fā)。如用來阻擋激發(fā)光并選擇熒光發(fā)射的濾光片F(xiàn)可以被引入到OBJ2和相機(jī)CAM1之間。如果需要或者方便的話，照射路徑和檢測路徑的元件可以比反光鏡分別到OBJ1和OBJ2更接近。
[0039]圖3:為評價(jià)光片顯微鏡的各種光束類型的性能，已經(jīng)執(zhí)行了調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF)的研究。MTF提供的相對條紋對比度作為空間頻率的函數(shù)，提供了對各種照射類型的對比和分辨率之間的關(guān)系的理解。MTF作為光學(xué)傳遞函數(shù)的絕對值被計(jì)算，這里定義為歸一化(normalise)光片強(qiáng)度的ζ軸部分的傅里葉變換。圖3示出了光片的各種類型的MTF，(a)在照射焦點(diǎn)位置，以及(b)在失焦平面(χ = 25μπι)?？臻g頻率(νζ)被歸一化為最高傳播空間頻率歸一化為:2ΝΑ/λ，其中λ和NA分別是照射波長和數(shù)值孔徑。貝塞爾光束的兩個(gè)近似值被比較:‘貝塞爾10%’和‘貝塞爾5%’，其可以使用具有10%和5%的半徑的相對開放的部分的環(huán)形孔徑被分別形成。
[0040]圖3 (a)示出了有孔徑高斯的MTF在光片腰部(黑色的點(diǎn)劃線)提供的最高對比度。但是，從圖3(b)中可以看出對比度顯著地下降而且甚至具有很多遠(yuǎn)離光片腰部的零值。因此，傳統(tǒng)的孔徑高斯光片只是在靠近光片腰部有值。貝塞爾和艾里光束示出了焦點(diǎn)對準(zhǔn)和失焦的更小的變化，因此對于靠近光片腰部的成像是不受限制的，遵從于相關(guān)的視場增強(qiáng)。但是貝塞爾光束的MTF (藍(lán)色實(shí)線和紅色點(diǎn)線)顯著地低于艾里光束(綠色實(shí)線)所關(guān)聯(lián)的。此外，相比之下，具有5%的比較小的開放的部分的貝塞爾光束示出了按比例的減小，基本上限制了在實(shí)際中可以達(dá)到的分辨率；此外，可以示出理論的貝塞爾函數(shù)的對比度收斂為零。這是不成功的，因?yàn)橛勺钫沫h(huán)產(chǎn)生的貝塞爾光束遵從于最大的視場。一般而言，大視場只可以使用貝塞爾光束光片通過權(quán)衡分辨率被獲得。艾里光束免于這種限制性權(quán)衡。由于艾里光束的不對稱，它的傳遞函數(shù)不是嚴(yán)格的實(shí)數(shù)并且具有依賴復(fù)自變量的空間頻率。傳遞函數(shù)的復(fù)數(shù)特性使誘發(fā)變化的散焦引起它的實(shí)部和虛部同時(shí)變?yōu)榱闶欠浅２豢赡艿摹Ｋ?，對于非對稱光束，低MTF值只針對大散焦和在高空間頻率出現(xiàn)。與貝塞爾光束相關(guān)聯(lián)的顯著的對比度減小不同，相移不影響信噪比并且因此通過簡單的線性反卷積很容易被解釋。
[0041]在傳播期間，在某種程度上甚至在障礙物(諸如散射物質(zhì))存在的情況下，艾里光束保持它的橫向強(qiáng)度分布(“自愈”或“自修復(fù)”)。由于其具有旁瓣并且遵循拋物線軌跡，艾里光束可能不會(huì)出現(xiàn)光片成像的要求。但是，在實(shí)際中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用傳播不變性，無衍射艾里光束針對光片成像擴(kuò)展了至少一個(gè)數(shù)量級的有效的視場，超出使用傳統(tǒng)的孔徑高斯光束可實(shí)現(xiàn)的。
[0042]在傳統(tǒng)光片顯微鏡的照射路徑中，通過簡單的合并立方相調(diào)制，如使用具有空間上變化的光學(xué)厚度的透明材料，可以完成將傳統(tǒng)的光片顯微鏡轉(zhuǎn)換為艾里光片顯微鏡。數(shù)學(xué)上的立方相調(diào)制可以被寫作《(W+//〗)，其中α是可調(diào)整光片的傳播不變性以匹配需要的視場的參數(shù)，而μy和μ 2是分別與y和Z軸對準(zhǔn)的笛卡爾坐標(biāo)的歸一化。通過確定遮罩的方向以使艾里光束的彎曲保持在光片的平面內(nèi)使艾里光束光片成為平面的將是可能的。由于在y方向上，點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)是由時(shí)間平均的光束強(qiáng)度形成，光片MTF是艾里光束的二維MTF通過原點(diǎn)的部分?？梢杂?jì)算出45度的遮罩旋轉(zhuǎn)以保持傳播路徑在光片平面內(nèi)將在低空間頻率將對比度減少到幾乎為零。這并不是完全出乎意料的，因?yàn)楸M管非對稱光束用于創(chuàng)建光片，但由于沿著y軸的時(shí)間平均光片本身將會(huì)是非對稱的。
[0043]各種實(shí)驗(yàn)被實(shí)施以測試相比于其它光束類型的光片顯微鏡的艾里光束(或它的各種實(shí)現(xiàn))的效果。在這些實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)激光束(Coherent Verdi V6, 6W 532 nm)被擴(kuò)大以填充聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD，Neos AOBD 45035-3)的孔徑并且通過一段2s的周期沿y軸掃描激光焦點(diǎn)創(chuàng)建光片，比最短的收集時(shí)間(840s)大大縮短。其次，AOD孔徑是使用放大的望遠(yuǎn)鏡再成像以超出空間光調(diào)制器(SLM，Hamamatsu LCOS X10468-04)的有效區(qū)域。在研究中SLM的使用使得各種光片類型之間的快速動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)并且使得針對各種光束類型被記錄的數(shù)據(jù)立方體并行，使圖片漂白和樣本移動(dòng)的影響縮減到最小。這使得在系統(tǒng)中的剩余像差消除，保證光束很類似理論的描述。
[0044]使用在其焦點(diǎn)處具有狹縫孔徑以選擇第一衍射級的縮小的望遠(yuǎn)鏡(0.5x)，SLM的有效區(qū)域被成像到照射物鏡(Mitutoyo 20χ/0.42，工作距離20mm)的后孔徑上。光束被聚焦到樣本之內(nèi)，該樣本被約束在正方形分布的硼硅玻璃毛細(xì)管中(Vitrocell 8250-100，邊長1mm，壁厚200 μ m)。毛細(xì)管被固定在PDMS中的熒光聚苯乙烯粒(Duke R900)填充，并被安裝在xyz壓電式臺上(Mad City Labs, Nano_LP200)以使樣本關(guān)于光片和檢測物鏡的焦平面自動(dòng)定位。
[0045]經(jīng)由正交安裝的具有適當(dāng)?shù)溺R筒透鏡和熒光濾光片的物鏡(NeWpOrt20X/U 40)使用C⑶相機(jī)(Basler piA640_210gm)檢測熒光。注意到，正交放置的物鏡是典型的，但是，其它配置可能是更方便的諸如穿過檢測透鏡或相反放置的二級透鏡或波導(dǎo)的斜照射。使用壓電式臺平移和具有SLM的全息偏轉(zhuǎn)的組合，光片以10nm的步長通過樣本被掃描。
[0046]數(shù)字后期處理經(jīng)常受限于點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的有限知識，這可以引起圖像偏移和邊緣震蕩效應(yīng)，例如在到艾里光束焦平面的距離是不確定的時(shí)。但是，這在光片顯微鏡中并不是問題，因?yàn)閭?cè)面檢測意味著直接關(guān)系存在于光片的傳播距離和在檢測器陣列的位置之間。因此線性反卷積可以精確地校正光學(xué)傳遞函數(shù)的振幅和相位，不但有效地消除艾里光束光片的彎曲，而且消除源于用于創(chuàng)建艾里光束的有限孔徑的任何殘余相位偽影。此外，精確的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的知識意味著光片不必是傳播不變性的，對于所需要的空間頻率和視場MTF沒有零點(diǎn)是足夠的。所以，非對稱光束的大家族可以用于擴(kuò)展光片顯微鏡的視場。圖6描述了幾個(gè)示例。
[0047]圖4示出了具有各種光束類型的光片顯微鏡的實(shí)驗(yàn)和仿真數(shù)據(jù)。光束在頂行被示出。對于(從左到右)孔徑高斯，分別具有10%和5%的孔徑半徑的環(huán)形孔徑寬度的兩個(gè)貝塞爾光束光片，以及艾里光束光片，沿y軸的最大強(qiáng)度投影被示出。行2示出了如在實(shí)驗(yàn)中使用的具有相同參數(shù)的光片顯微鏡性能的仿真。行3示出了仿真數(shù)據(jù)的反卷積。行4示出了包含熒光微球粒的PDMS樣本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。行5示出了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的反卷積。所有的圖像具有相同的尺寸和坐標(biāo)系統(tǒng)，其中焦平面在X = O處。為了清晰，偽彩色編碼被用于實(shí)驗(yàn)圖像和光片分布(profile)(反向刻度(inverted scale))。
[0048]圖4表明相對于傳統(tǒng)的和沿X軸的貝塞爾光束照射，對于傳統(tǒng)的高斯光片，高分辨率和大視場可以使用艾里光束光片獲得。對于傳統(tǒng)的光片顯微鏡，距離光片腰部超過10 μ m的熒光微球粒不能被分解。遠(yuǎn)離焦平面，MTF(cf.圖3b)中的空值導(dǎo)致不可改變的對比度損失和隨之發(fā)生的反卷積偽影。貝塞爾光束光片有效地?cái)U(kuò)展視場到20 μ m或40 μ m，近似相反地依賴于環(huán)形寬度，如果孔徑用于創(chuàng)建光束。通過考慮在圖4頂行描述的光束強(qiáng)度分布，可以理解在這個(gè)區(qū)域之外的分辨率的突然丟失。在大約20μπι和40 μ m處，可以看到軸上強(qiáng)度如何快速地降低。此時(shí)，由于環(huán)形孔徑內(nèi)部和外部邊緣之間的光路徑差異，相消干涉導(dǎo)致光束的退化。環(huán)形寬度的減小導(dǎo)致視場的增加。但是，也要注意的是這對分辨率有不利影響。通過對比圖3中示出的貝塞爾光束MTF曲線，這可以更多定量的被看到。
[0049]對照貝塞爾光束，使用艾里光片成像的相同樣本具有覆蓋整個(gè)感興趣區(qū)域的視場，而同時(shí)遍及全視場保持高的軸向分辨率。此外，因?yàn)榈头逯倒β蕟蝹€(gè)熒光團(tuán)的4D追蹤是可能的，由于艾里光片的旁瓣，通過多幀可以采集有用信號。因此，相比于傳統(tǒng)的或貝塞爾光束光片成像，熒光飽和、漂白和光損傷是不太可能的。因此，艾里光片的使用可以擴(kuò)展熒光團(tuán)的使用壽命。
[0050]通過懸浮在瓊脂糖膠中的人體胚胎腎臟細(xì)胞成像，本技術(shù)的對于生物樣本的適用性可以被進(jìn)一步證明。為了能夠?qū)崿F(xiàn)分辨率對比，細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以在線粒體中表現(xiàn)出紅色(DsRed)熒光蛋白。使用預(yù)先混入瓊脂糖膠的熒光微球體作為靠近感興趣細(xì)胞的熒光探針來完成現(xiàn)場波前校正。圖5示出了通過傳統(tǒng)光片顯微鏡難以接近的容積傳播的一組細(xì)胞。所有光束的X和y軸視圖均被示出。雖然可以看出兩個(gè)貝塞爾光束光片比孔徑高斯光片分解更多的細(xì)胞，但是只有艾里光束光片顯微鏡可以分解全部細(xì)胞，并且以高分辨率完成。
[0051]圖6示出了可以被用于擴(kuò)展容積光片成像的不同的非對稱光片的示例。左列:相位調(diào)制的等式，指定的弧度，作為歸一化的瞳孔坐標(biāo)函數(shù)U。如第一行中等式所描述的拋物線型的光束和艾里光束都具有立方相分布。第二行和第三行分別示出了分式和五分之一階指數(shù)。第四和第五行示出了測角和指數(shù)函數(shù)，在其泰勒展開式具有無窮的分量。作為最后的示例，第六行示出了結(jié)合高斯振幅調(diào)制的二階的多項(xiàng)式相位調(diào)制。
[0052]圖6的第2列示出了相位(藍(lán)色粗實(shí)線，[波長單位])、傳播振幅(黑色虛線，任意單位)。除了最后一個(gè)出于說明目的使用高斯切趾法被調(diào)制的類型，光束的振幅不被調(diào)制。圖6的第3列示出了由于相應(yīng)的調(diào)制引起的光束(以及因此的光片)的強(qiáng)度分布。第4列示出了在各自光片的腰部的MTF(藍(lán)色粗實(shí)線)，以及用于對比的傳統(tǒng)孔徑高斯光片的MTF(紅色虛線)。第5列示出了與引入兩個(gè)波長的光路徑差的散焦相一致的失焦MTF(W2q=2 λ )。與傳統(tǒng)孔徑高斯MTF不同，在調(diào)制光片的MTF中沒有空值可以被看見，并且對于多數(shù)空間頻率在失焦平面的對比度是非常高的。盡管這個(gè)列表不是詳盡的，很明顯，用于擴(kuò)展高分辨率成像容積的光片不必僅限于艾里光束光片。具體應(yīng)用和實(shí)施方式可能受益于可選的非對稱光片。
[0053]所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的人員將理解，不脫離本發(fā)明的范圍的公開的布置的變化是可能的。盡管本發(fā)明關(guān)于有選擇的平面照射顯微鏡被特別地描述，同樣適用于使用光片的任何布置，例如成像、光譜學(xué)，諸如熒光或拉曼光譜學(xué)，或激發(fā)或發(fā)揮光勢力，諸如誘導(dǎo)或引導(dǎo)。同樣地，除了這里描述的光學(xué)輻射，輻射的類型可以被使用，如毫米波，太赫茲，X射線，雷達(dá)或聲學(xué)。因此上述特定示例的描述只用于舉例說明并不是為了限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚細(xì)微的改變對于所描述的操作并沒有顯著的改變。
【權(quán)利要求】
1.一種光片光學(xué)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括用于使用無衍射或近似無衍射和/或傳播不變性的光束形成光片的裝置，所述光束具有垂直于傳播方向的非對稱強(qiáng)度光束分布，例如艾里光束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中所述無衍射或近似無衍射和/或傳播不變性的非對稱光束具有傅里葉變換，所述傅里葉變換包括具有二階或更高階多項(xiàng)式的相位項(xiàng)，例如，2.5的分式指數(shù)或立方指數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中近似無衍射和/或傳播不變性的非對稱光束具有傅里葉變換，所述傅里葉變換在相位調(diào)制的泰勒展開式中包含三階或更高階分量，例如立方相位分量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中所述無衍射非對稱光束是自愈或自修復(fù)的。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中在系統(tǒng)的調(diào)制傳遞函數(shù)中所述光束導(dǎo)致沒有或最小數(shù)目的零值。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括空間光調(diào)制器或其它靜態(tài)的或動(dòng)態(tài)的衍射光學(xué)元件以形成所述無衍射非對稱光束。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于移動(dòng)或定位所述非對稱光束以遍及樣本容積在不同位置處捕獲圖像的裝置。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括在檢測路徑中用于檢測來自由所述非對稱光束形成的多個(gè)光表面的光的相位調(diào)制，以及使用所述檢測的光形成容積圖像的成像裝置。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)被布置以使用單個(gè)光子激發(fā)。
10.一種光片光學(xué)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括用于創(chuàng)建具有垂直于傳播方向的非對稱強(qiáng)度分布的光片的裝置。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于形成對稱光片的裝置以及用于將對稱光片轉(zhuǎn)換為非對稱光片或光束的裝置。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)換裝置包括在所述對稱光片或光束傳播的照射路徑中的相位調(diào)制，例如立方相位調(diào)制。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)換裝置包括在所述對稱光片或光束傳播的照射路徑中的遮罩。
14.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的光片光學(xué)系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是以下中的一者或多者:光片成像系統(tǒng)；光譜學(xué)系統(tǒng)，例如拉曼光譜學(xué)系統(tǒng)；顯微鏡系統(tǒng)；在諸如任意惰性的顆粒或諸如細(xì)胞的生物顆粒上施加光學(xué)作用力的系統(tǒng)，例如光學(xué)捕獲系統(tǒng)或光學(xué)引導(dǎo)系統(tǒng)。
【文檔編號】G02B21/10GK104204898SQ201380018625
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月3日
【發(fā)明者】K·德拉起亞, T·威滕伯格 申請人:圣安德魯斯大學(xué)董事會(huì)