顯微鏡和用于選擇性平面照明顯微術(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及顯微鏡，該顯微鏡包括：照明裝置，該照明裝置包括照明光源(3)和用于以光片照亮樣本(1)的照明光路；用于檢測(cè)從樣本(1)輻射出的光的檢測(cè)裝置；成像光學(xué)器件，該成像光學(xué)器件將樣本(1)通過成像光路中的成像物鏡(7)至少部分地在檢測(cè)裝置上成像，其中光片在成像物鏡(7)的焦點(diǎn)中或在成像物鏡的幾何焦點(diǎn)附近的限定平面內(nèi)基本上是平的，并且其中成像物鏡(7)具有以非零角度與光片的平面相交的、優(yōu)選地與光片的平面垂直相交的光軸，其中在照明光路中提供了通過如下方式作為Sinc空間過濾器起作用的幅度和/或相位濾波器，即該Sinc空間過濾器在至少一個(gè)空間方向上通過對(duì)于出現(xiàn)的空間頻率以sinc函數(shù)濾波來限制照明光，和/或在至少一個(gè)空間方向上通過sinc濾波器函數(shù)對(duì)于照明光的相位和幅度進(jìn)行限制，和/或在照明光路中提供了組合的幅度和相位濾波器，所述組合濾波器通過以sinc濾波器函數(shù)影響照明光分布的傳輸率進(jìn)程來進(jìn)行光片的成形。
【專利說明】顯微鏡和用于選擇性平面照明顯微術(shù)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及顯微鏡，所述顯微鏡包括用于將樣本在檢測(cè)器上成像的成像物鏡以及 用于在成像光學(xué)器件的焦平面內(nèi)或在此焦平面附近限定的平面內(nèi)以光片照亮樣本的機(jī)構(gòu)。 用于照明的機(jī)構(gòu)包括輻射出相干光的照明光源。

【背景技術(shù)】
[0002] 其中照明光路和檢測(cè)光路基本上相互垂直布置并且其中以光片在成像光物鏡的 焦平面內(nèi)、即垂直于其光軸照亮樣本的顯微鏡，被構(gòu)造為用于根據(jù)選擇性平面照明顯微術(shù) (SPM)的方法來檢查樣本。與其中三維樣本在各個(gè)不同的深度的平面內(nèi)被逐點(diǎn)掃描并且其 中然后將所獲得的圖像信息組合為樣本的三維圖像的激光掃描共聚焦顯微術(shù)（LSM)的差 異在于，SPIM技術(shù)基于寬場(chǎng)顯微技術(shù)并且實(shí)現(xiàn)了基于通過樣本的各個(gè)平面的光學(xué)截面對(duì)于 樣本進(jìn)行圖像圖示。
[0003] SPM技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：以更高的速度進(jìn)行圖像信息記錄，生物樣本的褪色的風(fēng)險(xiǎn) 更低，以及焦點(diǎn)在樣本內(nèi)的更擴(kuò)大的侵入深度。
[0004] 原理上，在SPM技術(shù)中，以激光激勵(lì)包含在樣本中的或引入到樣本中的熒光團(tuán)， 這形成了所謂的光片。以此光片分別將樣本的深度內(nèi)的選擇的平面照亮并且以成像光學(xué)器 件獲得具有光截面形式的此樣本平面的圖像?；旧吓c此使用靜態(tài)光片的激勵(lì)等價(jià)的是薄 的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的激光束在成像物鏡的焦平面內(nèi)的快速往復(fù)運(yùn)動(dòng)。因此，有效地，即在觀測(cè)的時(shí) 間段內(nèi)以時(shí)間平均的方式實(shí)現(xiàn)了光片的形狀。
[0005] SPIM技術(shù)例如在如下文獻(xiàn)中描述：Stelzer等人的Optics Letter 31,1477(2006)，Stelzer 等人的 Science 305, 1007 (2004)，DE 10257423A1 和 TO 2004/0530558A1。
[0006] 在圖1中首先圖示了 SPM顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)。照明光源1的光通過照明光學(xué)器 件2成形為光片并且偏轉(zhuǎn)到樣本3上。樣本和光片處于成像物鏡4的焦平面內(nèi)。成像物鏡 4的光軸垂直于如下方向，樣本3從該方向被照亮。照明光學(xué)器件2通常包括多個(gè)光學(xué)元 件，所述光學(xué)元件將照明光源1的相干光準(zhǔn)直并且由此形成光片。在現(xiàn)有技術(shù)中，照明光學(xué) 器件2通常也包括多個(gè)柱透鏡，所述柱透鏡的平的側(cè)指向樣本并且其隆起的側(cè)指向照明光 源。在下文中將解釋照明光學(xué)器件2的多個(gè)示例，以所述照明光學(xué)器件2可產(chǎn)生與現(xiàn)有技 術(shù)中已知的設(shè)備相比帶有高景深和小陰影的光片。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 問題提出
[0008] 希望的是如下光分布（光片），即所述光片在一個(gè)方向（y方向）上的伸展小于 1 μ m，但在另外兩個(gè)方向上盡可能寬地伸展，其中在y方向上在光片上方和下方應(yīng)無光。在 光片的上方和下方的此光將干擾從觀測(cè)方向（y方向）的測(cè)量。
[0009] 目前已知的解決方案
[0010] a)干涉圖案可在y方向上是薄的并且原理上在X和z方向上理論上無限地伸展， 但干涉圖案在y方向上周期地延續(xù)，使得很多的光處于光片外。
[0011] b)貝塞爾光束（DE 10 2007 063 274 Al)可理論上在z方向上無限地伸展，在y 方向上具有希望的直徑，但又有很多的功率在y方向上處于光束外；如果在X方向上掃描貝 塞爾光束，則雖然得到了光片，但使得很多的光功率處于與希望的平面上方和下方。
[0012] c)使用柱透鏡的直線聚焦：使用柱透鏡可產(chǎn)生在X方向上的聚焦；如果通過散焦 在z方向上掃描光束，則也可實(shí)現(xiàn)光片。
[0013] 柱透鏡由入射的準(zhǔn)直激光束形成在X方向上的直線聚焦（在柱透鏡后方的距離f 處）。所述直線聚焦可在z方向上移動(dòng)（例如通過以可移動(dòng)透鏡或SLM改變焦距f來實(shí)現(xiàn) 散焦）。此直線聚焦當(dāng)然具有很小的在z方向上的伸展（DOF?λ/NA 2, DOF=景深），其中 在y方向上的直線聚焦越細(xì)則該伸展越小。
[0014] 例如，NA = 5 -在 λ =〇· 488 μ m 時(shí)，有 DOF ?λ /NA2?2 μ m
[0015] 以上的解決方案的缺點(diǎn)是單光束的小伸展，或要求必須掃描光束。此外，在貝塞爾 光束的情況中在y方向上并且在X直線聚焦的情況中在z方向上具有很多的光，這可能使 得樣本褪色。另外的目的因此是放大光聚焦的伸展。
[0016] 本發(fā)明的特征在于獨(dú)立權(quán)利要求的特征。優(yōu)選的擴(kuò)展是從屬權(quán)利要求的對(duì)象。權(quán) 利要求詳細(xì)地在本發(fā)明的公開中論述。本發(fā)明涉及用于"SPIM"顯微術(shù)的顯微鏡，以及所屬 的顯微技術(shù)方法，以及用于顯微鏡的運(yùn)行方法，以及在權(quán)利要求中闡述的Sinc濾波器和馬 修光束的用于SPIM顯微術(shù)的有利的使用。
[0017] 為此，根據(jù)本發(fā)明給出如下建議：
[0018] 通過限制光的頻譜中的z分量獲得在z方向上傳播不變的或良好限定的分布。每 個(gè)z分量通過"傳播"經(jīng)歷了另外的相移，因此有利的是以濾波器函數(shù)限制頻譜的z分量。 特別地建議作為z方向上的濾波器函數(shù)使用Sinc(Z)函數(shù)。
[0019] 原理上也可構(gòu)思另外的函數(shù)，例如Sine (z) ~2函數(shù)，但Sinc函數(shù)提供的優(yōu)點(diǎn)是在 z方向上實(shí)現(xiàn)（理想化的）恒定的輪廓。
[0020] 當(dāng)然，可進(jìn)一步優(yōu)化精確的濾波器函數(shù)，Sinc函數(shù)在此應(yīng)特別地有利地用作在Z 方向上在大的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了在軸上的近似恒定的光束輪廓的函數(shù)。
[0021] 直線聚焦的伸展因此根據(jù)本發(fā)明可在z方向上通過柱透鏡前方的Sine (z)濾波器 放大。Sinc(z)濾波器為此變換到y(tǒng)方向上并且實(shí)現(xiàn)為y方向上的濾波器。為此，當(dāng)然要求 相對(duì)構(gòu)建復(fù)雜的濾波器，因?yàn)镾inc函數(shù)具有正值和負(fù)值。單純的幅度濾波器對(duì)于傳輸率可 以僅取正值。濾波器的傳輸率的負(fù)值對(duì)應(yīng)于為λ/2的相移。以附加的例如λ/2的相移也 可實(shí)現(xiàn)對(duì)于傳輸率的負(fù)值。在X方向上濾波器函數(shù)可以是恒定的。
[0022] 圖2示出了對(duì)于復(fù)數(shù)濾波器的理論上理想的傳輸曲線的這種示例。圖中示意性地 圖示了準(zhǔn)直的激光束LK，所述激光束LK穿過布置在所使用的光學(xué)器件的光瞳內(nèi)的空間濾 波器F并且在幅度和相位上受到該空間濾波器影響。相應(yīng)的空間光分布作為調(diào)制激光束ML 示意性地圖示。
[0023] 在此首先刻畫了空頻濾波器sine ( V ζ)。
[0024] 柱透鏡ZL和所生成的光片LB在照明方向上跟隨。Sinc(Vz)有利地對(duì)應(yīng)于通過 Ewald方程在V ζ方向上放縮的Sinc，其零位置在V ζ= 〇處（軸線上）。因此在y軸上投 影的sine ( V z)導(dǎo)致在z方向上的伸展。
[0025] 在V y軸投影的sine ( V z)當(dāng)然在y方向上仍非理想地限制光束輪廓。在y方向 上投影的sine ( V z)因此例如與sine ( V y)(通過乘法）疊置；此sine ( V y)導(dǎo)致光片在y 方向上被限制，而在V，由投影的sine (V z)導(dǎo)致光片在一定的z距離上保持恒定。
[0026] 兩個(gè)Sinc函數(shù)相互影響；小的y伸展要求拉伸的sinc(vy)，這如在該示例中示出 那樣應(yīng)該大約對(duì)應(yīng)于投影的sine ( V z)。
[0027] 在該示例中，因此可達(dá)到DOF?8 μπι。另外的示例在下頁(yè)中闡述。
[0028] 在另外的示例中，作為使用基本上沿X軸恒定地形成的柱形光學(xué)器件來構(gòu)成光片 的替代，光片也可使用帶有例如球面的常規(guī)的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的光學(xué)器件來構(gòu)成。在ζ方向上的 濾波器函數(shù)（Sinc(V z))作為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的函數(shù)在x-y平面內(nèi)投影并且與在1和7上的一個(gè) 或兩個(gè)另外的濾波器函數(shù)相乘，以獲得在y方向上的希望的限制和在X和ζ方向上的希望 的伸展，即例如與在y方向上的很寬的sine ( V y)相乘以用于在y方向上薄的光片以及與 在X方向上的很窄的Sinc(Vx)相乘以用于在X方向上的大的伸展。
[0029] 在圖3中示例地在沿圖2的Y軸，沿Y/Ζ截面的橫截面中圖示了由三個(gè)濾波器函 數(shù)（X，y，ζ)疊置的幅度分布A。
[0030] 以此方式令人驚奇地也可在不使用如所圖示的柱透鏡的變形光學(xué)器件的情況下 實(shí)現(xiàn)伸展的直線聚焦，其焦距在Z方向上為10 μm而厚度在y方向上大致為1 μm(波長(zhǎng) 0· 488 μπι) (100μηιΧ10μηιΧ1μηι，ΧΧΥΧΖ)〇
[0031] 此外，可實(shí)現(xiàn)100 μπιΧ 100 μηιΧ4 μπι的光片（寬度χ乘深度ζ乘在y方向上的厚 度）。
[0032] Sinc函數(shù)簡(jiǎn)單地疊置地處在軸線上（零角度）并且相互"干擾"，即帶有更小的寬 度的各Sinc函數(shù)更占優(yōu)（也見圖3)。
[0033] 為了將Sinc函數(shù)相互分離，即傳輸盡可能多的頻率信息，可在物鏡光瞳內(nèi)離軸地 設(shè)置濾波器，理想地在盡可能大的孔徑下（例如，在物鏡中NA = 0.85至NA= 1)。因此，令 人驚奇的是可實(shí)現(xiàn)厚度更低的光片，例如IOOymXlO μ mX 2 μ m(x乘y乘ζ)。當(dāng)然，Sinc 函數(shù)的零點(diǎn)在照明光學(xué)器件的光瞳內(nèi)可自由選擇。
[0034] 帶有在y方向上的Ιμπι的直徑的更小的光片也是可以的（例如，在0.5 μπι的波 長(zhǎng)情況下1〇μπιΧ100μπιΧ1μπι，ΧΧΥΧΖ)。特別地，可使用新的濾波器生成帶有大的側(cè)向 伸展同時(shí)帶有在y方向上的低厚度和在y方向上在光片外更少的光的光片，所述光片比現(xiàn) 有技術(shù)中已知的光片明顯更好，例如在X或ζ方向上是高斯光束的至少兩倍的尺寸，或在y 方向上在光片外比貝塞爾光束或雙光束干涉圖案具有至少小十倍的光強(qiáng)度。
[0035] 光片也可在ζ方向上以及在X方向上走向（根據(jù)濾波器在光瞳內(nèi)的位置）。這使 得布置特別地靈活。
[0036] 光片可使用相位函數(shù)調(diào)制，以使其在x、y和ζ方向上移動(dòng)（聚焦或移動(dòng)）。因此， 光片可例如也使用SLM(空間光調(diào)制器）而通過空間運(yùn)動(dòng)（掃描）。此SLM單獨(dú)地或與幅度 濾波器組合地使用，并且導(dǎo)致光片的移動(dòng)，例如在y方向上的移動(dòng)。因此，對(duì)樣本的共焦掃 描可以以例如來自y方向的觀測(cè)光束實(shí)現(xiàn)。
[0037] 此外可將多個(gè)Sinc~3濾波器并且因此將多個(gè)光片并列或疊置布置。因此，光片面 積可擴(kuò)大或例如對(duì)于STED在激勵(lì)區(qū)域的邊沿上刺激出附加的去激勵(lì)。
[0038] 光片可調(diào)制（結(jié)構(gòu)化），這通過例如將兩個(gè)Sinc~3濾波器引入到光瞳內(nèi)而無散焦 或相移來實(shí)現(xiàn)。因此，可自由調(diào)節(jié)調(diào)制頻率。所形成的干涉場(chǎng)可用于SM(ZEISS Elyra S. 1) 或類似的帶有結(jié)構(gòu)化照明的方法。光片厚度可進(jìn)一步降低（例如，〇.7μπι)，其中光片的伸 展更低。
[0039] 數(shù)學(xué)公式和宙義
[0040] SINC 函數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種顯微鏡，包括： 〇成像光學(xué)器件，所述成像光學(xué)器件通過成像物鏡（7)在第一方向上接收從樣本（1) 以第一孔徑角度輻射出的光， 〇檢測(cè)裝置，用于檢測(cè)從樣本（1)以第一孔徑角度輻射出的、以成像光學(xué)器件接收的 光， 〇照明裝置，包括帶有波長(zhǎng)A的照明光源（3)和用于以在第二方向上的照明光分布照 亮樣本（1)的照明光路，其中，第二方向基本上垂直于第一方向， 其特征在于，所述照明裝置具有機(jī)構(gòu)，使得： 〇在第二方向中的截面（LZ)內(nèi)，照明光分布基本上恒定， 〇在由第一孔徑角度張成的錐形內(nèi)，在第一方向上的伸展（LY)的區(qū)域外，照明光的功 率小于20%，其中： LY〈2 入， LZ>8 入。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，所述機(jī)構(gòu)包括復(fù)數(shù)濾波器，所述復(fù)數(shù)濾波器將 到照明裝置的光瞳內(nèi)的光分布限制在基本上圓形的區(qū)域內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的顯微鏡，其中，濾波器產(chǎn)生在照明裝置的光瞳內(nèi)由至少兩個(gè) Sine函數(shù)的疊置形成的照明光分布。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的顯微鏡，其中，兩個(gè)Sine函數(shù)對(duì)應(yīng)于根據(jù)Ewald方程投影到 一個(gè)平面內(nèi)、優(yōu)選地到X-Y平面內(nèi)的Sine (z)函數(shù)。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的顯微鏡，其中，濾波器產(chǎn)生在照明裝置的光瞳內(nèi) 對(duì)應(yīng)于馬修光束的頻譜的照明光分布。
6. 特別地根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的顯微鏡，包括： -照明裝置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮樣本（1)的照明光路， -檢測(cè)裝置，用于檢測(cè)從樣本（1)輻射出的光， _成像光學(xué)器件，所述成像光學(xué)器件將樣本（1)通過成像光路中的成像物鏡（7)至少部 分地成像到所述檢測(cè)裝置上， -其中，光片在成像物鏡（7)的焦點(diǎn)中或在成像物鏡的幾何焦點(diǎn)附近的限定平面內(nèi)基 本上是平的，并且其中，成像物鏡（7)具有以非零角度與光片的平面相交的、優(yōu)選地垂直相 交的光軸， -其中，在照明光路中提供了通過如下方式作為Sine空間過濾器起作用的幅度和/或 相位濾波器，即，其在至少一個(gè)空間方向上通過對(duì)于出現(xiàn)的空間頻率以sine函數(shù)濾波來限 制照明光， 和/或在至少一個(gè)空間方向上通過sine濾波器函數(shù)對(duì)于照明光的相位和幅度進(jìn)行限 制， 和/或在照明光路中提供了組合的幅度和相位濾波器，所述組合濾波器通過以sine濾 波器函數(shù)影響照明光分布的傳輸率進(jìn)程來進(jìn)行光片的成形。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項(xiàng)所述的顯微鏡，其特征在于， 幅度和/或相位濾波器至少部分地布置在照明光學(xué)器件的光瞳平面內(nèi)或其附近， 和/或?yàn)V波器通過全息圖（CGH)和/或衍射光學(xué)器件實(shí)現(xiàn)， 和/或?yàn)V波器至少部分地通過用于光的空間調(diào)制器（空間光調(diào)制器（SLM))形成， 和/或以SLM實(shí)現(xiàn)光片垂直于光方向的移動(dòng)， 和/或成像物鏡的焦平面在光片移動(dòng)時(shí)移動(dòng)， 和/或在光瞳平面中產(chǎn)生非對(duì)稱的Sine函數(shù)/離軸分布， 和/或提供相對(duì)于光軸在軸外起作用的sine濾波器， 和/或提供多個(gè)Sine濾波器的疊置以用于光片結(jié)構(gòu)化， 和/或提供通過Ewald方程放縮的sine函數(shù)作為濾波器函數(shù)， 和/或在照明光路中進(jìn)行濾波器與變形光學(xué)器件的組合以用于光束成形。
8. -種用于運(yùn)行根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項(xiàng)所述的顯微鏡的顯微鏡方法或方法。
9. 一種顯微鏡，包括： -照明裝置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮樣本（1)的照明光路， -檢測(cè)裝置，用于檢測(cè)從樣本（1)輻射出的光， _成像光學(xué)器件，所述成像光學(xué)器件將樣本（1)通過成像光路中的成像物鏡（7)至少部 分地成像到檢測(cè)裝置上， -其中，光片在成像物鏡（7)的焦點(diǎn)中或在成像物鏡的幾何焦點(diǎn)附近的限定平面內(nèi)基 本上是平的，并且其中，成像物鏡（7)具有以非零角度與光片的平面相交的、優(yōu)選地垂直相 交的光軸， 其特征在于，使用馬修光束在SPIM中產(chǎn)生光片。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項(xiàng)所述的顯微鏡，其特征在于，使用掃描的馬修光束在 SPM中產(chǎn)生光片。
11. 特別地根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的顯微鏡，包括： -照明裝置，包括照明光源（3)和用于以光片照亮樣本（1)的照明光路， -檢測(cè)裝置，用于檢測(cè)從樣本（1)輻射出的光， _成像光學(xué)器件，所述成像光學(xué)器件將樣本（1)通過成像光路中的成像物鏡（7)至少部 分地成像到檢測(cè)裝置上， -其中，光片在成像物鏡（7)的焦點(diǎn)中或在成像物鏡的幾何焦點(diǎn)附近的限定平面內(nèi)基 本上是平的，并且其中，成像物鏡（7)具有以非零角度與光片的平面相交的、優(yōu)選地垂直相 交的光軸， 其特征在于， 以強(qiáng)度調(diào)制器和/或相位調(diào)制器產(chǎn)生馬修光束，特別是通過如下光學(xué)元件的至少一個(gè) 產(chǎn)生馬修光束： 1) 部分環(huán)形光圈，特別是由兩個(gè)對(duì)置的半圓形組成的光圈； 2) 通過用于光的空間調(diào)制器（空間光調(diào)制器（SLM)); 3) 軸棱錐； 4) 全息圖； 5) 衍射元件。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項(xiàng)所述的顯微鏡，其特征在于， 在環(huán)形光圈前產(chǎn)生橢圓高斯分布， 和/或在環(huán)形光圈前產(chǎn)生高斯分布，其中環(huán)形光圈的上部分和下部分不被施加以光， 和/或通過變形光學(xué)器件和/或如SLM的強(qiáng)度調(diào)制器進(jìn)行光束成形， 和/或在軸棱錐上產(chǎn)生橢圓高斯分布， 和/或在軸棱錐上產(chǎn)生高斯分布，其中軸棱錐的上部分和下部分不被施加以光， 和/或使用強(qiáng)度調(diào)制器以優(yōu)化光分布， 和/或?qū)⒆冃喂鈱W(xué)器件和強(qiáng)度調(diào)制器組合以優(yōu)化光分布， 和/或抑制馬修光束的頻率分量以避免射線的周期性強(qiáng)度調(diào)制， 和/或產(chǎn)生結(jié)構(gòu)化的照明， 和/或在平面檢測(cè)器上，特別是CCD接收器或EMCCD接收器上或CMOS或sCMOS照相機(jī) 上進(jìn)行逐行檢測(cè)， 和/或在平面檢測(cè)器上進(jìn)行面相關(guān)的檢測(cè)，其中檢測(cè)的面小于平面檢測(cè)器的整個(gè)檢測(cè) 面。
13.用于運(yùn)行根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項(xiàng)所述的顯微鏡的顯微鏡方法或方法。
【文檔編號(hào)】G02B27/09GK104428706SQ201380034258
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】J.西本摩根, W.辛格, T.安哈特, R.沃利申斯基 申請(qǐng)人:卡爾蔡司顯微鏡有限責(zé)任公司