專利名稱：用于分析井板、凝膠和斑點的數(shù)字成像系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及化驗分析系統(tǒng)，尤其涉及一種用于產(chǎn)生隨機排列得到樣品(例如凝膠內(nèi)的珠(bead)，培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落)或排列成規(guī)則陣列的(例如塑料板中的井，被設置在膜上的斑點)樣品的數(shù)字圖像的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明能夠產(chǎn)生數(shù)字圖像并能夠進行發(fā)出非常低的熒光、化學光或生物光的樣品的自動分析。特別是，本發(fā)明被設計用于分析在井板內(nèi)和凝膠介質(zhì)內(nèi)以及膜上，玻璃上，微型器件或其它載體上的樣品產(chǎn)生的亮度。
許多化學和分子生物學分析被這樣設計，使得在樣品內(nèi)的光反射作用的吸收、透射或發(fā)射發(fā)生變化。因此，用于對這些進行定量分析的儀器必須檢測亮度的改變。
一些樣品被設置在分立的長頸瓶或小瓶內(nèi)，而有些樣品被設置在塑料板內(nèi)，在塑料板上含有許多按一定間隔設置的井?！熬濉睒悠泛驮诜至⑷萜髦械念愃频臉悠废啾龋a(chǎn)率高而成本低。標準的井板在8×12cm的面積內(nèi)含有96個井。發(fā)展趨勢是在相同大小的板內(nèi)含有較多的井?，F(xiàn)在最高的工業(yè)密度是384個井。由小的井(微井，例如每板數(shù)千個，其全體積小于每個井1ul)排列而成的極高密度的陣列正在研究中，并將作為成熟的微井填充和檢測技術在工業(yè)上利用。
在扁的載體膜上或在處理過的玻璃條上設置小點(反應處)的網(wǎng)格。高密度網(wǎng)格可以含有數(shù)千個分立的點。網(wǎng)格樣品通常涉及和低核苷酸雜交，以便尋找含有特定序列的基因，或者確定特定基因起作用的程度。其應用包括庫篩選(library screening)，利用雜交排序，利用雜交診斷以及基因表達的研究。如果能夠簡單而可靠地對網(wǎng)格進行分析，高密度網(wǎng)格可以以低的成本提供極高的生產(chǎn)率。因此，在研究用于產(chǎn)生、檢測和分析基因組序列的高密度陣列的技術的公司引起了相當?shù)闹匾暋?br> 有些樣品涉及小的顆粒(一般是由化合物涂敷的珠)，其作為反應點?？梢杂袛?shù)千個珠，每個珠用組合庫中的不同的化合物(例如酶的分子變種)涂敷。這些珠被暴露于井中或凝膠基體中感興趣的物質(zhì)(例如克隆受體)。和靶物質(zhì)相互作用的珠借助于在每個珠周圍的區(qū)域內(nèi)的熒光發(fā)射或吸收進行識別。相互作用的珠被暗的不同亮度的區(qū)域包圍著。需要非常靈敏的檢測器來識別在和靶相互作用的珠周圍的亮度的微小變化。
把制成溶液的樣品涂在基體上，在基體上施加電壓。因為蛋白質(zhì)和具有不同氨基酸或核苷酸的核酸都具有特征靜電荷和分子尺寸，所以在試樣內(nèi)的元素可以提供其響應所加電壓而產(chǎn)生的不同的運動速度來進行分離。被分離開的元素通過使用同位素標記、熒光標記或亮度標記被可視化。在許多情況下(例如化學光)，由樣品產(chǎn)生的亮度是很小的。
位于排列成規(guī)則陣列的反應點(井，網(wǎng)格內(nèi)的斑點)的樣品可被稱為固定格式的樣品。而不規(guī)則地分布在凝膠或斑點基體內(nèi)的樣品可被稱為自由格式樣品。
固定格式樣品通常不利用成像來進行化驗。相反，自由格式樣品需要使用圖像分析系統(tǒng)，其可以對圖像內(nèi)的任何位置的反映進行檢測和定量分析。
被設計用于固定格式樣品的儀器一般沒有成像功能，因而尚不能用于自由格式樣品。同樣，被設計用于自由格式樣品的很少的幾種成像儀器尚不能用于井和其它的固定格式的靶。
非成像計數(shù)系統(tǒng)(液體閃爍計數(shù)器，光度計，熒光偏振儀等)基本上是光學儀器。它們使用光電倍增管(PMT)檢測井內(nèi)的光透射與光發(fā)射的變化。類似于光度計，這些系統(tǒng)把每個井發(fā)出的光集中成一個數(shù)據(jù)點。它們不提供關于井內(nèi)空間變化的信息，也不允許作用點的充填密度或位置改變。
每個PMT一次讀出一個井，并且在計數(shù)系統(tǒng)中，只允許設置數(shù)量有限的PMT(在現(xiàn)有的系統(tǒng)中最大為12個)。雖然數(shù)量有限的PMT意味著一次只能讀出少數(shù)的井，但通過多次移動PMT檢測器可以分析井的陣列。
非成像計數(shù)系統(tǒng)的主要優(yōu)點是它們是一種(按鈕)技術(容易使用)，并且是成熟的。因此，許多這種儀器在工業(yè)上是可以利用的，并且其性能是好的。
計數(shù)系統(tǒng)的主要缺點是a有限的靈活性--只有少數(shù)的儀器可以處理384個井，并且絕對處理不了較高密度的熒光或發(fā)光的樣品陣列。
b只設計有固定格式用作井或小瓶讀取器，并且不能以自由格式讀取樣品。
c對于暗的樣品，其處理速度慢--雖然在強光下一次掃描幾個井可以很快，但暗的樣品要求在掃描內(nèi)的每個位置花費較長的計數(shù)時間。因為有許多位置要被掃描，因而使生產(chǎn)率降低。
總之，非成像計數(shù)系統(tǒng)是不靈活的，并對于有些樣品提供有限的輸出。
用于扁的樣品的不同于非成像計數(shù)器的一種裝置是掃描成像器。掃描成像器，例如分子動態(tài)學(MD)風暴，MD熒光成像器，或Hitachi FMBIO在樣品上通過激光束或其它的光束，以逐點的或逐線的方式激勵熒光或反射光?？梢允褂霉步裹c的光學系統(tǒng)，通過犧牲速度和靈敏度來減少焦點之外的熒光(例如Biomedical PhotometricsMACROscope)。利用這些裝置，通過以串行方式在一段時間對點和線進行累加而構成圖像。
掃描成像器一般用于凝膠或斑點，此時它們提供方便的操作。樣品被插入，并通過小的用戶影響(沒有聚焦、和調(diào)整亮度等)，進行掃描并得到圖像。和非成像計數(shù)系統(tǒng)一樣，掃描成像器通常是一種按鈕技術。其容易使用以及好的性能導致其越來越多地被用于凝膠和斑點分析中。
掃描成像器具有4個主要缺點
a掃描速度慢。必須使光束和檢測器裝置在整個樣品上通過，同時在掃描過程中讀取數(shù)據(jù)。掃描一個小的樣品至少用5-10分鐘。而掃描一個大的樣品要用半小時。這限制了生產(chǎn)率，并且使在掃描處理期間變化的樣品的定量分析復雜化。
b有限數(shù)量的的波長。由光學系統(tǒng)提供有限數(shù)量的熒光激勵波長。因此，只有有限數(shù)量的分析方法可以使用。
c低的靈敏度。大部分掃描成像器比本領域的成像器的靈敏度低。
d亮度不合適。掃描成像器要求由對樣品施加光束而產(chǎn)生的亮的信號。因此，發(fā)射暗的內(nèi)源性亮度的光的樣品(例如涉及熒光素酶或魯米諾的反應)不能被成像。
e沒有合適的井。只有扁的樣品可以被成像。數(shù)量有限的共焦點儀器可以進行光學分段，然后把劃分的部分重新構成聚焦的濃的圖像。
一種面成像系統(tǒng)每次把整個樣品放在檢測器平面上。不需要移動PMT或掃描激光器，因為照相機并行地使在許多小的檢測器元件(通常是CCD)上的整個樣品成像。在同時獲取圖像之后，從檢測器讀出整個圖像。讀出是一個串行的過程，但是相當快，其速率范圍為幾千到幾百萬個像素/每秒。
面成像系統(tǒng)提供了有些很有吸引力的優(yōu)點。
a因為一次便使整個樣品成像，檢測處理可以非?？?。
b對于給定的合適的照明系統(tǒng)，可以應用任何激勵波長。
c可以對亮度反應(沒有入射光而發(fā)光)成像，包括閃爍光和生物光或化學光輝光。
d可以對自由格式或固定格式的樣品成像。
亮度成像更容易實現(xiàn)，其中不必施加照明。然而，大多數(shù)亮度反應是很暗的，這使得極其需要現(xiàn)有的面成像技術。標準的對策是使用用于這些類型的樣品的靈敏的、科學等級的CCD照相機。然而，在沒有本發(fā)明的情況下，積分照相機不能使許多亮度樣品成像。因此，本發(fā)明可以使用其它系統(tǒng)不能成像的樣品成像。
一般的現(xiàn)有技術的系統(tǒng)對于在平的膜上的亮度樣品和在井中的亮度樣品采用面成像。總是使用標準的照相機鏡頭。井成像的結果是有缺陷的，其中沒有對視差誤差進行校正。
有多種關于使用熒光進行面成像的現(xiàn)有技術。熒光顯微鏡(見Brooker等人的美國專利5332905)和常規(guī)的凝膠與斑點成像是最常用的方法。在顯微鏡方面的現(xiàn)有技術幾乎沒有什么關系，因為沒有提供對大的樣品面積進行成像。
關于大的樣品的現(xiàn)有技術主要包括對于常規(guī)的凝膠與斑點進行熒光成像的低成本的商業(yè)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可以使用標準的積分的CCD照相機對大的、亮的面成像。然而，它們具有以下主要缺點a局限于由氣體放電燈發(fā)射的波長。一般提供UVA,UVB,UVC與/或白光燈的一些組合。不能獲得其它的波長。
b在化驗期間波長不能改變。如果在化驗期間波長必須改變(例如關于用fura-2進行的鈣計量)，則不能采用這種裝置。
c對于熒光中小的改變不敏感。透射光從樣品的正下方進入檢測器光學系統(tǒng)。因此即使非常好的濾光器也不能除去所有的直射光，這便產(chǎn)生非特定亮度的亮的背景。在熒光中的小的改變(一般是許多樣品的)在非特定背景內(nèi)被丟失。
d低能的照相機和鏡頭。只有極少數(shù)的系統(tǒng)使用高性能的照相機。即使這些少數(shù)的系統(tǒng)也使用標準的CCTV或照相鏡頭，這限制了它們對于亮的樣品的應用。
e視差誤差使得不能進行精確的井成像。事實上，遠心的透鏡尚不能使用，這些系統(tǒng)在對井成像時呈現(xiàn)視差誤差。
本發(fā)明的新的特征減少了已有的大的熒光系統(tǒng)的缺點。這些新的特征包括a照明波長可以被選擇，而與氣體放電燈或激光器的峰值無關。
b使用計算機控制的濾光輪或其它裝置，在化驗期間可以改變照明。
c可以檢測熒光發(fā)射中的小的變化。因為熒光照明是通過外部照明(epi-illumination)得到的，或者來自脊部源或橫向源，直射激勵照明不會進入光學系統(tǒng)。這提供了盡量低的非特定背景。
d對于暗的樣品可以使用極高效的照相機和透鏡。
e獨特的遠心透鏡是極快的，并消除了視差誤差，從而使得能夠進行精確的井板分析。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于它的高速遠心透鏡，它可以立刻對整個井板成像，并可以對透明的或不透明的樣品提供高效率的外部照明。和樣品耦聯(lián)的光纖可用于代替透鏡耦聯(lián)。例如，光纖透鏡一直被用于運行在光子計數(shù)方式下的圖像放大的CCD照相機，用于分析固定格式或自由格式的數(shù)據(jù)。這種方法產(chǎn)生好的靈敏度，但是具有以下主要缺點a雖然建議系統(tǒng)可用于熒光樣品，但局限于透射照明的樣品，因為沒有位置用來插入外部照明機構。因此，光纖透鏡系統(tǒng)將使靈敏度變差，并不能用于不透明的樣品。許多樣品是不透明的(例如許多井板、尼龍膜)。
b井板是8×12cm的，這種尺寸的成像光纖的制造是很困難的和昂貴的。因此，必須對樣品獲得若干個小的圖像，然后重新組裝，以便本身整個樣品。
這種多次獲取使得不能使用具有隨時間而改變的樣品的裝置。
一種面成像分析系統(tǒng)(LUANA)被D.Neri等人披露了(“Multipurpose High Sensitivity LuminescenceAnalyzer”,Biotechniques20:708-713,1996)，其使用冷卻的CCD，側面安裝的光纖照明器和激勵濾光輪來實現(xiàn)一些類似于本發(fā)明的功能(波長選擇，面成像)。然而，LUANA使用側面安裝的光纖，這在實驗室安裝的系統(tǒng)中被廣泛使用，并具有被本發(fā)明克服的問題。具體地說，使用側面安裝的光纖提供極不均勻的照明，特別是在利用井板時。本發(fā)明的外部和透射照明系統(tǒng)對扁的樣品和井板都提供均勻的照明。此外，在LUANA的技術中，由于視差而不能對井板的樣品成像。
另--種系統(tǒng)(Fluorescence Imaging Plate Reader-FLIPR ofNovel Tech Inc.,Ann Arbor MI)使用面CCD檢測96井板中的熒光。這種裝置是一種非成像計數(shù)系統(tǒng)，并使用面CCD代替多個PMT。為了達到合理的靈敏度，其以96個井的格式運行，并把在每個井內(nèi)的所有的像素集中成為一個值。這種裝置不適用于亮度成像、自由格式成像或較高密度的井成像，并且成本非常貴。
有許多現(xiàn)有技術使用成像檢測顯微裝置(例如“基因”檢測器)內(nèi)包含的樣品。一些基因檢測器使用掃描圖像儀，并檢測由光電倍增管發(fā)出的光。另一些使用面積CCD，檢測被直接被設置在CCD上或被設置在可以放置在CCD上的遮片上的樣品點的變化。當固定的靶被限定時，基因檢測器具有大的潛力。例如，為尋找基因組信息而制造一種遮片，并使該遮片用于篩選大量的血試樣。當使其設計的序列具有高的效率時，遮片必須含有大量的活性點，如果其用于篩選各種序列的話。具有幾千個點的遮片的制造是困難而昂貴的。因此，第一代基因檢測器將用于篩選非常特殊的核苷酸序列。
顯微裝置的不靈活性和本發(fā)明形成了對比，本發(fā)明不需要試樣基片的微觀制造。而本發(fā)明允許把試樣放置在井中、膜上、硅化載片或其它環(huán)境中。幾乎任何反應都可以量化。因而，本發(fā)明可以用作顯微制造的替換技術。因為本發(fā)明是靈活的，并可以分析任何化學樣品，適用于分析研究的所有階段。其中包括設計原型和質(zhì)量篩選。因此，當微觀制造不適用或成本-效果比低時，本發(fā)明提供了一種微觀制造的方法。
上述的每種現(xiàn)有技術都是處理成像樣品的某些方面。然而，現(xiàn)有技術沒有解決在以低的光值成像大的樣品時遇到的所有主要問題。這些問題是a需要非常高的檢測器靈敏度；b需要靈活的單色的大面照明；c必須避免視差誤差；以及d需要更可靠的處理以便發(fā)現(xiàn)和量化靶。
廣義上說，本發(fā)明的目的在于提供一種克服現(xiàn)有技術的缺點的用于化驗的成像系統(tǒng)。尤其是旨在提供一種用于對井中或膜上的樣品進行面成像的完整的系統(tǒng)。特別是，本發(fā)明提供一種完整的系統(tǒng)，用于對化學光、熒光、化學熒光、生物光或其它非同位素雜交樣品，包括高密度的斑點陣列，進行成像。
本發(fā)明的另一個目的在于，對化學光、熒光、化學熒光、生物光或其它非同位素樣品，包括組合的樣品，以自由格式進行成像。
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種用于對熒光圖像數(shù)據(jù)進行數(shù)字消卷積軟件。應用這種軟件可以減少閃爍和丟失焦點信息。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種用于對樣品成像的方法和系統(tǒng)，該系統(tǒng)是靈活的、可靠的和有效的，特別適用于低值發(fā)射。
本發(fā)明提供一種檢測器、透鏡、成像系統(tǒng)和照明技術的協(xié)同的組合，其可以對利用非成像計數(shù)器和掃描圖像儀預先獲得的樣品進行成像。尤其是，其可以用于固定格式或自由格式，并利用井板或扁的樣品。其能夠檢測熒光、亮光或透射光。
本發(fā)明的特點包括，其檢測并量化大的規(guī)則排列的靶的陣列，檢測并量化不按規(guī)則陣列排列的靶，進行任何數(shù)量的按規(guī)則排列的樣品的自動分析，從少量的大的井到大量的極小的井或斑點。
本發(fā)明的另一個特點是提供一種面照明系統(tǒng)，其使用標準的低成本的相干濾光器選擇激勵波長，能夠?qū)φ麄€井板或類似尺寸的樣品提供均勻的單色激勵；并且在計算機控制下可以對整個井板或類似尺寸的樣品提供不同波長的均勻單色激勵。
一種使用本發(fā)明的系統(tǒng)提供一種專門設計用于井板格式的樣品的透鏡。這種透鏡在把光子從樣品轉(zhuǎn)移到CCD陣列方面非常有效(是快的)，最好包括外部照明系統(tǒng)，并可用于非常暗的樣品。該透鏡還是遠心的。遠心透鏡具有可以直接射進井板內(nèi)所有點的性能，并且沒有標準透鏡具有的視差誤差。
一種優(yōu)選的系統(tǒng)提供一種遠心的高速透鏡，其在需要時產(chǎn)生均勻的外部照明場。透鏡配備有內(nèi)部光纖照明系統(tǒng)，該系統(tǒng)不需要分色鏡。透鏡的結構最好能夠接收一個作為阻擋濾光器(barrierfilter)的內(nèi)部相干濾光器。通過透鏡的光線當照射到阻擋濾光器上時幾乎平行，使得濾光器工作在其規(guī)定的波長和帶寬允差下。
本發(fā)明的特點在于，其提供一種光匯聚效率高的高速遠心透鏡或者標準的攝影透鏡。
一種優(yōu)選的系統(tǒng)提供一種CCD面陣列照相機，其具有高的量子效率(大約為80％)，和高的靈敏度(16位精度)，使得大多數(shù)樣品都可以通過積分而不放大便可以檢測。該系統(tǒng)最好具有一個和可選擇的圖像放大器耦聯(lián)的積分冷卻CCD照相機。在一個用于極低光強的實施例中，來自樣品的入射的照明被放大器放大，在積分時間內(nèi)，放大的光在積分照相機上積累。在積分時間結束時，照相機由一專用控制器或成像裝置讀出，從而重現(xiàn)光圖像。可以使用多次曝光，以便增加照相機的動態(tài)范圍。提供光密封的樣品室，其中可安裝所有的照明和檢測元件，并且其中放置樣品。
按照本發(fā)明的一種系統(tǒng)可以包括平移裝置(translationstage)(選擇的)，其也位于光密封室內(nèi)，并用于移動大的樣品(例如22×22cm的膜)通過光學系統(tǒng)。本發(fā)明通過軟件控制該裝置的移動，并由利用平移裝置獲取的多個“瓦片”形成一個合成的圖像。
本發(fā)明最好提供有軟件控制系統(tǒng)，其校正陰影，幾何失真，散焦和照相機與透鏡系統(tǒng)固有的噪聲誤差；并使用由不同的激勵濾光器產(chǎn)生的多個圖像盡量多地除去非規(guī)范熒光。
具體地說，本發(fā)明提供一種軟件，用于利用先前由透鏡和檢測器系統(tǒng)測量的光學特性對一個焦面中的圖像進行消卷積。應當理解，來自多個焦面的數(shù)據(jù)也可以被消卷積。
雖然本發(fā)明的優(yōu)選實施例使用高精度的冷卻CCD照相機，但是如果成本是主要因素，本發(fā)明可以使用低成本的照相機構成。在這種情況下，通過降低圖像質(zhì)量和最終靈敏度，可以實現(xiàn)短的積分時間。
本發(fā)明的其它目的、特點和優(yōu)點從下面結合附圖對優(yōu)選實施例進行的詳細說明可以更清楚地看出，其中


圖1用于示意地說明按照本發(fā)明第一優(yōu)選實施例(直立的)的系統(tǒng)；圖2用側視圖示意地說明高速的遠心透鏡；圖3詳細表示透鏡的光學以及機械元件和發(fā)射濾光器支架；圖4示意地說明按照本發(fā)明的系統(tǒng)的第二實施例，其用于極低的光，具有設置在透鏡和CCD照相機之間的放大器；圖5示意地表示放大器的結構；圖6用側視圖示意地表示擴散照明板，表示來自主光纖束的單個的光纖束如何被取出并被設置在矩形光纖支架內(nèi)；圖7用頂視圖示意地表示擴散照明板，表示來自主光纖束的單個的光纖束是如何被引入光纖支架內(nèi)的通道陣列的；圖8是CCD照相機的示意圖；圖9是按照本發(fā)明用于進行圖像獲取和分析的方法的流程圖；以及圖10是說明在圖9的處理中用于定位靶的方法的流程圖。
現(xiàn)在參看附圖，圖1示意地表示按照本發(fā)明的成像系統(tǒng)1的優(yōu)選實施例。系統(tǒng)1大體上包括照明系統(tǒng)10，被提供在殼體14內(nèi)的成像子系統(tǒng)12，以及控制子系統(tǒng)16。成像子系統(tǒng)12包括設置在殼體14的照相機室20內(nèi)的CCD照相機子系統(tǒng)18和在照相機室20和樣品室24之間延伸的透鏡子部件22。在操作時，照明子系統(tǒng)10提供被施加于室24內(nèi)的樣品上所需的光能。由樣品發(fā)出的光能通過透鏡子系統(tǒng)22被傳遞到照相機18，在其中形成圖像，并將圖像傳遞到控制子系統(tǒng)16進行處理?？刂谱酉到y(tǒng)16包括照相機控制單元26，其是一種和特定照相機18以及計算機28匹配的常規(guī)單元，計算機28對于控制單元26編程，并接收來自照相機18的數(shù)據(jù)，以便按照本發(fā)明進行獨特的控制和處理。
用于照明子系統(tǒng)的光源最好是弧光燈30。來自燈30的光通過液體光導32被引入光耦合器或濾光輪34。液體光導34的優(yōu)點在于，它能傳遞UV范圍內(nèi)的光，并且比光纖對輸入的光的擴散作用強。
光耦合器34包括常規(guī)的用于標準的一英寸直徑的相干濾光器的濾光器支架(未示出)。在優(yōu)選的結構中，使用計算機控制的濾光輪代替光耦合器。濾光輪可以包括多個濾光器，在計算機的控制下，它們可以快速地改變。
光纖束36把來自光耦合器或濾光輪34的照明傳遞到不透光的樣品室24內(nèi)。光纖束36通過遮光板38，其允許光纖束在樣品支架聚焦期間上下移動。此外，來自透鏡22內(nèi)的外照明環(huán)光的光纖束40可以和光耦合器34相連。
描述了3種形式的照明系統(tǒng)，其中每種形式由單個光纖束輸入光。它們是透射板(42)，透鏡外側的環(huán)光(未示出)，和進行外部照明的透鏡(22)內(nèi)側的環(huán)光44。
透射板是一個矩形室50(見圖6和圖7)，在其內(nèi)來自光纖束51的單個光纖52被分開并被轉(zhuǎn)動90度，使得它們沿橫向指向樣品。光纖52以這樣的方式被分布在室內(nèi)，使得它們在照明圖形中的陰影最小。為此，在室的外圓周部分比在其中心部分設置較多的光纖。
矩形室50包括擴散柵54和石英玻璃擴散板56。這些擴散部件把來自光纖52的單個的光點作為其輸入，并在板56的表面上產(chǎn)生均勻的照明。室50還可以包括暗場闌(dark field stop)，以便使光從側面進入樣品。
外部的環(huán)光由和透鏡的軸線對準的光纖環(huán)構成，其中心具有足夠大以便包圍透鏡22的孔。環(huán)光的工作距離和透鏡22的焦距匹配。
內(nèi)部環(huán)光44由光纖環(huán)構成，其被設置在遠心透鏡22的本體內(nèi)并和其軸線對準，位于遠心透鏡的前透鏡元件的后方。擴散器、偏振器或其它的圓形元件可以設置在光纖環(huán)44的前方。
樣品井板被設置在被安裝在光纖室50的支架58內(nèi)(圖6)。支架58在其邊緣抓住井板。支架58的底部是空的，從而不影響對井的觀察。支架58被固定在可以使其沿垂直方向移動的傳動裝置上。通過調(diào)節(jié)傳動裝置60，支架58相對于透鏡22而移動，從而使光集中在樣品上。
透鏡22是高速遠心透鏡。透鏡具有發(fā)射濾光器槽62，其接收3英寸直徑的相干濾光器用于熒光成像。它包括位于前透鏡元件后方的內(nèi)部光纖環(huán)光源44。透鏡22在其中部由法蘭64(見圖2)被設置在照相機室內(nèi)。透鏡的后部伸入照相機室20中，提供到發(fā)射濾光器槽62的現(xiàn)成的通路而不干擾樣品。透鏡的前方伸入樣品室24中。
被冷卻的CCD照相機18被直接固定在透鏡上。因為照相機具有其自身的室20，所以不用擔心在冷卻裝置、電源和從室內(nèi)到照相機控制單元的數(shù)據(jù)電纜周圍的光的泄漏。
所有的控制、成像和分析功能都設置在計算機28中。
用于單色區(qū)域照明的標準技術是使用氣體放電照明燈(例如UV光盒)，在發(fā)射峰值其可以提供大約5000uW/cm2的表面。燈被涂敷用于把光發(fā)射限制于一個特定峰值的濾光器。雖然相當亮，但氣體放電燈在波長上被限制于由燈內(nèi)的氣體激發(fā)的峰值。
除去氣體放電燈之外，對于區(qū)域照明沒有更多的描述。主要問題是波長的選擇，以及把照明光束直接引入集中的光學系統(tǒng)會使靈敏度變差。為避免這些問題，光可以從上部、從側面?；蛘咄ㄟ^暗場或通過折射進入樣品。所有這些技術具有若干限制。側面安裝的光纖照明器是不均勻的。它們也不適合于井或其它非扁平的樣品，因為光以一定角度進入樣品，因而不能穿透靶的深部。折射或暗場照明器需要在井板處設置空間光學元件，并且不能用于不透明的樣品。
一種更靈活的照明系統(tǒng)使用寬帶照明光源，并能夠通過精密的濾光器(通常是相干濾光器)可以選擇單色照明的任何波長。使用濾光器是最好的，因為不同的照明器或低成本的可調(diào)激光器當在大面積上擴散時其光輸出將不足。
通常選擇汞弧或氙弧燈作為基于濾光器的單色激勵?；」鉄舻膬?yōu)點在于可以使其輸出成為窄的光束，使得在被散布在樣品的整個表面上之前可以通過小的容易得到的相干濾光器。可以使用透鏡或光纖把單色光從濾光器傳輸?shù)綐悠贰?br> 本發(fā)明比已有的任何裝置都更加靈活。其對整個樣品表面施加擴散的穿透照明(通過樣品)、脊部照明(通過環(huán)光或其它光源)或外部照明(通過透鏡)。外部照明是最好的，因為它通常產(chǎn)生較暗的背景、較寬的動態(tài)范圍以及在真實狀態(tài)下更線性的熒光響應。提供大面積的單色外部照明的能力是本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術的一個基本因素。
本發(fā)明在提供照明方面解決了3個主要問題。
a濾光器的可利用性-容易以小的尺寸實現(xiàn)的精密的濾光器(例如10nm帶寬濾光器)不能用于大面照明。這問題通過使用標準的相干濾光器被解決了。
b照明輸出-在8×12cm的面積上施加均勻的、單色的和可選擇的照明是本發(fā)明的特點。光耦合器或計算機控制的濾光輪接收標準的相干濾光器，并被用于選擇波長。光耦合器或輪可以被設置在專門設計的光纖板上用于穿透照明，被設置在光纖環(huán)上或被形成平面光用于脊部照明，或被設置在透鏡內(nèi)的光纖照明裝置上，用于外部照明。
c強度大-激勵照明被散布在大的面積上(一般96cm2)。因為強度隨被照射面積的平方而減少，所以得到的激勵強度的確是非常低的。在許多情況下，發(fā)射的熒光將不能用標準的工業(yè)等級的被冷卻的CCD照相機檢測到。本發(fā)明的非常靈敏的檢測器能夠使大的樣品發(fā)出的低的熒光成像。在極低的光的條件下，本發(fā)明包括可選擇的光放大系統(tǒng)，其可被插在透鏡和CDD照相機之間(如下所述)。
圖2表示在遠心透鏡22內(nèi)的照明和濾光器元件的總體布置。透鏡內(nèi)已安裝有光纖環(huán)光源44，其通過前透鏡元件在樣品(圖2的左側)上投射單色照明。環(huán)光源的焦面在B，而整個透鏡的焦面在B的前方A。把環(huán)光源的焦點置于樣品之外的一點上可以減少來自樣品的特定的反射。
發(fā)射濾光器槽62使得能夠插入相干濾光器，其從輸入的光線中除去激勵照明，只剩下由樣品發(fā)出的熒光。
圖3表示遠心的大的透鏡22的光學元件。透鏡具有39個表面，并具有以下的特征
有效的焦距164.436mm數(shù)值孔徑443放大率0.25注意在發(fā)射濾光器槽62內(nèi)光線幾乎是平行的。這使得濾光器能夠在其特定的波長和帶寬下操作。
雖然本發(fā)明可以使用任何透鏡，但使用其專門設計的透鏡可以得到最高的靈敏度。這種透鏡是高速的遠心透鏡，并包括適合于大的樣品的外部照明系統(tǒng)。
外部照明在熒光顯微鏡中是一種標準的技術，其中小的面積被照射。照射小的面積的最有效的方式是把二色分光鏡置于物鏡的后方。二色分光鏡或平面鏡是一個局部反射平面，其反射一個波長范圍，而允許另一個波長范圍通過。
在顯微鏡上，照明從側面進入二色分光鏡。使二色分光鏡具有一個角度，以便向下通過物鏡朝向樣品反射激勵光。由樣品發(fā)出的熒光(其波長比激勵光向上偏移)被物鏡采集，使其向上通過朝向分色鏡。分色鏡對于發(fā)射波長是透明的，使得光線通過分色鏡向著檢測器平面行進。對于每個激勵/發(fā)射波長需要不同的分色鏡。
在對于大的成像系統(tǒng)應用標準形式的基于二色分光的外部照明系統(tǒng)時存在的主要困難是a二色分光鏡至少必須和其必須填滿的物鏡那樣大。照相機透鏡比顯微鏡物鏡大得多，因而需要相當大的二色分光鏡。這樣大的二色分光鏡是不容易得到的。
b在高速大透鏡(macro lens)中，重要的是后透鏡元件要固定在盡可能靠近CCD的位置。在最后透鏡和CCD之間的距離的任何增加都顯著地減少工作數(shù)量和采集光的效率。因此，不可能把二色分光鏡設置在透鏡的后面。
c在常規(guī)的外部照明系統(tǒng)中，二色分光鏡通過整個透鏡反射激勵光。為此，激勵照明的傳輸極大地受到在透鏡中使用的玻璃的光學特性的影響。UV外部照明需要非常貴(并且難于加工)的石英光學玻璃。這些光學玻璃可以制成小尺寸的而用于顯微鏡物鏡，但是，用于本發(fā)明所述的大尺寸的情況將是非常貴的。
d二色分光鏡吸收光。一般地說，其效率為80-90％本發(fā)明的獨特的性能在于其不需要二色分光鏡。遠心透鏡是大的，因而有余地在其本體內(nèi)安裝照明裝置。照明裝置被如此安裝，使得其在前透鏡元件處從后方直接照射。這樣便照到樣品，而不需要反射的二色分光鏡。通過透鏡被反射回的任何雜散的激勵照明都通過位于照明光源后方的發(fā)射阻擋濾光器被除去。
此外，透鏡被如此設計，使得只有15個內(nèi)部透鏡元件中的1個處于內(nèi)部照明器的前方。其優(yōu)點在于，可以減小內(nèi)部閃爍和反射。同等重要的是，只需要前方透鏡對于UV是透明的。一個UV透明的透鏡是貴的，但是并不至于不能接受。
透鏡的前方元件被這樣計算，使得把光源聚焦在樣品的平面之外。光源不聚焦在樣品平面內(nèi)能夠減小反射。因為許多井板由拋光的塑料板制成，因而易于發(fā)生鏡面反射，這是一個重要特征。
這種透鏡是高效的。透鏡的匯集F/#是4.5。這意味著匯集的空間角是0.03891sr，匯集效率是0.03891/4p=.3096％。預期的透射值是0.85-0.90，給出的整體匯集效率為0.263-0.279％。和F/1.2照相透鏡相比，利用本透鏡的預期的改進大約為340％。
本透鏡是遠心的，遠心透鏡沒有視差誤差。利用標準透鏡得到的深色的圖像和窄的靶呈現(xiàn)視差誤差。在圖像中心的圓的靶被認為是真正的圓形。然而，透鏡以一定角度射進橫的靶。因此，這些橫的靶被看作是月牙形的。在許多情況下，根本看不到井的底部。遠心透鏡在井板的整個面積上匯集平行光線。因而，不以一個角度射進任何井中，因而沒有視差誤差。
本發(fā)明的透鏡的主要優(yōu)點在于，內(nèi)光束在適合于插入阻擋濾光器的位置被準直。即，透鏡是這樣計算的，使得大致在透鏡筒的中部的一點上，光線幾乎是平行的。在這一點上，透鏡中安裝相干濾光器。該濾光器用于除去激勵照明和其它的非規(guī)范光。在這一點上被準直的光束這重要的，因為相干濾光器必須以垂直于進入的照明的方式被安裝。如果進入的照明處于一個角度，則濾光器通過的波長將發(fā)生變化。在本發(fā)明中，當光線射到濾光器上時，它們幾乎是平行的，從而產(chǎn)生盡可能好的性能。
遠心透鏡具有固定的視野(在這種情況下直徑大約為14.5cm)，但是，如果需要對較大的樣品成像，在不透光的室內(nèi)可能要安裝電動的平移臺。在計算機的控制下，平移臺使樣品相對于透鏡而移動。在每次移動之后，獲得一個“瓦片”。當對整個樣品完成成像之后，所有的瓦片被重新組合(由軟件)成一個大的圖像，從而保持遠心度、無視差誤差以及在整個表面的高分辨率。
圖4表示圖1的系統(tǒng)的一種改型，其中增加了選擇的放大器70，以便提供用于對極低的光成像的另一種系統(tǒng)。在其它各個方面，該系統(tǒng)和圖1的系統(tǒng)基本相同。放大器70被安裝在遠心透鏡22和CCD照相機18之間。
圖5表示GEN3型的放大器70，其包括光敏陰極72，微通道板(MCP)74，熒光屏76，和真空密封的本體或殼體78。高速遠心透鏡22(圖2,3)置于部件70的前方。在其輸出側，透鏡被聚焦在陰極72的輸入窗上，從而把樣品圖像傳遞給部件70。光敏陰極72被這樣選擇，使得其與照到其上的光強成正比地反射電子。MCP74位于真空密封本體78內(nèi)，在陰極72和熒光屏76之間，并在每端和陰極72相連。MCP74具有小直徑的MCP通道，其每個涂敷有鎵的砷化物。從陰極72發(fā)射的電子沿著MCO通道被向著熒光屏76加速。當來自陰極的電子沿著小直徑的通道被加速時，它們撞擊涂敷的通道壁，從而產(chǎn)生附加的電子。當附加的電子離開MCP通道時，它們撞擊熒光屏76，從而在輸出窗產(chǎn)生樣品的放大的圖像。該圖像通過透鏡80和照相機中的CCD元件84耦聯(lián)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用Extended Blue GEN3圖像放大器比使用其它圖像放大器的優(yōu)點在于，其在輸出屏上提供的圖像是銳的，具有小的陰影誤差，并且比GEN1和GEN2放大器的噪聲小。不過，可以理解，隨著較好的放大器的研制，它們可以用于本發(fā)明中。
積分照相機18被這樣配置，使得在輸出窗78上產(chǎn)生的被高度放大的圖像通過中間透鏡80被聚焦在CCD元件84上。對于低光強樣品的圖像，照相機18的CCD元件84積分一段時間。在這段積分時間內(nèi)，來自輸出窗的入射到CCD元件84的光子作為負電荷(信號)被存儲在CCD元件84的大量單獨的區(qū)域中。在CCD元件84的每個單獨區(qū)域中的電荷量被累積如下。
信號=入射光×量子效率×積分時間來自放大器70的入射光的相對強度越大，存儲在CCD元件84的相應區(qū)域中的信號越大。
對于最低的光強的情況，因為閃爍接近樣品，本發(fā)明允許光放大器被插入透鏡和CCD照相機之間，這種光放大器是一種圖像放大器。例如，在Simonet的美國專利5204533中披露的放大提及把圖像放大器和CCD照相機相連。圖像放大器一般包括光陰極、熒光屏和連接在光陰極和熒光屏之間的微通道板(MCP)。利用這種類型的裝置，可以得到高達大約為90000的光放大倍數(shù)。
利用被插入光路鏈中的放大器，本發(fā)明成為一種圖像放大的CCD(ICCD)照相機。在ICCD照相機中，圖像在3個或4個平面中產(chǎn)生。在這些平面的每個上，具有一些量子效率的損失。因此，圖像放大器工作在高的增益下，以便克服在光路鏈內(nèi)的信號損失。在極高的放大倍數(shù)下，噪聲和通過MCP的離子反饋是如此嚴重，使得不可能進一步改進靈敏度。即使工作在最大的增益下，常規(guī)的圖像放大的CCD照相機因靈敏度不足而不能使最暗的樣品成像。
對于一般極暗的樣品，大多數(shù)ICCD照相機不能產(chǎn)生圖像，或者只能產(chǎn)生極淺的圖像，其中難于把靶和背景區(qū)別開來，并不能給出靶的強度的真正范圍。在最壞的情況下，則根本不能把靶和背景區(qū)別開來。
常規(guī)的圖像放大的CCD照相機使用等于一個電視幀的積分時間。短的積分時間允許放大器用于標準的低成本的視頻照相機，例如被用于電視工業(yè)中。換句話說，放大器用門進行控制，以便使用極短的積分時間(例如1msec)。使用門進行控制使得放大器可以用于光子計數(shù)方式。
本發(fā)明提供了兩種可以使用放大的光的方法。一種優(yōu)選的方法涉及在被冷卻的CCD照相機上連續(xù)積分放大器的輸出。這種方法是快速高效的，但具有有限的動態(tài)范圍?？梢允褂梅糯笃鞯睦鋮s，或不同時間的多次曝光，以便改進動態(tài)范圍。第二種方法涉及觀察一個較短時間內(nèi)的放大器輸出和光子計數(shù)。這種方法慢得多，但是具有寬的動態(tài)范圍。本發(fā)明可以根據(jù)樣品的要求來選擇兩種方法之一。
現(xiàn)有技術中存在在井板分析成像中使用放大的CCD照相機的技術。Martin和Bronstein(1994)以及Roda等人(1996)討論過利用放大的CCD照相機進行化學光樣品成像。只有亮的樣品可以看到。沒有提供對于深的井在沒有視差誤差的條件下，或者對樣品施加單色激勵進行成像。
Rushbrooke等人的美國專利4922092(1990)披露了使用和特殊光纖透鏡耦聯(lián)的圖像放大的CCD照相機。光纖透鏡包括在井陣列和放大器的輸入端之間傳輸光的光纖束。雖然由Rushbrooke披露的發(fā)明是無視差的，并且適用于標準的96或384井板，但是其不能對本發(fā)明所述的很高密度的井陣列成像。此外，由Rushbrooke披露的發(fā)明缺少照明能力。它也不能對自由格式的樣品成像，因為在輸入光束之間具有被尋址的空間。和光纖相反，本發(fā)明通過使用透鏡輸入，允許自由格式成像。
總之，本發(fā)明的本實施例允許使用置于透鏡后方的選擇的放大器，用于檢測最低光強的樣品。當被放大時，該裝置可以運行在連續(xù)積分或光子計數(shù)方式下。
利用圖4和圖5所示的系統(tǒng)，只有CCD檢測器被冷卻。這對于大多數(shù)應用是足夠的。不過，應當理解，放大器光陰極72也可以被冷卻，借以改進放大器的信噪比。類似地，整個光敏裝置(放大器+CCD)可以被冷卻。不過，冷卻整個光敏裝置的缺點是會降低在光纖輸出窗上的熒光的效率。
雖然高質(zhì)量的工業(yè)等級的CCD照相機可以檢測大約50個入射到CCD的光電子(和設置的檢測可靠性有關)，但在成像照明下的樣品時，這一表示性能的數(shù)據(jù)是不精確的。實際性能被整個光路鏈的發(fā)射與收集性能以及CCD照相機的性能復雜化了。因此，應該超出檢測器的QE，并檢查整個系統(tǒng)的傳輸效率。
有3個因素決定檢測器系統(tǒng)的傳輸效率(產(chǎn)生的光電子/發(fā)射的光子)。它們是透鏡的光匯集效率，CCD檢測器的量子效率和透鏡的透射率?？梢园聪率接嬎惝a(chǎn)生的光電子數(shù)Npe=τ*φdetector* c.e.*Nphotons其中τ是透鏡的透射率，對于本發(fā)明的透鏡大約為85-90％φ是CCD檢測器的量子效率，一般為35-40％，在本發(fā)明的情況下高達80％，以及c.e.是透鏡匯集效率，對于高速攝影透鏡，其小于.1％，在本發(fā)明的情況下大約為1.2％。
在一般的工業(yè)等級的CCD照相機系統(tǒng)中，使用可得到的最快的攝影透鏡(f1.2)，并利用高質(zhì)量的冷卻檢測器，CCD對于由試樣中的點光源產(chǎn)生的大約5000-10000個光子將產(chǎn)生1個光電子。
本發(fā)明的透鏡提供大約0.271％的匯集效率。CCD檢測器的效率大約是其它CCD的兩倍。其結果是本發(fā)明在理論上，對于由試樣中的點光源產(chǎn)生的大約500-1000個光子將產(chǎn)生1個光電子。這一很高的傳輸效率使得能夠進行利用現(xiàn)有技術的系統(tǒng)不能成像的樣品的檢驗。
在圖4和圖5所示的實施例的另一個實施例中，系統(tǒng)包括一個擴充的藍色型GEN3圖像放大器。其它類型的放大器雖然不如這種的好，但也可以使用。3種主要類型的放大器(GEN1,GEN2,GEN3)的區(qū)別在于其元件的結構和構成元件的材料不同。在GEN1放大器中，入射到光陰極上的照明以正比于入射信號的強度的速率產(chǎn)生發(fā)射。然后，從光陰極發(fā)射的電子通過高壓電場被加速，并使用靜電聚焦或近聚焦在熒光屏上聚焦。熒光屏可以是視頻照相機的輸入窗(如同硅放大的靶照相機)，或者可以直接觀看。GEN1具有一些幾何失真，并且具有相當?shù)偷牧孔有?大約10％)。
GEN2放大器類似于GEN3，在成像管內(nèi)在陰極和陽極之間具有MCP。和GEN1放大器相比，GEN2放大器較小，噪聲較低，并具有較高的增益。不過其量子效率相當?shù)?一般在20％以下)，并且其易于具有差的對比度傳輸特性。與此相反，GEN3放大器管具有大約30％的量子效率或更高(需要小的增益)，并具有很高的固有對比度傳輸特性。關于最近型號的GEN3，其增益值大約和GEN2的相等(可得到的極限增益值大約為90000)。因此，GEN3放大器比GEN2放大器易于產(chǎn)生較好的圖像。當由于成本或特殊的設計特點而需要時，也可以使用其它形式的放大器。可以使用具有高的固有增益的類似裝置(例如電子照射的后部照明的CCD檢測器)代替圖像放大器。
本發(fā)明的CCD照相機18可以使用鎖定于圖像放大器中的門控電源的積分時間，其結果是照相機可以以非常短的時間間隔被讀出。使用門控和快速讀出的特點，并使放大器運行在最高的增益下，或者利用中間放大器，可以使本發(fā)明作為常規(guī)的光子計數(shù)照相機那樣被操作。因而，本發(fā)明的系統(tǒng)可以有利地用于微弱樣品的直接成像，或者通過使其操作方式從積分變?yōu)殚T控而作為光子計數(shù)照相機。
圖8示意地表示CCD照相機18。照相機18包括位于照相機快門后面的CCD元件84。為了減少由CCD內(nèi)的電子產(chǎn)生的暗噪聲CCD元件84被安裝在散熱器88上，散熱器88又和Peltier冷卻元件以及用于提供增強的熱耗散的液體循環(huán)系統(tǒng)呈導熱連接。使透鏡位于快門上方，以便使圖像聚焦在CCD元件84上。在除去攝影透鏡裝置之后，高速遠心透鏡22(圖2和圖3)直接利用螺絲固定在照相機本體上。類似地，圖像放大器70(當存在時)被直接固定在照相機本體上。
面成像系統(tǒng)使用CCD陣列形成圖像。影響CCD陣列檢測少量的輸入光子數(shù)的能力的因素包括量子效率、讀出噪聲和大多數(shù)成像陣列的小的尺寸(例如2.25cm2)。
量子效率(QE)表示CCD中的光檢測器把入射的光子轉(zhuǎn)換成電子空穴對的能力。消費等級的CCD的QE一般大約為12-15％。標準的工業(yè)等級的CCD照相機的QE大約為40％。數(shù)量非常有限的薄的背后照明的CCD在峰值檢測波長下的QE可以達到80％。
讀出噪聲來源于CCD的輸出前置放大器，其測量每當一個或幾個CCD元件的電荷被傳遞給它時所產(chǎn)生的電壓中的小的改變。讀出噪聲直接和讀出速率有關，在使用慢的讀出速率時被減少。
暗噪聲是由在CCD中由熱而產(chǎn)生的電荷而產(chǎn)生的。通過增加背景電平，暗噪聲減少動態(tài)范圍?？梢詮膱D像中減去恒定的暗噪聲值，但是暗噪聲也具有不能被減去的隨機噪聲分量。這一分量加于檢測器的噪聲值上。通過冷卻CCD而使暗噪聲減少。
CCD元件的尺寸和其存儲光電子的能力(被稱作井容量)有關，因而和其動態(tài)范圍有關。在陣列中的每個CCD元件越大，元件的井容量和動態(tài)范圍越大。寬的動態(tài)范圍允許檢測器用于較長的曝光時間而不飽和，因而增強了極小信號的檢測。此外，較大元件的信噪性能本來就好于較小的元件。大多數(shù)面成像系統(tǒng)使用相當小的CCD。這對于其中離散的CCD元件是大的裝置產(chǎn)生有限的分辨率，并對于其中離散的CCD元件是小的裝置產(chǎn)生有限的動態(tài)范圍。具有有限的動態(tài)范圍的裝置不能達到16位的精度，因而必須用于相當亮的樣品(例如熒光顯微鏡，UV凝膠，很亮的化學光)。
本發(fā)明包括被設計用于減少剛剛述及的所有問題的CCD系統(tǒng)。這種CCD陣列通常是大的(6.25cm2)和效率高的(大約80％的量子效率)。其結果是獲得了具有寬的動態(tài)范圍的極高的檢測器靈敏度(16位)。優(yōu)選的支持電子部件包括高精度的數(shù)字化器，其具有最小的讀出噪聲。照相機最好被冷卻，以便減少暗噪聲。
在照相機內(nèi)附帶地提供有機電快門，用于限制圖像在CCD元件上曝光。照相機最好是薄的，背后照明的1024×1024個像素的黑白照相機，具有異步復位功能和高的量子效率。通過設置在照相機控制電路內(nèi)的數(shù)字化電路和設置在計算機內(nèi)的接口卡，照相機提供16位的數(shù)字信號輸出。來自CCD的數(shù)據(jù)以200000個像素/秒的速率被照相機控制單元數(shù)字化，并被直接傳遞到計算機存儲器。
在積分間隔之后，CCD照相機接收來自計算機的觸發(fā)脈沖，以便啟動機電快門的曝光。隨著快門的閉合，圖像被從CCD傳遞到計算機的內(nèi)部幀緩沖器。
雖然這種照相機可以在不冷卻CCD元件的情況下使用，但是通過使用具有整體冷卻的元件的CCD照相機，可以實現(xiàn)擴展的積分間隔。積分的有效性受冷卻程度的限制。利用無制冷的液體冷卻裝置，可以達到大約-50℃(環(huán)境溫度以下)的檢測器溫度。在這個溫度下，暗噪聲的累積速率大約為7-10個電子/秒。這種冷卻具有成本低并且容易實現(xiàn)的優(yōu)點。
不過，應該理解，如果使用制冷的液體或深冷的冷卻劑，可以實現(xiàn)更長的積分時間。
控制系統(tǒng)16包括控制單元26和計算機28。照相機控制單元是一個由照相機18的制造者提供的用于控制照相機的可由計算機控制的單元。計算機28最好是一種常規(guī)的運行在Windows環(huán)境下的計算機，并被編程用于實現(xiàn)按照本發(fā)明的圖像獲取和分析。
基于照相機的成像系統(tǒng)缺少在一般的計數(shù)或掃描系統(tǒng)中使用的按鈕操作。照相機聚焦、調(diào)整曝光時間等可能都不方便。
實際上，成像本身比對井內(nèi)的一種靶進行計數(shù)復雜得多。非成像計數(shù)系統(tǒng)具有相對簡單的任務。它們只需要控制掃描過程，控制內(nèi)部校準以及產(chǎn)生表示每個井的小的數(shù)據(jù)點陣列。其可以采用以下的操作步驟a相對于內(nèi)部標準校準檢測器。
b照明一個井。
c在照明的井上放置PMT。
d讀出井e把數(shù)據(jù)傳遞到分散板上。
f照明下一個井并重復。
面成像系統(tǒng)具有復雜得多的任務。對一個井板成像可以包括以下步驟a在整個井板上提供足夠的照明。
b控制高性能的照相機。
c存儲幾何和密度校正系數(shù)。
d對樣品成像。
e校正幾何和密度變量。
f如果需要，按照樣品內(nèi)的標準校正圖像。
g定位每個井并對強度量化。
h把數(shù)據(jù)傳遞到分散板上。
如果成像系統(tǒng)配置有用于完成上述b-h功能的軟件，則可以僅完成這些任務。本發(fā)明包括這種軟件。
具體地說，本發(fā)明的一個方面是一種軟件，其通過使用兩個圖像對于非規(guī)范背景校正熒光。第一個圖像由這樣一個激勵濾光器形成，其在激勵非規(guī)范熒光的同時激勵盡可能少量的規(guī)范熒光。第二個圖像由這樣一個激勵濾光器形成，其盡可能多地激勵規(guī)范熒光，而盡可能少地激勵非規(guī)范熒光。借助于從規(guī)范的圖像中減去非規(guī)范圖像而形成最佳的規(guī)范熒光圖像。
圖9是說明由用于控制系統(tǒng)1并從中獲取數(shù)據(jù)的計算機28執(zhí)行的主要處理的流程圖。在處理開始之后，使用照相機18在塊200獲取樣品的圖像。用于獲取樣品的偏圖像的處理是已知的。這種偏圖像考慮在獲取圖像時由系統(tǒng)本身引入的所有的嚴重失真和誤差。利用一種已知的方法，在步202獲取樣品的偏圖像。
在步204，獲取非規(guī)范圖像。這種圖像確定非規(guī)范元素例如基片對于圖像的貢獻。這一步被表示為選擇的，因為只有在樣品必須被照明以便獲得樣品圖像的情況下才進行，在這種情況下，一些光也從非規(guī)范元素反射。在另一方面，如果樣品是圖像的光源(例如化學光)，則不獲取非規(guī)范圖像。類似地，塊206的步驟是選擇的，因為它涉及獲取非規(guī)范偏圖像。
在塊208，從樣品圖像中除去或減去樣品偏圖像。在塊210從非規(guī)范圖像中減去非規(guī)范偏圖像。這得到兩個圖像，其中偏置的影響已得到補償。在塊212，從補償?shù)臉悠穲D像中除去補償?shù)姆且?guī)范圖像，從而產(chǎn)生工作圖像，其中樣品的作用被分離。本領域的技術人員應該理解，如果不進行步204和206，則步210和212也不進行。
在除去偏置之后，使用已知的方法提供各種其它的校正(例如起源于透鏡的幾何失真)。
在步214，操作者向計算機輸入標準的“網(wǎng)格”間距和“測試模板”。網(wǎng)格間距是在基片上樣品試樣的標準的心對心間距。“測試模板”是相應于膜上的一個點、板上的一個井或類似的靶的單個靶的標準規(guī)定(例如根據(jù)形狀和面積)。一般的測試模板是一個圓形的區(qū)域，并對于樣品中的每個靶有一個測試模板。網(wǎng)格由一個矩陣構成，其中含有對于每個靶的一個測試模板。
選擇地，操作者也可以定義一個“錨點”(anchor point)的陣列。樣品可以包括數(shù)千個可能樣品的陣列。在一些情況下，這些陣列的大部分將被填充，在另一些情況下，則只有一小部分被填充。在相當少的試樣點被填充的情況下，樣品將包括預定的“錨點”，以便幫助系統(tǒng)確定測試模板的位置。在大部分可能的試樣點被填充的情況下，試樣本身提供足夠的填充，以便定位測試模板，因而不需要錨點。
在塊216，產(chǎn)生具有規(guī)定的網(wǎng)格間距的規(guī)定的測試模板并被疊加在工作樣品圖像上。此時，操作者可以對測試模板的疊加的網(wǎng)格選擇地提供手動調(diào)節(jié)，以便使其和實際樣品在總體上對齊。操作者應當這樣作，例如，借助于利用鼠標移動整個陣列，然后“抓住”規(guī)范的測試模板并使其在樣品上的合適的靶上對準中心。例如，操作者可以借助于使網(wǎng)格的4個角上的測試模板在樣品的合適的靶上對準中心來進行整體對準。雖然不重要，但是這手動調(diào)整將加速并簡化由計算機28進行的處理。
在塊218進行如下所述的處理，以便確定測試模板相對于可能的靶的實際位置的更精確的位置。在塊218處理的開始，確定是否靶或錨點已被充分地識別或確定。如果靶已被很好地確定，則控制轉(zhuǎn)移到塊222，在其中測試模板的陣列和確定的靶對齊，但是如果錨點已被很好地確定，則控制轉(zhuǎn)移到塊220，在其中測試模板的陣列和錨點對齊；否則，控制則轉(zhuǎn)移到塊224，在其中預定的網(wǎng)格間距和陣列的測試模板被利用。應該理解，在一些情況下，可能需要把陣列和錨點對齊然后和靶對齊。
一旦測試模板和靶對齊之后，則在各個測試模板內(nèi)的測量對于不同的條件被解碼。例如，一個測試可能采取n個條件中的任何一些條件，因而塊226的處理可以在每個測試時對于這些條件中的一個對試樣進行解碼。實際的處理根據(jù)統(tǒng)計進行，并且由一個關于判定二進制決定的一個簡單例子可以得到最好的理解。不過，本領域的技術人員應當理解，所述的處理實際上可被用于解多個條件處理。在最簡單的情況下，二進制決定是“yes”或“no”的決定，其可以和某個條件的有無相關。按照塊226的處理，測量樣品的每個測試的實際值，對于一組試樣確定平均與標準偏差，這便得到工作統(tǒng)計分布。然后對于由操作者選擇的任何置信度值進行“yes”或“no”的解碼。操作者選擇置信度值使得確定一個門限值(例如根據(jù)所述的值確定一個與分布曲線的平均值的標準偏差的計算數(shù))，并且在門限值以上的任何信號被認為是“yes”，而在門限值以下的任何信號則被認為是“no”。
在塊228進行處理以便根據(jù)在塊226進行的處理產(chǎn)生陣列數(shù)據(jù)的報告?？梢栽O想這可以是一個任何形式的寫軟件的報告，其向操作者提供在制備所需格式的報告時的基本的靈活性。一旦報告被產(chǎn)生，處理就告結束。
作為附錄A所附的資料更詳細地說明了圖9的處理。
圖10是說明圖9的塊222中進行的處理的流程圖。
在開始處理之后，在塊300計算圖像背景和噪聲。在塊302，確定是否需要網(wǎng)格對于靶的陣列進行組對準。這可通過操作者觀察或者通過系統(tǒng)進行。這一檢驗的目的在于確定網(wǎng)格是否和整個靶對齊。如果由系統(tǒng)完成，則利用常規(guī)的用于檢驗兩個規(guī)則形狀的圖形是否對齊的程序完成。如果確定組已被充分地對齊，則控制轉(zhuǎn)移到塊306。
在塊304進行組對齊。這個操作的目的在于使檢測模板網(wǎng)格和各自的靶粗略地對齊。這可根據(jù)整個網(wǎng)格或由操作者選擇的部分網(wǎng)格進行。除去使ID在整個網(wǎng)格上最大之外，這對齊可以通過下面討論的關于塊306用于使ID最大的處理完成。
在塊306，在每個測試模板的區(qū)域內(nèi)進行臺階狀的處理，以便由式(1)確定在測試模板內(nèi)產(chǎn)生最大集成密度ID的點ID(x0,y0)=∫s(x0,y0)D(x,y)w(x-x0,y-y0)dxdy(1)其中(x0,y0)是測試模板的中心點；S(x0,y0)是在(x0,y0)的測試模板面積；D(x,y)是在(x,y)的密度值(例如增量劑)；以及w(x,y)是加權函數(shù)(例如在(0,0)具有其最大值的二維Gaussian函數(shù))。這對每個測試模板產(chǎn)生一個“A位置”，它是在式(1)中提供最大值的位置。在塊306之前的測試模板的位置則稱為“G位置”。
在塊308，在A位置和G位置之間進行置信度加權，以便達到每個測試模板的中心的最后位置。對于A位置的置信度加權系數(shù)是信噪比的形式。即，在每個點的ID值正比于在那一點的ID值和對那點在塊300確定的值的比。實際上，加權系數(shù)被用于確定沿著位置A和位置G之間的直線的測試中心的位置，從而加權確定該點和位置A接近的程度。
雖然詳細說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本發(fā)明不限于此。本領域的技術人員可以作出各種改變和改型。本發(fā)明的范圍由所附權利要求限定。
附錄A1．引言分子生物學、化學和自動化方面的快速進步正在從總體上對生物醫(yī)學，特別是對藥物新發(fā)明方面發(fā)揮著深刻的影響。由于某些公司對新技術接受得非?？?，加大了對所有的競爭者的壓力。人人都想降低發(fā)現(xiàn)和評估潛在治療指標所需的費用并加快其速度，結果導致了藥物科學的一個新領域-生物分子篩選-的迅速成長。生物分子篩選可以被定義為對大量化合物的潛在藥物學效應進行迅速而有效的實驗室試驗。
生物分子篩選的成長是組合化學、生物學多重接受法、分子基因?qū)W和其它領域中的新事物和新理解的必然結果。例如，組合化學家可以從一個簡單化合物開始，由它產(chǎn)生出成千上萬種具有潛在重要性的化合物。必須對所有這些化合物，或它們的一個重要亞群，做生物活性試驗。另一個例子是發(fā)現(xiàn)、檢測和研究化合物和基因之間的相互作用的特征。
組合化學、分子基因?qū)W和其它應用的要求已經(jīng)導致了篩選技術的一個特殊領域-高工效篩選(HTS)-的發(fā)展。HTS與通常定義的生物分子篩選沒有本質(zhì)的區(qū)別。我們可以把它看成是從篩選法而來的“減重高速汽車”，其中相當多的開銷和努力花費在提高測試化合物的速度上。檢定化學、檢測系統(tǒng)、自動化/機器人以及生物信息學中的最優(yōu)秀的技術都在HTS中扮演了自己的角色。
能夠使檢定化學最有效率的一種途徑是使檢定形式小型化。例如將從96個井板改成384個就增加了單位面積里的檢定位?？梢詳嘌詫芸斐霈F(xiàn)更高密度的微井形式。微井檢定將緊隨著其它篩選方案的引導，利用顯微加工裝置或布點機器人在固體載體上提供非常密集的DNA克隆陣列(例如Beattie等，1995；Eggers等，1994；Khrapko等，1989,1991；Lamture等，1994；Lipschutz等，1995；Maskos和Southern,1992；Mason,Rampal和Coassin,1994；Pearson和Tonucci,1995；Pease等1994；Saiki,Walsh,Levenson和Erilich,1989；Schena,Sbalon,Davis和Brown,1995；Southern,Maskos和Elder,1992)。
一個典型樣品中的目的基因數(shù)目在迅速增加。今天的顯微加工示范裝置含有大約1000-20000個格網(wǎng)元素(簡要評介見Southern,1996)。布點檢定通常獲得高得多的密集度。在我們的檔案中有一些圖片，是在一張約20×20厘米大的膜上容納了多于50000個同位素標記的cDNA點狀雜交斑。我們還看到過用非同位素方法獲得的高得多的密集度，在這種方法中密集度的集中不受同位素輻射發(fā)散的限制。由于微板、膜或其它媒體上愈來愈密集地布滿檢定位，導致了等間隔格網(wǎng)模式檢定位的高密集度。這就是通常所謂的“高密集度格網(wǎng)”。
分析井采用的傳統(tǒng)方法(一般是基于光電倍增管的計數(shù)器)常常不適于高密度格網(wǎng)。計數(shù)裝置必須一個接一個地為各個格點編址，無法處理小檢定位構成的大陣列。與此相對照，一個基于照相機的成象系統(tǒng)同時適于高密度格網(wǎng)和自由形式的樣品(即那些不是等間隔模式的樣品)。自由形式樣品的例子包括在分析皿中的組合液滴檢定、組織培養(yǎng)中的細胞級檢定和克隆檢定等等。
圖象和篩選技術之間的界面還處于形成階段，其技術剛剛達到可以使用的程度。顯微制造、非人造陣列(比如膜、微井)和檢測技術方面的革新將與圖象分析結合，成為新的篩選法在排序、診斷和接合方面的有力工具。
圖象與庫篩選分子基因?qū)W，或DNA分子水平的基因研究涉及到特定基因編碼的DNA的分離和特征化。最基本的目的基因是與疾病和病理學過程相關的基因組。例如大多數(shù)癌癥都來自于非遺傳性基因突變(體細胞突變)，這種突變導致細胞功能失常。如果一個特定基因的改變常常與一種特殊的癌癥相關，那么這種基因的變化或許就能夠被用來檢測這種癌癥?；蚬こ碳夹g也可以用來研究基因及其編碼蛋白的功能、批量生產(chǎn)稀有蛋白和創(chuàng)造基因紊亂的動物模型。所有這些的出發(fā)點就是cDNA和基因組庫的篩選。我們?yōu)楹唵巫R別出那些與我們的探針雜交的克隆而進行篩選，或為識別那些響應某些無關變量(比如兩個細胞株)而改變了基因表達的克隆而進行篩選。
DNA庫篩選的最普通的應用就是識別和分離對應于一個感興趣的特定基因的克隆。為了從一個特定的基因分離出克隆，必須有一個可用于這個基因的探針。然后對DNA庫進行篩選以得到包含有與探針雜交序列的克隆。
為感興趣的基因而分離克隆的DNA的第一步是將一個庫里的分立克隆涂抹到一個空模子里，在這個模子的各位置上放置一個分立克隆。位于各位置上的克隆可以是已知的克隆，正象當我們有一個科斯質(zhì)粒，或YAC，或BAC克隆的有序陣列時那樣。這種方法有一個優(yōu)點，即同時復制基因并標注它在染色體上的位置。由于這樣的庫常由基因譜圖構成，基因位置的識別就可以給出與已被標注在染色體同一區(qū)域的遺傳性疾病的可能的聯(lián)系。另外，克隆還可以構成一個特殊庫的非有序取樣(存在多余部分和重迭部分)。
分立的克隆的庫被復制在一個固態(tài)載體上，具有代表性的固態(tài)載體是濾膜。用精密的布點機器人能使整個庫在很少的膜上按高密集度格網(wǎng)涂抹開。因為庫中的各個克隆可能只包含感興趣的基因的一種蛋白或者一個特殊的基因可能在庫中未被充分表達，為了有更多的的機會找出正(互補)克隆，需要篩選出數(shù)萬甚至數(shù)十萬個分立的克隆。結果是針對一種特定基因的被標記的探針將只與數(shù)千個可能的目的基因中的少數(shù)幾個克隆相互作用。
為識別正克隆，我們將點狀斑的高密集度格網(wǎng)與一個被標記的探針雜交。典型的探針是一個DNA的小片段或者合成的已知排序的低核苷酸。雜交階段利用了強有力的排序特性和互補核酸單鏈之間的高親和性。這一過程的目標是確定我們膜上的庫是否包含了與我們探針的已知排序互補的排序。如果有，就能獲得這個雜交的排序，并用它把我們的注意引向包著較小的雜交部位的基因組的未知部分。
使克隆與探針的雜交度可視化是成象系統(tǒng)的職責之一。高密集度格網(wǎng)可以用同位素或非同位素成象使其可視化。對于同位素標記的探針，磷成象板技術是最方便和精確的信號檢測方法。非同位素的檢測可以用一個靈敏的數(shù)字照相機和化學發(fā)光劑或熒光標記來實現(xiàn)。我們建議用我們的Tundra超低光成象系統(tǒng)來達到這一目的。無論我們的標記物是什么，結果都是一幅高集密度格網(wǎng)的圖象。在典型的篩選研究中，這種圖象包含了成千上萬個未標記的點和幾個標記過的點。分析這個圖象來別識正的命中點是成象系統(tǒng)的主要功能之二。
圖象分析涉及點的定位、雜交強度的定量化和正負命中點的解析。最困難的方面是點的定位。因為篩選一個庫通常只在圖象上產(chǎn)生很少幾個可見的點，根據(jù)強度對正的目的基因進行定位看起來很容易。在這種情況下，我們將“盯住”圖象，并設置一個只選命中點的水平(閾值)。在庫篩選中比在基因表達研究(見后)中更適合采用按照密度值選取命中點的方法，但它卻不是一種選取命中點的好方法。這是由于以下原因1．本底和標記強度的變化常常在為命中點定義一個單一的密度值時導致某種不確定性?？紤]與克隆雜交的探針的情況，如果這個克隆是具有弱的、但真正與探針同系的染色體的重要的克隆，它將呈現(xiàn)微弱斑點，其強度僅僅稍高于那些負點的強度。如果做正點選擇時采用簡單的密度截斷，這個點就很可能被丟掉。
2．密度標準在進行定量和評估之前就消除了目的基因。因此我們是在主觀判斷(點看上去較暗或較亮)的基礎上，而不是在定量數(shù)據(jù)的基礎上檢測命中點。
作為對照，我們的軟件利用格網(wǎng)的等距離間隔在識別命中點之前給所有的格網(wǎng)元素定位和定量。這種方法(固定采樣探針的策略)在過濾器上使用特殊的“錨”點來提供特別的參考點。利用這些點，這個軟件就能標識在各個和每個格網(wǎng)元素上的克隆。這個軟件還能對局部本底變化、照明不均和其它誤差源進行修正。
有了這些已定位和進行過本底修正的格網(wǎng)元素，系統(tǒng)就從所有的元素讀取數(shù)據(jù)。格網(wǎng)中的每個目的基因都被定量化并被輸入這個格網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫。利用這些數(shù)據(jù)，就可以使用客觀的統(tǒng)計方法來識別正命中點。例如，我們能夠比較所有格網(wǎng)元素的強度，并選取那些與全平均信號的差別大于10倍標準偏差單位的信號。統(tǒng)計方法的使用確保用客觀標準將所有的正命中點，甚至那些不能被視覺分辨的正命中點識別出來。
最后，這個軟件提供方便的圖形輸出，以易于理解的方式顯示結果，同時還提供全部數(shù)字數(shù)據(jù)，可以將它們輸出到你的數(shù)據(jù)處理軟件去。
基因表達研究基因表達研究的目的是找出那些在兩種或兩種以上條件下其表達有所差異的基因。例如，我們可以對比這樣兩種情況下的基因表達一種是對照細胞中的基因，它們來自于有病的細胞系；另一種是暴露在藥劑之下的同種細胞中的基因。傳統(tǒng)的評估基因表達的方法是基于對分立的基因在RNA水平上按次序地分析或者一次進行少量的分析。與此相對照，使用高密集度格網(wǎng)允許同時研究上千種基因的表達。基因表達研究與庫篩選的主要區(qū)別在于我們不是尋找?guī)讉€識別與特定的已知排序雜交的命中點，而是評估大量基因被表達的程度。
基因表達是用復雜的探針混合體與cDNA庫的雜交來研究的。庫被復制布點，以產(chǎn)生兩套或更多的同樣的高密集度格網(wǎng)。在研究中不同的探針由各種條件下分離出的RNA分別衍生出來。各RNA樣本實際上都是許多mRNA分子的復雜混合體，這些分子對應于不同基因的產(chǎn)物。在這個復雜混合體中起作用的mRNA分子的數(shù)量反映了分立基因的表達水平。表達水平越高，混合體中的分子越多。
放射性的或生物素基的核酸參與(利用用反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶)產(chǎn)生復雜探針的過程。雜交后特殊基因的活性正比于在高密集度格網(wǎng)的各斑點上檢測到的信號。
與只有少數(shù)斑點雜交的庫篩選不同，在基因表達研究中大多數(shù)斑點都與RNAs的混合體雜交。所以識別所有格網(wǎng)斑點的位置并不困難。成象系統(tǒng)利用實際斑點矩陣的信息來排列取樣格網(wǎng)?；虮磉_研究中的真正問題在于數(shù)據(jù)量之巨大。多個膜上的高密集度格網(wǎng)可能包含幾萬個斑點，各斑點的表達值都必須被保留。圖象分析軟件要設計成能夠處理如此大量的數(shù)據(jù)集，并且能夠?qū)Σ煌瑮l件下的各數(shù)據(jù)集進行比較，這一點非常重要。我們的軟件就具備了這些能力。
比較不同條件下的表達并非一個微不足道的問題。各個格網(wǎng)的信號的絕對強度都與眾不同，所以我們不能簡單地做跨樣品的信號強度比較。我們的軟件提供了很多使無關的跨膜變化最小化的方法。例如，我們可以在各格網(wǎng)內(nèi)定義內(nèi)部標準(一個特殊的基因，或者所有基因的平均表達水平)。在將強度值對內(nèi)部標準歸一化之后，就可以對強度值進行跨格網(wǎng)的比較了。另一個辦法是比較兩種條件下的差值，用差值的分布來確定命中點。差值的分布不受膜之間差異的影響，而且還有一些其它的有益的統(tǒng)計特性。利用這些方法以及包含在我們軟件中的其它方法，我們就能執(zhí)行不同類型的必然因果關系數(shù)據(jù)分析來得到比較基因表達的最佳方法。
大型基因表達研究的結果構成一個巨大的數(shù)據(jù)集。因此排列并處理這個數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)管理功能非常重要。我們的單元顯示功能創(chuàng)建可以被直接輸入你的公司數(shù)據(jù)結構的矩陣。
2．高密度格網(wǎng)軟件的細節(jié)分段在分析高密度格網(wǎng)之前必須完成三個主要任務
1．識別各格網(wǎng)元素(我們將稱其為目的基因)以便了解它在矩陣中的位置。這種識別必須考慮到格網(wǎng)創(chuàng)建中的某些變易。
2．量化各目的基因的密度(反映雜交強度)。這可能需要做密度標準校正，和/或某種形式的本底修正。
3．選取感興趣的目的基因。一旦量化了目的基因密度，我們就能記錄各個和每個目標，從而分析不同樣品的基因表達?；蛘呶覀兛梢詮倪@個大陣列中僅僅選取有限數(shù)量的感興趣的目的基因(常常叫做命中點)。
分析的第一步總是目的基因識別。從本底中辨別目的基因的過程被稱為分段。
人工分段最簡單的分段形式是圈定各個目的基因，一次一個。方法是用鼠標將圓圈放到各個目的基因上。擊鼠標的鍵，就會顯示出目的基因的強度和位置。
在典型的庫篩選中，在大范圍的清晰的襯底上有少量明顯可見的點指明了命中點。點擊這些明顯的點(以產(chǎn)生它們的位置碼)好象是一種可接受的檢測方法?？墒?，即使命中點是清晰可見的，人工分段也是不可行的。問題在于將這些命中點分配到格網(wǎng)中合適的位置的過程。將任何點分配到格網(wǎng)中合適的位置首先涉及到這些點的檢測和排列。當然，你可以手工點擊所有這些點，但這將非常費時間。想象一下嘗試圈定1000個目的基因，再考慮許多實驗室希望在不遠的將來達到100,000個目的基因。
自動分段自動分段無需人工指導來發(fā)現(xiàn)目的基因。你的自動分段系統(tǒng)的質(zhì)量決定了它的成功與否。如果正確地實施了自動分段，它就能提供一個識別和分析千萬個目的基因的迅速和方便的方式。如果實施得不正確，自動分段會產(chǎn)生許多偽正點和偽負點，這就需要再加上后掃描編輯。最壞的情況下，差的自動分段會產(chǎn)生錯誤的數(shù)據(jù)。
自動分段的標準方法是給目的基因指定一個特定的密度范圍。這個過程叫做閾處理。處于這個密度范圍內(nèi)的象素被歸為目的基因。處于這個范圍之外的的象素被歸為本底。
如果目的基因是不同大小和不同形狀的，并且/或在圖象中不占固定的位置，則一個簡單的密度閾是最好的選擇。例如一個用同位素原位探針標記的涂有感光乳膠的組織切片所包含的目的基因(暗的顆粒)就會出現(xiàn)在圖象中的任何位置上。我們可以對這個圖象進行處理使得這些顆粒可見度最高，設置一個密度閾值(例如50灰度級)，然后檢測比這個閾值更暗的象素顆粒。
與此對照，用格網(wǎng)，目的基因被固定大小并被規(guī)則排列(圖1)。我們能夠利用這種規(guī)則排列的優(yōu)點來使分段更加精確和有效。實際上，單一的密度閾值在格網(wǎng)圖象中是不夠的。變化的局部本底(如左上部和右下部的密度不同)和規(guī)定辨別目的基因的強度水平方面的不確定性會使其失效。我們的經(jīng)驗是在大多數(shù)格網(wǎng)分析的形式下，密度閾處理是高度主觀和棘手的任務。
圖1空間上可變的目的基因和格網(wǎng)目的基因。左圖中的目的基因具有不同的大小和間距。它們可用設定密度閾來檢測。右圖中的目的基因被編組成格網(wǎng)。它們要用在各目的基因位置上放置固定的探針來探測。
用固定的取樣探針分段所幸的是格網(wǎng)能被十分客觀和比無規(guī)目的基因更有效地分析。我們知道目的基因的間距、數(shù)量和直徑，因此不需要以密度作為目的基因識別的唯一工具。AIS/MCID使用固定取樣探針的方法代之。
使用固定取樣探針時，格網(wǎng)定義決定分段處理。固定的取樣探針被(自動)放置在格網(wǎng)的各個位置上。這樣做的困難在于實際的樣品很少是完全等間距的。我們將發(fā)現(xiàn)布點機器人迷路、復制偏離或一些其它的因素導致格網(wǎng)的變化。因此用固定取樣探針方法分段需要分為兩步。首先，用格網(wǎng)定義的點的位置來復制格網(wǎng)。然后系統(tǒng)用一些相當復雜的算法對實際目的基因進行自動格網(wǎng)排列(圖2)。
圖2一個包含1536個分立點狀斑的格網(wǎng)。我們看到左邊的圖象是無取樣探針的。右邊的圖象顯示了位于各個點狀斑上的取樣探針。我們用這些點狀斑來自動放置、排列探針。
比起用掃描來找出超過密度閾值的目的基因的方法，使用固定取樣探針方法有幾個優(yōu)點1．我們檢測每個目的基因并將其定量化，包括所含數(shù)據(jù)在本底水平或近本底水平的那些基因。
2．對每個目的基因的檢測允許我們使用客觀的統(tǒng)計程序(代替主觀的密度閾)來定義命中點。
3．我們能在任意數(shù)量的實驗條件下跟蹤給定的目的基因，包括那些沒有明顯活化目的基因的實驗條件。這在基因表達研究中是十分重要的。
構造和排列格網(wǎng)格網(wǎng)是用鍵盤上輸入的間隔參數(shù)(點與點之間的距離和組與組之間的距離)來構造的。以規(guī)定的間隔定出格網(wǎng)的原形，并從這個原形出發(fā)形成整個格網(wǎng)。
精細排列某些格網(wǎng)取樣探針很可能沒有準確地放在分配給它的位置上。要解決這個問題，可以實行自動排列。在這個過程中，模糊邏輯算法將各分立格網(wǎng)元素放置在最符合實際圖象數(shù)據(jù)的位置上。如果需要進一步排列，可以用鼠標把任何格網(wǎng)元素或元素組拉到位。
錨不是所有的樣品都有可以用來做精細排列的可見的點。在庫篩選中，一般是在相當大的格網(wǎng)上只有少數(shù)幾個可見點。在這種情況下，精細排列算法缺乏足夠的數(shù)據(jù)而無法工作，除非在格網(wǎng)上加上已知的參考點。這些被稱為“錨”的參考點包括一個可見的目的基因，并被用來指導自動排列。例如，我們的布點機器人創(chuàng)建一個含6144個分立點的格網(wǎng)，我們可以在四個角和其它更有意義的位置的點上放進易于檢測的數(shù)量的標記。當我們創(chuàng)建格網(wǎng)時，AIS/MCID將用這些錨作為參考點來實施自動排列。
詳盡模式和篩選模式詳盡模式-基因表達詳盡模式獲取格網(wǎng)中各個和每個目的基因的值。詳盡模式給出目的基因的完全描述，并允許直接在多至四個格網(wǎng)之間做比較?？墒?，數(shù)據(jù)表里常包含成千上萬個數(shù)字，這會降低你的系統(tǒng)的速度。一般地說，對于幾個各有5000點的陣列還沒有什么問題。但是管理非常多的點(例如30,000或更多)就會限制容許能力。掃描格網(wǎng)不是主要問題。而僅僅核算一個含有50,000個數(shù)字的數(shù)據(jù)表就要花費一些時間。如果數(shù)據(jù)管理證明速度太慢，考慮改用篩選模式。
詳盡模式在基因表達研究中和雜交篩選的某些情形中是最有用的。這兩種應用都不僅僅涉及簡單辨別明顯的命中點和本底。因此，了解格網(wǎng)的每個點的反應如何是十分有用的。
庫篩選模式庫篩選模式一次分析一個格網(wǎng)，并只顯示這個格網(wǎng)中的命中點。當只有小比例的格網(wǎng)元素包含標記時，采用用庫篩選模式從大量庫藏中篩選未知的基因。
篩選使用與詳盡模式類似的邏輯結構，即要在統(tǒng)計分段之前掃描并量化所有的數(shù)據(jù)。不同之處在于我們想要從相對干凈的樣品中辨別出少數(shù)幾個標記過的命中點。不需要記錄那些未標記的格網(wǎng)位置，因為它們只會減慢系統(tǒng)的響應。
在篩選分段之后，未被選中的就被丟掉了，只有命中點被保留下來。由于數(shù)據(jù)表中只顯示命中點，數(shù)據(jù)管理就快得多了。
詳盡模式和篩選模式小結詳盡模式和篩選模式的不同在于格網(wǎng)被量化之后發(fā)生的事情。詳盡模式記錄每個目的基因的值，以便你能進行必然因果關系的數(shù)據(jù)分析。與此相對照，庫篩選模式只記錄有效命中點。它在目的基因的分布中設置一個截斷點(比如高于平均值5倍的標準偏差)以選擇有限數(shù)量的命中點供進一步注意。只有超過截斷點的那些目的基因才顯示在數(shù)據(jù)表中。
選擇感興趣的目的基因；統(tǒng)計分段在詳盡模式和篩選模式中，初始的分段步驟都使用固定取樣探針和自動排列以從格網(wǎng)中各個和每個目的基因產(chǎn)生數(shù)據(jù)。一旦目的基因被分了段，并對它們的密度或體積進行了量化，就會使用不同程序來選擇感興趣的目的基因。
我們用統(tǒng)計分段這個術語來描繪這個過程，在這個過程中，我們從全部點中選擇有限數(shù)量的命中點(篩選模式)，或從一個樣品到另一個樣品跟蹤基因表達中最重要的差別(詳盡模式)。我們可以將統(tǒng)計分段定義為統(tǒng)計推理在目的基因的自動界定上的應用。
篩選考慮這樣一個實驗我們用探針從三個細胞株中篩選一個cDNA庫。這些庫被點到三個識別膜上(20K探針/膜)，每個膜是一個細胞株。在雜交過程之后，我們檢查三個膜上的射線自顯影，并斷定所有的細胞株都顯示出與庫中的兩個克隆強的雜交。但是，第三個細胞株(C株)還顯示出與另外一個克隆的雜交(強度稍弱)(圖3)。這可能是C株與另兩株不同，但我們?nèi)绾蔚弥?圖3用探針從三個細胞系中篩選cDNA庫。所有三個細胞株都與兩個克隆雜交。細胞株C出現(xiàn)了與另一個克隆的雜交。要判斷這是否是一個真實效應，我們需要比較三個膜上第三個克隆的雜交強度。
可能影響我們關于第三個克隆的判斷的幾個因素1．第三個克隆可能與C株劇烈地雜交，但與A株和B株較弱地雜交。
2．第三個克隆專門與C株雜交，但雜交信號弱。
3．制備中可能包含一些模糊點，它們使得對第三個克隆的翻譯復雜化了。
在上述情況下，我們可能沒有一個非黑即白的判定，而是做出要對第三個克隆加以注意的決定。這個信號強度是否足以作為命中點 簡單地設置一個“看起來不錯”的密度閾是相當武斷的。
為了幫助你做出客觀的決定，系統(tǒng)找出并計算出所有目的基因的強度，數(shù)據(jù)中包括那些只有本底強度的目的基因、那些比本底稍高但仍很弱的目的基因以及那些具有足以被肉眼所見的更強烈的探針-克隆相互作用的目的基因。
一旦我們有了完備的數(shù)據(jù)集，我們就能用基于方差統(tǒng)計的程序來判別各個觀察到的強度是命中點的幾率。基于方差的判別與簡單的僅僅在密度的基礎上檢測命中點的閾值判別不同，它將各個目的基因的密度與所有目的基因的分布特性相比較。命中點是那些最與眾不同的目的基因。這樣做的邏輯是與其它目的基因非常不同的目的基因可能是應該研究的。這種基于方差的閾值的方案是非常有效的(運用統(tǒng)計學)和易于實施的。
詳盡模式和基因表達統(tǒng)計分段在示蹤基因表達時很有用。在這些研究中，我們通常跨多個格網(wǎng)比較給定克隆探針的反應強度。那些被實驗操作(例如使用潛在的藥品化合物)增強或抑制的反應是感興趣的反應。用統(tǒng)計分段分析這種研究方案的步驟如下1．測量所有目的基因的密度，跨若干樣品來量化基因的表達水平。各個樣品對應不同的實驗條件。
2．計算出每對目的基因的差值記錄?，F(xiàn)在我們有了在各種實驗條件下各目標克隆的差值分布。
3．計算差值記錄分布的平均值和SD(標準偏差)。
4．統(tǒng)計分段階段。選擇差值記錄高于或低于平均值幾倍SD單位的目的基因，這些目的基因可以被歸為命中點。作為基于方差的判別，這個命中點的選擇過程在總體密度上是與格網(wǎng)之間的差異無關的。
5．以一種叫做元素顯示(見下文)的形式顯示目的基因。
小結統(tǒng)計分段是統(tǒng)計推理在格網(wǎng)數(shù)據(jù)分析上的應用。它的優(yōu)點在于為判別目的基因提供了客觀的標準，并且它允許我們對數(shù)據(jù)進行跨樣品的比較。之所以有后一個優(yōu)點是因為基于方差的分析使無關因素(如影印效果、曝光時間)的影響減至最小。
總的來說，統(tǒng)計分段是從大量數(shù)據(jù)中提取有效命中點的一種客觀的程序。統(tǒng)計分段的中央優(yōu)點是a)我們能有據(jù)地提出用來分辨命中點的標準；b)我們能使外部處理變量的效應最小化，以簡化跨格網(wǎng)的比較。
快速數(shù)據(jù)通訊元素顯示格網(wǎng)分析會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)點。這些數(shù)據(jù)可以用你認為合適的任何方式來描述。例如，向Excel輸出數(shù)據(jù)矩陣，按照雜交強度排列，并用排列好的數(shù)據(jù)表來傳達你的結果。
另一個選擇是創(chuàng)建元素顯示。這是一種圖形圖象，它用不同方式標記有限數(shù)量的感興趣的目的基因。例如，在篩選研究中，命令元素顯示去標記密度高于點密度平均值六倍SD單位以上的點，元素顯示將你的注意從常規(guī)過程的上千個點引向最相關的數(shù)據(jù)點(圖4)。
當然，對一個干凈的膜和一個二進制標記(通或斷)，可能不需要元素顯示。我們可以只看原始圖象來了解哪個點是命中點。可是當樣品不干凈，或存在標記強度梯度時，元素顯示就變得非常有用了。在這些情況下，肉眼趨向于不確定，讓計算機以顏色代碼和易懂的方式來顯示命中點就較容易。
元素顯示在詳盡模式跨兩個或更多的樣品做比較時特別有用。格網(wǎng)和格網(wǎng)之間的平均目的基因強度、本底水平和其它因素都趨于不同，因此，要跨樣品對特殊格網(wǎng)格點的相對強度做出視覺判斷是非常困難的。與此對照，因素顯示清晰地顯示出格網(wǎng)之間的變化。任何統(tǒng)計分段的輸出都可以用單幅元素顯示概括出來(圖5)。
本底偏差的影響任何形式的分段都會受本底的影響。理想地，本底水平低，而且為常數(shù)。低本底改善靈敏度。常數(shù)本底簡化目的基因檢測。不幸的是，幾乎沒有低的和常數(shù)的本底。因此AIS/MCID提供了本底變化的修正。
無修正 無本底修正選點指定特定的點(如各序列的左上部位)來抑制本底。
圍繞象素系統(tǒng)查看各點的外邊界，并從這些圍繞象素計算這個點的本底。
用戶選擇你定義一個或多個用來做本底修正的樣品區(qū)。
圖象處理一些圖象處理功能，當圖象中點與點之間本底不同時能有效除去本底。
上述所有的修正方法都存在各自的弱點。最好的選則是將原始樣品的本底最小化。
小結高密集度格網(wǎng)研究方案1．快速自動大格網(wǎng)分析在一個格網(wǎng)上可以放置任意數(shù)量的目的基因?？梢杂萌魏蚊襟w做格網(wǎng)矩陣(如膜、凝膠、微滴定板)。
2．自動鋪展、排列和本底修正格網(wǎng)被按照用戶輸入的間隔建立(鋪展)起來。格網(wǎng)鋪展開后，自動排列成圖象中最佳數(shù)據(jù)位置并消除本底。
3．詳盡和篩選模式每次掃描都讀取所有的格網(wǎng)元素。但是我們可以選擇保留并顯示所有的數(shù)據(jù)，或僅僅保留和顯示那些被定為命中點的數(shù)據(jù)。保留所有的數(shù)據(jù)允許做非常廣泛的必然因果分析，而只保留命中點可以節(jié)省時間。
4．統(tǒng)計分離命中點是由它們在所有格網(wǎng)元素的分布中所處的位置來自動確定的。這個程序是客觀并易于證明的。
5．跨樣品比較目的基因統(tǒng)計分離使處理因素的影響最小化，并允許進行跨樣品比較。例如，我們可以在各包含5,000個點狀斑的一個對照膜和三個實驗膜之間比較雜交強度的增減。
6．元素顯示這些簡化圖形顯示能顯示被減少為少量彩色代碼的命中點的一個或多個點陣。
權利要求
1一種用于化驗的數(shù)字成像系統(tǒng)，包括透鏡子部件和設置在透鏡子部件后方的成像子部件，用于對設置在透鏡子部件前方的樣品形成圖像，所述透鏡子部件包括透鏡，其包括前透鏡元件并具有一個光軸；以及光源，其被設置在所述透鏡內(nèi)的所述前透鏡元件的后方，并被如此構成，使得光直接進入所述前透鏡元件從所述透鏡射出。
2如前一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述光源包括多個光纖，其第一端適合于和一個照明源耦聯(lián)，并具有被設置在所述透鏡內(nèi)的所述前透鏡元件的后方的第二端，該第二端的位置被這樣設置，使得光從其中基本上平行于所述軸線向著所述前透鏡元件發(fā)射。
3如前面任一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡沒有二色分光鏡，而能夠向樣品發(fā)射激勵光，并從樣品向回向成像子部件發(fā)射樣品發(fā)射的沒有激勵光的光。
4如前面任一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡包括多個透鏡元件，其主要部分被設置在所述光源的后面。
5如前一權利要求所述的系統(tǒng)，其中只有前透鏡元件被設置在所述光源的前方。
6如前面任一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡含有多個透鏡元件，并且還包括用于在所述前透鏡元件和所述多個透鏡元件的最后一個之間的位置保持至少一個發(fā)射濾光器的裝置，所述透鏡被這樣構成，使得從所述樣品通過所述透鏡向回射出的光線在所述保持裝置的位置基本上和所述軸線平行。
7如前面任一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡被這樣構成，使得在大于到所述樣品的距離上對來自所述光源的照明聚焦。
8如前面任一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡被這樣構成，使得其具有足夠大的視野，以便觀看含有點的陣列的整個樣品。
9如前一權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡具有直徑至少為一個厘米的視野。
10一種透鏡子部件，用于進行化驗的數(shù)字成像系統(tǒng)，所述成像系統(tǒng)包括設置在透鏡子部件后方的成像子部件，用于對設置在透鏡子部件的前方的樣品成像，所述透鏡子部件包括遠心的放大透鏡，包括前透鏡元件并具有光軸；以及設置在所述透鏡內(nèi)的在所述前透鏡元件后方的光源，其被如此構成，使得光直接進入所述前透鏡元件從所述透鏡射出。
11如前一權利要求所述的透鏡子部件，其中所述光源包括多個光纖，其第一端適合于和一個照明源耦聯(lián)，并具有被設置在所述透鏡內(nèi)的所述前透鏡元件的后方的第二端，該第二端的位置被這樣設置，使得光從其中基本上平行于所述軸線向著所述前透鏡元件發(fā)射。
12如權利要求10或11所述的透鏡子部件，其中所述透鏡沒有二色分光鏡，而能夠向樣品發(fā)射激勵光，并從樣品向回向成像子部件發(fā)射樣品發(fā)射的沒有激勵光的光。
13如權利要求10-12任一個所述的透鏡子部件，其中所述透鏡包括多個透鏡元件，其主要部分被設置在所述光源的后面。
14如前一權利要求所述的透鏡子部件，其中只有前透鏡元件被設置在所述光源的前方。
15如權利要求10-14的任何一個所述的透鏡子部件，其中所述透鏡含有多個透鏡元件，并且還包括用于在所述前透鏡元件和所述多個透鏡元件的最后一個之間的位置保持至少一個發(fā)射濾光器的裝置，所述透鏡被這樣構成，使得從所述樣品通過所述透鏡向回射出的光線在所述保持裝置的位置基本上和所述軸線平行。
16如權利要求10-15所述的透鏡子部件，其中所述透鏡被這樣構成，使得在大于到所述樣品的距離上對來自所述光源的照明聚焦。
17如權利要求10-16任何一個所述的透鏡子部件，其中所述透鏡被這樣構成，使得其具有足夠大的視野，以便觀看含有點的陣列的整個樣品。
18如前一權利要求所述的透鏡子部件，其中所述透鏡具有直徑至少為一個厘米的視野。
19在用于化驗的面積數(shù)字成像系統(tǒng)中的一種用于提取樣品上的靶的方法，所述樣品包括可以不按照良好的規(guī)則性排列的靶的陣列，所述方法包括以下步驟確定一個標準靶位置的矩陣，其中包括在樣品上多個固定的、預定的網(wǎng)格點的每一個的預定的二維尺寸和形狀的測試模板；以及通過以下措施確定相應于靶的測試模板的最可能的位置利用樣品的圖像，根據(jù)圖像中的相應于選擇的靶的標準靶位置附近的像素強度對于選擇的靶求出最可能的位置；并且使用一個表示最可能位置的可靠度的置信度值作為加權系數(shù)，從標準靶位置向選擇的靶的最可能的位置移動測試模板的位置。
20如前一權利要求所述的方法，其中所述確定步驟對于每個靶通過迭代進行。
21如權利要求19或20任何一個所述的方法，其中在所述求取步驟中使用的圖像是這樣產(chǎn)生的產(chǎn)生表示最有利的感興趣的效果的樣品的主要圖像，產(chǎn)生表示感興趣的最小效果的輔助圖像，使輔助圖像和主要圖像進行組合。
22如權利要求19-22任何一個所述的方法，其中樣品具有預定的錨點，按下述措施使矩陣相對于樣品中的實際的靶位置被最初定向把規(guī)范的測試模板放置在下述之一上錨點；可以被清楚地確定的靶點。
23如權利要求19所述的方法，其中對于靶的置信度值由靶的可檢測性確定。
24如權利要求1-9任何一個所述的系統(tǒng)，其中所述透鏡是遠心的大透鏡(macro lens)。
25如權利要求10-18任何一個所述的透鏡子部件，其中所述透鏡是遠心的大透鏡(macro lens)。
26在用于化驗的數(shù)字成像系統(tǒng)中，該系統(tǒng)包括透鏡子部件和設置在透鏡子部件后方的成像子部件，用于對設置在透鏡子部件前方的樣品形成圖像，位于樣品前方的照明子部件包括位于樣品前方并靠近樣品的平面擴散板；以及多個光纖，每個具有適用于和光源相連的第一端和第二端，所述第二端設置在所述擴散板的后方，并且其方位被這樣設置，使得其發(fā)射的光基本上垂直于擴散板的平面，所述光纖被如此設置，使得它們之間的間距在擴散板的中心比在其外周大。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種電子成像系統(tǒng),用于評定矩陣中的比色的熒光或亮度信號的強度,所述矩陣由井,微井,在膜上、凝膠上或其它樣品上的雜交斑點。該系統(tǒng)包括非常靈敏的面積CCD檢測器(18),具有外部照明(44)的高速遠心透鏡(22),反射/透射照明系統(tǒng),照明波長選擇裝置(34),和光密封分室(24)。使用計算機和圖像分析軟件控制硬件,校正和校準圖像,并檢測和量化圖像內(nèi)的靶。
文檔編號G02B13/14GK1234114SQ97197924
公開日1999年11月3日 申請日期1997年8月12日 優(yōu)先權日1996年8月16日
發(fā)明者彼得·拉姆, 孫剛, 羅爾夫·米勒, 蒂莫西·奧姆斯比, 肯尼思·R·卡斯爾 申請人:圖像研究公司