用于使立體樣品成像的方法和顯微鏡的制作方法
【專利摘要】介紹了一種用于使立體樣品(16)顯微地成像的方法，其中，使得顯微鏡物鏡(12)依次朝向至少兩個基準(zhǔn)平面聚焦，所述基準(zhǔn)平面在立體樣品(16)內(nèi)部沿著顯微鏡物鏡(12)的光軸(O)處于不同的立體樣品深度；針對每個基準(zhǔn)平面求取矯正件(18)的基準(zhǔn)方位，在該基準(zhǔn)方位，利用矯正件(18)來矯正與立體樣品深度有關(guān)的像差；基于求取的基準(zhǔn)方位，針對立體樣品中的至少一個目標(biāo)平面，確定矯正件(18)的目標(biāo)方位，在該目標(biāo)方位利用矯正件(18)來矯正在目標(biāo)平面的立體樣品深度出現(xiàn)的像差；為了給立體樣品(16)成像，使顯微鏡物鏡(12)朝向目標(biāo)平面聚焦，并將矯正件(18)挪動至目標(biāo)方位。
【專利說明】
用于使立體樣品成像的方法和顯微鏡
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于使立體樣品顯微地成像的方法以及一種顯微鏡。
【背景技術(shù)】
[0002] 在三維地延展的樣品（下面也稱為立體樣品）的光學(xué)顯微中，高質(zhì)量的三維成像是 主要的關(guān)注點。對此，主要挑戰(zhàn)之一就是由光在樣品中的傳播路徑引起的像差。在此尤其會 觀察到所謂的孔徑像差，其產(chǎn)生的原因是，立體樣品的折射率不同于樣品周圍的介質(zhì)的折 射率。光在樣品內(nèi)部的傳播路徑越長，由折射率的這種不匹配引起的孔徑像差就越大。因而 尤其難以為位于立體樣品內(nèi)部深處的樣本平面精確地成像。如果樣品折射率沿著顯微鏡物 鏡的光軸改變，即沿著樣品深度的方向改變，那就會更加難以實現(xiàn)高質(zhì)量的三維樣品成像。
[0003] 為了避免前述像差，通常采用帶有矯正件的浸液物鏡，矯正件為了矯正孔徑像差 是可移調(diào)的。由現(xiàn)有技術(shù)已知的這種矯正件例如具有可機(jī)動地移調(diào)的透鏡支架，透鏡支架 使顯微鏡物鏡中包含的透鏡單元為了矯正像差而沿著光軸移動。DE 10 2011 051 677A1中 就公開了這種矯正移調(diào)的一個例子。
[0004] 如果要在一個寬廣的軸向范圍內(nèi)矯正由折射率不匹配引起的孔徑像差，那就需要 給矯正件提供一定的折射能力，于是在矯正移調(diào)時樣本鏡頂焦距就會出現(xiàn)并非所愿的變 化，即成像的樣本平面沿著光軸出現(xiàn)移動。然后樣本鏡頂焦距的這種變化導(dǎo)致所攝取的立 體圖像的無法忍受的失真。
[0005] 另外按照現(xiàn)有技術(shù)中的一些設(shè)計方案，依據(jù)深度來調(diào)節(jié)顯微參數(shù)，例如多光子顯 微鏡中的激光功率。可是這些參數(shù)并不影響對顯微鏡物鏡的成像性能或鏡頂焦距調(diào)節(jié)的矯 正。所以，當(dāng)前的現(xiàn)有技術(shù)，特別是在沿著樣品深度具有非均勻折射率的樣品中，并不允許 在軸向方向上寬廣地延展的、高質(zhì)量地顯微的立體成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是，提出一種方法和一種顯微鏡，其能實現(xiàn)沿著光軸在寬廣的范圍 內(nèi)無誤地為立體樣品成像。
[0007] 本發(fā)明通過獨立權(quán)利要求的主題來實現(xiàn)所述目的。有利的改進(jìn)在相應(yīng)的從屬權(quán)利 要求中給出。
[0008] 本發(fā)明的方法規(guī)定，使帶有矯正件的顯微鏡物鏡依次朝向至少兩個用作基準(zhǔn)平面 的樣本平面聚焦，這些基準(zhǔn)平面在立體樣品內(nèi)部沿著顯微鏡物鏡的光軸處于不同的樣品深 度。針對每個基準(zhǔn)平面都求取矯正件的基準(zhǔn)方位，在該基準(zhǔn)方位，利用矯正件來矯正與樣品 深度有關(guān)的像差。然后，基于求取的基準(zhǔn)方位，針對樣品中的至少一個目標(biāo)平面，確定矯正 件的目標(biāo)方位，在該目標(biāo)方位利用矯正件來矯正在目標(biāo)平面的樣品深度出現(xiàn)的像差。最后， 為了給立體樣品成像，使顯微鏡物鏡朝向目標(biāo)平面聚焦，并將矯正件挪動至目標(biāo)方位。
[0009] 借助聚焦裝置使顯微鏡物鏡朝向至少兩個基準(zhǔn)平面聚焦，這樣就猶如使要成像的 樣品區(qū)域沿著光軸固定，也就是使要顯微的立體物固定。對要顯微的立體物的這種固定優(yōu) 選在處于真正攝像之前的布設(shè)過程中進(jìn)行，在這種固定中，針對在樣本內(nèi)部處于不同的樣 品深度的至少兩個基準(zhǔn)平面，確定矯正件的基準(zhǔn)方位，從而在這些基準(zhǔn)方位分別利用矯正 件按所希望的方式矯正與樣品深度有關(guān)的像差。在此，矯正件的基準(zhǔn)方位可以由使用者手 動地獲取，但也可以借助適合于此的控制單元自動地獲取。
[0010]矯正件的針對基準(zhǔn)平面獲取的基準(zhǔn)方位隨后被用來針對至少一個(但通常為多 個）目標(biāo)平面分別確定矯正件的目標(biāo)方位，該目標(biāo)方位在以后為相應(yīng)的目標(biāo)平面成像時負(fù) 責(zé)盡可能好地矯正在該目標(biāo)平面上出現(xiàn)的、與深度有關(guān)的像差。在這里，這些目標(biāo)平面位于 由基準(zhǔn)平面沿著光軸限定的成像區(qū)域內(nèi)部。
[0011] 因而針對各個基準(zhǔn)平面確定的基準(zhǔn)方位猶如形成了基準(zhǔn)點，這些基準(zhǔn)點可以在以 后被考慮用于立體樣品的三維成像，以便實現(xiàn)在要顯微的立體物內(nèi)部的任意的目標(biāo)平面上 都能按所希望地矯正與深度有關(guān)的像差。在此，在立體樣品的三維成像中分別定位的目標(biāo) 平面通常并不與先前在顯微鏡的布設(shè)過程中規(guī)定的基準(zhǔn)平面一致。但要指出，根據(jù)本發(fā)明 也并不排除目標(biāo)平面與基準(zhǔn)平面之間的這種一致性，也就是說，所考察的各目標(biāo)平面也允 許與先前規(guī)定的基準(zhǔn)平面之一重合。
[0012] 在該方法的一種非常優(yōu)選的設(shè)計中，針對每個基準(zhǔn)平面都求取顯微鏡物鏡的樣本 鏡頂焦距相對于給定鏡頂焦距的由矯正件在相應(yīng)的基準(zhǔn)方位引起的偏差作為基準(zhǔn)鏡頂焦 距偏差。然后，基于目標(biāo)平面的針對各個基準(zhǔn)平面求取的基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差來確定目標(biāo)鏡 頂焦距偏差，該目標(biāo)鏡頂焦距偏差表示樣本鏡頂焦距相對于給定鏡頂焦距的由矯正件在目 標(biāo)方位引起的偏差。最后，在考慮到目標(biāo)鏡頂焦距偏差的情況下，使顯微鏡物鏡朝向目標(biāo)平 面聚焦。
[0013] 這種設(shè)計能夠以特別有利的方式注意到矯正移調(diào)對顯微鏡物鏡的樣本鏡頂焦距 的作用，即對樣本平面的軸向位置的作用，并予以矯正，顯微鏡物鏡恰好朝向所述樣本平面 聚焦。因此，樣本平面的由矯正件引起的并非所愿的軸向移動按下述方式得到補償:在顯微 鏡物鏡朝向要成像的目標(biāo)平面聚焦時考慮所求取的目標(biāo)鏡頂焦距偏差。為此首先獲知矯正 件的相應(yīng)移調(diào)是如何作用于顯微鏡物鏡的樣本鏡頂焦距的。例如可以通過合適的測試樣 品，但也可以在布設(shè)顯微鏡時通過對矯正件的反復(fù)的移調(diào)和通過顯微鏡物鏡的隨后的再聚 焦，來實現(xiàn)確切地了解矯正移調(diào)的作用。然而，在一種優(yōu)選的實施方式中也可行的是，僅僅 根據(jù)對顯微鏡物鏡的光學(xué)設(shè)計的認(rèn)知來了解矯正移調(diào)對樣本鏡頂焦距的作用，并基于這種 了解以數(shù)字方式求取目標(biāo)鏡頂焦距偏差。
[0014] 考慮到樣本鏡頂焦距的由矯正件引起的變化，這能實現(xiàn)在很大程度上隨意地選擇 要采用的矯正件。因而尤其沒必要的是，所采用的矯正件具有盡可能小的折射能力 (Brechkraf t)，以便一開始就避免樣本鏡頂焦距的任何變化。因為利用較高的折射能力也 可以補償較大的折射率不匹配，這種不匹配比如尤其在軸向延展的立體樣品中出現(xiàn)，所以 本發(fā)明的方法也能實現(xiàn)為較大的立體樣品進(jìn)行精確的三維成像。
[0015] 優(yōu)選基于基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差來獲知鏡頂焦距規(guī)程，該規(guī)程與矯正件的方位相關(guān)地 說明了樣本鏡頂焦距偏差。在立體攝像中所采用的目標(biāo)鏡頂焦距偏差于是借助這種鏡頂焦 距規(guī)程來確定。前述鏡頂焦距規(guī)程可以例如以適當(dāng)?shù)貐?shù)化的函數(shù)的形式或者以數(shù)值表的 形式存儲起來，借此通過數(shù)學(xué)插值來計算目標(biāo)鏡頂焦距偏差。所述插值例如可以采用線性 法或立方法或樣條插值法來進(jìn)行。
[0016] 在本發(fā)明的方法的一種優(yōu)選的改進(jìn)中，可以采用相應(yīng)的方式，基于矯正件的基準(zhǔn) 方位來求取矯正規(guī)程，該規(guī)程與樣品深度相關(guān)地說明了矯正件的被設(shè)置用來矯正像差的方 位。于是可以借助于該矯正規(guī)程特別是通過插值來確定矯正件的目標(biāo)方位。
[0017] 如果與矯正件的方位相關(guān)地不僅樣本鏡頂焦距發(fā)生變化，而且顯微鏡物鏡的焦距 發(fā)生變化，進(jìn)而其放大率也發(fā)生變化，則優(yōu)選針對每個基準(zhǔn)平面都求取顯微鏡物鏡放大率 相對于給定放大率的由矯正件在相應(yīng)的基準(zhǔn)方位引起的偏差作為基準(zhǔn)放大率偏差。然后基 于針對相應(yīng)的基準(zhǔn)平面求取的基準(zhǔn)放大率偏差，針對目標(biāo)平面確定目標(biāo)放大率偏差，該目 標(biāo)放大率偏差表示所述放大率相對于給定放大率的由矯正件在目標(biāo)方位引起的偏差。為了 補償由矯正件引起的放大率變化，最后在考慮到目標(biāo)放大率偏差的情況下移調(diào)可變的放大 部件。對因矯正件而改變的放大率或樣本焦距的這種補償優(yōu)選實時地與對像差的矯正和對 鏡頂焦距變化的矯正并行地進(jìn)行?？勺兊姆糯蟛考缈蓪崿F(xiàn)為Vario-攝像機(jī)適配器，或 者實現(xiàn)為共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的掃描系統(tǒng)的一部分。
[0018] 在另一有利的改進(jìn)中，針對每個基準(zhǔn)平面都確定至少一個基準(zhǔn)控制參數(shù)。然后基 于如此確定的基準(zhǔn)控制參數(shù)，針對目標(biāo)平面確定并調(diào)節(jié)目標(biāo)控制參數(shù)。這種基準(zhǔn)控制參數(shù) 的一個例子比如是光功率，在為立體樣品成像時以該光功率照明相應(yīng)的目標(biāo)平面。由此可 以沿著整個被顯微的立體物實現(xiàn)均勻的圖像亮度。另一個例子是在多光子顯微術(shù)中用于補 償樣本離散的所謂的預(yù)啁嗽(Prechirp)。
[0019] 至少兩個基準(zhǔn)平面優(yōu)選包括多個沿著光軸等距離的平面。由于在這種情況下在布 設(shè)顯微鏡時規(guī)定的基準(zhǔn)平面沿著光軸相互間具有相等的間距，所以矯正件的針對基準(zhǔn)平面 求取的基準(zhǔn)方位形成如下內(nèi)容的可靠的依據(jù):在要顯微的立體物的內(nèi)部的所有可能的目標(biāo) 平面上總可以找到矯正件的精確的目標(biāo)方位，進(jìn)而對在相應(yīng)的樣品深度出現(xiàn)的像差予以良 好的矯正。
[0020] 為了使得顯微鏡物鏡朝向所希望的各樣本平面聚焦，顯微鏡物鏡相對于立體樣品 沿著光軸移動。這可以借助聚焦裝置來進(jìn)行，該聚焦裝置作用于顯微鏡物鏡上，或者作用于 載有立體樣品的載物臺上。因而在第一實施方式中，聚焦裝置使得顯微鏡物鏡在空間內(nèi)移 動，而載物臺則保持固定不動。相反，在第二實施方式中，在顯微鏡物鏡固定不動的情況下， 載物臺在空間內(nèi)移動。也可以考慮將這兩個聚焦方案組合起來。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，設(shè)置用于使立體樣品成像的顯微鏡，該顯微鏡包括顯微 鏡物鏡、矯正件、聚焦裝置和控制單元。在此，控制單元經(jīng)過設(shè)計，從而按前述方式控制顯微 鏡物鏡、矯正件和聚焦裝置。
[0022] 就本發(fā)明的顯微鏡而言，矯正件優(yōu)選包括顯微鏡物鏡中含有的透鏡單元和用于使 得透鏡單元沿著光軸移動的驅(qū)動單元。
[0023] 如果針對該顯微鏡按上述方式考慮到樣本鏡頂焦距的由矯正件引起的偏差，則可 行的是，給透鏡單元規(guī)定大的折射能力，從而也可以矯正立體樣品內(nèi)部的大的折射率變化。
[0024] 在一種特別優(yōu)選的設(shè)計中，驅(qū)動單元包括設(shè)置在顯微鏡物鏡殼體上的、圍繞光軸 可旋轉(zhuǎn)的矯正環(huán)，該矯正環(huán)的旋轉(zhuǎn)運動可轉(zhuǎn)變?yōu)橥哥R單元沿著光軸的移調(diào)運動。矯正件的 這種設(shè)計例如可以像在開篇提到的DE 10 2011 051 677A1中公開的那樣來實現(xiàn)，其公開內(nèi) 容在此援引加入到本申請中。
【附圖說明】
[0025]本發(fā)明的其它有利的改進(jìn)可由參照附圖所做的如下說明得到。其中：
[0026]圖1為示出了顯微鏡物鏡的示意圖，在正確地調(diào)節(jié)好矯正件的情況下，該物鏡聚焦 到第一基準(zhǔn)平面上；
[0027]圖2為對應(yīng)于圖1的示意圖，在該圖中，顯微鏡物鏡聚焦到第二基準(zhǔn)平面上，而并未 利用矯正件來矯正像差；
[0028]圖3為對應(yīng)于圖2的示意圖，示出了鏡頂焦距偏差，該鏡頂焦距偏差是由朝向第二 基準(zhǔn)平面調(diào)節(jié)的矯正件引起的；
[0029]圖4為對應(yīng)于圖3的示意圖，其針對第二基準(zhǔn)平面示出了鏡頂焦距矯正；
[0030] 圖5為流程圖，其示出了用于安置顯微鏡的方法步驟；
[0031] 圖6為流程圖，其示出了借助根據(jù)圖5安置的顯微鏡來使立體樣品成像的方法步 驟；
[0032]圖7示出了本發(fā)明的顯微鏡的一種實施方式，其具有直立的顯微鏡支架和可移調(diào) 的載物臺作為聚焦裝置；
[0033]圖8示出了本發(fā)明的顯微鏡的另一種實施方式，其具有直立的顯微鏡支架和可移 調(diào)的物鏡旋座作為聚焦裝置；
[0034]圖9示出了本發(fā)明的顯微鏡的另一種實施方式，其具有倒置式顯微鏡支架和可移 調(diào)的物鏡旋座作為聚焦裝置;和
[0035]圖10示出了本發(fā)明的顯微鏡的另一種實施方式，其具有倒置式顯微鏡支架和可移 調(diào)的載物臺作為聚焦裝置。
【具體實施方式】
[0036]首先參照圖1和4非常基本地介紹根據(jù)本發(fā)明如何矯正由折射率不匹配引起的孔 徑像差（0i'i'nungsibhlcr)以及由對孔徑像差的矯正引起的樣本鏡頂焦距(Schni ttwe i te)的 變化。為此在圖1~4中僅示意性地示出了對于矯正孔徑像差和再調(diào)節(jié)樣本鏡頂焦距來說至 關(guān)重要的顯微鏡組件和特征參數(shù)，以便于介紹本發(fā)明的方法。
[0037]根據(jù)圖1~4,整體標(biāo)有10的顯微鏡包括顯微鏡物鏡12、載物臺14、矯正件18以及控 制單元20,在載物臺上設(shè)置著立體樣品16,矯正件在本實施例中是顯微鏡物鏡12的一部分。 另外，顯微鏡10具有聚焦裝置，利用該聚焦裝置可以沿著光軸〇相對于顯微鏡物鏡12移調(diào)載 有立體樣品16的載物臺14。聚焦裝置在圖1~4中僅示意性地用雙箭頭22標(biāo)出。就像矯正件 18-樣，聚焦裝置22也通過控制單元20來控制。為此，矯正件18和聚焦裝置22通過連接線路 24或26與控制單元20耦接。
[0038]矯正件18具有透鏡單元，該透鏡單元是顯微鏡物鏡中所含有的在圖1至圖4中未示 出的成像鏡頭的一部分。為了按下述方式矯正由折射率不匹配引起的孔徑像差，可以通過 控制單元20使得矯正件18沿著光軸0移動。
[0039]圖1示出了一種狀態(tài)，在該狀態(tài)下，顯微鏡物鏡12朝向樣本平面28聚焦。在此，在圖 1中所示的狀態(tài)下，矯正件18沿著光軸0調(diào)節(jié)，從而盡可能好地通過矯正件18來矯正孔徑像 差。這種盡可能好的矯正調(diào)節(jié)在圖1中用 C1表示。
[0040]樣本平面28形成第一基準(zhǔn)平面，針對該第一基準(zhǔn)平面獲知矯正件18的所希望的方 位(^，下面稱為第一基準(zhǔn)方位。
[0041 ] 在根據(jù)圖1的狀態(tài)下，第一基準(zhǔn)平面28在樣本16內(nèi)部沿著光軸0處于一個位置，該 位置對應(yīng)于顯微鏡物鏡12的樣本鏡頂焦距。與基準(zhǔn)方位C1有關(guān)的樣本鏡頂焦距在圖1中用do (C1)表示。樣本鏡頂焦距do(C1)表示由第一基準(zhǔn)平面28形成的樣本平面相距顯微鏡物鏡12 (確切地說，是相距其在樣本側(cè)布置在最遠(yuǎn)處的光學(xué)平面)的距離。
[0042]在圖1中，參數(shù)Z1表示載有立體樣品16的載物臺14相距顯微鏡物鏡12上的一個固 定的參考點的距離。顯微鏡物鏡12上的這個固定的參考點例如由顯微鏡物鏡12與圖1中未 示出的物鏡旋座相接觸的接觸面產(chǎn)生。參數(shù)zi因而表示立體樣品16與顯微鏡物鏡12之間的 距離，進(jìn)而表示聚焦裝置22的以下也稱為聚焦距離的調(diào)節(jié)參數(shù)。聚焦距離 Z1因而也是樣本 平面28在立體樣品16內(nèi)部所處的深度的量度。這意味著，在聚焦距離Z1改變時，樣品深度同 樣地改變，顯微鏡物鏡12在立體樣品16內(nèi)部朝向該樣品深度聚焦。
[0043]圖2中示出了一種狀態(tài)，在該狀態(tài)下，顯微鏡物鏡12在立體樣品16內(nèi)部朝向一個深 度聚焦，該深度對應(yīng)于(在本例中較小的）聚焦距離22。因此，在根據(jù)圖2的狀態(tài)下，從上面觀 察，樣本平面28位于立體樣品16內(nèi)部較深處。位于較深處的這個平面規(guī)定了第二基準(zhǔn)平面。 [0044]因為來自樣本平面28的光在立體樣品16內(nèi)部的傳播路徑長度在圖2中所示的狀態(tài) 下比在根據(jù)圖1的狀態(tài)下長，所以由于折射率不匹配而出現(xiàn)孔徑像差。該孔徑像差在圖2中 示意性地用從立體樣品16朝向顯微鏡物鏡12射出的光束上的彎角表示。由于在圖2中矯正 件18仍然處于針對根據(jù)圖1的狀態(tài)優(yōu)化的基準(zhǔn)方位(^中，所以，在圖2中孔徑像差尚未矯正。 [0045]圖3示出是如何通過矯正件18的移調(diào)來矯正圖2中所示的孔徑像差的。因而在圖3 中針對矯正件18選擇一個不同于方位C1的第二基準(zhǔn)方位(：2，利用該第二基準(zhǔn)方位盡可能好 地矯正第二基準(zhǔn)平面28的孔徑像差。然而，由于矯正件18移動至基準(zhǔn)方位〇 2，顯微鏡物鏡12 的樣本鏡頂焦距相對于所希望的給定鏡頂焦距發(fā)生變化。該變化了的樣本鏡頂焦距在圖3 中用do(C2)表示。因此，樣本平面28在圖2中沿著光軸0向上移動一個由Δ do(ci，C2) = do (C2)-d〇(Cl)得到的量值。
[0046]最后，圖4示出如何補償由于樣本鏡頂焦距改變而導(dǎo)致的樣本平面28的并非所愿 的移動。因而借助于聚焦裝置22,在圖4中使得圖3中給出的聚焦距離Z2以樣本鏡頂焦距的 由矯正件18引起的變化量即Ad〇( C1，C2)減小。這意味著，在根據(jù)圖4的例子中，載物臺14以 量值沿著光軸0向上移動。由此又可以在立體樣品16內(nèi)部靠近最初定位的樣本 平面28。
[0047]圖5示出了流程圖，其僅示例性地示出顯微鏡10的在真正攝像之前所處的方位，其 特別是用來確定基準(zhǔn)平面，且針對這些基準(zhǔn)平面求取矯正件的基準(zhǔn)方位，并求取相對于給 定鏡頂焦距的基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差。可選地也考慮基準(zhǔn)放大率偏差，只要通過矯正件18的移 調(diào)也引起樣本焦距偏差，進(jìn)而引起放大率相對于給定放大率的偏差。
[0048]在步驟S1中靠近基準(zhǔn)平面Χη，其方式為，借助于聚焦裝置22使得顯微鏡物鏡12朝 向該基準(zhǔn)平面χη聚焦。在步驟S2中將矯正件18移至基準(zhǔn)方位cn。在該基準(zhǔn)方位(^，針對基準(zhǔn) 平面X n盡可能好地矯正由折射率不匹配引起的孔徑像差。如果通過矯正件18的移調(diào)而使得 樣本鏡頂焦距出現(xiàn)變化A d〇(cn)，則按照圖4再調(diào)節(jié)樣本平面。參數(shù)△(!〇((：")因而對應(yīng)基準(zhǔn) 鏡頂焦距偏差。如果通過矯正件18的移調(diào)還引起樣本焦距的變化，進(jìn)而引起放大率的變化， 則附加地確定基準(zhǔn)放大率偏差iKcn)。
[0049] 步驟S2和S3就像先前參照圖1~4所述那樣執(zhí)行。在這里，實時地執(zhí)行步驟S3是特 別有利的。
[0050] 在步驟S4中決定，在步驟S2和S3中求取的參數(shù)Cn、Zn必要時還有0(cn)是否要作為 基準(zhǔn)點（31：1^2 816116)11存儲起來，其中，11表示整數(shù)的控制變量(]^111；1；>31^31316)。如果要存 儲所述這些參數(shù)，就在步驟S5中進(jìn)行這種存儲，且以步驟S6繼續(xù)流程。如果不想存儲基準(zhǔn)點 η，就直接以步驟S6繼續(xù)流程。
[0051] 在步驟S6中確定是否要求取另一基準(zhǔn)點。如果情況如此，就使得控制變量η增大1 (η = η+1)，并且控制流程返回至步驟S1。如果不想求取另一基準(zhǔn)點，就在步驟S7中確定目標(biāo) 平面zk并在步驟S8中存儲起來，顯微鏡物鏡12要朝向該目標(biāo)平面聚焦，隨后使得立體樣品 16成像。
[0052]圖6示出流程圖，其中示例地表明是如何基于顯微鏡10的根據(jù)圖5所處的方位進(jìn)行 立體攝像的。
[0053]在步驟S10中開始針對目標(biāo)平面zk的攝像過程，其中，k表示整數(shù)的控制變量。在步 驟S11中讀出表示目標(biāo)平面zk的信息，該信息在顯微鏡10的該方位情況下已經(jīng)事先存儲起 來（圖5中的S8)。在步驟S12中提供指配于各個基準(zhǔn)平面的基準(zhǔn)點，即基準(zhǔn)方位cdP基準(zhǔn)鏡 頂焦距偏差Z n(圖5中的S5)。在步驟S11和S12中提供的信息將繼續(xù)使用，以便針對所選的目 標(biāo)平面zk求取相應(yīng)的目標(biāo)參數(shù)，即矯正件18的目標(biāo)方位c k、目標(biāo)鏡頂焦距偏差xdP(可選的） 目標(biāo)放大率偏差杉!^，利用所述目標(biāo)鏡頂焦距偏差來控制聚焦裝置22，利用所述目標(biāo)放大率 偏差來控制可變的放大部件。
[0054]具體而言，在步驟S13中針對目標(biāo)平面zk計算矯正件18的目標(biāo)方位ck。然后在步驟 S14中，矯正件18移動至目標(biāo)方位ck，以便盡可能好地矯正目標(biāo)平面zk上的孔徑像差。
[0055]在步驟S15中針對目標(biāo)平面zk計算基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差xk。在步驟S16中根據(jù)基準(zhǔn)鏡 頂焦距偏差xk來移調(diào)聚焦裝置22。
[0056]在步驟S17中針對目標(biāo)平面zk計算目標(biāo)放大率偏差&。然后在步驟S18中根據(jù)目標(biāo) 放大率偏差&來移調(diào)可變的放大部件。
[0057] 在此，由步驟S13和S14形成的用于移調(diào)矯正件18的處理分支、由步驟S15和S16形 成的用于移調(diào)聚焦裝置22的處理分支以及(可選的）由步驟S17和S18形成的用于移調(diào)可變 的放大部件的處理分支并行地執(zhí)行。這些處理分支共同地通至步驟S19,在該步驟中，在調(diào) 節(jié)完涉及目標(biāo)平面Zk的目標(biāo)參數(shù)Ck、Zk和&之后，攝取目標(biāo)平面Zk的圖像。如此產(chǎn)生的立體圖 像數(shù)據(jù)在步驟S20中存儲起來。在步驟S21中詢問是否要攝取另一目標(biāo)平面。如果情況如此， 就使得控制變量k增大l(k = k+l)，并且重新執(zhí)行上述攝像過程。如果不想攝取另一目標(biāo)平 面，就結(jié)束該過程。
[0058]需要指出，參照圖5和6介紹的流程僅僅是示例性的?？梢钥紤]各種不同的變型，例 如立體攝像，在這種情況下只考慮對矯正件18的調(diào)節(jié)，但不考慮由于對矯正件18的移調(diào)而 引起的樣本鏡頂焦距的變化和顯微鏡放大率的變化。在這種情況下，可以省去由步驟S15、 S16或S17、S18形成的處理分支。但也可以規(guī)定附加的、并行執(zhí)行的處理步驟，比如基于先前 規(guī)定的、涉及基準(zhǔn)平面的基準(zhǔn)控制參數(shù)來調(diào)節(jié)涉及目標(biāo)平面的目標(biāo)控制參數(shù)例如照明光功 率。
[0059]在圖7~10中示出了本發(fā)明的顯微鏡10的各種不同的實施方式。
[0060]根據(jù)圖7的顯微鏡10除了包括已參照圖1和4介紹的顯微鏡組件外，還包括直立的 顯微鏡支架30以及記錄(Dokumentat ion)單元32,該記錄單元通過連接線路34與控制單元 20耦接。在根據(jù)圖7的實施方式中，聚焦裝置22(就像在根據(jù)圖1~4的實施例中一樣)通過沿 著光軸機(jī)動地可移調(diào)的載物臺14產(chǎn)生。圖7中還示出了浸漬介質(zhì)36,立體樣品16埋入到該浸 漬介質(zhì)中。浸漬介質(zhì)36的折射率經(jīng)過選擇，使其盡可能好地適配于立體樣品16的折射率。 [0061]根據(jù)圖8的實施方式相比于圖7中所示的實施方式有所不同：聚焦裝置22并非由可 移調(diào)的載物臺形成，而是由沿著光軸可移動的物鏡旋座形成，顯微鏡物鏡12固持在該物鏡 旋座上。
[0062]相比之下，根據(jù)圖10的實施方式具有倒置式顯微鏡支架38。在該實施方式中，聚焦 裝置22也由沿著光軸可移調(diào)的物鏡旋座40形成。
[0063]最后，根據(jù)圖10的實施方式相比于圖9中所示的實施方式的不同之處在于，聚焦裝 置22也通過沿著光軸可移調(diào)的載物臺14來實現(xiàn)。
[0064]根據(jù)圖7~10的實施方式也僅僅是示例性的。特別地，本發(fā)明并不局限于一定的顯 微鏡類型。確切地說，本發(fā)明可應(yīng)用于各種不同的顯微術(shù)方法中，例如廣角顯微術(shù)、共焦顯 微術(shù)、多光子顯微術(shù)或光片(Lichtblatt)顯微術(shù)。
[0065]附圖標(biāo)記清單
[0066] 10顯微鏡
[0067] 12顯微鏡物鏡
[0068] 14載物臺
[0069] 16立體樣品
[0070] 18矯正件
[0071] 20控制單元
[0072] 22聚焦裝置
[0073] 24連接線路
[0074] 26連接線路
[0075] 28樣本平面
[0076] 30直立的顯微鏡支架
[0077] 32記錄單元
[0078] 34連接線路
[0079] 36浸漬介質(zhì)
[0080] 38倒置式顯微鏡支架
[0081 ] 40物鏡旋座
【主權(quán)項】
1. 一種用于使立體樣品（16)顯微地成像的方法，其中， 使得帶有矯正件（18)的顯微鏡物鏡（12)依次朝向至少兩個基準(zhǔn)平面聚焦，所述基準(zhǔn)平 面在立體樣品（16)內(nèi)部沿著顯微鏡物鏡（12)的光軸(0)處于不同的立體樣品深度； 針對每個基準(zhǔn)平面都求取矯正件（18)的基準(zhǔn)方位，在該基準(zhǔn)方位，利用矯正件（18)來 矯正與立體樣品深度有關(guān)的像差； 基于求取的基準(zhǔn)方位，針對立體樣品（16)中的至少一個目標(biāo)平面，確定矯正件（18)的 目標(biāo)方位，在該目標(biāo)方位利用矯正件(18)來矯正在目標(biāo)平面的立體樣品深度出現(xiàn)的像差； 為了給立體樣品（16)成像，使顯微鏡物鏡（12)朝向目標(biāo)平面聚焦，并將矯正件（18)挪 動至目標(biāo)方位。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中， 針對每個基準(zhǔn)平面，求取顯微鏡物鏡（12)的樣本鏡頂焦距相對于給定鏡頂焦距的由矯 正件(18)在相應(yīng)的基準(zhǔn)方位引起的偏差作為基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差； 基于目標(biāo)平面的所述基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差，確定目標(biāo)鏡頂焦距偏差，該目標(biāo)鏡頂焦距偏 差表示樣本鏡頂焦距相對于給定鏡頂焦距的由矯正件(18)在目標(biāo)方位引起的偏差； 在考慮到目標(biāo)鏡頂焦距偏差的情況下，使顯微鏡物鏡（12)朝向目標(biāo)平面聚焦。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，基于基準(zhǔn)鏡頂焦距偏差來求取鏡頂焦距規(guī)程，該鏡 頂焦距規(guī)程與矯正件（18)的方位相關(guān)地說明了樣本鏡頂焦距偏差，并借助該矯正規(guī)程特別 是通過插值法來確定矯正件(18)的目標(biāo)方位。4. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，基于矯正件（18)的基準(zhǔn)方位來求取矯 正規(guī)程，該矯正規(guī)程與立體樣品深度相關(guān)地說明了矯正件（18)的被設(shè)置用來矯正像差的方 位，并借助于該矯正規(guī)程特別是通過插值法來確定矯正件(18)的目標(biāo)方位。5. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中， 針對每個基準(zhǔn)平面，求取顯微鏡物鏡（12)的放大率相對于給定放大率的由矯正件（18) 在相應(yīng)的基準(zhǔn)方位引起的偏差作為基準(zhǔn)放大率偏差； 基于基準(zhǔn)平面的該基準(zhǔn)放大率偏差，確定目標(biāo)放大率偏差，該目標(biāo)放大率偏差表示所 述放大率相對于給定放大率的由矯正件(18)在目標(biāo)方位引起的偏差； 在考慮到目標(biāo)放大率偏差的情況下移調(diào)可變的放大部件。6. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中， 針對每個基準(zhǔn)平面，確定至少一個基準(zhǔn)控制參數(shù)特別是照明光功率； 基于所述基準(zhǔn)控制參數(shù)，針對目標(biāo)平面確定并調(diào)節(jié)目標(biāo)控制參數(shù)。7. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，至少兩個基準(zhǔn)平面包括多個沿著光軸 (0)等距離的平面。8. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，為了聚焦，使顯微鏡物鏡（12)相對于立 體樣品（16)沿著光軸(0)移動。9. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，要成像的立體樣品區(qū)域沿著光軸(0)由 位于最小的立體樣品深度的基準(zhǔn)平面和位于最大的立體樣品深度的基準(zhǔn)平面限定。10. -種用于使立體樣品（16)成像的顯微鏡（10)，帶有： 顯微鏡物鏡（12); 矯正件（18); 聚焦裝置(22);和 控制單元(20);其中， 控制單元(20)使顯微鏡物鏡（12)借助于聚焦裝置(22)依次朝向至少兩個基準(zhǔn)平面聚 焦，所述基準(zhǔn)平面在立體樣品（16)內(nèi)部沿著顯微鏡物鏡（12)的光軸(0)處于不同的立體樣 品深度； 控制單元(20)針對每個基準(zhǔn)平面求取矯正件（18)的基準(zhǔn)方位，在該基準(zhǔn)方位，利用矯 正件(18)來矯正與立體樣品深度有關(guān)的像差； 控制單元(20)基于求取的基準(zhǔn)方位，針對立體樣品（18)中的至少一個目標(biāo)平面，確定 矯正件（18)的目標(biāo)方位，在該目標(biāo)方位利用矯正件（18)來矯正在目標(biāo)平面的立體樣品深度 出現(xiàn)的像差； 控制單元(20)為了給立體樣品（16)成像，使顯微鏡物鏡（12)借助于聚焦裝置(22)朝向 目標(biāo)平面聚焦，并將矯正件(18)挪動至目標(biāo)方位。11. 如權(quán)利要求10所述的顯微鏡（10 )，其中，矯正件（18)具有包含在顯微鏡物鏡（12)中 的透鏡單元和用于使透鏡單元沿著光軸(0)移動的驅(qū)動單元。12. 如權(quán)利要求11所述的顯微鏡（10)，其中，驅(qū)動單元包括設(shè)置在顯微鏡物鏡（12)的殼 體上的、圍繞光軸(0)可旋轉(zhuǎn)的矯正環(huán)，該矯正環(huán)的旋轉(zhuǎn)運動可轉(zhuǎn)變?yōu)橥哥R單元(60)沿著光 軸(〇)的移調(diào)運動。13. 如權(quán)利要求10~12中任一項所述的顯微鏡（10)，其中，為了移調(diào)顯微鏡物鏡（12) 和/或為了移調(diào)載有立體樣品（16)的載物臺，聚焦裝置(22)可機(jī)動地移調(diào)。
【文檔編號】G02B27/00GK105980909SQ201580008610
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年2月9日
【發(fā)明人】克里斯蒂安·舒曼, 安德里亞·穆爾特
【申請人】萊卡微系統(tǒng)Cms有限責(zé)任公司