專利名稱：用于治療癌癥的胰島素樣生長因子結合蛋白7的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用包含多肽的藥劑(agent)治療癌癥。
背景技術：
活化性V-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物Bl (BRAF)突變在許多類型的癌癥(包 括50-70%的黑素瘤、15%的結腸直腸癌和卵巢癌、和36-69%的乳頭狀甲狀腺癌)中是 普遍的(綜述于 Davies 等，2002，Nature, 417 949-954 ；及 Namba 等，2003，J.Clin. Endocr.Metab.，88: 4393-97)。也已經在多至82 %的良性黑素細胞腫瘤(痣)中鑒定 出活化性BRAF突變(Pollock等，2003，Nature Genet., 33: 19-20)。最常見的活化性 BRAF突變是第600位處用谷氨酸對纈氨酸的替代(V600E ；先前鑒定為V599E)。此突 變產生有高度活性的激酶，其刺激組成型胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號傳導。已 經顯示了 BRAFV600E的表達在培養(yǎng)的人成纖維細胞(Zhu等，1998，Genes Dev., 12 2997-3007)和人黑素細胞(Michaloglou等，2005，Nature, 436 720-724)中及在體內在 瘤前痣(preneoplasticnevi) (Michaloglou 等，2005，Nature, 436 720-724)中誘導衰老。發(fā)明概述本公開內容部分基于如下令人驚訝的發(fā)現，即胰島素樣生長因子結合蛋白 7 (IGFBP7)在具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導的細胞，例如表達活化形式 的BRAF或RAS病毒癌基因同系物(RAS)(例如成神經細胞瘤RAS病毒癌基因同 系物(NRAS)、V-KI-RAS2柯斯頓(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)、 V-HA-RAS Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(HRAS))的細胞中誘導衰老(senescence) 和/或凋亡(apoptosis)。本文描述了使用IGFBP7劑來診斷和治療腫瘤(例如癌癥)、誘 導細胞凋亡、誘導細胞衰老、和抑制細胞增殖的方法。一方面，本申請的特征為治療受試者中的腫瘤的方法，其如下實現，即鑒定患 有、有風險患有、或懷疑患有腫瘤的受試者；并對所述受試者施用有效量的IGFBP7劑， 由此治療所述腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤是癌癥(例如黑素瘤、癌瘤、乳腺 癌、卵巢癌、胰腺癌、結腸直腸癌、或乳頭狀甲狀腺癌)。在一些實施方案中，所述腫瘤 具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導。在一些實施方案中，所述腫瘤的生長和/或 存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑。在一些實施方案中，所述腫瘤表達活化 的或致癌性的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS>或HRAS)。在一些實施方案中，所述 活化的或致癌性的BRAF具有殘基600處纈氨酸突變成谷氨酰胺的突變(BRAFV600E)。在一些實施方案中，所述方法進一步包括評估來自所述受試者的樣品以確定增 強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導的存在，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS，并基于增強的 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導的存在，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk 信號傳導途徑，和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS來選擇進行治療的受試 者。在一些實施方案中，所述樣品包括來自腫瘤的細胞、核酸、或多肽。在一些實施 方案中，所述活化的或致癌性的BRAF具有殘基600處纈氨酸突變成谷氨酰胺的突變 (BRAFV600E)。另一方面，本申請的特征為在如下的細胞(例如腫瘤細胞)中誘導衰老的方法， 包括給所述細胞施用有效量的IGFBP7劑，所述細胞具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信 號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或表達活化的 或致癌性的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS>或HRAS)。在一些實施方案中，所述 細胞是腫瘤細胞。又一方面，本申請的特征為在如下的細胞(例如腫瘤細胞)中誘導凋亡的方法， 包括對所述細胞施用有效量的IGFBP7劑，所述細胞具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信 號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或表達活化的 或致癌性的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS、或HRAS)。另一方面，本申請的特征為抑制如下細胞(例如腫瘤細胞)的增殖的方 法，其中所述方法包括對所述細胞施用有效量的IGFBP7劑，所述細胞具有增強的 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導 途徑，和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS、或HRAS)。又一方面，本申請的特征為在含有如下細胞的腫瘤受試者中抑制生長(例如轉 移性生長(metastatic))的方法，包括對所述受試者施用有效量的IGFBP7劑，所述細胞具 有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk 信號傳導途徑，和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS>或 HRAS)。另一方面，本申請的特征為IGFBP7劑在制備用于治療受試者中的腫瘤或癌癥 (例如黑素瘤、癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結腸直腸癌、或乳頭狀甲狀腺癌)的藥 物中的用途。在一些實施方案中，所述腫瘤具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導 (signaling)，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或表達活 化的BRAF或RAS (例如NRAS、KRAS>或HRAS)。在一些實施方案中，所述腫瘤或 癌癥是轉移性的。又一方面，本申請的特征為用于治療受試者中的腫瘤或癌癥(例如黑素瘤、癌 瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結腸直腸癌、或乳頭狀甲狀腺癌)的分離的IGFBP7劑。 在一些實施方案中，所述腫瘤具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存 活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或表達活化的BRAF或RAS (例如 NRAS > KRAS >或HRAS)。在一些實施方案中，所述腫瘤或癌癥是轉移性的。在一些實施方案中，所述IGFBP7劑是包含與SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 7 至少80%相同(例如至少85%、90%, 95%, 98%,或99%相同)的多肽的組合物。所 述多肽可以與異源部分(例如異源多肽序列)偶聯。在一些實施方案中，所述IGFBP7劑 包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 7的功能片段或域?？梢岳绫砻?topically)、系統(tǒng)、或局部(locally)(例如通過藥物釋放植入物)施用所述IGFBP7劑。在一些實施方案中，通過將誘導IGFBP7或其活性片段或類似物表達的組合物 (例如編碼與SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 7至少80%同一性(例如至少85%、90%, 95%, 98%,或99%同一性)的多肽的核酸)導入受試者中來施用所述IGFBP7劑。所 述核酸可以在載體，例如病毒載體(例如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載 體、或慢病毒載體)中。在一些實施方案中，通過將含有編碼與SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO 7至少80%相同(例如至少85%、90%, 95%, 98%,或99%相同)的多肽的核 酸的細胞導入受試者中來施用所述IGFBP7劑，所述細胞分泌所述多肽(the IGFBP7agent is administeredby introducing into the subject a cell that a nucleic acid encoding a polypeptide atleast 80 % identical (e.g.，at least 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identical) to SEQID NO 1 or SEQ ID NO 7that secretes the polypeptide)。另一方面，本申請的特征為診斷損傷(例如黑素細胞皮膚損傷)的方法，包括 獲得損傷(例如黑素細胞皮膚損傷)樣品(例如組織樣品、細胞樣品、蛋白質樣品、或核 酸樣品)，并測定所述樣品中的IGFBP7表達，其中若所述樣品可檢測地表達IGFBP7，則 所述損傷診斷為良性(例如黑素細胞痣)，且其中若所述樣品不表達IGFBP7，則所述損 傷診斷為癌性(例如黑素瘤)。在一些實施方案中，所述方法包括測定所述樣品是否具有 增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活是否依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk 信號傳導途徑，和/或是否含有活化的BRAF或RAS(例如BRAFV600E)，并且若 所述樣品表達IGFBP7并具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存 活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或含有活化的BRAF或RAS，則 所述損傷診斷為良性(例如黑素細胞痣)。若所述樣品不表達IGFBP7并具有增強的 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導 途徑，和/或含有活化的BRAF或RAS，則所述損傷診斷為癌性(例如黑素瘤)。在一 些實施方案中，所述方法包括測定所述樣品是否具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳 導，生長和/或存活是否依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或是否含有 活化的BRAF或RAS (例如BRAFV600E)，并且若所述樣品表達IGFBP7并具有增強的 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導 途徑，和/或含有活化的BRAF或RAS，則所述損傷診斷為良性(例如黑素細胞痣)，且 若所述樣品表達IGFBP7但沒有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活 不依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或不含活化的BRAF或RAS，則所述 損傷診斷為癌性(例如黑素瘤)?！岸嚯摹焙汀暗鞍踪|”可互換使用，指任何肽連接的氨基酸鏈，不管長度或翻 譯后修飾。如本文中所使用的，“有風險形成癌癥”(或“有形成癌癥的風險”)的受試者 指具有形成癌癥的素因(predisposition)，即形成癌癥的遺傳或家族素因，或者已經暴露 于能導致癌癥的條件的受試者。從上文出發(fā)，會顯而易見的是，“有風險形成癌癥”的 受試者不是所有受試者?！皯岩苫加邪┌Y的”受試者指具有癌癥的一種或多種癥狀的受試者。癌癥 癥狀是本領域技術人員公知的，包括但不限于體重減輕、虛弱(weakness)、過度疲勞(excessive fatigue)、進食困難(difficulty eating)、食欲不振(loss ofappetite)、不常見的 疲特征(unusual mole feature)、新色素沉著皮膚區(qū)(newlypigmented skin area)、皮膚生 長、皮膚潰瘍、皮膚腫塊(skin lump)、慢性咳嗽(chronic cough)、氣喘惡化(worsening breathlessness)、 呼吸困難(breathingdifficulty)、淋巴結腫大(enlarged lymph node)、咳 血(coughing up blood)、血尿(blood in the urine)、血便(blood in stool)、惡心(nausea)、 嘔吐(vomiting)、肝轉移(liver metastases)、月市轉移(lung metastases)、骨轉移(bone metastases)、乳房或乳頭變化(breast or nipple change)、乳頭溢液(nipple discharge)、 肚脹(abdominal fullness)、胃氣脹(bloating)、腹腔積水(fluid in peritoneal cavity)、便 秘、(constipation)、腹脹(abdominal distension)、結腸穿孑L (perforation ofcolon)、急性腹 膜炎(acute peritonitis)(感染、發(fā)熱、疼痛)、陰道出血(vaginalbleeding)、疼痛、嘔血 (vomiting blood)、大量出汗(heavy sweating)、發(fā)熱、高血壓(high blood pressure)、貧 血(anemia)、腹瀉(diarrhea)、黃疸(jaundice)、頭暈(dizziness)、受寒(chill)、肌肉 痙攣(muscle spasm)、結腸轉移(colonmetastases)、月市轉移(lung metastases)、膀胱轉移 (bladder metastases)、肝轉移(liver metastases)、骨轉移(bone metastases)、腎轉移(kidney metastases)、胰轉移(pancreas metastases)、吞咽困難(difficulty swallowing)等。 例如， 已經被內科醫(yī)生診斷為患有癌癥的患者仍被懷疑患有癌癥。術語“癌癥”指具有自主生長能力的細胞。此類細胞的例子包括具有以快速增 殖的細胞生長表征的異常狀態(tài)或狀況的細胞。該術語想要包括癌性生長，例如腫瘤；致 癌性過程、轉移性組織、和惡性轉化的細胞、組織、或器官，不管組織病理學類型或侵 入性階段。還包括多種器官系統(tǒng)諸如呼吸、心血管、腎、生殖、血液學、神經學、肝、 胃腸、和內分泌系統(tǒng)的惡性；以及腺癌，包括惡性諸如大多數結腸癌、腎細胞癌瘤、 前列腺癌和/或睪丸腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell carcinoma of the lung)、小腸癌 (cancer of the smallintestine)、和食道癌(cancer of the esophagus)。 “天然發(fā)生的”癌癥 包括不是以實驗方法通過將癌細胞植入受試者中誘導的任何癌癥，并且包括例如自發(fā)發(fā) 生的癌癥、通過將患者暴露于致癌原引起的癌癥、源自于轉基因癌基因的插入或腫瘤抑 制基因的敲除的癌癥、和由感染(例如病毒感染)引起的癌癥。術語“癌瘤”是本領域 公認的，指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬技術領域的 普通技術人員通常的理解具有相同的意義。雖然可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用與 本文中所描述的方法和材料類似或等同的方法和材料，但是下文描述了合適的方法和材 料。通過提及而完整收錄本文所提及的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文 獻。在矛盾的情況中，應當以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法、和實施 例僅是例示性的，而并不意圖是限制性的。在下文的附圖和描述中列出了本發(fā)明的一個或多個實施方案的詳情。從描述和 附圖及權利要求書出發(fā)，本發(fā)明的其它特征、目的、和優(yōu)點會是顯而易見的。附圖簡述圖IA是全基因組ShRNA篩選BRAFV600E介導的對細胞增殖的阻斷所需要的基
因的示意性匯總。圖IB是描繪17種BRAFV600E/BJ KD細胞系增殖的一組照片表示。將穩(wěn)定表達指定的ShRNA的IxlO4個BJ成纖維細胞在12孔板形式中培養(yǎng)，用BRAFV600E表達逆 轉錄病毒感染，并在14天后用結晶紫染色。NS，非沉默對照shRNA。圖IC是一幅柱狀圖，其描繪了 17種BRAFV600E/黑素細胞KD細胞系的定量 增殖測定法。用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染穩(wěn)定表達指定的shRNA的BJ成纖維 細胞，并在14天后通過錐蟲藍(trypan)排除測試來分析。相對于正常黑素細胞的生長表 示BRAFV600E/黑素細胞的生長。對于BRAFV600E/黑素細胞KD細胞系，相對于相 應黑素細胞KD細胞系在沒有BRAFV600E表達的情況中的生長來將數值標準化。誤差 工形線(bar)表示標準誤差。圖ID是一幅柱狀圖，其描繪了 17種BRAFV600E/黑素細胞KD細胞系的DNA 復制測定法。通過BRAFV600E表達后4天的BrdU摻入來監(jiān)測DNA復制。圖IE是一幅柱狀圖，其描繪了 17種BRAFV600E/黑素細胞KD細胞系的凋亡。 通過BRAFV600E表達后4天的膜聯蛋白V_PE染色來監(jiān)測凋亡。圖IF是一組免疫印跡，其描繪了在17種BRAFV600E/黑素細胞KD細胞系 之每一種中監(jiān)測pl6INK4a的誘導和組蛋白3賴氨酸9CH3K9)的乙?；拿庖哂≯E分析。 β -ACTIN (ACTB)作為加樣對照監(jiān)測。圖2Α(頂部)是對來自正常黑素細胞、BRAFV600E/黑素細胞、穩(wěn)定表達 IGFBP7shRNA的BRAFV600E/黑素細胞的CM中或用I-IGFBP7抗體處理以免疫消減 IGFBP7的BRAFV600E/黑素細胞CM中的IGFBP7水平的分析。圖2A(底部)是一幅柱狀圖，其描繪了添加上文所描述的不同CM后未處理的黑 素細胞的增殖。添加CM后14天測量增殖，并相對于未處理的黑素細胞的生長標準化。 誤差工形線表示標準誤差。圖2B是純化的、重組IGFBP7 (rIGFBP7)的考馬斯染色凝膠。在左側按kDa顯
示了分子量標志物的位置。圖2C是一幅線圖，描繪了監(jiān)測處理后14天rIGFBP7對黑素細胞生長的影響的 增殖測定法。圖2D是一組12幅顯微照片，其描繪了對用表達空載體(第一欄)或 BRAFV600E(第二欄)的逆轉錄病毒感染的黑素細胞，或用來自BRAFV600E/黑素細胞 的CM(第三欄)或rIGFBP7(第四欄)處理的黑素細胞的β _半乳糖苷酶染色。以10Χ、 20Χ和40Χ的放大率顯示圖像。圖2Ε是一組柱狀圖，其描繪了未處理的黑素細胞、或穩(wěn)定表達非沉默(NS)或 IGFBP7shRNA的黑素細胞的生長速率。每天監(jiān)測細胞數目達6天。圖3A是監(jiān)測來自人黑素瘤細胞系的CM中的IGFBP7表達的免疫印跡分析 (頂部)和相關的柱狀圖(底部)，該柱狀圖顯示了對含有活化性BRAFV600E突變 (SK-MEL-28、MALME-3M、WM793B、WM39、和 WM278)、活化性 RASQ61R 突變 (SK-MEL-2、SK MEL-103、禾Π WM1366)、或者 BRAF 和 RAS 兩者都為野生型(CHL、 SK-MEL-31、WM1321、和WM3211)的人黑素瘤細胞系的IGFBP7表達的定量實時 RT-PCR分析。誤差工形線表示標準誤差。圖3Β是一幅柱狀圖，其描繪了用rIGFBP7處理后24小時的人黑素瘤細胞系的 增殖。相對于相應的細胞系在沒有添加rIGFBP7的情況中的生長來將增殖標準化。誤差工形線表示標準誤差。圖3C是一幅柱狀圖，其描繪了用rIGFBP7處理后24小時的人黑素瘤細胞系的凋亡。圖3D是在存在或沒有rIGFBP7的情況中且穩(wěn)定表達非沉默(NS)、SMARCB1 或BNIP3L shRNA的SK-MEL-28細胞中的SMARCB1、BNIP3L和活化的胱天蛋白酶 3(act-CASP3)表達的一組免疫印跡。β-肌動蛋白(ACTB)作為加樣對照監(jiān)測。圖3Ε是一幅柱狀圖，其描繪了在SK-MEL-28細胞中STATl募集至SMARCB1
啟動子，如通過ChIP分析所測量的。圖3F是一對柱狀圖，其描繪了用NS或STATl siRNA處理后SK-MEL-28細胞 中的SMARCB1 (左側)或STAT1 (右側)mRNA水平，如通過qRT_PCR所測量的。圖3G是一對柱狀圖，其描繪了在SK-MEL-28細胞中SMARCB1(左側)或 BRGl (右側)募集至BNIP3L啟動子，如通過ChIP分析所測量的。圖3H是一幅線圖，其描繪了 SK-MEL-28細胞的凋亡。將SK-MEL-28細胞與 rIGFBP7 —起溫育0、2、6、12、或24小時，之后清洗細胞，并在缺乏rIGFBP7的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。然后在24小時后定量凋亡。圖4A是一組免疫印跡，其監(jiān)測用漸增濃度的rIGFBP7(0.2、1.0、2.0、5.0或 10 μ g/ml)處理24小時的SK-MEL-28細胞中的磷酸-ERK和總ERK的水平。圖4B是一幅柱狀圖，其描繪了 SK-MEL-28細胞對rIGFBP7的敏感性。用空表 達載體或組成性活性ERK2突變體轉染細胞。用rIGFBP7處理后24小時分析細胞生長， 并相對于相應的細胞系在沒有添加rIGFBP7的情況中的生長標準化。誤差工形線表示標 準誤差。圖4C是一組免疫印跡，其監(jiān)測用空表達載體或組成性活化的ERK2突變體穩(wěn)定 轉染的SK-MEL-28細胞中的BNIP3L、act_CASP3、磷酸-ERK和總ERK的表達。不處 理或用10 μ g/ml rIGFBP7處理SK-MEL-28細胞達24小時，如標示的，之后收獲細胞。圖4D是一組免疫印跡，其監(jiān)測用rIGFBP、MEK抑制劑(MEK_i)或RAF抑制 齊[J (RAF-i)處理后 24 小時的 SK-MEL-28 細胞中的 BNIP3L、SMARCB 1> act_CASP3、 磷酸-ERK和總ERK的表達。圖5A是一幅線圖，其描繪了用rIGFBP7局部處理的異種移植小鼠的腫瘤體積。 將SKMEL28或SK-MEL-31細胞皮下注射入裸鼠體側中，并在3、6、和9天后(箭)， 在腫瘤位置處給小鼠注射rIGBP7或(作為對照)PBS。誤差工形線表示標準誤差。圖5B是一副線圖，其描繪了用rIGFBP7系統(tǒng)處理的異種移植小鼠的腫瘤體積。 將SK-MEL-28或SK-MEL-31細胞注射入裸鼠的體側中。在腫瘤達到IOOmm3的大小 時，在第6天、第9天、和第12天時(箭)通過尾靜脈注射系統(tǒng)施用100 μ grIGFBP7。圖5C是一幅柱狀圖，其描繪了 rIGFBP7對腫瘤生長的劑量依賴性抑制。將 SK-MEL-28細胞注射入裸鼠的體側中，如(圖5B)中所描繪的，之后通過尾靜脈注射系 統(tǒng)施用2、20、50、100、或250μβι·Κ}ΡΒΡ7。注射后第21天時測量腫瘤體積。圖6Α是一組免疫組織化學載玻片，其描繪了正常人皮膚(正常皮膚一第1欄)、 痣(BRAFV600E陽性一第2欄和第3欄)、和黑素瘤(BRAFV600E-第4欄和第5欄；和 BRAF-wt-第6欄和第7欄)樣品中的IGFBP7表達。用蘇木精和曙紅(Η&Ε)對樣品染色(第1行)。以2X(第2行)和/或20X(第3行)放大率顯示描繪IGFBP7表達的圖 像。箭頭標示正常皮膚中的IGFBP7陽性黑素細胞。圖6B是活化的BRAF如何促進衰老的示意性匯總。在BRAF_wt黑素細胞中， 通過BRAF-MEK-ERK途徑的正常信號傳導導致IGFBP7的誘導，繼而其抑制通過自分 泌/旁分泌途徑的BRAF-MEK-ERK途徑；結果是受控的增殖。在BRAFV600E陽性痣 中，BRAF-MEK-ERK途徑的組成性活化導致IGFBP7的誘導，其抑制所述途徑，并活化 衰老基因。在BRAFV600E陽性黑素瘤中，IGFBP7表達是喪失的，并且細胞經歷不受控 的增殖。外源性IGFBP7的添加抑制BRAF-MEK-ERK途徑，并活化凋亡基因。圖7A 是人 IGFBP7 的多肽序列(SEQ ID NO 1 ； GenBank 登錄號 ΝΡ_001544)。圖7B是人IGFBP7mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 2 ； GenBank登錄號 NM_001553)。圖8A 是人 BRAF 的多肽序列(SEQ IDNO 3 ； GenBank 登錄號 NP_004324)。圖8B是人BRAF mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 4 ； GenBank登錄號 NM_004333)。圖9A 是人 NRAS 的多肽序列(SEQ ID NO 5 ； GenBank 登錄號 NP_002515)。圖9B是人NRAS mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 6 ； GenBank登錄號 NM_002524)。圖IOA是IGFBP7啟動子的示意圖；通過垂直線按比例顯示CpG 二核苷酸的位置。圖IOB是對黑素細胞痣(BRAFV600E)、黑素瘤(BRAF wt)、和黑素瘤 (BRAFV600E)中的IGFBP7啟動子的亞硫酸氫鹽序列分析。每個圓圈表示CpG 二核苷 酸空心(白色)圓圈表示未甲基化的CpG位點，而實心(黑色)圓圈標示甲基化的CpG 位點。每行表示單克隆。圖IOC是對一組指定的黑素瘤細胞系中的IGFBP7啟動子的亞硫酸氫鹽序列分 析。每個圓圈表示CpG 二核苷酸空心(白色)圓圈表示未甲基化的CpG位點，而實 心(黑色)圓圈標示甲基化的CpG位點。每行表示單克隆。圖IOD是一幅柱狀圖，其描繪了用DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2，-脫氧 胞苷酸(5-aza)處理后黑素瘤細胞系中的IGFBP7mRNA水平，如通過qRT_PCR所測量
的。誤差工形線表示標準誤差。圖IlA是一幅柱狀圖，其描繪了指定的人癌細胞系對IGFBP7介導的凋亡的敏感 性。通過工形線標示RAS/BRAF突變狀態(tài)，如圖例上所顯示的。圖IlB是一幅柱狀圖，其描繪了指定的人癌細胞系對由MEK抑制劑U0216實現 的生長抑制的敏感性。通過工形線標示RAS/BRAF突變狀態(tài)，如圖例上所顯示的。

圖12A是用于測定IGFBP7對異種移植小鼠中的轉移性肺腫瘤的影響的實驗方案 的示意圖。圖12B和圖12C是小鼠的一對照片表示，其顯示了用A375 (Fluc-IRES_GFP) 細胞注射后第6天時體內GFP表達細胞的濃度。圖12B，PBS-對照處理的；圖12C， IGFBP7處理的。圖12D是描繪實驗過程里對小鼠存活的Kaplan-Meier分析的圖。
圖13A是用于測定IGFBP7對異種移植小鼠中的轉移性肺腫瘤的影響的實驗方案 的示意圖。 圖13B是描繪實驗過程里對小鼠存活的Kaplan-Meier分析的圖。發(fā)明詳述本公開內容包括用IGFBP7劑治療腫瘤(例如癌癥)、誘導細胞凋亡、誘導細胞 衰老、和抑制細胞增殖的方法。IGFBP7 劑可以與本文中所描述的方法一起使用的IGFBP7劑指如下的藥劑，其包含 IGFBP7多肽序列和，備選地，一種或多種多肽或非多肽部分(moieties)，從而所述藥劑 具有rIGFBP7在體外抑制人BJ原代包皮成纖維細胞增殖的能力的至少25% (例如至少 30 % ； 40 % ； 50 % ； 60 % ； 70 % ； 75 % ； 80 % ； 85 % ； 90 % ； 95 % ； 97 % ； 98 % ； 99% ； 99.5%,或100%或甚至更大)(參見實施例1)。例示性藥劑包括IGFBP7的片段 和類似物(參見下文)。IGFBP7多肽序列可以包括成熟的、可溶性IGFBP7多肽(例如 SEQ ID NO 1 的殘基 24 至 282、25 至 282、26 至 282、27 至 282、28 至 282、或 29 至 282)、IGFBP7的一個或多個域、或其片段或變體。IGFBP7的例示性片段包含來自SEQ ID NO 1 的殘基 84 至 103 的序列(GMECVKSRKRRKGKAGAAAG ； SEQ ID NO 7)。在某些實施方案中，IGFBP7多肽包括與整個或部分天然存在的IGFBP7多肽基 本上相同的序列。與本文所描述的IGFBP7多肽序列“基本上相同的”多肽具有如下的 氨基酸序列，其與由SEQIDNO : 1或SEQ ID NO: 7表示的IGFBP7多肽的氨基酸序列 至少 65% (例如至少 75%、80%, 85%, 90%, 95%, 98%,或 99%，例如 100% )相 同。此外，具有多至50，例如1、3、5、10、15、20、25、30、或40處氨基酸插入、刪 除、或替代(例如保守氨基酸替代)的IGFBP7多肽在本文所描述的組合物和方法中會是 有用的。“保守氨基酸替代”指如下的替代，其中氨基酸殘基用具有類似側鏈的氨基酸 殘基替換。本領域中已經限定了具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有 堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶 電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱 氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例 如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸?？梢允褂肂LAST 2.0程序(其對于公眾在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST可獲得)來 測定兩種氨基酸序列之間的百分比同一性。使用缺省參數(BLOSUM62矩陣，缺口存 在代價(gap existence cost) 11，每殘基缺口代價1，和λ比率0.85)來實施序列比較。 BLAST程序中所使用的數學算法記載于Altschul等，1997，Nucleic Acids Research，25: 3389-3402。本文中所描述的方法中有用的IGFBP7多肽可以是，但不限于重組多肽和天然 存在多肽。IGFBP7多肽可以獲自任何人或哺乳動物物種，并且包括具有所公開的活性 的可變剪接形式和其它同等型。已經在黑猩猩(例如GenBank登錄號XP_517274)、獼 猴(例如 GenBank 登錄號 ΧΡ_001083041、ΧΡ_001082658)、牛(例如 GenBank 登錄號 XP_873466)、犬(例如 GenBank 登錄號 XP_850270、XP_861128)、小鼠(例如 GenBank登錄號Q61581)、和大鼠(例如GenBank登錄號NP_001013066)中鑒定出與人IGFBP7多
肽具有相似性的非人IGFBP7多肽。新方法中也有用的是融合蛋白，其中將IGFBP7多肽的一部分與無關的多肽(例 如標志多肽或純化標簽)融合以創(chuàng)建融合蛋白。例如，可以將多肽與肽標簽融合以便于 純化(例如與六組氨酸標簽或FLAG標簽融合以便于純化細菌表達的多肽或與血凝素標簽 或FLAG標簽融合以便于純化真核細胞中表達的多肽)。還有用的是例如包含第一部分 和第二部分的多肽；所述第一部分包括例如IGFBP7多肽，而所述第二部分包括例如可檢 測的標志物或血清蛋白質，例如免疫球蛋白恒定區(qū)，或人血清清蛋白。IGFBP7的氨基端區(qū)域(SEQ ID NO 1的多至殘基81)含有與其它胰島素樣生 長因子結合蛋白(IGFBP)具有同源性的區(qū)域。此區(qū)域包括在殘基32、35、40、48、57、 59、60、63、71、和81處的保守半胱氨酸殘基和殘基56至63處的保守“GCGCCxxC” 域(參見 Kim 等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94 12981-86)。IGFBP7 的其它保守域包括 在約殘基118至156處的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑和濾泡素抑制素樣域(保守域數據 庫登錄號cd00104)和在約殘基160-162至248處的免疫球蛋白域(細胞粘附分子亞家族) (保守域數據庫登錄號cd00931)。可以在生成IGFBP7多肽的片段、類似物和變體時使用 保守的殘基和域(domain)。IGFBP7劑可以在多肽上的一個或多個位點(例如在氨基或羧基端)具有一處或 多處化學修飾(例如翻譯后修飾)?；瘜W修飾的方法是本領域技術人員公知的，并且可以 用于改變IGFBP7劑的一項或多項特性，例如活性、穩(wěn)定性、保留、或藥動學。例示性 修飾包括糖基化和PEG化。IGFBP7在SEQID NO 1的殘基171至173處含有推定的N 糖基化位點。對IGFBP4的PEG化記載于US 2006/0100144?？梢耘cIGFBP7劑一起使 用類似的修飾和方法。IGFBP7 劑還可以是 IGFBP7 多肽(例如 SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 7)的 肽模擬物型式，其功能片段或變體?？梢砸勒毡绢I域已知的用于生成肽模擬物的方法 來修飾這些多肽。參見例如 Kazmierski，W.M.編，PeptidomimeticsProtocols，Human Press (Totowa NJ 1998) ； Goodman 等編，Houben-WeylMethods of Organic Chemistry Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)；及 Mayo 等， J.Biol.Chem.，278 45746(2003)。在一些情況中，本文中所公開的肽和片段的這些修飾 的肽模擬物型式相對于非肽模擬肽展現出增強的體內穩(wěn)定性。用于創(chuàng)建肽模擬物的方法包括用D氨基酸對映體替換肽序列中的一個或多個(例 如所有)氨基酸。此類序列在本文中稱為“逆”序列。在另一種方法中，氨基酸殘基 的N端至C端次序是顛倒的，從而氨基酸殘基從初始肽的N端至C端的次序變成氨基酸 殘基從經過修飾的肽模擬物中的C端至N端的次序。此類可以稱為“反”序列。肽模擬物可以是逆(retro)和反型式(inverso)兩者，即本文中所公開的肽的 “逆-反”型式。新的肽模擬物可以由如下安排的D-氨基酸構成，使得氨基酸殘基從
肽模擬物中的N端至C端的次序對應于氨基酸殘基從初始肽中的C端至N端的次序。用于制備肽模擬物的其它方法包括用化學獨特的但公認的氨基酸功能類似物， 即人工氨基酸類似物替換肽中的一個或多個氨基酸殘基。人工氨基酸類似物包括氨 基酸、β-取代的β-氨基酸(“β 3_氨基酸”)、氨基酸的含磷類似物，諸如α-氨基磷酸和α-氨基次膦酸、和具有非肽連接的氨基酸?？梢允褂萌斯ぐ被醽韯?chuàng)建肽模擬 物(peptidomimetics)，諸如類肽(peptoid)寡聚物(例如類肽酰胺或酯類似物)，β -肽、 環(huán)肽、寡尿素(oligcmrea)或寡氨基甲酸酯(oligocarbamate)肽；或雜環(huán)分子。在本文所公開的方法中也有用的是編碼本文所描述的IGFBP7劑，例如天然存 在的IGFBP7多肽或者改變或刪除了天然存在的氨基酸序列的IGFBP7多肽形式(例如 IGFBP7的片段或類似物)的核酸分子。某些核酸可以編碼在正常生理學條件下可溶的多 肽?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何手段來在細胞內表達(例如外源表達)IGFBP7劑。為 了生成表達IGFBP7劑的細胞，可以使用本領域已知的多種技術之任一種來轉染、轉化、 或轉導細胞?？梢允褂萌魏螖的康谋绢I域技術人員已知的轉染、轉化、和轉導方案，例 如那些記載于 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York.N.Y., 或多種商品化的試劑盒(例如Invitrogen Life Technologies，Carlsbad, Calif.)中的。此類 技術可以產生穩(wěn)定的或瞬時的轉化體。一種合適的轉染技術是電穿孔，其可以使用商品 化的設備對多種細胞類型(包括哺乳動物細胞、酵母細胞和細菌)實施。對特定的宿主 細胞類型以實驗方式確定用于電穿孔的最佳條件(包括電壓、電阻和脈沖長度)，并且可 以自制造商獲得用于優(yōu)化電穿孔的一般準則。施用IGFBP7劑的例示性方法包括向受試者中導入編碼本文所描述的IGFBP7 劑的核酸。在一些實施方案中，編碼IGFBP7劑的核酸包含在載體內，例如如包含表達 IGFBP7劑的核酸的病毒。例示性的病毒載體包括腺病毒(綜述于Altaras等，2005， Adv.Biochem.Eng.Biotechnol., 99: 193-260)、腺伴隨病毒(綜述于 Park 等，2008，Front. Biosci., 13: 2653-59 ；還可參見 Williams，2007，Mol.Ther.，15: 2053-54)、細小病 毒、慢病毒、逆轉錄病毒(綜述于Tai等，2008，Front.Biosci.，13: 3083-95)、和單純皰 疹病毒。Patil等，2005，AAPS J., 7 E61-77中綜述了投遞核酸的方法，通過提及而將 其完整收入本文。在一些實施方案中，向癌細胞或癌細胞附近的細胞直接施用表達IGFBP7多肽的 核酸。在一些實施方案中，向離體細胞施用表達IGFBP7多肽的核酸，然后對受試者在 腫瘤附近施用所述離體細胞?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何手段來生成IGFBP7劑，例如通過化學合成、重組方 法、或者自天然生成IGFBP7的細胞的分離來實現。純化和分離包含多肽的分子的方法也 是本領域技術人員公知的。從培養(yǎng)細胞純化IGFBP7的例示性方法記載于Yamauchi等， 1994，BiochemJ., 303 591-598。IGFBP7的片段和類似物的生成片段的生成可以以數種方式例如重組方式、通過蛋白水解消化、或者通過化學合成來生成 蛋白質片段?？梢酝ㄟ^從編碼多肽的核酸的一端(對于末端片段)或兩端(對于內部片 段)除去一個或多個核苷酸來生成多肽的內部或末端片段經過誘變的DNA的表達生成多 肽片段。如此用“末端步切(end-nibbling)”內切核酸酶進行的消化可以生成編碼一系 列片段的DNA。也可以通過隨機剪切、限制性消化或上文所討論的方法的組合來生成編 碼蛋白質片段的DNA。也可以使用本領域已知的技術諸如常規(guī)的Merrifield固相f_Moc或t_Boc化學來
13化學合成片段。例如，可以將本發(fā)明的肽任意分成具有想要的長度且沒有片段交疊的片 段，或者分成具有想要的長度的交疊片段。類似物的生成通過隨機方法來生成經過改變的DNA和肽序列可以通過編碼蛋白質或蛋白質的特定域或區(qū)域的DNA的隨機誘變來制備蛋白質 的氨基酸序列變體。有用的方法包括PCR誘變和飽和誘變。還可以通過合成一套簡并 寡核苷酸序列來生成隨機氨基酸序列變體的文庫。(用于篩選變體文庫中的蛋白質的方法 在本文中的別處)。PCR 誘變在PCR誘變中，使用降低的Taq聚合酶保真度來將隨機突變弓I入DNA的克隆片 段中(Leung等，1989，Technique 1 11-15)。這是一種非常有力且相對快速的引入隨機 突變的方法。在降低通過Taq DNA聚合酶進行的DNA合成的保真度的條件下(例如通 過使用dGTP/dATP比率為5和向PCR反應添加Mn2+)使用聚合酶鏈式反應(PCR)來擴 增要誘變的DNA區(qū)。將所擴增DNA片段的集合(pool)插入合適的克隆載體中以提供隨 機突變體文庫。飽和誘變飽和誘變容許將大量的單堿基替代快速引入克隆的DNA片段中(Mayers等， 1985，Science 229 242)。此技術包括突變的產生(例如通過在體外化學處理或照射單 鏈DNA，并合成互補的DNA鏈)。可以通過調控處理的嚴格來調控突變頻率，并且可以 獲得基本上所有有可能的堿基替代。因為此規(guī)程沒有牽涉遺傳選擇突變型片段，所以獲 得中性替代及那些改變功能的替代兩者。點突變的分布并不偏向于保守的序列元件。簡并寡核苷酸還可以自一套簡并寡核苷酸序列產生同系物文庫?？梢栽谧詣踊疍NA合成儀 中實施簡并序列的化學合成，然后將合成的基因連接入合適的表達載體中。簡并寡核 苷酸的合成是本領域已知的(參見例如Narang，SA(1983)Tetrahedron 39 3 ； Itakura 等(1981) Recombinant DNA, Proc 3rd ClevelandSympos.Macromolecules 編 AG Walton, Amsterdam Elsevier第 273 頁-第 289 頁；Itakura等(1984) Annu.Rev.Biochem.53 323 ； Itakura 等(1984) Sciencel98 1056 ； Ike 等(1983)Nucleic Acid Res.ll 477。已經在其 它蛋白質的定向進化中采用此類技術(參見例如Scott等(1990) Science 249 386-390 ； Roberts 等(1992) PNAS 89 2429-2433 ； Devlin 等(1990) Science 249 404-406 ； Cwirla 等(1990)PNAS 87 6378-6382 ；以及美國專利 No.5,223,409, 5,198,346，和 5,096,815)。類似物的生成通過定向誘變來生成經過改變的DNA和肽序列可以使用非隨機或定向誘變技術來在特定區(qū)域中提供特定的序列或突變?？梢?使用這些技術來創(chuàng)建變體，其包含例如蛋白質的已知氨基酸序列的殘基的刪除、插入、 或替代?？梢詡€別地或連續(xù)地修飾突變位點，例如如下實現(1)首先用保守氨基酸替 換，然后用更激進的選擇，這取決于所實現的結果，(2)刪除靶殘基，或者(3)在定位位 點附近插入相同或不同類的殘基，或者選項1-3的組合。丙氨酸掃描誘變丙氨酸掃描誘變是一種對于鑒定想要的蛋白質中作為用于誘變的優(yōu)選位置或域的某些殘基或區(qū)域有用的方法，Cunningham 和 Wells(Science244 1081-1085，1989)。 在丙氨酸掃描中，鑒定殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基諸如Arg、Asp、His、 Lys、和Glu)，并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替換。氨基酸 的替換可以影響氨基酸與細胞中或外部的周圍水性環(huán)境的相互作用。然后通過在替代位 點或為替代位點引入別的或其它變體來改進那些表明對替代功能敏感性的域。如此，雖 然用于引入氨基酸序列變異的位點是預先確定的，但是突變的性質本身不需要是預先預 定的。例如，為了優(yōu)化給定位點處的突變的性能，可以在靶密碼子或區(qū)域處進行丙氨酸 掃描或隨機誘變，并且對所表達的想要蛋白質亞基變體篩選想要活性的最佳組合。寡核苷酸介導的誘變寡核苷酸介導的誘變是一種對于制備DNA的替代、刪除、和插入變體有用的方 法，參見例如Adelman等，(DNA 2 183，1983)。簡言之，通過將編碼突變的寡核苷 酸與DNA模板雜交來改變想要的DNA，其中所述模板是單鏈形式的質?；蚴删w，其含 有想要的蛋白質的未改變的或天然的DNA序列。雜交后，使用DNA聚合酶來合成模板 的整個第二條互補鏈，如此其會摻入寡核苷酸引物，并且會編碼想要的蛋白質DNA中的 所述變化。一般而言，可以使用長度為至少25個核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸 會具有12個至15個核苷酸，它們在編碼突變的核苷酸的任一側上與模板完全互補。這 確保寡核苷酸會與單鏈DNA模板分子正確雜交。容易使用本領域已知的技術諸如記載于 Crea 等(Proc.Natl.Acad.Sci. (1978) USA，75: 5765)的技術來合成寡核苷酸。盒式誘變用于制備變體的另一種方法，即盒式誘變基于記載于Wells等(Gene(1985) 34 315)的技術。起始材料是含有要突變的蛋白質亞基DNA的質粒(或其它載體)。鑒定 要突變的蛋白質亞基DNA中的密碼子。在鑒定出的突變位點的每一側上必須有獨特的限 制性內切核酸酶位點。若沒有此類限制性位點存在，則它們可以使用用于在想要的蛋白 質亞基DNA中的合適位置處引入它們的上文所描述的寡核苷酸介導的誘變方法來產生。 已經將限制性位點引入質粒中后，在這些位點處切割質粒以使其線性化。使用標準規(guī)程 來合成如下的雙鏈寡核苷酸，其編碼限制性位點之間的DNA的序列但含有想要的突變。 使用標準技術分開合成兩條鏈，然后雜交在一起。此雙鏈寡核苷酸稱為盒。將此盒設計 成具有與線性化的質粒的末端可比較(comparable)的3’和5’末端，從而可以將其直接 連接至質粒。此質粒現在含有突變的想要蛋白質亞基DNA序列。組合誘變也可以使用組合誘變來生成突變體。例如，比對同系物組或其它相關蛋白質的 氨基酸序列，優(yōu)選地，以提升(promote)有可能的最高同源性?？梢赃x擇比對序列的給定 位置處出現的所有氨基酸來創(chuàng)建組合序列的簡并集合。通過在核酸水平的組合誘變來產 生變體的多樣化文庫，并且由多樣化的基因文庫編碼。例如，可以以酶方法將合成寡核 苷酸的混合物連接入基因序列中，使得潛在序列的簡并集合作為個體肽，或者備選地， 作為含有簡并序列組的較大的融合蛋白組可表達。用于篩選肽片段或同系物的文庫的初級高通量(high-thmugh-put)方法用于篩選所生成的突變型基因產物的各種技術是本領域已知的。用于篩選大基 因文庫的技術通常包括將基因文庫克隆入可復制的表達載體中，用所得的載體文庫轉化合適的細胞，并在測量想要的活性(例如對人BJ增殖的抑制)的檢測的條件下表達基 因。下文所描述的每種技術適合用于篩選大量通過例如隨機誘變技術創(chuàng)建的序列的高通 量分析?；罨蛔儽疚闹兴枋龅姆椒ê徒M合物在包含如下細胞的癌癥的治療中是特別有用 的，所述細胞具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或存活依賴于 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑，和/或在BRAF信號轉導途徑中具有活化性突變 (例如活化性BRAF或RAS (例如NRAS、HRAS、或KRAS))(參見例如Dhomen和 Marais, 2007，Curr.Opin.Genet.Dev., 17:31-39)。BRAF 活化 MAP 激酶胞內信號調 節(jié)激酶(MEK)，繼而其磷酸化和活化胞內信號調節(jié)激酶1和2 (ERK1和ERK2)。已經 在大多數所測試的黑素瘤樣品中，以及在來自數種其它類型的癌癥的樣品中找到了活化 性BRAF突變。已經在數種癌癥中找到了活化性RAS突變，包括黑素瘤、多發(fā)性骨髓 瘤、結腸直腸癌、濾泡性癌、濾泡性腺瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、膀 胱癌、胰腺癌、肺腺癌、膽囊癌、膽管癌、甲狀腺癌、和多種癌瘤?？梢酝ㄟ^例如檢測細胞或細胞溶胞物中的這些蛋白質的磷酸化形式的存在來測 量細胞中的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導的增強。對磷酸化的BRAF、MEK和Erk特 異性的抗體可購自例如 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts)和 Santa Craz Biotechnology, Inc. (Santa Craz, California)。生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑的細胞在 Ras-BRAF-MEK-Erk途徑的成分的表達或活性受到人工抑制(例如通過藥理學(例如 法尼基轉移酶抑制劑R115777、MEK1/2抑制劑PD184352、MEK抑制劑U0216 (Cell Signaling)、MEK 抑制劑 PD98054 (Calbiochem)、RAF 抑制劑 GW5074 (Sigma)、BAY 43-9006、CI-1040、寄端霉素(hypothemycin)、或 PD0325901) (Solit 等，2006，Nature, 439 358-362 ； Alessi 等，1995，J.Biol.Chem.，270 27489-94)或遺傳手段(例如用顯 性陰性(negative)Ras、MEKl shRNA、或針對途徑的一種成分的抑制性核苷酸進行的轉 染))時會展示降低的生長和/或存活?；罨腂RAF蛋白質具有下列一項或多項特性提高的激酶活性、體內或體外 向ERK的信號傳導增強、NIH 3T3細胞的轉化、和人包皮成纖維細胞(例如BJ成纖維 細胞或原代包皮成纖維細胞)的增殖減緩。例示性的活化性BRAF點突變包括用Glu對 Val600的替代(V600E ；通過例如在BRAF編碼序列的核苷酸1799處的T — A轉換引 起)、用Ile對Arg462的替代(R462I ；通過例如在BRAF編碼序列的核苷酸1385處的 G-T轉換引起)、用Ser對Ile463的替代(I463S ；通過例如在BRAF編碼序列的核苷酸 1388處的T — G轉化引起)、用Glu對Gly464的替代(G464E ；通過例如在BRAF編碼 序列的核苷酸1391處的G — A轉換引起)、用Glu對Lys601的替代(K601E ；通過例如 核苷酸1801處的A — G轉換引起)、用Val對Gly465的替代(G465V)、用Arg(L596R) 或 Val(L596V)對Leu596 的替代、用 Arg(G468R)或 Ala(G468A)對Gly468 的替代、和用 Gly對Asp593的替代(D593G)。還已經鑒定出由染色體重排引起的活化性BRAF突變。 例如，已經報告了由染色體7q倒位引起的AKAP9和BRAF蛋白的融合，導致AKAP9基 因的外顯子1-8與BRAF的外顯子9-18之間以符合讀碼框方式融合(Ciampi等，2005，J.Clin.Invest.，115 94—101)。活化的RAS蛋白具有下列一項或多項特性體內或體外的向RAF (例如BRAF) 的信號傳導增強、NIH 3T3細胞的轉化、和人包皮成纖維細胞(例如原代包皮成纖維細 胞BJ成纖維細胞)的增殖減緩。例示性的活化性NRAS點突變包括用Arg對Glyl3的 替代(G13R，通過密碼子13處的G — C突變引起)和用Arg對Gln61的替代(Q61R， 通過密碼子61處的CAA —CGA突變引起)。還可參見Bos等，1985，Nature, 315 726-730 ； Davis 等，I984，Cytogenet.CellGenet.，37 448-449 ； Taparowsky 等，I983， Cell, 34: 581-586 ； Yuasa等，1984，Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 81: 3670-74)。例示性的 活化性HRAS點突變包括用Val對Glyl2的替代(G12V，通過密碼子12處的GGC — GTC 突變引起)和用Lys對Gln61的替代(Q61K，通過密碼子61處的CAG — AAG突變引 起)。例示性的活化性KRAS點突變包括用Cys對Glyl2的替代(G12C，通過核苷酸34 處的G —T轉換引起)、用Arg對Gly 12的替代(G12R，通過密碼子12處的G — C轉換 引起)、用Asp對Glyl3的替代(G13D，通過密碼子13處的G — A轉換引起)、用Thr 對Ala59的替代(A59T，通過密碼子59處的G — A轉換引起)、用Asp對Glyl2的替代 (G12D)、用Val對Glyl2的替代(G12V)、用Ser對Glyl2的替代(G12S，通過密碼子12 處的G —A轉換引起)、Glyll的插入(G11-INS，通過外顯子1中的3_bp插入引起)、 和用Arg對Glyl3的替代(G13R，通過密碼子13處的G — C轉換引起)。組成性活化的ERK突變體包括ERK2Q103A和ERK2L73P，S151D (Emrick等， 2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 103 18101-06; Emrick 等，2001，J.Biol.Chem.，276 46469-79)。例示性的活化的 MEKl 突變體是 MEKlEE (Tournier 等，1999，MoLCell Biol., 19 1569-81)?？梢酝ㄟ^測定來自受試者的樣品中的突變型核酸的存在來檢測活化性BRAF、 RAS> ERK、或MEK突變。用于檢測BRAF突變的例示性的商品化測定法是Mutector 突變檢測試劑盒(Trimgen，Sparks, MD ；產品目錄編號GP04、MH1001-01、 MH1001-02、MH1001-03、MHlOO 1-04) (Xing 等，2004，Clin.Endocrinol.Metab.，89: 2867-72 ； Ichii-Nakato 等，2006，J.Invest.Dermatol., 126:2111-18)。用于檢測 KRAS 突變的例示性的商品化測定法可購自DxS Ltd. (Manchester, UK)。檢測突變型核酸的其它例示性方法包括直接測 序；限制性片段分析(Cohen等， 2003，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci., 44: 2876-78)；單鏈構象多態(tài)性凝膠電泳(Lee 等， 2003，Br.J.Cancer.，89: 1958-60)；定點誘變 / 限制性分析(Alsina 等，2003，Clin. Cancer Res.，9 6419-25 ； Goydos 等，2005，J.Am.Coll.Surg.，200 362-370)；序列 特異性 PCR(Deng 等，2004，Clin.Cancer Res.，10: 191-195)；實時聚合酶鏈式反應 和解鏈曲線分析(Ikenoue 等，2004，Cancer Genet.Cytogenet.，149 68-71)；缺口連 接酶鏈式反應(Goldenberg等，2004，Mod.Pathol., 17: 1386-91)；突變體等位基因 特異性 PCR 擴增(MASA) (Lilleberg 等，2004，Ann.NYAcad.Sci.，1022 250-256 ； Sapio 等，2006，Eur.J.Endocrinol.，154 341-348)；等位基因特異性 PCR(Burger 等， 2006，Eur.Urol.，50: 1102-09)；實時等位基因特異性 PCR(Jarry 等，2004，Mol.Cell. Probes., 18 349-352 ； Yancovitz 等，2007，J.Mol.Diagn.，9 178-183) ； PCR 限制 性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析(Hayashida 等，2004，Thyroid, 14: 910-915 ； Chung等，2006，Clin.Endocrinol. (Oxf.), 65: 660-666)；錯配連接測定法(Busby 和Morris， 2005，J.Clin.Pathol.，58 372-375)；連接酶檢測反應(Turner 等，2005，J.Cutan. Pathol., 32: 334-339)；高分辨率擴增子解鏈分析(Willmore-Payne 等，2005，Hum. Pathol., 36 486-493)；變性劑毛細管電泳(Hinselwood 等，2OO5，Electrophoresis, 26: 2553-61)；環(huán)雜交遷移率變動測定法(loop-hybrid mobility shift assay) (Matsukuma 等，2006，J.Mol.Diagn.，8 504-512)；單堿基延伸分析(Kann 等，2006，Clin.Chem.， 52: 2299-2302)；寡核苷酸微陣列(Kim 等，2007，J.Mol.Diagn., 9 55-63)；原位雜 交；原位擴增；和檢測核苷酸多態(tài)性(例如單核苷酸多態(tài)性)的其它已知手段。還可參 見 US 2006/0246476、US 2006/0252041、US 2007/0020657、和 US 2007/0087350。在 一些實施方案中，測定數種突變型核酸的存在與否(例如序貫地或者同時地)。也可以通過測定突變型蛋白質的存在來檢測活化性BRAF、RAS> ERK, 或MEK突變。用于檢測突變型蛋白質的例示性方法包括使用突變特異性抗體的免 疫學方法(Fensterle 等，2004，BMC Cancer, 4 62 ； Kawakami 等，2005，Cancer Metastasis Rev., 24: 357-66)；含有突變特異性抗體的陣列；和質譜術(例如MS/MS或 MALDI-TOF 質譜術)(Powell 等，2005，J.Pathol.，205 558-64)。在一些實施方案中， 測定數種突變型蛋白質的存在與否(例如序貫地或者同時地)。也可以通過對樣品測定BRAF或RAS活性來檢測活化性BRAF、RAS> ERK、
或MEK突變(參見例如US 2006/0211073)?；蛘?，可以通過檢測由突變型蛋白質所產 生的基因表達的特征性樣式來推斷活化性BRAF、RAS> ERK、或MEK突變的存在。來自受試者的樣品可以是任何類型的，包括但不限于活組織檢查、吸出物、血 液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、或其它體液。樣品通常會包括受試者的細胞，例如來 自受試者的腫瘤、損傷、或懷疑為癌性的組織的細胞。然而，本文所描述的檢測方法中 有許多靈敏得足以檢測出無細胞樣品中痕量的突變型核酸或蛋白質，甚至在存在相應的 野生型核酸或蛋白質的情況中。可以將含有細胞的樣品固定或者以其它方式處理，之后 進行測定。癌癥診斷學可以通過對來自受懷疑的腫瘤的樣品(例如一種或多種細胞)測試IGFBP7 表達來實現某些癌癥(例如具有活化的BRAF或RAS的癌癥)的診斷。具有增強的 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或存在依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途 徑、和/或含有活化的BRAF或RAS并且基本上沒有表達或沒有可檢測地表達IGFBP7的 樣品(例如與來自受試者的非癌性細胞或組織的樣品或參照值(例如從正常細胞或組織樣 品獲得的)相比)被診斷為癌性。同樣地，沒有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、 生長和/或存在不依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或不含活化的BRAF 或RAS并且基本上不表達或沒有可檢測地表達IGFBP7的樣品(例如與來自受試者的非癌 性細胞或組織的樣品或參照值(例如從正常細胞或組織樣品獲得的)相比)可以被診斷為 癌性。可以對任何器官或組織的損傷或受懷疑的腫瘤使用本文中所描述的診斷方法。 在器官或組織是皮膚時，樣品可以含有黑素細胞。具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信 號傳導、生長和/或存在依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或含有活化的BRAF或RAS并且基本上表達IGFBP7的黑素細胞被診斷為黑素細胞痣(黑痣)；具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或存在依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信 號傳導途徑、和/或表達活化的BRAF或RAS，但基本上不表達IGFBP7的黑素細胞被 診斷為黑素瘤。沒有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或存在不依賴于 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或不含活化的BRAF或RAS但確實基本上或可 檢測地表達IGFBP7的黑素細胞也被診斷為黑素瘤?？梢耘c組織切片(例如冷凍組織切 片)一起使用測定法，因此對于組織學分析和臨床診斷是有用的。所述方法不需要特定 的組織固定方法，因為該測定法與未固定的細胞或組織或者與數種固定劑(例如甲醇/丙 酮固定，或甲醛固定)一起運行。測定法可以與石蠟切片(例如復原的石蠟切片)一起 運行。其它有用的組織固定方法是本領域普通技術人員已知的。用于檢測樣品中的IGFBP7表達的方法包括檢測mRNA或cDNA和檢測蛋白質， 例如使用抗體或其它結合蛋白質，或使用活性測定法來實現。也有可能使用多種分子技 術之任一種(包括RT-PCR和微陣列分析)來檢測IGFBP7mRNA或cDNA。本領域中已知的基因表達分析的方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma 和 Vilo，FEBS Lett., 2000，480，17—24; Celis 等，FEBS Lett.，2000，480，2-16), SAGE(基因表達系列分析)(Madden 等，Drag Discov.Today，2000, 5，415-425)、 READS (經消化的 cDNA 的限制酶擴增(restriction enzymeamplification of digested cDNA)) (Prashar 禾Π Weissman，Methods Enzymol., 1999，303，258-72)、TOGA (總基因表 達分析(total gene expression analysis)) (Sutcliffe 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97，1976-81)、蛋白質陣列和蛋白質組學(Celis 等，FEBS Lett.，2000，480，2-16 ； Jungblut 等，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、表達序列標簽(EST)測序(Celis 等，FEBS Lett.，2000，480，2-16 ； Larsson 等，J.Biotechnol.，2000，80，143-57)、消 減式 RNA 指紋(subtractive RNAfingerprinting，SuRF) (Fuchs 等，Anal.Biochem.，2000， 286，91-98 ； Larson 等，Cytometry, 2000，41，203-208)、消減克隆、差別展示(DD) (Jurecic 和 Belmont，Curr.Opin.Microbiol., 2000，3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli 等，J.CellBiochem.Suppl.，1998, 31，286-96), FISH(熒光原位雜交)技術(Going 禾口 Gusterson, Eur.J.Cancer, 1999，35，1895-904)和質譜術方法(綜述于 To，Comb.Chem. High Throughput Screen, 2000，3，235-41)。癌癥可以使用新方法來診斷和治療數種類型的癌癥，例如黑素瘤、甲狀腺癌(例如 乳頭狀甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid carcinoma)、濾泡性癌(follicular carcinoma)、濾泡性腺瘤(follicular adenoma))、結腸直腸癌、肺癌(例如腺癌、非小細胞
肺癌)、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma))、多發(fā)性骨髓瘤、白血 病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、和其它癌瘤。診斷癌 癥的方法是本領域技術人員公知的。在一些實施方案中，新方法對于任何類型的具有增 強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或存在依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號 傳導途徑、和/或含有活化的或致癌性BRAF或RAS的腫瘤、癌癥、或新生物可以是有 用的。藥學配制劑
可以將本文中所描述的IGFBP7劑(它們在本文都可以稱為“活性化合物”)摻 入藥學組合物中。此類組合物通常包括活性化合物和藥學可接受載體或賦形劑。“藥學 可接受載體”可以包括與藥學施用相容的溶劑、分散介質、涂層、抗菌和抗真菌劑、等 張劑和吸收延遲劑等。還可以將補充的活性化合物摻入組合物中。有許多可以將在新方法中使用的新組合物投遞至受試者(一般而言)，且具 體地，投遞至那些受試者中的特定細胞或組織的方法。例如，可以將本文中所描述的 IGFBP7劑注射入受試者或受試者的組織中。在另一個例子中，可以將編碼IGFBP7劑的 載體(例如質?；虿《?導入受試者的細胞或組織中。然后載體會進入該組織的一種或 多種細胞，并表達IGFBP7劑。可以如下增強此類質粒的投遞特異性，即將它們與器官 或組織特異性親和力聯系起來，從而它們優(yōu)先進入指定的細胞類型。然而，因為IGFBP7 能在細胞外起作用，所以不必將載體直接投遞至腫瘤細胞?？梢詫⑤d體投遞至腫瘤周圍 的組織。表達蛋白質進行腫瘤療法的方法記載于例如Cross和Burmester，2006，Clin. Med.Res.，4 218-227 ； Lejuene 等，2007，Expert Rev.Anticancer Ther.7 701-713;及 Bloquel 等，2004，J.Gene Med., 6 S11-S23?？梢詫⒒衔锛捌渖韺W可接受鹽和溶劑化物配制用于口服、表面(topical)、 口腔、胃腸外或直腸施用或者通過吸入或吹入(經由口或鼻)進行的施用。一般會將化合物配制用于通過注射(例如推注或連續(xù)輸注)進行的胃腸外施用。 供注射用的配制劑可以以單位劑量形式呈現，例如在安瓿中或者在裝有添加的防腐劑的 多劑容器中。組合物可以采取諸如懸浮液、溶液或油性或水性媒介中的乳劑等形式，而 且可以含有配方劑(formulatory agent)，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸钚?成分在使用前可以是粉末形式，供與合適媒介(例如無菌無熱原水)的構建。若組合物 意圖在特定的治療區(qū)域中使用，則可以通過向腫瘤位置中的一次或多次局部注射來施用 組合物以盡可能多地消除與化合物在治療區(qū)域外的活性有關的任何副作用。在先前所描述的配制劑外，還可以將化合物配制為積存制劑 (depotpreparation)?？梢酝ㄟ^植入(例如皮下或肌肉內)或者通過肌肉內注射來施用此類 長效配制劑。如此，例如化合物可以用合適的聚合物或疏水性材料(例如作為可接受油 中的乳液)或離子交換樹脂，或者作為略溶性衍生物(例如作為略溶性鹽)配制。積存 制劑可以包括包埋的或包囊的分泌IGFBP7劑的細胞或組織，其可以例如通過植入或通過 肌肉內注射來施用。若想要的話，可以在包裝或分配器裝置中呈現組合物，所述包裝或分配器裝置 可以裝有含有活性成分的一個或多個單位劑量形式。包裝可以例如包括金屬或塑料薄 片，諸如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可以附有施用指令。本發(fā)明的治療性組合物還可以含有載體或賦 形劑，其中許多是熟練技術人員已 知的。用于制備此類配制劑的方法是公知的，并可參見例如，Remington=TheScience and Practice of Pharmacy, University of the Sciences inPhiladelphia (USIP)，2005。還可以使用本領域已知的方法來將組合物配制用于活性化合物的細胞內投遞。 例如，組合物可以包括投遞活性化合物穿過胞質膜的脂質體或其它載體。還可以使用用 膜滲透性肽(membrane-permeant peptide)諸如Tat或觸角(Antennapedia)覆蓋的小泡。用 于增強細胞內投遞的許多其它方法對于本領域技術人員是熟悉的
公認的是，可以獨立地或者彼此組合地使用本文中所描述的藥學組合物和方 法。也就是說，可以以時間交疊或非交疊方案對受試者施用一種或多種藥學組合物(例 如包含IGFBP7劑的藥學組合物)，和/或進行本文所描述的一種或多種治療方法。在療 法在時間上交疊時，療法一般可以以任何次序發(fā)生，并且可以是同時的(例如一起在復 合的組合物中同時施用或者同時地但作為分開的組合物施用)或者分散的。舉例而言， 可以同時或序貫地對患有本文所描述的病癥的受試者施用選擇性殺死異常細胞的細胞毒 劑和在一個實施方案中可以與治療劑、細胞毒劑、成像劑等偶聯或連接的抗體(例如本 發(fā)明的抗體)兩者。
有效劑量可以通過標準藥學規(guī)程來測定IGFBP7劑的毒性和治療功效，其使用培養(yǎng)中的細 胞或者實驗動物測定LD50 (對50%的群體致死的劑量)和ED50 (在50%的群體中治療有 效的劑量)來實現。毒性與治療效果之間的劑量比率是治療系數，并且其可以表示為比 率LD50/ED50。優(yōu)選展現出大的治療系數的抑制劑。雖然可以使用展現出毒性副作用 的抑制劑，但是要注意設計如下的投遞系統(tǒng)，其將此類化合物靶向受累組織位置以使對 非靶向細胞的潛在損害最小化，由此降低副作用。可以在配制人用劑量范圍中使用自細胞培養(yǎng)測定法和動物研究獲得的數據。優(yōu) 選地，此類化合物的劑量位于包括具有少許毒性或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內。 劑量可以在此范圍內變化，這取決于所采用的劑量形式和所利用的施用路徑。對于在新 方法中所使用的任何化合物，最初可以自細胞培養(yǎng)測定法評估治療有效劑量。也可以在 動物模型中計算劑量以達到包括IC50(即，實現對癥狀的半最大抑制的測試化合物濃度) 的循環(huán)血漿濃度范圍，如在細胞培養(yǎng)中所測定的?？梢允褂么祟愋畔砀_地確定人 中有用的劑量。
實施例材料和方法細胞系和培養(yǎng)原代包皮成纖維細胞(BJ)和人黑素瘤細胞系獲自ATCC，并在補充有10%胎牛 血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基中于37°C在5% CO2下培養(yǎng)。人原代黑素細胞 獲自Cascade Biologies，并依照供應商的推薦培養(yǎng)。逆轉錄病毒和質粒自質粒 pBABE-zeo(Addgene)禾Π pBABE-zeo/BRAFV600E 生成表達空載體或 BRAFV600E 的逆轉錄病毒(Michaloglou 等，2005，Nature, 436 720-724)。還獲得表 達組成性活化的 ERK2 突變體ERK2Q103A和 ERK2L73P、S15ID (Emrick等，2006，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，103 18101-06 ； Emrick 等，2001，J.Biol.Chem.，276 46469-79) 禾口 MEKl 突變體 MEKlEE(Tournier 等，1999，MoLCell Biol., 19: 1569-81)的質粒。shRNA 篩選經由馬薩諸塞大學醫(yī)學院ShRNA文庫核心設備獲得人ShRNAmir文庫(釋放 (release) 1.20 ； Open Biosystems)。以約 2.6X 105pfu/ml 的滴度產生 10 種逆轉錄病毒集 合，各包含約6000個shRNA克隆。共轉染入PhoenixGP3包裝細胞系中后產生這些逆轉錄病毒原液(Grignani，1998，Cancer Res.，58: 14-19)。在IOOmm平板中用逆轉錄病毒原液以MOI為0.2轉導PFF成纖維細胞(1.2X106)，并在2天后選擇對嘌呤霉素(1.5 μ/ gml)的抗性達7天。然后在所有細胞均被感染的條件下(MOI 20)用攜帶BRAFV600E的 逆轉錄病毒感染細胞。繞過BRAFV600E誘導的細胞增殖阻斷的細胞形成集落，將其合并 并擴充，并通過序列分析來鑒定shRNA。為了鑒定候選shRNA，對轉導病毒的shRNA區(qū) 進行 PCR 擴增(使用弓 I 物 PSM2-正向，5，-GCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3，(SE Q ID NO 8)禾口 PSM2-反向，5，-GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC—3，(SEQID NO 9))，并克隆入pGEM-T Easy (Promega)中。每種集合對平均48個克隆進行測序(使用 引物 PSM2-seq，5，-GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3，(SEQ IDNO 10))。如下產生 各種PFF或黑素細胞敲除細胞系，即用針對候選基因的單一 shRNA穩(wěn)定轉導6 X IO4個細 胞，接著用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染。自Open Biosystems文庫獲得或合成各種 ShRNA0定量實時RT-PCR逆轉錄病毒轉導和嘌呤霉素選擇后7天，使用TRIZ0L3 (Invitrogen)分離總 RNA。使用SuperScript3 II逆轉錄酶(Invitrogen)依照制造商的指令實施逆轉錄，接著 使用具有 Rox 的 Platinum SYBR3Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen)來進行定量實時 PCR。增殖測定法對于圖IB中所顯示的增殖測定法，將穩(wěn)定表達ShRNA的1 X IO4個細胞在12孔 平板形式中培養(yǎng)，用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染，并在14天后用結晶紫染色。對 于所有其它定量增殖測定法，在相關圖例中指定的時間點通過錐蟲藍排除測試來測量細 胞成活力。數值表示為百分比細胞生長，如相關圖例中所描繪的。對于圖2A中所顯示 的增殖測定法，每3天補充CM，并在CM處理總共14天后測量增殖。除非另有說明， 以10 μ g/ml的濃度將rIGFBP7添加至培養(yǎng)基。凋亡測定法用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染PFF成纖維細胞或黑素細胞或shRNA敲除 衍生物(5 X IO5個細胞)，并在4天后在膜聯蛋白V-PE (BDBiosciences)方面對總細胞群 體染色。為了在rIGFBP7處理后監(jiān)測黑素瘤細胞中的凋亡，用rIGFBP7 (10 μ g/ml)處理 5X IO5個細胞達24小時，并在膜聯蛋白V-PE方面染色。DNA復制測定法用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染PFF成纖維細胞或黑素細胞或shRNA敲除 衍生物(5 X IO5個細胞)，并在約4天后在BrdU摻入方面對總細胞群體染色。簡言之， 用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染4天的末期前4小時，將細胞與20 μ M BrdU (Sigma) 一起溫育以容許BrdU摻入，在該點在70%乙醇中固定細胞，使用0.2% Triton3X-100透 化，用2N HCl處理，并使用a-BrdU抗體(Ab-3，Oncogene)來探查，然后使用抗小鼠 IgG德克薩斯紅偶聯的抗體(Calbiochem)來檢測所述a_BrdU抗體?？贵w和免疫印跡分析為了制備細胞提取物，在Laemmli緩沖液中溶解細胞；對于磷酸-蛋白質， 在存在磷酸酶抑制劑混合物(Sigma)的情況中溶解細胞。為了制備條件化培養(yǎng)基，在Opti-MEM3 (Invitrogen)中培養(yǎng)細胞達24小時，收獲培養(yǎng)液，并使用Centricon3Plus 20 管(Millipore)來濃縮。相對于細胞數目標準化條件化培養(yǎng)液，之后加載凝膠。對于 圖3D和圖4C中所顯示的實驗，以lOyg/ml的濃度將rIGFBP7添加至培養(yǎng)基。對于 圖 4D 的 MEK/RAF 抑制劑實驗，用 2 μ g/ml 或 10 μ g/ml rIGFBP7、20 μ M 或 40 μ M MEK 抑制劑 PD98054 (Calbiochem)、或者 5ηΜ 或 IOnM RAF 抑制劑 GW5074 (Sigma)處 理SKMEL-28細胞達24小時，之后收獲細胞。通過SDS-PAGE溶解蛋白質，并轉移 至硝化纖維素。用下列抗體探查印跡a-p16(Abcam)、α -乙?；疕3K9 (Upstate)、 α-IGFBP7 (SantaCruz)、 α-SMARCB1 (Abnova)、 α -BNIP3L (Proscience) > α -BRAFV600E (SantaCraz)、α -切割的胱天蛋白酶 _3pl 1 (Santa Cruz)、α - β -肌動蛋 白(Sigma)、α -磷酸-ERK (Cell Signaling)或 α -ERK (Cell Signaling)。重組IGFBP7表達和純化使用BaC-to-BaC3桿狀病毒表達系統(tǒng)(Invitrogen)依照制造商的指令，使用表 達帶有C端Flag標簽的融合蛋白的人IGFBP7表達載體pFASTBAC_l/IGFBP7 (Oh等， 1996，J.Biol.Chem., 271 30322-25)來生成重組桿狀病毒。然后將重組桿狀病毒構建體 轉染入Sffi細胞(Invitrogen)中進行桿狀病毒生成，并進行擴增以生成重組IGFBP7蛋白。 收集來自IGFBP7表達Sffi細胞的條件化培養(yǎng)基，與I-Flag M2珠(Sigma) —起溫育，并 使用I-Flag肽洗脫結合的蛋白質。衰老有關的β -半乳糖苷酶測定法用PBS清洗用表達載體或BRAFV600E的逆轉錄病毒感染的黑素細胞，或用 BRAFV600E/黑素細胞CM或rIGFBP7 (10 μ g/ml)處理14天的黑素細胞兩次(于室 溫5分鐘)，用3%甲醛固定(于室溫5分鐘)，并用PBS再清洗三次。然后將細胞在 SA- β -Gal染色溶液(lmg/mL X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚b_D_半乳糖苷)、40mM檸 檬酸/磷酸鈉(pH6.0)、5mM亞鐵氰化鉀、5mM鐵氰化鉀、150mMNaCl和2mM MgCl2) 中于37°C (0% CO2)溫育過夜。用PBS清洗細胞，并在ZeissAxiovert3 40CFL顯微鏡上 顯現。使用QCapture3Pro第5版軟件(QImagingCorporation)捕捉圖像。ChIP 測定法使用rIGFBP7處理后24小時制備的提取物來實施染色質免疫沉淀(ChIP)測定 法。使用下列抗體α-BRGl(de La Serna 等，2000，Mol.Cell.Biol.，20:2839-51)、 α-磷酸-STATl (Upstate)、及 α-SMARCB1 禾Π α-STATl (SantaCraz)。對于對 SMARCB1啟動子的ChIP實驗，使用跨越位于轉錄起始位點上游約2.4kb的STATl結合位 點的引物。對于對BNIP3L啟動子的ChIP實驗，使用一系列覆蓋約2kb BNIP3L啟動子 的引物對；添加rIGFBP7后，SMARCB1和BRGl被募集至轉錄起始位點附近的BNIP3L 啟動子。通過使用具有 Rox 的 Platinum SYBR3Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen)進 行的定量實時PCR來分析ChIP產物。如先前所描述的那樣完成倍數差異的計算(Pfaffl， 2001，Nucleics Acids Res.，29: e45)。腫瘤形成測定法將5 X IO6 個 SK-MEL-28 或 SK-MEL-31 細胞在 100 μ 1 無血清 DMEM 中懸浮， 并皮下注射入無胸腺Balb/c (nu/nu)小鼠(Taconic)的右體側中。3天、6天、和9天 后，在腫瘤位置給小鼠注射總體積100 μ 1中的20 μ g rIGBP7或作為對照的PBS。每三天測量腫瘤尺寸，并使用公式η /6X (長度)X (寬度)2計算腫瘤體積。對于系統(tǒng)施用 實驗，將5X IO6個SK-MEL-28或SK_MEL_31細胞注射入裸鼠的體側中，并在腫瘤達到 IOOmm3的大小時，在第6天、第9天、和第12天時通過尾靜脈注射投遞總體積100 μ 1中 的100 μ g rIGFBP7。每三天測量腫瘤尺寸。依照實驗動物管理和使用委員會(Institutional Animal Care and UseCommittee, IACUC)準則來實施動物實驗。免疫組織化學本研究得到UMass醫(yī)學中心機構審查委員會(Medical Center institutionalreview board)批準。從UMass醫(yī)學中心，Worcester，MA的病理學文件檢索來自正常皮膚(η
=5)、痣(η = 20)和惡性黑素瘤(原發(fā)性(η = 7)和轉移性(η = 13))的檔案材料。 再檢查所有病例的組織學切片，并由皮膚病理學家確認診斷。將所有患者數據脫鑒定 (de-identify)。切出5微米厚的切片用于免疫組織化學研究，其使用標準技術用熱誘導性表位 恢復緩沖液和針對IGFBP7的一抗(1 20稀釋；Santa Cruz)來實施。合適的陽性和陰性 對照包括在內。通過確定胞質中的IGFBP7表達來記錄正染色。沒有記錄顯著的細胞核 染色。由皮膚病理學家檢查所有經過染色的載玻片。使用加有40μ1/ιη1的20mg/ml蛋白 酶 K 和 4μ1/ιη1 的 0.1MDTT 的 ISS 緩沖液(20XSSCpH7.0、3M NaCL 0.3M 檸檬酸鈉、 IMNaCL和10% SDS)自十份10 μ m厚的切片分離用于基因型分型的基因組DNA。簡 言之，自載玻片刮下組織樣品，并于ere在具有蛋白酶κ和DTT的iss緩沖液中溫育過 夜。第二天，用酚-氯仿提取樣品兩次(第二輪使用Phase Lock Gel (Eppendorf))，然后 使用乙醇沉淀樣品。定量基因組DNA，并通過凝膠電泳，接著進行PCR擴增和TA克隆 (Promega)來檢查其完整性。對多個克隆測序以鑒定BRAF基因的外顯子15中的V600E 突變(T1796A)(引物正向引物5，-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3‘ (SEQ ID NO 11)，反向引物5，-GGCCAAAATTTAATCAGTGGA-3 ‘ (SEQ ID NO 12))。亞硫酸氫鹽測序基本上如所描述的那樣實施亞硫酸氫鹽修飾(Frommer等，1992，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，89 1827-31)，只是在亞硫酸氫鹽處理(在黑暗中實施)過程中以 125mM的濃度使用氫醌，并在亞硫酸氫鹽反應后在QIAQUICK3柱(Qiagen)上對DNA脫 鹽。為每種細胞系或人組織樣品測序6個克隆。對于5-氮雜-2’ -脫氧胞苷酸(5-aza) 處理，用10 μ M 5-aza(Calbiochem)處理黑素瘤細胞系達48小時。實施例1 全基因組ShRNA篩選鑒定BRAFV600E介導的衰老和凋亡所需要的因 ±為了鑒定BRAFV600E阻斷原代細胞增殖所需要的基 因，實施全基因組小發(fā)夾 RNA(shRNA)篩選(圖IA中示意性顯示)。在人原代包皮成纖維細胞(PFF)中實施初 次篩選。將包含針對約28,000種基因的約62,400種shRNA的人shRNA文庫分成10個 集合，其被包裝入逆轉錄病毒顆粒中，并用于穩(wěn)定轉導PFF。然后在所有細胞均被感染 的條件下用表達BRAFV600E的逆轉錄病毒感染細胞。繞過BRAFV600E誘導的細胞增殖 阻斷的細胞形成集落，將其合并和擴充，并通過序列分析來鑒定shRNA。如下確認陽性 候選物，即用針對候選基因的單一shRNA穩(wěn)定轉導PFF，用BRAFV600E表達逆轉錄病毒感染，并定量細胞增殖。然后在二次篩選中對確認的候選ShRNA測試其在BRAFV600E表達原代人黑素細胞中繞過增殖阻斷的能力。篩選鑒定出17種基因，它們在ShRNA介導的敲除后使BRAFV600E表達 PFF (BRAFV600E-PFF)和黑素細胞(BRAFV600E黑素細胞)能夠增殖。表1中列出了 這些基因，并在圖IB中顯示了 17種BRAFV600E-PFF敲除(KD)細胞系的增殖測定法。 如自先前的研究預期的(Zhu等，1998，Genes Dev., 12: 2997-3007)，BRAFV600E在含 有對照非沉默(NS) ShRNA的PFF (BRAFV600E-PFF-NS)中的表達有效抑制細胞增殖(圖 1B)。顯著地，然而，此阻斷在所有17種BRAFV600E-PFFKD細胞系中均被克服。定 量實時RT-PCR(qRT-PCR)在所有情況中確認，靶基因的表達在相應的PFF和黑素細胞 KD細胞系中是降低的。對于所有17種基因，針對同一靶基因的第二種無關ShRNA也使 PFF能夠在BRAFV600E表達后增殖。表1.BRAFV600E誘導的對細胞增殖的阻斷所需要的基因
權利要求
1.一種治療受試者中的腫瘤的方法，該方法包括鑒定患有、有風險患有、或懷疑患有腫瘤的受試者；測定所述腫瘤的細胞是否具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生長和/或 存活是否依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或是否表達活化的或致癌性的 BRAF 或 RAS ；禾口若所述腫瘤具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS，則對 所述受試者施用有效量的IGFBP7劑，由此治療腫瘤。
2.權利要求1的方法，其中所述腫瘤是癌癥。
3.權利要求2的方法，其中所述癌癥是黑素瘤。
4.權利要求2的方法，其中所述癌癥是癌瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結腸癌、結 腸直腸癌、或乳頭狀甲狀腺癌。
5.權利要求2的方法，其中所述癌癥表達活化的或致癌性的BRAF或RAS。
6.權利要求2的方法，其中所述活化的或致癌性的BRAF是BRAFV600E。
7.權利要求1的方法，其中所述致癌性的BRAF是BRAFV600E。
8.權利要求1的方法，其中所述IGFBP7劑包含與SEQID NO 1或SEQID NO 7 具有至少80%同一性的多肽。
9.權利要求8的方法，其中所述多肽與SEQID NO: 1或SEQ ID NO : 7具有至少 85%同一性。
10.權利要求8的方法，其中所述多肽是與異源部分偶聯的。
11.權利要求10的方法，其中所述異源部分是異源多肽序列。
12.權利要求1的方法，其中所述IGFBP7劑由與SEQID NO 1或SEQ IDNO 7具 有至少80%同一性的多肽構成。
13.權利要求12的方法，其中所述多肽與SEQIDNO : 1或SEQ ID NO : 7具有至少 85%的同一性。
14.權利要求1的方法，其中所述IGFBP7劑包含SEQIDNO:1的功能性片段或域。
15.權利要求1的方法，其中通過向所述受試者導入編碼與SEQID NO 1或SEQ ID NO 7具有至少85%同一性的多肽的核酸來施用所述IGFBP7劑。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸在病毒載體中。
17.權利要求16的方法，其中所述病毒載體是腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒、或 慢病毒載體。
18.權利要求1的方法，其中表面、系統(tǒng)、或局部施用所述IGFBP7齊IJ。
19.權利要求18的方法，其中通過藥物釋放植入物局部施用所述IGFBP7劑。
20.一種抑制具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于 Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS的細胞 增殖的方法，該方法包括給所述細胞施用有效量的IGFBP7劑。
21.權利要求20的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。
22.IGFBP7劑在制備用于治療受試者中的腫瘤的藥物中的用途。
23.權利要求22的用途，其中所述腫瘤是黑素瘤。
24.權利要求22的用途，其中所述腫瘤具有增強Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導、生 長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或表達活化的或致癌性的 BRAF 或 RAS (例如 NRAS)。
25.—種診斷黑素細胞皮膚損傷的方法，該方法包括 獲得黑素細胞皮膚損傷的樣品；測定所述樣品中的IGFBP7表達；并 測定所述樣品是否含有活化的BRAF或RAS ；其中若所述樣品表達IGFBP7并含有活化的BRAF或RAS，則所述損傷被診斷為黑素 細胞痣，其中若所述樣品不表達IGFBP7但含有活化的BRAF或RAS，則所述損傷被診斷為黑素瘤，且其中若所述樣品表達IGFBP7但不含活化的BRAF或RAS，則所述損傷被診斷為黑素瘤。
26.權利要求25的方法，其中所述樣品是細胞。
27.權利要求25的方法，其中所述表達是mRNA表達。
28.權利要求25的方法，其中所述表達是蛋白質表達。
29.—種治療受試者中的黑素瘤的方法，該方法包括 鑒定患有、有風險患有、或懷疑患有黑素瘤的受試者；并 對所述受試者施用有效量的IGFBP7劑，由此治療所述黑素瘤。
30.權利要求29的方法，其中所述IGFBP7劑是包含與SEQIDNO:1或SEQ ID NO 7具有至少80%同一性的多肽的組合物。
全文摘要
治療受試者中的腫瘤的方法包括鑒定患有、有風險患有、或懷疑患有腫瘤的受試者，并且若所述腫瘤具有增強的Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導，生長和/或存活依賴于Ras-BRAF-MEK-Erk信號傳導途徑、和/或表達活化的或致癌性的BRAF或RAS，則對所述受試者施用有效量的IGFBP7劑。
文檔編號G10K15/02GK102016980SQ200880112853
公開日2011年4月13日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權日2007年9月11日
發(fā)明者納倫德拉·瓦加佩耶, 邁克爾·格林 申請人:馬薩諸塞大學