專利名稱：用蛋白指紋法檢測結(jié)直腸癌在血液中蛋白指紋的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法，具體指用于生物樣品分析的蛋白指紋法。本發(fā)明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組并采用計算機(jī)可讀取的條碼格式(蛋白指紋)分析的蛋白指紋法。
背景技術(shù)：
不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行定性鑒定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內(nèi)等電點聚焦先分離蛋白質(zhì)，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行第二次分離。結(jié)果得到一張根據(jù)等電點范圍(凈電荷)和大小(質(zhì)量)來區(qū)分蛋白質(zhì)的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征一質(zhì)量和等電點(pI)。其次，各維度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質(zhì)量差異小于5％或pI差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達(dá)的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據(jù)多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而費(fèi)時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質(zhì)譜的方法測定蛋白質(zhì)是較新的方法，但目前的質(zhì)譜分析方法只能對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，無法進(jìn)行定量分析，尤其在是樣品中混合物復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量極小的情況下。
滯留層析法是上世紀(jì)90年代開發(fā)的一種新的生物分析方法(Singh TK，F(xiàn)ox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人將其用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究中。滯留層析中先將待測樣品與選定的吸附劑結(jié)合，然后檢測滯留在吸附劑上的分析物。與常規(guī)層析不同，進(jìn)行滯留層析時無需將分析物先從吸附劑上洗脫，而是直接進(jìn)行檢測。其優(yōu)點是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。但目前未見到文獻(xiàn)有用滯留層析法進(jìn)行蛋白指紋鑒定分析。
蛋白指紋技術(shù)最早源于馬鈴薯/土豆品種鑒定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。當(dāng)時用電泳技術(shù)來區(qū)別分不同品種土豆。因為不同品種的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合。由于人體細(xì)胞蛋白比土豆要復(fù)雜的多，故僅用電泳來鑒別疾病的蛋白指紋遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人細(xì)胞、結(jié)直腸癌患者細(xì)胞及結(jié)直腸息肉病患者細(xì)胞在血液中蛋白指紋用途的新方法。
本發(fā)明采用蛋白指紋法對蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒別。
蛋白指紋法是通過鑒別檢測特定的蛋白質(zhì)組用于疾病診斷。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)的定義是研究一組蛋白質(zhì)在細(xì)胞終身表達(dá)的變化狀態(tài)。蛋白質(zhì)組學(xué)的目的之一是鑒定和描述由于不同細(xì)胞差異表達(dá)的有機(jī)生物分子。通過比較表達(dá)情況可以鑒定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別。鑒別出可作為某種疾病標(biāo)志的蛋白質(zhì)組，可用于該疾病的診斷及治療藥物的篩選。
本發(fā)明所述的鑒別檢測蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。
本發(fā)明用滯留層析法從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出并捕獲到用于檢測的蛋白質(zhì)組。滯留層析法是將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測系統(tǒng)所無法達(dá)到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細(xì)胞或組織液提取物中差異表達(dá)的蛋白質(zhì))。根據(jù)吸附劑/洗脫劑組合的化學(xué)特性測定包括分子量在內(nèi)的理化特征的蛋白質(zhì)。詳述本方法如下I 吸附劑包含陰離子，陽離子，親水，疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì)，配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基)。更具體的說，可以開發(fā)出化學(xué)生物特異性吸附劑以檢測重要的診斷標(biāo)記。在某實施例中，基質(zhì)可具有為診斷疾病或綜合征所用標(biāo)記組合而選用的吸附位點排列。
II 信息處理在特定洗脫條件下檢測被吸附結(jié)合的分析物提供了有關(guān)樣品中分析物及其化學(xué)特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結(jié)合特性。與吸附劑結(jié)合的分析物具有使得結(jié)合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結(jié)合。強(qiáng)陽離子分子只有在很強(qiáng)的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結(jié)合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結(jié)合所需的相應(yīng)化學(xué)特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學(xué)特性的一類或單一分析物。采集有關(guān)分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細(xì)分辨混合物中的分析物，而且提供有關(guān)分析物的化學(xué)信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數(shù)據(jù)被稱為“滯留數(shù)據(jù)”。
用可編程計算機(jī)分析滯留試驗得出的數(shù)據(jù)是最簡單的。計算機(jī)程序一般包括一個儲存編碼的可讀介質(zhì)。某計算機(jī)編碼進(jìn)入存儲，其中包含了基質(zhì)陣列上各種征點的位置，該處的吸附和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某選擇性的一組特征。計算機(jī)還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號強(qiáng)度數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)指示所測分析物的數(shù)量，可能包括所測各分析物的信號強(qiáng)度和測得的分子量。
計算機(jī)還具有處理數(shù)據(jù)的編碼。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特征概況。例如，可將據(jù)分子量測得的特定分析物的滯留數(shù)據(jù)根據(jù)特定的結(jié)合特性(例如與陰離子吸附劑)分類。收集到的數(shù)據(jù)提供某特定分析物化學(xué)特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結(jié)構(gòu)。例如，根據(jù)不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數(shù)據(jù)所揭示的信息可以得出某蛋白質(zhì)的等電點。這進(jìn)而反映出該蛋白質(zhì)內(nèi)離子氨基酸的大致數(shù)量。所以，計算機(jī)可能包含將結(jié)合信息轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)信息的編碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識別特征，這可以由結(jié)合或質(zhì)量差異反映出來。
得出的數(shù)據(jù)即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號強(qiáng)度顯示成分子量的函數(shù)圖。另一種格式又稱“條碼格式”，其中，信號強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示，得出外觀類似商場上所用條碼帶讀取商品名稱。
III 滯留層析涉及多種分離方法的組合，包括并行檢測和描述多種分析物。這些組合方法具有多種用途。發(fā)展靶分析物檢測法；差異蛋白質(zhì)展示；毒理學(xué)篩選；多種診斷標(biāo)記的同時檢測；藥物開發(fā)。
實施例對該方法進(jìn)行了詳細(xì)的描述。細(xì)胞樣品通常包含數(shù)以百千計的蛋白質(zhì)。人們可能希望準(zhǔn)確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，吸附劑可以是陰離子交換劑。
從該滯留圖可以挑選出至少一種靶分析物被保留的選擇條件?？梢蕴暨x靶分析物發(fā)生最大結(jié)合的選擇性條件。但是，如果該選擇性條件對靶分析物的選擇性比其他選擇性條件更強(qiáng)，則宜選擇靶分析物吸附并非最大的條件。例如，假設(shè)滯留圖分析顯示，在中性pH附近，靶分析物被陰離子交換保留，但也弱吸附于親水性吸附劑。
IV 鑒定生物材料間差異表達(dá)的分析物的方法本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了鑒定在兩種以上樣品中差異表達(dá)的有機(jī)生物分子，特別是蛋白質(zhì)的方法。“差異表達(dá)”指兩樣品間分析物量或質(zhì)上的差異。這些差異可能緣于蛋白質(zhì)表達(dá)的任一階段，該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組選擇性條件制備的分辨率越高，所以，可比較的分析物數(shù)量也越多。然后，比較識別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達(dá)的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。差異滯留還包括分析物質(zhì)的差異。例如，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現(xiàn)為結(jié)合特性差異(例如，如果蛋白質(zhì)被糖基化與凝集素結(jié)合將不同)或質(zhì)量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計算機(jī)進(jìn)行。
該方法特別適用于檢測兩種細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白。兩種細(xì)胞可以是正常細(xì)胞和病理細(xì)胞例如癌細(xì)胞，或不同水平的細(xì)胞，或不同發(fā)育或分化階段的細(xì)胞，或細(xì)胞周期內(nèi)不同部分的細(xì)胞。但是。該方法也可用來檢測不同條件下的同種細(xì)胞。在這樣的方法中，一份生物樣品與測試試劑接觸，另一份不接觸。然后，比較兩者的滯留圖。根據(jù)滯留特性或質(zhì)量的不同，該方法可以顯示蛋白質(zhì)或其他生物分子表達(dá)的增加或減少，或發(fā)生了某種改變。
利用滯留圖獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)理化特性信息，用本發(fā)明方法可測定蛋白質(zhì)的候選特征。
本方法適用于鑒定疾病的診斷標(biāo)記。與正常樣品或細(xì)胞相比，患者樣品或病理培養(yǎng)細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能就是診斷標(biāo)記。
V 通過分解代謝信號擴(kuò)增提高靈敏度將大蛋白分裂成小片段然后檢測這些小片段能夠顯著提高檢測大蛋白在復(fù)雜混合物差異存在(例如，因為差異表達(dá))的靈敏度。靈敏度的提高有幾個原因。首先，當(dāng)樣品中所有蛋白質(zhì)都被(例如)酶解而片段化時，大蛋白可能產(chǎn)生更多片段而不是小蛋白。其次，解吸譜法的整體靈敏度在低分子量時高于高分子量時。第三，蛋白片段化增加了來自靶分析物的信號數(shù)量，因此提高了測得分析物的可能性。第四，蛋白片段化提高了捕獲可能性，因此提高了測得靶分析物的可能性。第五，如果蛋白質(zhì)在兩種樣品中差異存在，那么通過增加來自該蛋白的信號數(shù)量，量的差異更可能被測得。
人體內(nèi)的疾病蛋白標(biāo)志物往往會受血液中酶的降解。這樣，我們就可以用滯留層析法來捕獲這種分解代謝信號，從而提高蛋白指紋的靈敏度。滯留層析分辨的分析物的具體實例包括生物大分子，例如肽，蛋白質(zhì)，酶，糖，寡糖，多糖；上述生物大分子的片段，例如肽片段和蛋白質(zhì)片段；上述生物大分子復(fù)合物，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，受體-配體復(fù)合物，酶-底物，酶抑制劑，肽復(fù)合物，蛋白質(zhì)復(fù)合物，糖復(fù)合物和多糖合物；生物小分子，例如氨基酸，藥物，激素，合成小分子，例如藥學(xué)或治療上的有效藥物。
本發(fā)明提供一種統(tǒng)一的操作系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)功能，細(xì)胞功能和生物整體功能的發(fā)現(xiàn)和診斷。
更具體的說，根據(jù)分析物在至少兩種不同選擇條件下吸附固定相的能力(例如陰離子/陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質(zhì)譜)根據(jù)質(zhì)量在第二維度上分離分析物，進(jìn)一步檢測已分離的分析物。分析物所吸附的性質(zhì)提供了分析物的物理化學(xué)信息。
在實施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。III)檢測步驟包括用激光解吸質(zhì)譜測定分析物的質(zhì)量。
洗脫條件的差異在于pH，緩沖能力，離子強(qiáng)度，水結(jié)構(gòu)特征，除垢劑種類，除垢劑強(qiáng)度，疏水性或介電常數(shù)。
本發(fā)明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否差異存在(例如差異表達(dá))的方法。該方法可以用于通過差異蛋白質(zhì)展示檢測差異蛋白表達(dá)的組合方法。該方法包括A)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；B)測定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和C)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在。
實施例之一是測定某種蛋白是否在兩種不同樣品，包含細(xì)胞的第一和第二樣品或來自細(xì)胞的材料中差異表達(dá)。在實施例中，第一生物樣品來自健康者，第二生物樣品來自某種病癥的患者。樣品可選自例如血液，尿液，血清和組織。以在患者樣品中增加的分析物作為侯選診斷標(biāo)記。通常，確認(rèn)一種診斷標(biāo)記需在多個受試者中檢測到該標(biāo)記物。
本發(fā)明在可分析的樣品類型上沒有限制。本發(fā)明特別適用于分辨生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物；還特別適用于分辨非生物有機(jī)組合物中的分析物，尤其是有機(jī)分子和無機(jī)分子的組合物。
滯留層析及蛋白指紋方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的滯留層析及蛋白指紋方法的一個操作方案實例。
1.樣品處理將生物樣品稀釋在溶液中。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點樣在基質(zhì)(包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑)一個位點上。
3.洗滌用結(jié)合溶劑洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μL洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)幾次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μL洗滌液重復(fù)以上步驟。
用水徹底洗滌整個陣列。
自然干燥芯片。
加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。
自然干燥芯片。
用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀用氮激光儀(335nm)和80cm飛行管分析陣列分析滯留與各位點的蛋白質(zhì)。用計算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
本發(fā)明滯留層析及蛋白指紋法可用于細(xì)胞和臨床疾病的診斷，如腫瘤的診斷。
本發(fā)明提供的方法的特點為(1)準(zhǔn)確滯留層析的一個特點是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，滯留層析可提供有關(guān)滯留分析物化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。
滯留層析與常規(guī)層析存在以下區(qū)別。首先，滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規(guī)層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進(jìn)行檢測。用常規(guī)方法檢測不出吸附劑上洗脫下的分析物。第二，吸附層析與解吸質(zhì)譜檢測相結(jié)合提供了毫微微摩爾級的優(yōu)良靈敏以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因為允許直接檢測分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度描述。第四，吸附劑可以于預(yù)先確定的排列，可定址位置附著于基質(zhì)上。這就能夠?qū)υ诓煌疵摋l件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點”)的分析物進(jìn)行并行處理。
質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的準(zhǔn)確性，一般誤差率只有0.1-1.0Da。例如，檢測出8131Da及8221Da被配位共價金屬螯合劑表面的基質(zhì)所捕捉的蛋白，由于質(zhì)譜差率只有0.1-1.0Da，蛋白8131Da及8221Da不可能是一種蛋白質(zhì)。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的而氨基酸的平均質(zhì)量為100Da，因此，必須有50Da以上的差距，才可能是第二種蛋白質(zhì)。
(2)方便本方法將血清蛋白分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。
(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行疾病血清診斷時，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。本發(fā)明采用了計算機(jī)“條碼格式”，信號強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示。此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強(qiáng)弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此“蛋白指紋”或條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析。
我國結(jié)直腸癌發(fā)病率已上升為腫瘤發(fā)病率第三位，據(jù)統(tǒng)計約有1/3的患者治療時已屬晚期，五年生存率為50％，其原因是無特異性高的早期診斷方法，因此從血清中尋求特異生物標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的診斷是臨床急需解決的難題。因此尋求結(jié)直腸癌的早期診斷的特異方法是目前臨床急待解決的難題。本研究利用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)特異生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)分析方法，對結(jié)直腸癌患者與正常人的血清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，對比，篩選，可用于臨床結(jié)直腸癌早期診斷。
具體實施例方式
實施例1 正常人細(xì)胞、結(jié)直腸癌患者細(xì)胞及結(jié)直腸息肉病患者細(xì)胞在血液中蛋白指紋的區(qū)分(1)實驗方法一、材料1.標(biāo)本來源結(jié)腸癌患者組有146例結(jié)直腸癌患者，均經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌，其中Dukes A期20例，Dukes B，Dukes C，Dukes D期共126例。正常人組有62例正常人。結(jié)直腸良性病對照組有32例結(jié)直腸良性病患者，其中結(jié)直腸腺瘤10例，家族性多發(fā)性息肉病6例，結(jié)直腸非腫瘤性息肉16例。三個組年齡均在40-60歲間，有相似的暴露史。男女比例結(jié)腸癌患者組為男性97例、女性49例。結(jié)直腸良性病組為男性21例、女性11例。正常人組為男性40例、女性22例。三組均無影響血清中蛋白質(zhì)含量的其它相關(guān)性疾病。
2.試劑Cibacron Blue、尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sinapinic acid)均購自Sigma公司。
二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于-70℃保存；2.樣品的準(zhǔn)備用Cibacron Blue除去人血清中的白蛋白，后取20μl，按1∶7用pH7.0緩沖液(100mmol/L磷酸鈉，250mmol/L氯化鈉)稀釋至150μl。
3.芯片的預(yù)處理配位共價金屬螯合劑作用吸附劑芯片每孔加50μl 100mmol/L硫酸銅，室溫下振蕩5min，倒除硫酸銅，用去離子水沖洗5次后甩干，每孔中加入50μl100mmol/L醋酸鈉(pH4.0)室溫下振蕩5min，以除去沒有結(jié)合的銅離子，芯片每孔加入150μl結(jié)合/洗脫緩沖液(50mmol/L HEPES pH7.0)，置于振蕩器上，室溫孵育5min后除去緩沖液，重復(fù)1次后，每孔加入50μl稀釋好的樣品，置于振蕩器上，4℃孵育60min后除去緩沖液，接著用150μl結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗3次，每次振蕩5min，最后1次用1mMHEPES pH7.0快速沖洗，取出芯片，在每孔周圍用疏水筆圈樣品孔并風(fēng)干，加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
4.芯片檢測用質(zhì)譜儀直接分析。結(jié)果用計算機(jī)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
5.CEA的檢測采用酶聯(lián)免疫法檢測。正常參考值＜5μg/L。
(2)實驗結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計算機(jī)讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿蛋白指紋著線性軸的暗度強(qiáng)度值信號，此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強(qiáng)弱。通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述10種蛋白指紋可以用于區(qū)分正常人細(xì)胞、結(jié)直腸癌患者細(xì)胞及結(jié)直腸息肉病患者細(xì)胞。
分析146例病人與62例正常人和32例結(jié)直腸息肉病患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4467±1Da，8131±1Da，8939±1Da，9000±1Da，9134±1Da，8221±1Da，5369±1Da，5928±1Da，8324±1Da，15122±1Da中10個蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將正常人與結(jié)直腸癌患者及結(jié)直腸息肉病患者準(zhǔn)確的分組。示意

圖1中8939Da蛋白質(zhì)含量差異正常人為8939Da蛋白質(zhì)含量明顯高于結(jié)直腸癌患者和結(jié)直腸息肉病患者，而結(jié)直腸癌患者又比結(jié)直腸息肉病患者要高。經(jīng)方差分析，三組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)(如圖1、表1)。
表1 三組在質(zhì)荷比為8939Da處蛋白質(zhì)的相對含量組別 例數(shù) 蛋白質(zhì)的相對含量(％)結(jié)直腸癌組146 3.53±2.32正常人組 62 32.15±3.79結(jié)直腸良性病組32 0.99±0.46注三組蛋白質(zhì)相對含量兩兩比較P≤0.01。
預(yù)測準(zhǔn)確率用統(tǒng)計學(xué)分析三組，結(jié)果顯示用這10個蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)142/146例結(jié)直腸癌患者與62/62例正常人及32/32例結(jié)直腸良性病患者被正確分組，準(zhǔn)確率為98.3％(236/240)。
敏感度和特異性146例患者中有142例患者被本方法診斷為結(jié)直腸癌患者，94例正常人及良性病患者均被本方法診斷為非結(jié)直腸癌患者。靈敏度為97.3％(142/146)，特異性為100％(94/94)。
本方法與病理結(jié)果的對比結(jié)果顯示146例結(jié)直腸癌患者中有4例被漏診，其Dukes B期2例，Dukes C期2例。
本方法與酶聯(lián)免疫法結(jié)果的對比用血清中癌胚抗原(CEA)做對照檢測，146例結(jié)直腸癌患者中有88例被診斷為結(jié)直腸癌患者，靈敏度為60.3％；94例非結(jié)直腸癌患者中22例被診斷為非結(jié)直腸癌患者，特異性僅為23.2％。
(2)結(jié)論將來自具有統(tǒng)計意義的患者群的樣品與正常樣品比較，用配位共價金屬螯合吸附劑-Cu(銅)芯片所捕獲的10種血清蛋白指紋，可以用于鑒別診斷。本研究利用配位共價金屬螯合劑-Cu芯片對146例確診為結(jié)直腸癌患者與62正常人血清和32例結(jié)直腸良性疾病患者血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)量4467Da至15122Da中的10個蛋白質(zhì)相對含量三組有明顯的差異，三組在質(zhì)量為8939Da的蛋白質(zhì)相對含量有明顯差異，并且10個蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為97.3％(142/146)，特異性為100％(94/94)。
用血清中癌胚抗原(CEA)做對照檢測，146例結(jié)直腸癌患者中有88例被診斷為結(jié)直腸癌患者，靈敏度為60.3％；94例非結(jié)直腸癌患者中22例被診斷為非結(jié)直腸癌患者，特異性僅為23.2％，對比本方法實驗結(jié)果，其靈敏度與特異性均不如本實驗所篩選的生物標(biāo)志物用于診斷的靈敏度及特異性高。血清中癌胚抗原的檢測對結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有重要意義，是作為臨床上觀察療效的指標(biāo)之一。
本實驗結(jié)果與病理結(jié)果對照顯示Dukes B、C期結(jié)直腸癌患者各僅有2例被漏診而無Dukes A期結(jié)直腸癌患者被漏診，表明此生物標(biāo)志物不僅可以用于中晚期結(jié)直腸癌的診斷，更具有意義的是可以準(zhǔn)確的診斷Dukes A期結(jié)直腸癌，為結(jié)直腸癌的普查提供了新的可靠的診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，這是目前最好的無創(chuàng)性診斷方法。
權(quán)利要求
1.一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分析方法，其特征是采用蛋白指紋法對樣品中蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒別檢測。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的鑒別檢測中蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，在滯留層析法中所用的吸附劑包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑。
4.用權(quán)利要求1的方法分析生物樣品中特異的蛋白質(zhì)組以檢測正常人細(xì)胞、結(jié)直腸癌患者細(xì)胞及結(jié)直腸息肉病患者細(xì)胞在血液中蛋白指紋的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析的蛋白指紋法。本方法用質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別檢測蛋白質(zhì)組。分析所得數(shù)據(jù)的形式是可用計算機(jī)讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發(fā)明的方法可用于檢測血液中正常人細(xì)胞、結(jié)直腸癌患者細(xì)胞及結(jié)直腸息肉病患者細(xì)胞的蛋白指紋。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。
文檔編號H01J49/02GK1595138SQ03156860
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者許洋, 高春芳 申請人:北京賽爾迪科技開發(fā)有限公司