專利名稱：貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體及制備方法，尤其是一種操作簡單、成本低、避免細(xì)胞形態(tài)變化、保證實驗效果的貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體及制備方法。
背景技術(shù)：
目前，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用掃描電鏡(電子顯微鏡)觀察貼壁細(xì)胞的表面形貌已非常普遍。由于掃描電鏡是利用細(xì)聚焦電子束在樣品表面掃描時激發(fā)出來的各種物理信號來調(diào)制成像的，因此必須將貼壁細(xì)胞制備成可供掃描電鏡觀察的載體，即貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體?，F(xiàn)有貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體大多是以玻璃載玻片為培養(yǎng)板，其制備方法基本上是將玻璃載玻片經(jīng)紫外線滅菌、多聚賴氨酸包被后放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度后，向培養(yǎng)皿中加入緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行清洗，然后再用PH7.2 1.4，濃度為2.5%的戊二醛固定細(xì)胞，再次對細(xì)胞進(jìn)行清洗之后，用不同濃度梯度的乙醇對細(xì)胞脫水、干燥及抽真空處理。將覆有細(xì)胞的玻璃載玻片取出，并通過導(dǎo)電膠層將玻璃載玻片固定在掃描電鏡樣品托上，從導(dǎo)電膠層側(cè)面引出一條導(dǎo)電條，將導(dǎo)電條的另一端置于細(xì)胞面上，用離子濺射鍍膜儀鍍導(dǎo)電層，使導(dǎo)電條的另一端與導(dǎo)電層固定相接。存在如下問題:
1.由于玻璃載玻片的細(xì)胞貼附性差，為提高細(xì)胞貼附性，培養(yǎng)之前必須對載波片進(jìn)行包被處理，費(fèi)時費(fèi)力；
2.玻璃載玻片經(jīng)過多次脫水及干燥處理后脆性增加，易斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化，尤其是可導(dǎo)致具有較長樹突的細(xì)胞樹突斷裂；同時細(xì)胞表面還會因脂類析出而覆蓋一層厚厚的被膜，使貼壁細(xì)胞的輪廓隱約顯現(xiàn)，嚴(yán)重時致使貼壁細(xì)胞皺縮、塌陷，所有現(xiàn)象均會影響實驗結(jié)果；
3.每次均需將覆有細(xì)胞層的玻璃載玻片從細(xì)胞培養(yǎng)皿中取出，因玻璃載波片與培養(yǎng)皿底面的貼合力大，故取出載波片較為艱難,容易在細(xì)胞面上產(chǎn)生劃痕；
4.難以區(qū)分細(xì)胞面與玻璃載玻片底面，有時會出現(xiàn)將細(xì)胞面朝下的玻璃載玻片固定在樣品托上的現(xiàn)象。TC 表面細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning tissue-culture treated culture dishes)是現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)器皿，是用透明的、具有一定韌性德純凈聚苯乙烯制造而成，內(nèi)表面共價結(jié)合水凝膠層，具有親水性和電荷中性，具有表面濕潤的持久性和細(xì)胞吸附的穩(wěn)定性，作為專用細(xì)胞培養(yǎng)器具，對細(xì)胞有很好的親和性。然而，迄今為止并沒有關(guān)于用TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿直接制備貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種尤其是一種操作簡單、成本低、避免細(xì)胞形態(tài)變化、保證實驗效果的貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體及制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體，有掃描電鏡樣品托，在掃描電鏡樣品托上通過導(dǎo)電膠層固定有TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板，在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板上覆有細(xì)胞層，細(xì)胞層上有導(dǎo)電膜，導(dǎo)電條跨接導(dǎo)電膜與導(dǎo)電膠層。一種所述貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行:
a.將細(xì)胞在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至所需密度；
b.用pH7.2 1.4、濃度為2.5%的戊二醛固定細(xì)胞；
c.用0.lmol/ L的PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，再用0.1mol /L的PBS緩沖液浸泡細(xì)胞12 15小時；
d.用IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次；
e.依濃度梯度從低到高向細(xì)胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，輕柔吹打3飛次，靜置10分鐘，IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次，直至最后一次加入叔丁醇；當(dāng)最后一次加入叔丁醇后直接在液氮環(huán)境下使叔丁醇結(jié)晶；所述濃度梯度為10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ；
f.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿置入真空機(jī)里抽真空；
g.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁剪去，并將覆有細(xì)胞層的培養(yǎng)皿的底板剪至電鏡觀察所需的大小及形狀并通過導(dǎo)電膠層將培養(yǎng)皿的底板固定在掃描電鏡樣品托上，從導(dǎo)電膠層側(cè)面引出一條導(dǎo)電條；
h.將導(dǎo)電條的另一端置于細(xì)胞層上，用離子濺射鍍膜儀鍍導(dǎo)電層，使導(dǎo)電條的另一端與導(dǎo)電層固定相接。本發(fā)明是直接用TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞并以覆有細(xì)胞層的TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板制備貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體，具有簡單、快捷、方便等優(yōu)點，具體如下:
1.由于TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿對細(xì)胞有很好的親和性，因此無需進(jìn)行包被處理，操作簡單，省時省力；
2.TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿具有一定韌性，雖經(jīng)過多次脫水及干燥處理也不易斷裂，避免因斷裂而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化，保證實驗效果；
3.以叔丁醇替代乙醇做脫水劑，不僅具有更好的脫水效果，而且叔丁醇可在液氮環(huán)境下形成結(jié)晶，以最大限度保持細(xì)胞的性狀，避免細(xì)胞形態(tài)在抽真空狀態(tài)下發(fā)生變化；
4.克服了將覆有細(xì)胞層的玻璃載玻片從細(xì)胞培養(yǎng)皿中取出所存在的技術(shù)缺陷；
5.由于最終是將剪去TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁且覆有細(xì)胞的的底板固定在樣品托上，細(xì)胞面便一目了然，不會出現(xiàn)將細(xì)胞面朝下固定在樣品托上的現(xiàn)象。


圖1是本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式依次按如下步驟進(jìn)行:
a.將細(xì)胞在35mmTC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至所需密度；
b.用pH7.2 1.4、濃度為2.5%的戊二醛固定細(xì)胞；
c.用0.lmol/ L的PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，再用0.1mol /L的PBS緩沖液浸泡細(xì)胞12 15小時；
d.用IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次； e.依濃度梯度從低到高向細(xì)胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，輕柔吹打:T5次，靜置10分鐘，IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次,直至最后一次加入叔丁醇；當(dāng)最后一次加入叔丁醇后就無需吹打、靜置，而是直接在液氮環(huán)境下使叔丁醇結(jié)晶；所述叔丁醇的濃度梯度為 10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ；
f.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿置入真空機(jī)里抽真空，抽出結(jié)晶的叔丁醇等；
g.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁剪去，并將覆有細(xì)胞層的培養(yǎng)皿的底板剪至電鏡觀察所需的大小及形狀并通過導(dǎo)電膠層將培養(yǎng)皿底板(細(xì)胞層朝上)固定在掃描電鏡樣品托上，從導(dǎo)電膠層側(cè)面引出一條導(dǎo)電條；
h.將導(dǎo)電條的另一端置于細(xì)胞層上，用離子濺射鍍膜儀鍍導(dǎo)電層，使導(dǎo)電條的另一端與導(dǎo)電層固定相接。 所生產(chǎn)的貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體如圖1所示，有掃描電鏡樣品托1，在掃描電鏡樣品托I上通過導(dǎo)電膠層2固定有TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板3，在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板3上覆有細(xì)胞層4，細(xì)胞層4上有導(dǎo)電膜5，導(dǎo)電條6跨接于導(dǎo)電膜5與導(dǎo)電膠層2。
權(quán)利要求
1.一種貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體,有掃描電鏡樣品托(I),其特征在于:在掃描電鏡樣品托(I)上通過導(dǎo)電膠層(2 )固定有TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板(3 )，在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板(3)上覆有細(xì)胞層(4)，細(xì)胞層(4)上有導(dǎo)電膜(5)，導(dǎo)電條(6)跨接導(dǎo)電膜(5)與導(dǎo)電膠層(2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行: a.將細(xì)胞在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至所需密度； b.用pH7.2 .4、濃度為2.5%的戊二醛固定細(xì)胞； c.用0.lmol/ L的PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，再用0.1mol /L的PBS緩沖液浸泡細(xì)胞12 15小時； d.用IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次； e.依濃度梯度從低到高向細(xì)胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，輕柔吹打3飛次，靜置10分鐘，IXPBS緩沖液清洗細(xì)胞I次，直至最后一次加入叔丁醇；當(dāng)最后一次加入叔丁醇后直接在液氮環(huán)境下使叔丁醇結(jié)晶；所述濃度梯度為10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ； f.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿置入真空機(jī)里抽真空； g.將TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁剪去，并將覆有細(xì)胞層的培養(yǎng)皿的底板剪至電鏡觀察所需的大小及形狀并通過導(dǎo)電膠層將培養(yǎng)皿的底板固定在掃描電鏡樣品托上，從導(dǎo)電膠層側(cè)面引出一條導(dǎo)電條； h.將導(dǎo)電條的另一端 置于細(xì)胞層上，用離子濺射鍍膜儀鍍導(dǎo)電層，使導(dǎo)電條的另一端與導(dǎo)電層固定相接。
全文摘要
本發(fā)明公開一種貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體，有掃描電鏡樣品托(1)，在掃描電鏡樣品托(1)上通過導(dǎo)電膠層(2)固定有TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板(3)，在TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板(3)上覆有細(xì)胞層(4)，細(xì)胞層(4)上有導(dǎo)電膜(5)，導(dǎo)電條(6)跨接于導(dǎo)電膜(5)與導(dǎo)電膠層(2)。其制備方法是直接用TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，以以叔丁醇替代乙醇做脫水劑，最終以覆有細(xì)胞層的TC表面細(xì)胞培養(yǎng)皿的底板制備貼壁細(xì)胞掃描電鏡載體，具有簡單、快捷、方便等優(yōu)點。
文檔編號H01J37/20GK103151231SQ20131003052
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者宋智琦, 李乃浩 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院