一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺，它包括：一真空腔室，一設(shè)置在真空腔室的一端的防污染系統(tǒng)適配接口，一設(shè)置在真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口，一設(shè)置在真空腔室的上壁面的上光學(xué)窗口，一設(shè)置在真空腔室的下壁面并與上光學(xué)窗口相對的下光學(xué)窗口，一設(shè)置在真空腔室的一側(cè)的真空系統(tǒng)適配接口，以及一設(shè)置在電鏡樣品桿適配接口與上、下光學(xué)窗口之間的真空閥；其中，真空閥與電鏡樣品桿適配接口之間構(gòu)成了一預(yù)真空通道，在預(yù)真空通道的一側(cè)設(shè)置有一預(yù)抽真空閥門；在電鏡樣品桿適配接口、上光學(xué)窗口、下光學(xué)窗口、真空系統(tǒng)適配接口和防污染系統(tǒng)適配接口處均設(shè)有真空密封圈。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于光電關(guān)聯(lián)成像領(lǐng)域，也可單獨(dú)應(yīng)用于光學(xué)顯微成像。
【專利說明】一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于光學(xué)成像【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是關(guān)于一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷 臺。

【背景技術(shù)】
[0002] 低溫電子顯微鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X射線晶體學(xué)、核磁共振譜學(xué)等已成為高分辨結(jié) 構(gòu)生物學(xué)研究最重要的實驗手段，越來越多的生物大分子結(jié)構(gòu)被陸續(xù)解析出來。然而，人們 最終目的是原位解析生物大分子及分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)，從而在分子、細(xì)胞器、細(xì)胞等不同層次 上闡述生命活動的本質(zhì)。
[0003] 近幾年，通過綜合突光蛋白標(biāo)記技術(shù)、突光顯微鏡技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)和低溫電 鏡電子斷層掃描技術(shù)，人們可以直接觀察目標(biāo)分子在細(xì)胞內(nèi)的定位和運(yùn)動，并解析出目標(biāo) 分子所在位置的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。隨著細(xì)胞生物學(xué)的深入發(fā)展，利用熒光顯微鏡和電子顯微 鏡對同一細(xì)胞內(nèi)同一位置的分子機(jī)器同時進(jìn)行高精度定位和高分辨率超微結(jié)構(gòu)的研究成 為非常有力的研究手段，這項技術(shù)稱為光電聯(lián)合顯微成像技術(shù)（Correlative Light and Electron Microscopy CLEM)。通過突光顯微技術(shù)對目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記定位，通過電鏡三維重構(gòu) 技術(shù)獲取細(xì)胞指定部位的三維結(jié)構(gòu)，將定位信息和結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行整合和處理，從而獲得大 量關(guān)于分子機(jī)器在細(xì)胞原位的三維結(jié)構(gòu)信息，并由此統(tǒng)計歸納出目標(biāo)分子機(jī)器原位動態(tài)變 化規(guī)律。
[0004] 目前，光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)的硬件實現(xiàn)主要有兩種方式：一種是光鏡電鏡一體化集 成系統(tǒng)，即在電鏡內(nèi)部集成光學(xué)成像模塊，其優(yōu)勢在于可實現(xiàn)生物樣品的原位光鏡、電鏡分 別成像甚至同時成像，光學(xué)成像與電鏡成像圖像匹配方便，避免了光鏡、電鏡間的樣品轉(zhuǎn)移 的繁瑣步驟及可能造成的樣品污染。然而由于透射電鏡物鏡極靴間的空間有限，對放入其 中的光學(xué)成像系統(tǒng)產(chǎn)生諸多限制，物鏡工作距離較大，難于獲得高分辨率熒光圖像。另外一 種較靈活的關(guān)聯(lián)方式是光鏡電鏡分體成像，在獨(dú)立的光學(xué)成像系統(tǒng)上搭載冷臺，完成低溫 熒光成像，再將樣品從冷臺轉(zhuǎn)移到低溫電鏡中成像。這種關(guān)聯(lián)方式的優(yōu)勢在于光鏡與電鏡 在硬件上互不限制，光學(xué)成像模式多樣，有利于實現(xiàn)更高分辨率的熒光定位。然而，現(xiàn)有的 低溫冷臺設(shè)計方案多是采用液氮（或低溫氮?dú)猓┝鲃又评?，液氮震動造成的樣品焦面漂?以及超低溫對物鏡的損壞都是影響該技術(shù)推廣普及的難題。同時，低溫樣品在光鏡成像和 到低溫電鏡的傳輸過程中面臨的易損壞、易污染也是一項重大挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于現(xiàn)有低溫透射電鏡和熒光顯微鏡成 像系統(tǒng)，用于實現(xiàn)光電關(guān)聯(lián)成像技術(shù)的高真空熒光顯微鏡低溫樣品觀察冷臺。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空 冷臺，其特征在于，它包括：一真空腔室，一設(shè)置在所述真空腔室的一端的防污染系統(tǒng)適配 接口，一設(shè)置在所述真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口，一設(shè)置在所述真空腔室的 上壁面的上光學(xué)窗口，一設(shè)置在所述真空腔室的下壁面并與所述上光學(xué)窗口相對的下光學(xué) 窗口，一設(shè)置在所述真空腔室的一側(cè)的真空系統(tǒng)適配接口，以及一設(shè)置在所述電鏡樣品桿 適配接口與所述上、下光學(xué)窗口之間的真空閥；其中，所述真空閥與所述電鏡樣品桿適配接 口之間構(gòu)成了一預(yù)真空通道，在所述預(yù)真空通道的一側(cè)設(shè)置有一預(yù)抽真空閥門；在所述電 鏡樣品桿適配接口、上光學(xué)窗口、下光學(xué)窗口、真空系統(tǒng)適配接口和防污染系統(tǒng)適配接口處 均設(shè)有真空密封圈。
[0007] 還包括一防污染系統(tǒng)，所述防污染系統(tǒng)包括：一通過所述防污染系統(tǒng)適配接口部 分伸入所述真空腔室1的導(dǎo)熱桿，一連接在所述導(dǎo)熱桿位于所述真空腔室內(nèi)的一端的金屬 冷盒，一連接在所述導(dǎo)熱桿位于所述真空腔室外的一端的導(dǎo)熱芯，以及一杜瓦罐；其中，所 述金屬冷盒與所述上、下光學(xué)窗口位置相對，所述金屬冷盒的上、下表面相對設(shè)置有一對通 光孔；所述杜瓦罐內(nèi)部形成充裝有液氮的液氮腔室，所述導(dǎo)熱芯設(shè)置于所述液氮腔室內(nèi)。
[0008] 所述導(dǎo)熱桿、金屬冷盒和導(dǎo)熱芯由紫銅或銀制成。
[0009] 本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明提供了一種能夠與低 溫透射電鏡樣品桿相適配的光學(xué)真空冷臺，其為樣品創(chuàng)造了一個真空環(huán)境，使得低溫樣品 在光學(xué)真空冷臺中完成光學(xué)成像后可快速轉(zhuǎn)移至透射電鏡中成像，由于本發(fā)明以真空環(huán)境 來代替現(xiàn)有技術(shù)中冷臺的液氮（或低溫氮?dú)猓┲评?，因此本發(fā)明冷臺能夠有效地避免液氮 (或氮?dú)猓┱饎釉斐傻臉悠方姑嫫埔约俺蜏貙ξ镧R的損壞，并且本發(fā)明在轉(zhuǎn)移過程中 無需直接觸碰樣品，可有效避免夾取樣品過程中載網(wǎng)形變、污染物污染以及樣品位置的移 動。2、本發(fā)明還提供了一套防污染系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在低溫樣品四周維持一個低溫環(huán)境，用 以吸附凝結(jié)光學(xué)成像過程中真空腔室內(nèi)的污染物，從而可以有效解決長時間光學(xué)成像過程 中低溫樣品的污染問題。3、本發(fā)明可以通過載物臺適配架方便地安裝在不同類型的光學(xué)顯 微鏡（不僅是普通正置或倒置熒光顯微鏡，也可用于光激活定位超分辨熒光顯微鏡等）上， 且可根據(jù)實際實驗需求實現(xiàn)光學(xué)物鏡外置工作模式，物鏡半嵌入式工作模式或者物鏡全嵌 入式工作模式，以適應(yīng)不同工作距離的光學(xué)物鏡成像。4、本發(fā)明涉及的電鏡樣品桿適配接 口可經(jīng)過適當(dāng)尺寸和形狀的調(diào)整應(yīng)用于不同型號的透射電子顯微鏡樣品桿甚至拓展到掃 描電子顯微鏡等。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于光電關(guān)聯(lián)成像領(lǐng)域，也可單獨(dú)應(yīng)用于光學(xué)顯微成像， 可以配合不同類型的樣品桿實現(xiàn)低溫、高溫、氣氛、液相等不同條件下成像。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明整體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0011] 圖2是本發(fā)明在物鏡內(nèi)置工作模式下的兩種結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012] 其中，圖2(a)表示本發(fā)明與物鏡的半封閉式連接關(guān)系；圖2(b)表示本發(fā)明與物鏡 的全封閉式連接關(guān)系。

【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0014] 實施例一：
[0015] 如圖1所示，本實施例包括一真空腔室1，真空腔室1的一端設(shè)置有一防污染系統(tǒng) 適配接口 2,另一端設(shè)置有一電鏡樣品桿適配接口 3。在真空腔室1上、下兩壁面相對設(shè)置 有一上光學(xué)窗口 4和一下光學(xué)窗口 5,上、下光學(xué)窗口 4、5可以通過螺栓固定連接的方式與 真空腔室1連接以方便拆卸。在真空腔室1的一側(cè)設(shè)置有一真空系統(tǒng)適配接口 6,其用于連 接為真空腔室1抽取真空的真空泵組。在位于電鏡樣品桿適配接口 3與上、下光學(xué)窗口 4、 5之間的真空腔室1內(nèi)設(shè)置有一真空閥7,真空閥7與電鏡樣品桿適配接口 3之間構(gòu)成了一 預(yù)真空通道，在預(yù)真空通道的一側(cè)設(shè)置有一預(yù)抽真空閥門8,其用于連接低級真空泵組。
[0016] 在本實施例中，電鏡樣品桿適配接口 3、上光學(xué)窗口 4、下光學(xué)窗口 5、真空系統(tǒng)適 配接口6和防污染系統(tǒng)適配接口2處均設(shè)有真空密封圈（設(shè)置方式為本領(lǐng)域常規(guī)手段）以 保證整個系統(tǒng)在工作過程中維持恒定的真空度。
[0017] 本實施例中所述的光學(xué)真空冷臺在使用時，可按照如下步驟進(jìn)行：
[0018] 1)將本實施例光學(xué)真空冷臺通過適配架安裝在倒置突光顯微鏡（如：01ympus 1X73等）的載物臺上，選用長工作距離光學(xué)物鏡（如：LUCPLFLN 40X)用于熒光成像；同時 使用真空盲板將防污染系統(tǒng)適配接口 2直接密封，將真空系統(tǒng)適配接口 6連接真空泵組。
[0019] 2)安裝完畢后，首先將真空腔室1的真空閥7關(guān)閉，然后啟動真空泵組為真空腔室 1抽真空，直到真空腔室1內(nèi)真空抽到規(guī)定值（通常優(yōu)于5*l(T 3Pa)。
[0020] 3)將固定有低溫冷凍樣品的電鏡低溫樣品桿插入電鏡樣品桿適配接口 3,打開預(yù) 抽真空閥門8及與其連接的低級真空泵組對預(yù)真空通道預(yù)抽真空，待預(yù)真空通道內(nèi)真空度 優(yōu)于設(shè)定值（通常優(yōu)于IPa)，關(guān)閉預(yù)抽真空閥門8,并打開真空閥7,將電鏡低溫樣品桿完全 推入真空腔室1內(nèi)，確保樣品位于上、下光學(xué)窗口 4、5之間，并等待真空腔室1內(nèi)真空恢復(fù) 到規(guī)定值。
[0021] 4)真空腔室1內(nèi)真空恢復(fù)后，打開電鏡低溫樣品桿上的金屬擋片，即可進(jìn)行熒光 顯微鏡觀察、成像。
[0022] 5)光學(xué)成像完成后，關(guān)閉電鏡低溫樣品桿上的金屬擋片，拉出電鏡低溫樣品桿至 最前端出了真空閥7,關(guān)閉真空閥7,繼續(xù)拉電鏡低溫樣品桿直至完全從電鏡樣品桿適配接 口 3內(nèi)完全拔出，并轉(zhuǎn)移到透射電鏡中，根據(jù)熒光顯微鏡得到的熒光圖像，選擇感興趣的目 標(biāo)區(qū)域進(jìn)行電鏡成像，從而獲得光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像數(shù)據(jù)。
[0023] 實施例二：
[0024] 如圖1所不，在實施例一的基礎(chǔ)上，本實施例還包括一防污染系統(tǒng)，防污染系統(tǒng)包 括一通過防污染系統(tǒng)適配接口 2部分伸入真空腔室1的導(dǎo)熱桿9,導(dǎo)熱桿9位于真空腔室1 內(nèi)的一端連接一金屬冷盒10,金屬冷盒10與上、下光學(xué)窗口 4、5位置相對，在金屬冷盒10 的上、下表面相對設(shè)置有一對通光孔（圖中未示出）。導(dǎo)熱桿9位于真空腔室1外的一端連 接一導(dǎo)熱芯11。防污染系統(tǒng)還包括一杜瓦罐12,杜瓦罐12內(nèi)部形成液氮腔室，液氮腔室內(nèi) 充滿液氮且由液氮腔室封蓋13蓋住罐口，導(dǎo)熱芯11設(shè)置于液氮腔室13內(nèi)。
[0025] 本實施例中的導(dǎo)熱桿9、金屬冷盒10和導(dǎo)熱芯11均可以由紫銅、銀等高熱導(dǎo)率的 材質(zhì)制成。
[0026] 本實施例所述的光學(xué)真空冷臺在使用過程中與實施例一有所不同的是：
[0027] 在步驟1)中，由于安裝了防污染系統(tǒng)，光學(xué)真空冷臺的防污染系統(tǒng)適配接口 2不 采取直接密封；在步驟3)中將電鏡低溫樣品桿完全推入真空腔室1后，應(yīng)確保樣品位于金 屬冷盒10內(nèi)。這樣在光鏡觀察過程中，金屬冷盒10會罩在樣品周圍，吸附真空腔室1內(nèi)的 污染物，避免樣品在成像過程中受到污染。
[0028] 本發(fā)明光學(xué)顯微鏡真空冷臺可允許實現(xiàn)的工作模式包括兩種：
[0029] -、當(dāng)樣品到下光學(xué)窗口 5的下表面的距離可以滿足光學(xué)物鏡的工作距離時，物 鏡為外置式（如圖1所示）。
[0030] 二、當(dāng)樣品到下光學(xué)窗口 5的外表面的距離不能滿足光學(xué)物鏡的工作距離時，則 需將下光學(xué)窗口 5拆除，同時將光學(xué)物鏡14通過軟波紋管15、真空密封圈16、密封固定夾 17安裝在原下光學(xué)窗口 5所在的位置，使物鏡的上端位于真空腔室1內(nèi)。光學(xué)物鏡14 (物 鏡在這種使用方式下，應(yīng)保證良好的真空密封性。）的下端可以以原有方式處在大氣環(huán)境中 (如圖2 (a)所示），也可以安裝一透光片18使整個物鏡完全封閉在真空環(huán)境內(nèi)（如圖2 (b) 所示），前者稱之為半封閉式，后者稱之為全封閉式。這樣，能夠保證樣品與光學(xué)物鏡14之 間的距離滿足成像條件。此外，光學(xué)物鏡14與冷臺之間為波紋管軟連接，不影響成像過程 中物鏡與樣品之間的相對移動。
[0031] 本發(fā)明僅以上述實施例進(jìn)行說明，各部件的結(jié)構(gòu)、設(shè)置位置及其連接都是可以有 所變化的，在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，凡根據(jù)本發(fā)明原理對個別部件進(jìn)行的改進(jìn)和等同 變換，均不應(yīng)排除在本發(fā)明的保護(hù)范圍之外。
【權(quán)利要求】
1. 一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺，其特征在于，它包括： 一真空腔室， 一設(shè)置在所述真空腔室的一端的防污染系統(tǒng)適配接口， 一設(shè)置在所述真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口， 一設(shè)置在所述真空腔室的上壁面的上光學(xué)窗口， 一設(shè)置在所述真空腔室的下壁面并與所述上光學(xué)窗口相對的下光學(xué)窗口， 一設(shè)置在所述真空腔室的一側(cè)的真空系統(tǒng)適配接口，以及 一設(shè)置在所述電鏡樣品桿適配接口與所述上、下光學(xué)窗口之間的真空閥； 其中，所述真空閥與所述電鏡樣品桿適配接口之間構(gòu)成了一預(yù)真空通道，在所述預(yù)真 空通道的一側(cè)設(shè)置有一預(yù)抽真空閥門；在所述電鏡樣品桿適配接口、上光學(xué)窗口、下光學(xué)窗 口、真空系統(tǒng)適配接口和防污染系統(tǒng)適配接口處均設(shè)有真空密封圈。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺，其特征在于，還包括 一防污染系統(tǒng)，所述防污染系統(tǒng)包括： 一通過所述防污染系統(tǒng)適配接口部分伸入所述真空腔室1的導(dǎo)熱桿， 一連接在所述導(dǎo)熱桿位于所述真空腔室內(nèi)的一端的金屬冷盒， 一連接在所述導(dǎo)熱桿位于所述真空腔室外的一端的導(dǎo)熱芯，以及 一杜瓦罐； 其中，所述金屬冷盒與所述上、下光學(xué)窗口位置相對，所述金屬冷盒的上、下表面相對 設(shè)置有一對通光孔；所述杜瓦罐內(nèi)部形成充裝有液氮的液氮腔室，所述導(dǎo)熱芯設(shè)置于所述 液氮腔室內(nèi)。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種光鏡電鏡關(guān)聯(lián)成像用光學(xué)真空冷臺，其特征在于，所述導(dǎo) 熱桿、金屬冷盒和導(dǎo)熱芯由紫銅或銀制成。
【文檔編號】H01J37/26GK104142302SQ201410363314
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】季剛, 李碩果, 孫飛 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所