專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療和診斷乳腺癌的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及乳腺癌的檢測(cè)和治療。更具體地說(shuō)本發(fā)明涉及在乳腺癌組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的核苷酸序列和由這些核苷酸序列編碼的多肽。所述核苷酸序列與多肽可以用于預(yù)防和治療乳腺癌的疫苗和藥物組合物中。這些多肽也可以用于產(chǎn)生化合物(如抗體)，所述化合物在診斷和檢測(cè)患者乳腺癌的進(jìn)程中有用。
背景技術(shù)：
乳腺癌在美國(guó)和整個(gè)世界對(duì)婦女來(lái)說(shuō)是一個(gè)重要的健康問(wèn)題。盡管這種疾病的檢測(cè)和治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但是對(duì)于婦女來(lái)說(shuō)，在與癌癥有關(guān)的死亡中，乳腺癌仍然是第二大原因，在美國(guó)每年受此影響的婦女超過(guò)180,000。在北美，目前長(zhǎng)期患有乳腺癌的婦女占1/8。
目前還沒(méi)有任何預(yù)防或者治療乳腺癌的疫苗或者其它普遍成功的方法。目前這種疾病的治療依賴(lài)于早期診斷(通過(guò)常規(guī)乳腺的熒光屏檢查方法)和積極治療，所述積極治療包括各種治療(如手術(shù)，放療，化療以及激素治療)的一種或多種。通常根據(jù)各種預(yù)后參數(shù)(包括特異性腫瘤標(biāo)記物的分析)選擇特定乳腺癌的治療過(guò)程。例如參見(jiàn)，Porter-Jordan和Lippman，乳腺癌(Breast Cancer)873-100(1994)。然而，已確立的標(biāo)記物的使用常常導(dǎo)致難以解釋的結(jié)果，并且觀察到的乳腺癌患者的死亡率較高的結(jié)果表明需要改進(jìn)這種疾病的治療、診斷和預(yù)防。
因此，本領(lǐng)域需要改進(jìn)的治療和診斷乳腺癌的方法。本發(fā)明滿(mǎn)足了這些需要，另外本發(fā)明還具有其它相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述簡(jiǎn)言之，本發(fā)明提供了用于診斷和治療乳腺癌的組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含(a)相對(duì)于正常組織而言，在乳腺癌組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的核苷酸序列；(b)如下定義的這種序列的變體；或(c)編碼多肽之表位的核苷酸序列，所述多肽由至少上述一種序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸分子包含如SEQ ID NO1所示的人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。在其它的實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸分子包含如SEQID NO3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317之任一項(xiàng)所示的核苷酸序列。
在相關(guān)實(shí)施方案中，分離的多核苷酸分子編碼多肽的一個(gè)表位，其中所述多肽由下列核苷酸序列編碼(a)在嚴(yán)格的雜交條件下，與SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317之任一項(xiàng)所示的序列雜交；(b)與SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317之任一項(xiàng)所示的序列具有至少80％的相同性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的一個(gè)表位的分離的多核苷酸，所述多肽由下列核苷酸序列編碼(a)由SEQ ID NO141序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；或者(b)這種核苷酸序列的變體，其只是在不超過(guò)20％的核苷酸位置上含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、缺失、插入和/或修飾，從而保留了由此核苷酸序列編碼的多肽之抗原和/或免疫原性。本發(fā)明也提供了含有與上述多核苷酸互補(bǔ)之核苷酸序列的分離的DNA和RNA分子。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了包含如上所述多核苷酸的重組表達(dá)載體和由此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明也提供了含有由如上所述多核苷酸編碼的氨基酸序列的多肽，可與這種多肽結(jié)合的單克隆抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含選自SEQ ID NO299、300、304-306、308和315及其如下定義的變體之氨基酸序列。
在又一方面，本發(fā)明提供了確定患者存在乳腺癌的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括在生物學(xué)樣品中檢測(cè)如上所述的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括在生物學(xué)樣品中檢測(cè)編碼如上所述多肽的RNA分子。在又一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括(a)使用如上所述的多肽對(duì)患者進(jìn)行皮內(nèi)注射；和(b)檢測(cè)患者皮膚上的免疫反應(yīng)，并由此檢測(cè)患者乳腺癌的存在。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上述檢測(cè)患者是否存在乳腺癌的方法，其中所說(shuō)的多肽由下列核苷酸序列編碼SEQ ID NO78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290及在嚴(yán)格條件下可與其雜交的序列。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于確定乳腺癌的診斷試劑盒。所述診斷試劑盒一般包含一種或多種如上所述的單克隆抗體，或者一種或多種可與如下多肽結(jié)合的單克隆抗體和檢測(cè)試劑，所述多肽由選自下列的核苷酸序列編碼SEQ ID NO78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290。
在相關(guān)方面，所述診斷試劑盒包含第一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)引物和第二個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)引物，至少一種引物對(duì)于此處所述多核苷酸是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)引物含有如上述的多核苷酸或者編碼由選自以下序列編碼的多肽之多核苷酸的至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸，所述序列包括SEQ ID NO.78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290。
在另一個(gè)相關(guān)方面，所述診斷試劑盒包含至少一個(gè)寡核苷酸探針，所述探針對(duì)此處所述多核苷酸是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針包含如上所述的多核苷酸或者選自下組的多核苷酸(SEQ ID NO.78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290)的至少大約15個(gè)連續(xù)的核苷酸。
在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)患者乳腺癌進(jìn)程的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括(a)在生物學(xué)樣品中，在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)如上所述的多肽的量；(b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)上重復(fù)步驟(a)；和(c)比較步驟(a)和(b)測(cè)得的多肽的量，由此監(jiān)測(cè)患者乳腺癌的進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括(a)在生物學(xué)樣品中，在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)編碼如上所述多肽的RNA分子的量；(b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)上重復(fù)步驟(a)；和(c)比較步驟(a)和(b)測(cè)得的RNA分子的量，由此監(jiān)測(cè)患者乳腺癌的進(jìn)展。在又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)如上所述患者乳腺癌進(jìn)展的方法，其中所述多肽由下列核苷酸序列編碼SEQ ID NO.78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290和在嚴(yán)格條件下可與其雜交的序列。
在其它方面，本發(fā)明提供了藥物組合物(其包含如上所述的多肽和與之組合在一起的生理上可接受的載體)和疫苗(其包含如上所述的多肽和與之組合在一起的免疫刺激劑或佐劑)。在另一方面，本發(fā)明提供了包含由下列核苷酸序列編碼的多肽的藥物組合物和疫苗SEQ IDNO.78-86、144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220、241、242、246、248、249、252、256、267、270、274、277、279、282、283、285-287、289、290和在嚴(yán)格條件下可與其雜交的序列。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了抑制患者乳腺癌發(fā)展的方法，這種方法包括向患者施用如上所述的藥物組合物或疫苗。
參照下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將顯而易見(jiàn)。本文公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)，如同每一篇分別引用，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是經(jīng)凝膠電泳分離的差示PCR產(chǎn)物，所述PCR產(chǎn)物是從由正常乳腺組織制備的cDNA(1和2道)和由同一患者的乳房腫瘤組織制備的cDNA(3和4道)獲得的。箭頭表示相應(yīng)于B18Agl的條帶。
圖2是比較乳腺癌組織(1道)和正常乳腺組織中B18Ag1 mRNA水平的Northern印跡。
圖3是乳腺癌組織中B18Ag1 mRNA的水平與各種正常的及非乳腺腫瘤組織中的B18Ag1 mRNA水平比較，其由RNase保護(hù)分析獲得。
圖4是基因組克隆圖譜，其顯示出由Xbal限制酶切消化末端獲得的附加的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(如SEQ ID NO3-SEQ ID NO10所示)相對(duì)于B18Ag1的位置。
圖5A和5B顯示測(cè)序方案，基因組的組構(gòu)和預(yù)測(cè)的包含B18Ag1的逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的開(kāi)放讀框。
圖6顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B18Ag1的核苷酸序列。
圖7顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B17Ag1的核苷酸序列。
圖8顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B17Ag2的核苷酸序列。
圖9顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B13Ag2a的核苷酸序列。
圖10顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B13Ag1b的核苷酸序列。
圖11顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B13Ag1a的核苷酸序列。
圖12顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B11Ag1的核苷酸序列。
圖13顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B3CA3c的核苷酸序列。
圖14顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B9CG1的核苷酸序列。
圖15顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B9CG3的核苷酸序列。
圖16顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B2CA2的核苷酸序列。
圖17顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B3CA1的核苷酸序列。
圖18顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B3CA2的核苷酸序列。
圖19顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B3CA3的核苷酸序列。
圖20顯示典型的乳房腫瘤特異性cDNA B4CA1的核苷酸序列。
圖21A描述在乳腺癌組織(1-8道)和正常的乳腺組織(9-13道)和H2O(14道)中的乳腺腫瘤基因的RT-PCR分析。
圖21B描述了在前列腺腫瘤(1，2道)、結(jié)腸腫瘤(3道)、肺腫瘤(4道)、正常的前列腺(5道)、正常的結(jié)腸(6道)、正常的腎(7道)、正常的肝(8道)、正常的肺(9道)、正常的卵巢(10，18道)、正常的胰腺(11，12道)、正常的骨胳肌(13道)、正常的皮膚(14道)、正常的胃(15道)、正常的睪丸(16道)、正常的小腸(17道)、HBL-100(19道)、MCF-12A(20道)、乳腺癌(21-23道)、H2O(24道)、結(jié)腸腫瘤(25道)的乳腺癌基因的RT-PCR分析。
圖22顯示由抗B11-8 CTL系識(shí)別的B11Agl肽(稱(chēng)為B11-8)。
圖23顯示由B11-8特異性克隆A1識(shí)別的用抗原B11Ag1轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系。
圖24顯示由B11-8特異性克隆A1識(shí)別的肺腺癌系(LT-140-22)和乳腺癌系(CAMA-1)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般地涉及診斷、檢測(cè)和治療乳腺癌的組合物和方法。本文描述的組合物包括多肽、多核苷酸和抗體。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽包含至少蛋白質(zhì)的一部分，所述蛋白質(zhì)在人乳腺癌組織中較在正常的人乳腺組織中的表達(dá)水平要更高(即在腫瘤組織中編碼所述多肽的RNA水平至少高出2倍)。本文將這種多肽稱(chēng)為乳房腫瘤特異性多肽，編碼這種多肽的cDNA分子稱(chēng)為乳房腫瘤特異性cDNA。本發(fā)明的多核苷酸通常包括DNA或者RNA序列，所述DNA或者RNA序列編碼上述多肽的全部或部分，或者是與這種序列互補(bǔ)的序列?？贵w通常是能夠與上述多肽的一部分結(jié)合的免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)或者它的片段?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體(包括產(chǎn)生如本文所述的單克隆抗體)，或者通過(guò)將抗體基因轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)菌或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以便產(chǎn)生重組抗體。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，多肽包括但不限于由人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列編碼的多肽(和它的表位)，如稱(chēng)為B18Ag1的序列(圖5和SEQ ID NO1))。另外，由含有B18Ag1的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組之內(nèi)的其它序列(SEQID NO141)編碼的多肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述序列包括但不限于SEQ ID NO3-SEQ ID NO10所示的序列。如Werner等(病毒學(xué)(Virology)174225-238(1990))所述，B18Ag1與內(nèi)源性人逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的gag p30基因具有同源性，另外，其與大約三十個(gè)其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因具有同源性。如下文詳細(xì)討論的，本發(fā)明也包括大量的其它乳房腫瘤特異性多肽，如那些由下列核苷酸序列編碼的多肽SEQ ID NO11-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″多肽″包括任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其中包括含有本文所引用的序列的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。包含蛋白質(zhì)(含有本文所述的序列)表位的多肽可以完全由所述的表位組成，或者可以含有其它的序列。所述的其它序列可以來(lái)源于該種天然蛋白質(zhì)或者可以是異源的，這種序列可以(但)不是必需)具有免疫原或者抗原特性。
本文所用的″表位″是可以被B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表面抗原受體識(shí)別(即特異結(jié)合)的多肽的一部分。通常可以使用公知的技術(shù)鑒定表位，如Paul在“基礎(chǔ)免疫學(xué)”(第三版，243-247，Raven出版社，1993)及其中所引用的參考文獻(xiàn)中描述的技術(shù)。這樣的技術(shù)包括從天然多肽中篩選能夠與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆進(jìn)行反應(yīng)的多肽。多肽的表位是能夠以與全長(zhǎng)多肽反應(yīng)性(如在ELISA和/或T細(xì)胞反應(yīng)性測(cè)定中測(cè)定的反應(yīng)性)相似的水平與這種抗血清和/或T細(xì)胞反應(yīng)的部分。通?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法完成這種篩選，如Harlow和Lane在“抗體”(實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)中所描述的方法。也可以通過(guò)計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)B細(xì)胞和T細(xì)胞表位。包含在腫瘤組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的多肽之表位的多肽(含有或不含有其它的氨基酸序列)也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單或雙鏈聚合體，包括DNA和相應(yīng)的RNA分子(包括HnRNA和mRNA分子，有義和反義鏈)，也包括cDNA、基因組DNA和重組DNA，以及全部或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子含有內(nèi)含子，以通常的一對(duì)一的方式與DNA分子相對(duì)應(yīng)。mRNA分子與HnRNA和DNA分子相對(duì)應(yīng)，其中HnRNA和DNA分子內(nèi)的內(nèi)含子已被剪切掉。多核苷酸可包含整個(gè)基因或其任一部分。可操作反義多核苷酸可包含相應(yīng)多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定義包括所有這些可操作反義片段。
本發(fā)明的組合物和方法也包括上述多肽的變體和編碼這些多肽的多核苷酸。本文所使用的多肽″變體″是與天然多肽在替代和/或修飾方面不同的多肽，最終保留了所說(shuō)多肽的抗原和/或免疫原特性。通?？梢酝ㄟ^(guò)修飾一個(gè)上述多肽序列并評(píng)價(jià)修飾的多肽與上述的抗血清和/或T細(xì)胞的反應(yīng)性來(lái)鑒定這種變體。多肽變體優(yōu)選地顯示與同一性多肽具有至少約70％，更優(yōu)選至少約90％和最優(yōu)選至少約95％的同一性(如上述確定)。
如此處所用，″保守替代″是指其中的氨基酸由另一個(gè)性質(zhì)相似的氨基酸替代，這樣，肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)料到這種多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水特性實(shí)質(zhì)上沒(méi)有變化。一般來(lái)說(shuō)，下列氨基酸組為保守變化(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
變體也可，或替代性地，含有其它修飾，包括對(duì)多肽的抗原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性影響最小的氨基酸的缺失或插入。例如，可在多肽的N末端連接一個(gè)信號(hào)(或前導(dǎo))序列，該序列可以以共翻譯或翻譯后方式指導(dǎo)該蛋白的轉(zhuǎn)移。多肽還可偶聯(lián)接頭或其它序列，以方便該蛋白的合成、純化或鑒定(如poly-His)，或增強(qiáng)多肽對(duì)固體支持物的結(jié)合。例如，多肽可與免疫球蛋白Fc區(qū)連接。
核苷酸“變體”是指與所述核苷酸序列相比具有一或多個(gè)核苷酸缺失、替代或插入之不同的序列。這種修飾可采用誘變技術(shù)如寡核苷酸指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變(如例如Adelman等，DNA，2183，1983所示)很容易導(dǎo)入。核苷酸變體可是天然存在的等位基因變體，或者是非天然存在的變體。變體核苷酸序列顯示與所述序列優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，最優(yōu)選至少約90％相同性(測(cè)定見(jiàn)下)。
本發(fā)明提供的乳房腫瘤抗原包括與一個(gè)或多個(gè)本文特別描述的DNA序列基本相同的DNA序列編碼的變體。此處“基本相同”是指這些DNA序列能在中等嚴(yán)格條件下雜交。適宜的中等嚴(yán)格條件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)洗；50℃-65℃時(shí)在5×SSC中雜交過(guò)夜，或當(dāng)物種間(cross-species)同源時(shí)在45℃、0.5×SSC雜交；然后在65℃用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC各洗兩次，每次20分鐘。這種雜交DNA序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，例如由于密碼簡(jiǎn)并，編碼由多個(gè)雜交的DNA序列編碼免疫原性多肽之核苷酸序列。
如果在兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列中核苷酸或氨基酸殘基序列在按如下所述對(duì)比(align)最大對(duì)應(yīng)性(maximum correspondence)時(shí)相同，則稱(chēng)這兩個(gè)序列是“相同的”。典型地，兩個(gè)序列之間的比較通過(guò)在一個(gè)比較窗口比較這些序列，以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來(lái)進(jìn)行。此處所用“比較窗口”是指至少約20個(gè)連續(xù)位置，通常是30到約75個(gè)，或40到約50個(gè)連續(xù)位置的片段，其中當(dāng)兩個(gè)序列最優(yōu)對(duì)比之后一個(gè)序列可在該窗口中與相同數(shù)目連續(xù)位置的參考序列比較。
用于比較的序列最優(yōu)對(duì)比可用Lasergene生物信息學(xué)軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)采用缺省參數(shù)來(lái)進(jìn)行。該程序包括下列文獻(xiàn)所述的若干對(duì)比方案Dayhoff，M.O.(1978)蛋白質(zhì)的進(jìn)化變換模型-檢測(cè)遠(yuǎn)緣關(guān)系的矩陣，見(jiàn)Dayhoff，M.O.(編)蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure)，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)(National Biomedical Research Foundation)，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358頁(yè)；Hein J.(1990)對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一途徑，第626-645頁(yè)，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)第183卷，Academic Press公司，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)微型計(jì)算機(jī)上快速靈敏的多序列對(duì)比CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)線(xiàn)性空間最優(yōu)對(duì)比CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor 11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Neighbor joining法，一種重建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的新方法分子生物進(jìn)化(Mol.Biol.Evol.)4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)數(shù)值分類(lèi)法-數(shù)值分類(lèi)法的原理和實(shí)踐Freeman出版社，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的快速相似性搜索美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.，Sci.USA)80726-730。
優(yōu)選地，“序列相同百分?jǐn)?shù)”通過(guò)在至少20個(gè)位置的窗口比較兩個(gè)最優(yōu)對(duì)比的序列來(lái)確定，其中，與最優(yōu)對(duì)比的兩個(gè)序列中的(不含插入或缺失的)參考序列相比，多核苷酸序列在比較窗口中的部分可包含20％或更少，通常是5-15％或10-12％的插入或缺失(即空位)。該百分?jǐn)?shù)按如下計(jì)算確定在兩個(gè)序列中均出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將該匹配位置數(shù)除以參考序列中的總位置數(shù)(即窗口大小)，然后將結(jié)果乘以100即產(chǎn)生序列相同百分?jǐn)?shù)。一般來(lái)說(shuō)，可以使用多種技術(shù)中的任何一種制備編碼本文所述多肽全部或部分的核苷酸序列。例如，在相應(yīng)mRNA的乳腺腫瘤特異性表達(dá)的基礎(chǔ)上，使用差示PCR克隆編碼這種多肽的cDNA分子。此技術(shù)能夠比較由正常和乳腺癌組織中制備的RNA模板獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢允褂?dT)12AG引物經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。使用隨機(jī)引物擴(kuò)增所得的cDNA后，從銀染色的凝膠上切除相當(dāng)于腫瘤RNA特異擴(kuò)增產(chǎn)物的帶，并將其亞克隆到合適的載體，如T-載體(Novagen，Madison，WI)?？梢允褂肧EQ ID NO87-125所示的隨機(jī)引物由上面制備的cDNA擴(kuò)增編碼本文公開(kāi)的乳腺腫瘤特異性多肽全部或部分的核苷酸序列。
另外，可以從人基因組DNA或者乳腺癌cDNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼本文所述的多肽的基因(或它的一部分)。對(duì)于這一方法，可以基于SEQ ID NO1中提供的序列設(shè)計(jì)B18Ag1序列特異性引物，也可以購(gòu)買(mǎi)或合成這種引物。一對(duì)用于由乳腺癌cDNA擴(kuò)增的合適的引物是(5′ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO.126)和(5′CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ ID NO.127)。然后，使用公知的技術(shù)(例如Sambrook等所述(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1989))可以將B18Ag1的擴(kuò)增部分用于分離來(lái)源于人基因組DNA文庫(kù)或來(lái)源于乳腺癌cDNA文庫(kù)的全長(zhǎng)基因。在B18Ag1作為其中一部分的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的其它序列可以是類(lèi)似地通過(guò)使用B18Ag1特異性序列作為探針通過(guò)篩選人基因組文庫(kù)制備的序列。然后，通過(guò)克隆相應(yīng)的cDNA，預(yù)測(cè)開(kāi)放讀框以及將相應(yīng)的cDNA克隆到含有病毒啟動(dòng)子(例如T7)的載體中，確定SEQ ID NO141所示的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中的翻譯成蛋白質(zhì)的核苷酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)在翻譯反應(yīng)中使用所得的構(gòu)建體，以便鑒定翻譯成表達(dá)蛋白的核苷酸序列。同樣，可以以SEQ ID NO11-86、142-298、301-303、307、313、314、316和317所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)本文描述的其它乳腺腫瘤特異多肽的特異引物。
可以很容易地由所述DNA序列制備由上述DNA序列編碼的重組多肽。例如，可以使用市售的濾膜首先濃縮合適的宿主/載體系統(tǒng)的上清液，所述宿主/載體系統(tǒng)向培養(yǎng)基中分泌重組蛋白質(zhì)或多肽。濃縮后將濃縮物加入到合適的純化基質(zhì)(如親和基質(zhì)或者離子交換樹(shù)脂中)。最后，為了進(jìn)一步純化重組多肽，可以使用一個(gè)或多個(gè)反相HPLC步驟。
一般來(lái)說(shuō)，可以使用任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的表達(dá)載體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的重組多肽。可以在由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，所示的表達(dá)載體包含編碼重組多肽的DNA分子。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞，酵母和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，酵母或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如COS或者CHO)。
也可以使用這些技術(shù)制備含有表位的多肽或天然多肽變體。例如，通?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)(如寡核苷酸定點(diǎn)特異誘變)制備天然多肽的變體，并且可以除去DNA序列部分以便可以制備截短的多肽。也可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)通過(guò)合成方法產(chǎn)生少于大約100個(gè)氨基酸(通常少于50個(gè)氨基酸)的部分和其它變體。例如，可以使用任何市售的固相技術(shù)合成這種多肽，如Merrifield固相合成方法，其中的氨基酸依次加入到延長(zhǎng)的氨基酸鏈中。參見(jiàn)Merrifield，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志852149-2146(1963)。可以從供應(yīng)商(如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster城，CA)購(gòu)買(mǎi)用于多肽自動(dòng)合成的設(shè)備，并且按照廠商的說(shuō)明進(jìn)行操作。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含由具有下列任一序列的DNA分子編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317；和這些多肽的變體。本發(fā)明的多肽也包括由能夠與下列DNA分子之一在嚴(yán)格的條件下雜交的DNA序列編碼的多肽(和它的表位)SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，其中所述DNA序列在全部序列上與所示的序列具有至少80％的等同性，且其中相應(yīng)于核苷酸序列的RNA以比在正常乳腺組織中高的水平在人乳腺腫瘤組織中表達(dá)。本文所用的″嚴(yán)格條件″是指在6X SSC，0.2％SDS溶液中預(yù)洗滌；65℃下在6X SSC，0.2％SDS中過(guò)夜雜交；之后，65℃下在1X SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘；然后再于65℃下1 X SSC，0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘。按照本發(fā)明的多核苷酸包括編碼上述任一多肽的分子。
在另一方面，本發(fā)明提供了抗體。可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的眾多技術(shù)中的任何一種來(lái)制備這種抗體。例如參見(jiàn)Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。在這一技術(shù)中，首先將包含多肽的免疫原注射到眾多哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)的任何一種中。在這一步驟中，本發(fā)明的多肽可以在沒(méi)有任何修飾的情況下作為免疫原。另外，特別是對(duì)于比較短的多肽，如果此多肽與載體蛋白(如牛血清白蛋白和匙孔 血藍(lán)蛋白)結(jié)合，可以誘導(dǎo)超級(jí)免疫反應(yīng)。將所述免疫原注射到動(dòng)物宿主中，優(yōu)選的是按照預(yù)定的方案，并配合一次或多次加強(qiáng)免疫，同時(shí)定期對(duì)這些動(dòng)物取血。然后，從這種抗血清中純化此多肽特異的多克隆抗體，例如，使用與合適的固相支持物偶聯(lián)的多肽通過(guò)親和層析進(jìn)行純化。
例如，可以使用Kohler和Milstein的技術(shù)(歐洲免疫學(xué)雜志6511-519(1976))和其改進(jìn)技術(shù)制備所述目的抗原多肽的特異單克隆抗體。簡(jiǎn)言之，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需要的特異性之抗體(即可以與目的多肽反應(yīng))的無(wú)限增殖細(xì)胞系。例如可以從脾細(xì)胞產(chǎn)生這種細(xì)胞系，所述脾細(xì)胞由按照如上所說(shuō)方法免疫的動(dòng)物中獲得。然后，例如通過(guò)將這些脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶(優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶與所述免疫動(dòng)物是同系的)融合來(lái)使之無(wú)限增殖?？梢允褂枚喾N融合技術(shù)。例如，可以將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子去污劑結(jié)合幾分鐘，然后將它們以低密度接種在支持雜交細(xì)胞生長(zhǎng)而不支持骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇培養(yǎng)基上。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇。培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間(通常1-2周)后，觀察雜合體集落。選擇單集落，并檢測(cè)它們的培養(yǎng)物上清液與所述多肽的結(jié)合活性。具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤是優(yōu)選的。
可以從正在生長(zhǎng)的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。此外，可以使用多種技術(shù)提高產(chǎn)率，如可以將雜交瘤細(xì)胞系注射到合適的脊椎動(dòng)物宿主(如小鼠)的腹腔中。然后從腹水或者血液中收獲單克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)從此抗體中除去污染物，如層析、凝膠過(guò)濾、沉淀和抽提。本發(fā)明的多肽可以用于純化方法中，例如用于親和層析步驟中。
例如可以在檢測(cè)患者乳腺癌的方法中使用抗體。這種方法包括使用抗體檢測(cè)合適的生物學(xué)樣品中是否存在本文所述的乳腺腫瘤特異性多肽。本文所述“合適的生物學(xué)樣品”包括患者的腫瘤或正常組織的活檢、乳房切除術(shù)、血液、淋巴結(jié)、血清或尿樣、或者其它組織、勻漿、或者它們的提取物。
對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，使用抗體檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記物可以有很多測(cè)定方法。例如參見(jiàn)Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。例如，可以以Western印跡方式進(jìn)行測(cè)定，其中對(duì)由所述生物學(xué)樣品中獲得的蛋白質(zhì)制劑進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到合適的膜上，并使之與所述抗體反應(yīng)。然后可以使用下文描述的合適檢測(cè)試劑檢測(cè)此膜上抗體的存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定方法包括使用固定在固相支持物上的抗體與所述多肽結(jié)合，并將其從樣品的其余部分分離出來(lái)。然后可以使用含有報(bào)道基團(tuán)的二級(jí)抗體或試劑檢測(cè)結(jié)合的多肽。另外，可以使用競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，即將多肽用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記，并在所述抗體與樣品溫育后，使之與固定的抗體結(jié)合。樣品中的組分抑制所述標(biāo)記多肽與抗體結(jié)合的程度表明了這種樣品與固定的抗體的反應(yīng)性，結(jié)果表明了樣品中多肽的濃度。
固相支持物可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何可以與抗體結(jié)合的物質(zhì)。例如，固相支持物可以是微量滴定板的試驗(yàn)孔或者硝酸纖維素濾膜或者其它合適的膜。另外，這種支持物可以是小珠、或者圓片(如玻璃)、玻璃纖維、膠乳或者塑料材料(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)。這種支持物也可以是磁性顆?；蛘呃w維光學(xué)傳感器，如美國(guó)專(zhuān)利5,359,681所公開(kāi)的那些物質(zhì)。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種技術(shù)將這種抗體固定在所述固相支持物上，這些技術(shù)在專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)充分描述。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“固定”是指非共價(jià)結(jié)合(如吸附)和共價(jià)結(jié)合(這種結(jié)合可以通過(guò)抗原與支持物的功能基團(tuán)直接連接，或者通過(guò)交聯(lián)劑連接)。通過(guò)吸附作用與微量滴定板的孔或者膜進(jìn)行固定是優(yōu)選的。在這種情況下，可以通過(guò)使合適緩沖液中的抗體與固相支持物接觸一段合適的時(shí)間來(lái)完成吸附。接觸的時(shí)間取決于溫度，但一般為大約1小時(shí)至1天。一般來(lái)說(shuō)，將塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)的孔與大約10ng至大約1μg(優(yōu)選的是大約100-200ng)的抗體接觸足以固定足量的多肽。
通常也可以通過(guò)使支持物首先與雙官能試劑反應(yīng)來(lái)使抗體與固相支持物共價(jià)結(jié)合，所述雙官能試劑既能夠與支持物反應(yīng)，又能夠與抗體的官能基團(tuán)(如羥基或者氨基基團(tuán))反應(yīng)。例如，可以使用苯醌或者通過(guò)將支持物上的醛基團(tuán)與結(jié)合伴侶上的胺和活性氫縮合來(lái)使所述抗體與具有合適聚合物涂層的支持物共價(jià)結(jié)合(例如參見(jiàn)Pierce，免疫技術(shù)目錄和手冊(cè)(1991)A12-A13)。
在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)樣品中多肽的測(cè)定方法是雙-抗體夾心法測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)首先將已經(jīng)固定在固相支持物(一般是微量滴定板的孔)上的抗體與所述生物學(xué)樣品結(jié)合，這樣可以使樣品中的多肽與固定的抗體結(jié)合。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中除去沒(méi)有結(jié)合的樣品，并加入能夠與多肽上的不同位點(diǎn)結(jié)合的二級(jí)抗體(含有報(bào)道基團(tuán))。然后使用適合特異報(bào)道基團(tuán)的方法測(cè)定與固相支持物結(jié)合的二級(jí)抗體的量。
更具體地說(shuō)，一旦抗體如上所述固定在支持物上，一般來(lái)說(shuō)就封阻了支持物上其余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何合適的封阻試劑(如牛血清白蛋白或者吐溫20TM(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO))。然后將固定的抗體與樣品一起溫育，使多肽可以與該抗體結(jié)合。在溫育前，可以用合適的稀釋劑(如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))稀釋樣品。一般來(lái)說(shuō)，合適的接觸時(shí)間(即溫育時(shí)間)是足以檢測(cè)到樣品中存在多肽的時(shí)間，所述樣品來(lái)源于乳腺癌患者個(gè)體。優(yōu)選的接觸時(shí)間是足以使結(jié)合水平達(dá)到結(jié)合多肽與未結(jié)合多肽平衡時(shí)的結(jié)合水平的至少95％。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道可以通過(guò)測(cè)定一段時(shí)間的結(jié)合水平來(lái)很容易地確定達(dá)到平衡時(shí)所需要的時(shí)間。在室溫下，溫育大約30分鐘一般是足夠的。
然后可以通過(guò)用合適的緩沖液(如含有0.1％吐溫20TM的PBS)洗滌固相支持物來(lái)除去未結(jié)合的樣品。然后向固相支持物中加入含有報(bào)道基團(tuán)的二級(jí)抗體。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括酶(如辣根過(guò)氧化物酶)、底物、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)和生物素。可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法使抗體與報(bào)道基團(tuán)綴合。
然后將二級(jí)抗體與固定抗體-多肽復(fù)合物溫育一段時(shí)間，所述時(shí)間足以檢測(cè)到結(jié)合的多肽。通?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定在一段時(shí)間內(nèi)結(jié)合的水平來(lái)確定合適的時(shí)間。然后除去未結(jié)合的二級(jí)抗體，并使用報(bào)道基團(tuán)測(cè)定結(jié)合的二級(jí)抗體。測(cè)定報(bào)道基團(tuán)的方法取決于報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)于放射性基團(tuán)，閃爍計(jì)數(shù)或者放射自顯影方法通常是合適的。分光鏡方法可以用于檢測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)?？梢允褂门c不同報(bào)道基團(tuán)(一般為放射性或者熒光基團(tuán)或者酶)結(jié)合的抗生物素蛋白測(cè)定生物素。通?？梢酝ㄟ^(guò)加入底物(通常在特定時(shí)期)來(lái)檢測(cè)酶報(bào)道基團(tuán)，之后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分光鏡或其它分析。
為了確定是否存在乳腺癌，通常把從保持結(jié)合到固相支持物的報(bào)道基團(tuán)檢測(cè)到的信號(hào)和對(duì)應(yīng)于從非腫瘤組織中得到的預(yù)先測(cè)定的閾值的信號(hào)相比較。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，閾值(cut-off)是將固定的抗體和無(wú)乳腺癌的患者樣品一起培養(yǎng)而獲得的平均信號(hào)值。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)產(chǎn)生信號(hào)樣品的值大于預(yù)先測(cè)定的閾值三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)，可以認(rèn)為此樣品是乳腺癌陽(yáng)性的。在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Receiver Operator曲線(xiàn)，按照Sackett等的方法(臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)藥基礎(chǔ)科學(xué)，106-7頁(yè)(Little Brown和Co.，1985))確定閾值。簡(jiǎn)言之，在這一實(shí)施方案中，可以從一個(gè)樣品的真陽(yáng)性率(即，敏感性)和假陽(yáng)性率(100％特異性)作圖確定閾值，所述真、假陽(yáng)性率和診斷試驗(yàn)結(jié)果的每個(gè)可能閾值相對(duì)應(yīng)。在圖中最靠近左上角樣品的閾值(即，包圍最大的區(qū)域的值)是最精確的閾值，樣品產(chǎn)生的信號(hào)比通過(guò)這種方法確定的閾值高時(shí)，可以認(rèn)為此樣品是陽(yáng)性的。另外，閾值可以偏移到圖的左邊，使得假陽(yáng)性率最??；或偏移到右邊，使假陰性率最小。一般來(lái)說(shuō)，如果樣品產(chǎn)生的信號(hào)比通過(guò)這種方法確定的閾值高時(shí)，可以認(rèn)為此樣品對(duì)乳腺癌是陽(yáng)性的。
在相關(guān)實(shí)施方案中，以流通(flow-through)或者帶狀檢驗(yàn)方式進(jìn)行測(cè)定，其中的抗體固定到膜(如硝酸纖維素)上。在流通檢驗(yàn)中，當(dāng)樣品通過(guò)膜時(shí)，樣品中的多肽結(jié)合到固定的抗體上。其次，當(dāng)含有二級(jí)抗體的溶液流經(jīng)膜時(shí)，標(biāo)記的二級(jí)抗體就結(jié)合到抗體-多肽復(fù)合物上。然后可以按照如上所述進(jìn)行結(jié)合的二級(jí)抗體的檢測(cè)。在帶狀檢驗(yàn)方式中，將膜的一端(結(jié)合抗體的端)浸沒(méi)在含有樣品的溶液中。樣品沿著膜遷移，穿過(guò)含有二級(jí)抗體的區(qū)域，遷移到固定抗體的區(qū)域。在固定抗體區(qū)域的二級(jí)抗體的濃度表明存在乳腺癌。一般地，在那個(gè)位點(diǎn)的二級(jí)抗體的濃度產(chǎn)生了肉眼可見(jiàn)的帶型(例如一條線(xiàn))，這種帶型的缺乏表明結(jié)果為陰性。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)生物學(xué)樣品含有一定量的在雙抗體夾心法測(cè)定(上述討論的形式)中能足以產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的多肽時(shí)，選擇固定到膜上的抗體的量是以產(chǎn)生視覺(jué)上能辨認(rèn)的帶型為依據(jù)的。固定到膜上的抗體的量?jī)?yōu)選的為大約25ng-1μg，更優(yōu)選的為大約50ng-1μg。通常可以使用非常少量的生物學(xué)樣品進(jìn)行這種檢測(cè)。
也可以通過(guò)評(píng)價(jià)生物學(xué)樣品(例如活組織檢查、乳房切除術(shù)和/或患者的血液樣品)中的編碼本文所述的乳腺腫瘤特異性多肽的mRNA水平與預(yù)測(cè)的閾值的相關(guān)性確定是否存在乳腺癌。可以使用任何一種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法(例如原位雜交和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增)進(jìn)行這種評(píng)價(jià)。
例如，聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)從cDNA擴(kuò)增序列，所述cDNA是由上述的任一種生物學(xué)樣品分離的RNA制備的?？梢栽赟EQ IDNO1、11-86、142-298、301-303、307、313、314、316和317之任一個(gè)所提供的序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)在這種擴(kuò)增中使用的序列特異性引物，也可以購(gòu)買(mǎi)或者合成。本文所提及的B18Ag1的合適的引物為B18Ag1-2(5′ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO.126)和B18Ag1-3(5′CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ IDNO.127)。然后可以通過(guò)凝膠電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法目測(cè)檢驗(yàn)。通常在由匹配的兩種組織(來(lái)自相同個(gè)體的腫瘤和非腫瘤組織)或不匹配的兩種組織(來(lái)自不同個(gè)體的腫瘤和非腫瘤組織)獲得的樣品上進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選地，在一些跨越兩個(gè)數(shù)量級(jí)的數(shù)個(gè)cDNA稀釋液上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。和非腫瘤樣品的同一稀釋液相比，如果腫瘤樣品的一些稀釋液在表達(dá)上增加2倍或更多，就可以認(rèn)為此樣品為陽(yáng)性的。
此處所用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子特異的寡核苷酸引物/探針”是指與目標(biāo)多核苷酸至少約80％、優(yōu)選至少約90％、更優(yōu)選至少約95％相同的寡核苷酸序列，或是指與下述序列反義的寡核苷酸序列，所述序列與目標(biāo)多核苷酸至少約80％、優(yōu)選至少約90％、更優(yōu)選至少約95％相同。在本發(fā)明診斷方法中非常有用的寡核苷酸引物和/或探針優(yōu)選具有至少約10-40個(gè)核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸引物包含編碼此處所述多肽之一的多核苷酸(或與編碼此處所述多肽之一的序列反義之多核苷酸)的至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明診斷方法所用寡核苷酸探針包含編碼此處所述多肽之一的多核苷酸(或與編碼此處所述多肽之一的序列反義之多核苷酸)的至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸?；赑CR的實(shí)驗(yàn)和原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的。
使用瓊脂糖和溴化乙錠染色(在確定基因特異性時(shí)是重要的)的常規(guī)RT-PCR方案由于對(duì)它們進(jìn)行定量所需要的時(shí)間和精力(即，飽和和/或滴定曲線(xiàn)的建立)及它們樣品生產(chǎn)量等原因，不能有助于診斷試劑盒的發(fā)展。通過(guò)研究產(chǎn)生一種方法，例如實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)解決這一問(wèn)題，所述實(shí)時(shí)RT-PCR可以在單個(gè)的試管中進(jìn)行測(cè)定，反之，也可以經(jīng)改變用于96孔平板形式?？梢詮腁BI/Perkin Elmer得到能完成這種方法的儀器。另外，其它的高生產(chǎn)量測(cè)定中，使用標(biāo)記的探針(例如地高辛配基)和針對(duì)所說(shuō)探針的標(biāo)記(例如酶、熒光、放射性)的抗體，這種測(cè)定也可以用于96孔平板測(cè)定研究。
在另一種確定患者是否患有乳腺癌的方法中，可以在皮膚試驗(yàn)中，使用本文所述的一種或多種乳腺腫瘤特異性多肽。本文所使用的″皮膚試驗(yàn)″是一種直接針對(duì)于病人進(jìn)行的測(cè)定方法，對(duì)所述病人進(jìn)行真皮內(nèi)注射一種或多種多肽來(lái)測(cè)定超敏(DTH)反應(yīng)(如腫脹，變紅或皮炎)?？梢允褂媚軌蚴苟嚯?或多種多肽)和病人的皮膚細(xì)胞接觸的任何器械，例如結(jié)核菌素注射器或者1毫升注射器。優(yōu)選地在注射至少48小時(shí)(更優(yōu)選的為48-72小時(shí))后測(cè)定反應(yīng)。
DTH反應(yīng)是一種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以前接受過(guò)試驗(yàn)抗原(即所用的多肽的免疫原性部分或者它的變體)的患者發(fā)生較多這種反應(yīng)?？梢允褂弥背哌M(jìn)行視覺(jué)測(cè)量。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)反應(yīng)直徑超過(guò)大約0.5cm(優(yōu)選的直徑超過(guò)5.0cm)，那么此反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)，表明病人具有乳腺癌。
本文所描述的用于皮膚試驗(yàn)的乳腺腫瘤特異性多肽優(yōu)選地配制成含有至少一種多肽和生理上可接受的載體(如水、鹽水、醇或者緩沖液)的藥物組合物。這種組合物一般含有一種或多種以上多肽，所述多肽的量的范圍為在0.1ml的總體積中有大約1μg-100μg，優(yōu)選的是10μg-50μg。優(yōu)選地，在這種藥物組合物中使用的載體是具有合適的防腐劑的鹽水溶液，如苯酚和/或吐溫80TM。
在本發(fā)明的其它方面，可以通過(guò)進(jìn)行一段時(shí)間的上述任何一種測(cè)定分析和評(píng)價(jià)反應(yīng)水平的變化(即，檢測(cè)的多肽或mRNA的量，或在皮膚試驗(yàn)時(shí)檢測(cè)到的免疫應(yīng)答的程度)來(lái)監(jiān)測(cè)所治療的乳腺癌的發(fā)展和/或反應(yīng)。例如，可以每一個(gè)月或兩個(gè)月進(jìn)行一次測(cè)定，這樣測(cè)定1至2年。一般來(lái)說(shuō)，在那些反應(yīng)水平隨時(shí)間增加的患者中，乳腺癌有所發(fā)展。相反，當(dāng)檢測(cè)的信號(hào)仍保持不變或隨時(shí)間減少時(shí)，乳腺癌沒(méi)有發(fā)展。
在本發(fā)明的其它方面，本文所描述的化合物可以用于乳腺癌的免疫治療。在這些方面，優(yōu)選地將化合物(可以是多肽、抗體或者核酸分子)摻入到藥物組合物或疫苗中。藥物組合物包括一種或多種這些化合物或生理上可接受的載體。疫苗可以包含一種或多種多肽和免疫刺激劑，例如佐劑或脂質(zhì)體(在其中加入化合物)。免疫刺激劑可以是增強(qiáng)或加強(qiáng)對(duì)外源抗原(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答的任一物質(zhì)。免疫刺激物可包括佐劑、生物可降解的微球體(polylactic galactide)和脂質(zhì)體(其中摻入了化合物；參見(jiàn)Fullerton，美國(guó)專(zhuān)利4,235,877)。疫苗制品一般如M.F.Powell和M.J.Newman等編“疫苗設(shè)計(jì)”中所述。在本發(fā)明中的藥物組合物和疫苗也可以含有其它的化合物，其可為生物活性或無(wú)生物活性的。例如在組合物或疫苗中可以摻入融合蛋白或作為獨(dú)立化合物形式存在一種或多種其它腫瘤抗原的免疫原性部分。
另外，疫苗可以含有編碼上述一種或多種多肽的DNA，因此在原位產(chǎn)生多肽。在這種疫苗中，DNA可以存在于任何一種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的遞送系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)包含用于在患者中表達(dá)的必需DNA序列(如合適的啟動(dòng)子與終止信號(hào))。細(xì)菌遞送系統(tǒng)包括施用能在其細(xì)胞表面表達(dá)多肽免疫原部分的細(xì)菌(如Bacillus-Calmette-Guerrin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如牛痘或者其它的痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者腺病毒)引入DNA，所述病毒表達(dá)系統(tǒng)可以包括使用非病原(缺陷型)可復(fù)制型病毒。把DNA加入到這種表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。所述DNA也可以是″裸露″的DNA，例如Ulmer等(科學(xué)2591745-1749(1993))和Cohen等(科學(xué)2591691-1692(1993))描述過(guò)的。通過(guò)把DNA涂到可被生物降解的珠(使DNA有效地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中)上可以增加裸露DNA的攝取。
在本發(fā)明的藥物組合物中可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何合適的載體，載體的類(lèi)型將隨著施用的方式不同而異。對(duì)于腸胃外施用(如皮下注射)，優(yōu)選的載體含有水、鹽水、醇、脂肪、蠟或者緩沖液。對(duì)于口服施用，可以使用上述的任何一種載體或固體載體，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂?？杀簧锝到獾奈⑶蝮w(例如polylactate polyglycolate)也可以作為本發(fā)明藥物組合物的載體。
在本發(fā)明的疫苗中可以使用任何一種佐劑，以便非特異性地增強(qiáng)免疫反應(yīng)。大部分佐劑含有用來(lái)保護(hù)抗原使之免受迅速分解代謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或者礦物油和免疫應(yīng)答刺激劑(例如脂質(zhì)A、Bortadella pertussis或者結(jié)核分枝桿菌衍生蛋白)。合適的佐劑是市售的，例如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)、Merck佐劑65(Merck和Rahway，NJ公司)、AS-2(Smith Kline Beecham，Philadelphia PA)；鋁鹽，如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽；?；野彼岵豢扇軕乙?；酰化糖；陽(yáng)離子或陰離子衍生化的多糖；聚磷腈；可被生物降解的微球體、單磷?；|(zhì)A和quil A。也可以把細(xì)胞因子(如GM-CSF或白介素-2、7或12)作為佐劑。
在此處提供的疫苗中，佐劑組分優(yōu)選地經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)Th1型的免疫反應(yīng)。高水平的Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)一般有利于誘導(dǎo)針對(duì)施用的抗原之細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL10)一般有利于誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。施用此處提供的疫苗，患者會(huì)產(chǎn)生包括Th1型和Th2型反應(yīng)在內(nèi)的免疫反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)主要是Th1型的，Th1型細(xì)胞因子的水平比Th2型細(xì)胞因子水平增加的較高。這些細(xì)胞因子的水平利用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)可容易地鑒定。對(duì)于細(xì)胞因子家族的綜述，見(jiàn)Mosmann和Coffman，免疫學(xué)年鑒(Ann.Rev.Immunol.，7145-173，1989)。
用于誘發(fā)優(yōu)勢(shì)Th1型反應(yīng)的優(yōu)選佐劑包括例如，單磷酰脂質(zhì)A，優(yōu)選3-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)與一種鋁鹽的組合。MPL佐劑可獲自Corixa公司(Seattle，WA，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,877,611；4,866,034；4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)Th1型反應(yīng)。這類(lèi)寡核苷酸為公知，并在例如WO96/02555和WO99/33488中描述。免疫刺激性DNA序列也在例如Sato等，科學(xué)，273352，1996中描述。另一優(yōu)選的佐劑是皂甙，優(yōu)選QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，其可單獨(dú)或與其它佐劑一起使用。例如，一種加強(qiáng)體系包括單磷酰脂質(zhì)A與皂甙衍生物的組合，諸如WO94/00153中所述的QS21與3D-MPL的組合，或一種不甚具有反應(yīng)性的組合物，其中QS21由膽固醇湮滅，如WO96/33739所述。其它優(yōu)選的制劑包含水包油型乳液和生育酚。一種特別有力的佐劑制劑包含在水包油型乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚，如WO95/17210所述。
其它優(yōu)選的佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic，法國(guó))，SAF(Chiron，California，美國(guó))，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS系列佐劑(如，SBAS-2或SBAS-4，可獲自SmithKline Beecham，Rixensart，比利時(shí))，Detox(Ribi ImmunoChem Research Inc.，Hamilotn，MT)，RC-529(Ribi ImmunoChem Research Inc.，Hamilotn，MT)和氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)。
可用制備抗原、免疫刺激物和適當(dāng)載體或賦形劑之組合的周知的方法制備此處提供的任一疫苗。此處所述組合物可作為緩釋劑型的一部分(即如膠囊、海綿或凝膠(由例如多糖構(gòu)成)，其實(shí)現(xiàn)施用后化合物的緩慢釋放)。這類(lèi)制劑一般可利用周知的方法制備(見(jiàn)如，Coombes等，疫苗141429-1438，1996)且利用如口服、直腸或皮下植入方式施用，或通過(guò)在期望的位點(diǎn)植入施用。緩釋制劑可含有分散于載體基質(zhì)和/或包含于由速度控制膜包圍的貯存囊中的多肽、多核苷酸或抗體。
用于這類(lèi)制劑中的載體為生物相容性的，且可被生物降解；優(yōu)選的，制劑提供了相對(duì)恒定量的活性成分釋放。這類(lèi)載體包括聚(丙交酯-乙交酯)共聚物的微粒，以及聚丙烯酸酯、膠乳、淀粉、纖維素和葡聚糖。其它延遲釋放的載體包括超分子生物載體，其包含非液體親水性?xún)?nèi)核(如，交聯(lián)的多糖或寡糖)以及，任選的，一種包含兩親性化合物(如磷脂)的外層(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5151254，和PCT申請(qǐng)WO94/20078，WO/94/23701和WO 96/06638)。在緩釋制劑中所含的活性化合物的量取決于植入的位點(diǎn)、釋放的速率和期望的持續(xù)時(shí)間以及需要治療或預(yù)防的病癥。
在藥物組合物和疫苗中可使用任一種遞送載體以利于針對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生。遞送載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和其它可經(jīng)改造增加APC效率的細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可經(jīng)過(guò)(但不必)遺傳修飾以增加呈遞抗原的能力，改善T細(xì)胞反應(yīng)的活化和/或維持，使具有自身抗腫瘤作用和/或與受者免疫相容(即HLA單元型匹配)。APC一般可從多種生物液和器官的任一種中分離，包括腫瘤和腫瘤周?chē)慕M織，也可以是自體、同種異體、同基因或異種細(xì)胞。
本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案利用樹(shù)突細(xì)胞或其先祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞為高度有效的APC(Aanchereau和Steinman，自然，392245-251，1998)，已顯示作為生理佐劑用于引發(fā)預(yù)防性或治療性抗腫瘤免疫有效(見(jiàn)，Timmerman和Levy，醫(yī)學(xué)年鑒，50507-529，1999)。一般，樹(shù)突細(xì)胞可基于其典型形狀(原位星形，體外具有明顯的胞質(zhì)加工(樹(shù)突)可見(jiàn))、其高效攝取、加工和呈遞抗原的能力和其激活天然T細(xì)胞反應(yīng)的能力加以鑒別。樹(shù)突細(xì)胞可被當(dāng)然地加工以表達(dá)在體內(nèi)或離體下不常見(jiàn)的特異性細(xì)胞表面受體或配體，且這種修飾的樹(shù)突細(xì)胞被本發(fā)明構(gòu)思。作為樹(shù)突細(xì)胞的替代，分泌的液泡抗原載荷的樹(shù)突細(xì)胞(稱(chēng)為exosomes)也可用在疫苗中(見(jiàn)Zitvogel等，自然醫(yī)學(xué)，4594-600，1998)。
樹(shù)突細(xì)胞和先祖細(xì)胞可獲自外周血、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞、腫瘤周?chē)M織浸潤(rùn)細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍胎血或其它適當(dāng)?shù)亟M織或液體。例如，可加入細(xì)胞因子的組合物(如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNFα)離體分化樹(shù)突細(xì)胞以培養(yǎng)來(lái)自外周血的單核細(xì)胞?；蛘?，獲自外周血、臍胎血或骨髓的CD34陽(yáng)性細(xì)胞可通過(guò)加入一種培養(yǎng)液組合物被分化為樹(shù)突細(xì)胞，所述培養(yǎng)液組合物包含GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配基、LPS、flt3配基和/或其它可誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞分化、成熟和增殖的化合物。
常規(guī)地將樹(shù)突細(xì)胞分類(lèi)為“成熟”和“非成熟”細(xì)胞，其使得可以簡(jiǎn)單的方法區(qū)分兩種充分表征的表型。但是，這一命名應(yīng)當(dāng)不被理解為排除了所有可能的分化中間階段。不成熟樹(shù)突細(xì)胞特征為具有高抗原攝取和加工能力，其與Fcγ受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟細(xì)胞一般特征為這些標(biāo)記物的低表達(dá)，但是負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子(諸如I型II型MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)及共同刺激性分子(如CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表達(dá)。
一般可用編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸(或其部分或其它變體)轉(zhuǎn)染APC，使得多肽或其免疫原性部分在細(xì)胞表面表達(dá)。這種轉(zhuǎn)染可離體發(fā)生，且包含這類(lèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之組合物或疫苗可隨后用于治療目的，如此處所述。或者，靶定樹(shù)突細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因遞送載體可施用于患者，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)染。樹(shù)突細(xì)胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染例如一般可利用任何已知的方法進(jìn)行(如公開(kāi)于WO97/24447的)，或利用基因槍方法(Mahvi等，免疫和細(xì)胞生物學(xué)，75456-460，1997)。樹(shù)突細(xì)胞的抗原載荷可通過(guò)將樹(shù)突細(xì)胞或先祖細(xì)胞與多肽、DNA(裸露的或在質(zhì)粒載體中)或RNA溫育實(shí)現(xiàn)；或與表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒載體)溫育而實(shí)現(xiàn)。載荷前，多肽可與提供T細(xì)胞幫助的免疫伴侶(如載體分子)共價(jià)偶聯(lián)?；蛘?，樹(shù)突細(xì)胞可用非偶聯(lián)的免疫載體單獨(dú)或在存在多肽的條件下標(biāo)記(pulse)。
疫苗和藥物組合物可以單劑量或多劑量容器的形式提供，如密封的安瓿或小瓶。這類(lèi)容器可優(yōu)選牢固地密封以保證制劑在使用時(shí)無(wú)菌。一般，制劑可以懸浮液、溶液或油中的乳液或水性載體形式儲(chǔ)存?；蛘撸呙缁蛩幬锝M合物可以冷凍干燥條件保存，僅需要在使用前加入無(wú)菌液體載體。
上述藥物組合物和疫苗也可以用于，例如治療患者的乳腺癌。本文所使用的＂患者＂指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選的是指人?；颊呖梢曰加幸部梢詻](méi)有乳腺癌。因此，上述藥物組合物和疫苗可以用于防止乳腺癌的發(fā)展或治療患有乳腺癌的患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在手術(shù)去除原發(fā)癌和/或施用放療和常規(guī)化療藥物之前或之后施用這些化合物。為了防止或減緩乳腺癌的發(fā)展，可以把含有本文描述的一種或多種多肽的藥物組合物或疫苗施用給患者。另外，也可以施用編碼多肽的裸DNA或者質(zhì)?；蛘卟《据d體。為了治療患者的乳腺癌，所述藥物組合物或疫苗也可以包含一種或多種多肽、抗體或與編碼本文所述的多肽的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列(例如反義RNA或者反義脫氧核糖核酸寡核苷酸)。
施用的方式、頻率和劑量將根據(jù)個(gè)體的不同而異。一般來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如抽吸)或口服施用藥物組合物或疫苗。1-10個(gè)劑量可以施用52周的療程。優(yōu)選地施用6個(gè)劑量，間隔為1個(gè)月，此后可以階段性地進(jìn)行加強(qiáng)接種。也可以根據(jù)患者個(gè)體的不同而改變施用方案。合適的劑量為當(dāng)施用上述的化合物后能夠提高抗腫瘤免疫反應(yīng)的化合物的量?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定患者的抗腫瘤抗體或通過(guò)疫苗產(chǎn)生的能夠體外殺死患者腫瘤細(xì)胞的溶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。這種疫苗也應(yīng)該可以引起免疫反應(yīng)，和未接種的患者相比，在接種的患者中，這種免疫反應(yīng)能產(chǎn)生改進(jìn)的臨床結(jié)果(例如更快地緩解、完全或部分或更長(zhǎng)的無(wú)病存活)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于含有一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗來(lái)說(shuō)，存在于每一個(gè)劑量中的多肽的量大約為100μg-5mg。合適的劑量的多少將因患者而異，但一般從大約0.1ml-5ml。
本文公開(kāi)的多肽和多核苷酸也可用于用過(guò)繼免疫療法治療癌癥。過(guò)繼免疫療法可大致分為主動(dòng)和被動(dòng)免疫療法。在主動(dòng)免疫療法中，治療依賴(lài)于施用免疫應(yīng)答修飾劑(例如腫瘤疫苗、細(xì)菌佐劑和/或細(xì)胞因子)體內(nèi)刺激內(nèi)源宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤發(fā)生反應(yīng)。
在被動(dòng)免疫療法中，治療涉及具有確定腫瘤免疫活性的、可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的生物劑(如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)的遞送，并不一定依賴(lài)完整宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括T淋巴細(xì)胞(例如CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、CD4+T輔助細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞或表達(dá)所公開(kāi)抗原的抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。本文公開(kāi)的多肽還可用于產(chǎn)生抗體或抗獨(dú)特型抗體(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,918,164)，用于被動(dòng)免疫治療。
獲得用于過(guò)繼免疫治療的足夠數(shù)量T細(xì)胞的主要方法是體外培養(yǎng)免疫T細(xì)胞。將單一抗原特異的T細(xì)胞擴(kuò)大至數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞并保持體內(nèi)抗原識(shí)別的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域熟知的。典型地，這些體外培養(yǎng)條件采用抗原間歇刺激，經(jīng)常是存在細(xì)胞因子(如IL-2)和不分裂飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下。如上所述，本文所述免疫活性多肽可用于快速擴(kuò)大抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物以產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞用于免疫治療。具體地，采用本領(lǐng)域熟知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可用免疫反應(yīng)性多肽間歇刺激(pulse)抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或B細(xì)胞，或者將一或多個(gè)多核苷酸序列轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞。為了使培養(yǎng)的T細(xì)胞在治療中有效，培養(yǎng)的T細(xì)胞必須能大量生長(zhǎng)和分布，并能在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。研究顯示，通過(guò)用補(bǔ)充了IL-2的抗原重復(fù)刺激，可誘導(dǎo)培養(yǎng)的T細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)并以充足的數(shù)量長(zhǎng)期存活(見(jiàn)例如Cheever，M等，出處同前)。
此處公開(kāi)的多肽可用于產(chǎn)生和/或分離腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，其可再施用回患者。在一種技術(shù)中，可利用相應(yīng)于所公開(kāi)的多肽之免疫原性部分的短肽體內(nèi)免疫，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞系。所得抗原特異性CD8+CTL克隆可從患者中分離，利用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增，并返回到患者。
或者，可利用相應(yīng)于多肽之免疫原性部分的肽產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞亞型，方法是體外選擇性刺激和擴(kuò)增自體T細(xì)胞，以提供抗原特異性T細(xì)胞，該T細(xì)胞隨后如Chang等人所述(Crit.Rev.Oncol.Hematol.，22(3)，213，1996)轉(zhuǎn)移至患者。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用相應(yīng)于至少一個(gè)所公開(kāi)多肽之免疫原性部分的肽刺激(pulse)同源或自體樹(shù)突細(xì)胞。所得抗原特異性樹(shù)突細(xì)胞可轉(zhuǎn)移到患者中，或用于刺激T細(xì)胞以提供其后將施用至患者中的抗原特異性T細(xì)胞。在Cheever等人“用培養(yǎng)的T細(xì)胞治療原理再探”，免疫學(xué)綜述，157177，1997)中證實(shí)了肽刺激樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的用途，和這些抗原特異性T細(xì)胞隨后用于在鼠模型中去除腫瘤的用途。
另外，表達(dá)公開(kāi)的多核苷酸之載體可被導(dǎo)入取自患者的干細(xì)胞，體外克隆性擴(kuò)增用于自體移植回相同患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，可從患者外周血中利用市售的細(xì)胞分離系統(tǒng)(如CellPro Incorporated’s(Bothell WA)CEPRATETM系統(tǒng))分離免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如T細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,240,856；5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)?？捎冒谶f送載體(如微球體)中的免疫反應(yīng)性多肽刺激所分離的細(xì)胞，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增腫瘤抗原特異性T細(xì)胞，并將細(xì)胞返回至患者。
本發(fā)明提供下列實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1使用差示RT-PCR制備乳腺癌特異cDNA這一實(shí)施例具體說(shuō)明了使用差示篩選制備編碼乳腺腫瘤特異多肽的cDNA分子。A.B18 Ag1cDNA的制備和mRNA表達(dá)的鑒定制備患有乳腺癌患者的乳腺癌和正常組織的組織樣品，所述乳腺癌是由患者取樣，經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)的。從樣品中提取正常RNA和腫瘤RNA，并分離mRNA，然后使用(dT)12AG(SEQ ID NO.130)錨定的3’引物將mRNA轉(zhuǎn)化成為cDNA。然后使用隨機(jī)選擇的引物(CTTCAACCTC)(SEQ ID NO103)進(jìn)行差示PCR。擴(kuò)增條件是含有1.5mM MgCl2、20pmol引物、500 pmol dNTP和1個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Branchburg，NJ)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。使用94℃變性30秒、42℃退火1分鐘、72℃延伸30秒進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。獲得含有76種擴(kuò)增產(chǎn)物的RNA指紋。盡管乳腺癌組織的RNA指紋與正常的乳腺組織的有98％多的等同性，但是多次觀察到特異性的腫瘤RNA指紋模式的帶。從銀染色的凝膠中切除此帶，亞克隆到T載體(Novagen，Madison，WI)中，并進(jìn)行測(cè)序。
稱(chēng)作B18Ag1的cDNA序列如SEQ ID NO1所示。GENBANK和EMBL的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索表明最早克隆的B18 Ag1片段與內(nèi)源性人逆轉(zhuǎn)錄病毒元件S71具有77％的等同性，S71是與猿肉瘤病毒(SSV)同源的截短逆轉(zhuǎn)錄病毒單元。S71在3’末端含有不完全的gag基因(pol基因的一部分)和LTR樣結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Werner等，病毒學(xué)174225-238(1990))。B18Ag1在相當(dāng)于P30(gag)的基因座區(qū)與SSV也具有64％的等同性。B18Ag1含有三個(gè)分離的且不完全的讀框，其中包含與感染哺乳動(dòng)物的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒gag蛋白具有大量同源性的區(qū)域。此外，與S71的同源區(qū)不正好在gag基因內(nèi)部，但橫越包含LTR的幾個(gè)kb序列。
使用計(jì)算機(jī)分析指導(dǎo)合成Bl8Ag1特異PCR引物。RT-PCR擴(kuò)增(94℃，30秒；60℃→42℃，30秒；72℃，30秒；40個(gè)循環(huán))確認(rèn)B18Ag1是以相對(duì)很高的水平存在于患者乳腺癌組織中的真實(shí)mRNA序列。擴(kuò)增所用的引物為B18Agl-1(CTG CCT GAG CCA CAAATG)(SEQ ID NO.128)和B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGAGGA ATA)(SEQ ID NO.129)，鎂離子濃度為3.5mM，pH為8.5；B18Ag1-2(ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA)(SEQ ID NO.126)和B18Ag1-3(CCG GTA TCT CCT CGT GGT TATT)(SEQ ID NO.127)，鎂離子濃度為2mM，pH為9.5。相同的實(shí)驗(yàn)表明此患者正常的乳腺組織中表達(dá)水平極低，已經(jīng)到了不存在表達(dá)的程度(參見(jiàn)圖1)。然后使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明B18Ag1 mRNA存在于9個(gè)其它的乳腺癌樣品(巴西和美國(guó)患者)中，但在每個(gè)乳腺癌患者的正常乳腺組織中沒(méi)有，或含量極低。RT-PCR分析還表明在各種正常的組織(包括淋巴結(jié)、心肌和肝臟)中不存在B18Ag1轉(zhuǎn)錄物，在PBMC和肺組織中的含量相對(duì)較低。如圖2所示，Northern印跡分析確認(rèn)了B18Ag1 mRNA存在于乳腺癌樣品中，而不存在于正常的乳腺組織中。
RNase保護(hù)分析也確認(rèn)了B18Ag1在乳腺癌組織中的差異表達(dá)。圖3顯示出B18Ag1 mRNA在多種組織類(lèi)型中的水平，此結(jié)果是在4個(gè)不同的RNase保護(hù)測(cè)定中確定的。1-12道是多種正常的乳腺組織樣品；13-25道是多種乳腺癌樣品；26-27道是正常的前列腺樣品；28-29道是前列腺腫瘤樣品；30-32道是結(jié)腸腫瘤樣品；33道是正常的主動(dòng)脈；34道是正常的小腸；35道是正常的皮膚；36道是正常的淋巴結(jié)；37道是正常的卵巢；38道是正常的肝；39道是正常的骨胳肌；40道是第一個(gè)正常的胃部樣品；41道是第二個(gè)正常的胃部樣品；42道是正常的肺；43道是正常的腎；44道是正常的胰腺。在每個(gè)測(cè)定中包含一個(gè)已知的β-肌動(dòng)蛋白信息豐度的陽(yáng)性對(duì)照RNA并相對(duì)于此陽(yáng)性對(duì)照將不同的測(cè)定結(jié)果規(guī)范化，有利于實(shí)驗(yàn)間的比較。
RT-PCR和Southern印跡分析表明B18Ag1基因座以單拷貝的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件存在于人基因組的DNA中。使用最初的B18Ag1序列作為探針?lè)蛛x了大約為12-18kb的基因組克隆。通過(guò)XbaI消化也分離了4個(gè)其它的亞克隆。由這些克隆XbaI消化的末端(如圖4所示)獲得的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒序列如SEQ ID NO3-SEQ ID NO10所示，其中SEQ ID NO3是圖4中標(biāo)號(hào)為10序列的位置；SEQ ID NO4是標(biāo)號(hào)為11-29序列的位置；SEQ ID NO5是標(biāo)號(hào)為3序列的位置；SEQ ID NO6是標(biāo)號(hào)為6序列的位置；SEQ ID NO7是標(biāo)號(hào)為12序列的位置；SEQ ID NO8是標(biāo)號(hào)為13序列的位置；SEQ ID NO9是標(biāo)號(hào)為14序列的位置和SEQ ID NO10是標(biāo)號(hào)為11-22序列的位置。
隨后的研究表明12-18kb的基因組克隆含有大約7.75kb的逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，如圖5A和5B所示。此逆轉(zhuǎn)錄病毒單元的序列如SEQ IDNO141所示。圖5A頂端帶有編號(hào)的直線(xiàn)是指逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組克隆有義鏈序列。此線(xiàn)下面的方框表明選擇的限制酶切位點(diǎn)的位置。箭頭描述出用于對(duì)此克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒元件進(jìn)行測(cè)序的不同重疊克隆。箭頭的方向表示單程亞克隆序列相當(dāng)于有義或者反義鏈。圖5B是含有B18Ag1的逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的示意圖，其描述了此元件中病毒基因的組構(gòu)。代表推測(cè)的讀框的空白方框(從甲硫氨酸開(kāi)始)遍布整個(gè)元件中。方框左邊所示的是6個(gè)可能的讀框，其中1-3讀框相當(dāng)于讀框的有意義鏈。
使用SEQ ID NO1的cDNA作為探針獲得更長(zhǎng)的cDNA(SEQ IDNO227)，與SEQ ID NO141所示的基因組序列相比，此cDNA含有最小的核苷酸差異(不到1％)。B.編碼其它乳腺腫瘤特異多肽的cDNA分子的制備如上所述制備正常的RNA和腫瘤RNA，分離mRNA，并使用(dT)12AG錨定的3’引物將mRNA轉(zhuǎn)化成為cDNA。然后使用隨機(jī)選擇的引物SEQ ID NO87-125進(jìn)行差示PCR。擴(kuò)增條件如上所述，將觀察到的腫瘤RNA指紋模式的特異帶從銀染色的凝膠中切除下來(lái)，亞克隆到T載體(Novagen，Madison，WI)或pCRII載體(Invitrogen，SanDiego，CA)中并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。所得的序列如SEQ ID NO11-SEQ IDNO86所示。在分離的79個(gè)序列中，發(fā)現(xiàn)67個(gè)是新的(SEQ ID NO11-26和28-77)(也參見(jiàn)圖6-20)。
在進(jìn)一步的研究中獲得了抗原B15Ag1(最初鑒定的部分序列見(jiàn)于SEQ ID NO27)的延伸的DNA序列(SEQ ID NO290)。將SEQ IDNO290的序列與上述基因庫(kù)中的序列比較顯示與已知人β-A肌動(dòng)蛋白基因的同源性。進(jìn)一步研究得到了抗原B21GT2(也稱(chēng)為B311D；最初鑒定的部分cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO56)的全長(zhǎng)cDNA序列的分離。全長(zhǎng)序列見(jiàn)于SEQ ID NO307；相應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQ IDNO308。進(jìn)一步研究得到B311D剪接變體的分離。測(cè)定SEQ IDNO316的B311D克隆的序列，來(lái)自該克隆的XhoI/NotI片段用凝膠純化，并利用隨機(jī)引物進(jìn)行32P-cDTP標(biāo)記，用于進(jìn)一步篩選獲得額外B311D基因序列的探針。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩選了人乳腺癌cDNA細(xì)菌文庫(kù)的兩個(gè)級(jí)分。用此方法分離的一個(gè)克隆產(chǎn)生了包含polyA+尾的額外序列。該克隆確定的cDNA序列(也稱(chēng)為B311D_BT1_1A)見(jiàn)于SEQID NO317。SEQ ID NO316和317的序列發(fā)現(xiàn)有超過(guò)464bp區(qū)域的同一性，在接近SEQ ID NO317的polyA+尾處序列不同。
隨后的研究鑒定了額外的146種序列(SEQ ID NO142-289)，其中115種似乎為新的(SEQ ID NO142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288和291)。據(jù)發(fā)明人所了解，在先鑒定的序列從未顯示自人乳腺癌組織中以比在正常乳腺組織中高的水平表達(dá)。
在進(jìn)一步的研究中，分離了數(shù)種抗原B11Ag1(也稱(chēng)為B305D)的不同剪接形式，多種剪接形式中的每一個(gè)含有略微不同的B11Ag1編碼框架版本。剪接結(jié)合序列定義了各個(gè)外顯子，其以多種模式和布置構(gòu)成了多種剪接形式。設(shè)計(jì)引物利用如下述RT-PCR檢查每一外顯子的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)每一外顯子在顯示與原初B11Ag1克隆相同的表達(dá)模式，表達(dá)具有乳腺癌、正常前列腺和正常睪丸特異性。測(cè)定的編碼分離蛋白質(zhì)之外顯子的cDNA序列分別見(jiàn)于SEQ ID NO292-298。相應(yīng)于SEQ ID NO292-298的序列之推定的氨基酸序列見(jiàn)于SEQ IDNO299-300。利用快速cDNA末端擴(kuò)增(RACE)、和如上提供的對(duì)于B11Ag1的剪接形式之一特異性的5’引物，以及乳腺癌進(jìn)行研究，導(dǎo)致三種額外的、相關(guān)剪接形式之分離，分別稱(chēng)為B11C-15/B11C-8和B11C-9，16同工型。這三種同工型的測(cè)定的cDNA序列示于SEQ IDNO301-303，相應(yīng)的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO304-306。
在隨后對(duì)B305同工型A(cDNA序列見(jiàn)于SEQ ID NO292)的研究中，發(fā)現(xiàn)cDNA序列(見(jiàn)SEQ ID NO313)中在位置884中含有額外的鳥(niǎo)嘌呤殘基，導(dǎo)致在開(kāi)放閱讀框中的移碼。此ORF的測(cè)定的DNA序列見(jiàn)SEQ ID NO314。此移碼產(chǎn)生一個(gè)293氨基酸的蛋白質(zhì)序列(見(jiàn)SEQ ID NO315)，其含有與其它B305D同工型相同的C末端結(jié)構(gòu)域，但是在N末端區(qū)域不同。實(shí)施例2從人基因組DNA制備B18Ag1 DNA這一實(shí)施例具體說(shuō)明了通過(guò)擴(kuò)增從人基因組的DNA制備B18Ag1DNA。
可以使用20pmol的B18Ag1特異引物、500pmol dNTP和1個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Branchburg，NJ)，通過(guò)下列擴(kuò)增參數(shù)由250ng人基因組DNA制備Bl8Ag1 DNA94℃變性30秒；由60℃降至42℃退火30秒(每?jī)蓚€(gè)循環(huán)遞減2℃)；72℃延伸30秒。最后的延伸(42℃退火溫度)應(yīng)該循環(huán)25次。使用計(jì)算機(jī)分析選擇引物。合成的引物為B18Ag1-1、B18Ag1-2、B18Ag1-3和B18Ag1-4?？梢允褂玫囊飳?duì)為1+3、1+4、2+3和2+4。
凝膠電泳后，可以將對(duì)應(yīng)于B18Ag1DNA的帶切割下來(lái)，并克隆到合適的載體中。實(shí)施例3從乳腺癌cDNA中制備B18Ag 1 DNA這一實(shí)施例具體說(shuō)明了通過(guò)擴(kuò)增由人乳腺癌cDNA制備B18Ag1DNA。
從由人乳腺癌組織制備的RNA在含有下列成分的反應(yīng)混合物中合成第一條cDNA500ng poly A+RNA、200pmol的引物(T)12AG(即TTT TTT TTT TTT AG)(SEQ ID NO130)、1X第一條鏈逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、6.7mM DTT、500mmol dNTP、1個(gè)單位的AMV或MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(來(lái)源于任何供應(yīng)商，如Gibco-BRL(Grand Island，NY))，總體積為30μl。第一條鏈合成后，將cDNA稀釋大約25倍，取1μl用于如實(shí)施例2中所描述的擴(kuò)增。當(dāng)有些引物對(duì)能夠形成異源轉(zhuǎn)錄物群體時(shí)，引物B18Ag1-2(5′ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(SEQ IDNO126)和B18Ag1-3(5′CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQID NO127)產(chǎn)生單一的151bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例4B18Ag1的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的鑒定這一實(shí)施例具體說(shuō)明了B18Ag 1表位的鑒定。
可以使用各種計(jì)算機(jī)算法篩選B18Ag1序列。為了確定B細(xì)胞表位，使用Hopp(臨床生物學(xué)研究報(bào)告172B367-77(1985))、或Cease等(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1641779-84(1986))或者Spouge等(免疫學(xué)雜志138204-12(1987))的方法篩選序列的疏水和親水值?？梢允褂弥T如AMPHI(如Margalit等，免疫學(xué)雜志1382213(1987))的程序或Rothbard和Taylor的方法(如EMBO J.793(1988))預(yù)測(cè)另外的II類(lèi)MHC(抗體或者B細(xì)胞)表位。
一旦使用這些技術(shù)鑒定了這些肽(長(zhǎng)度為15-20個(gè)氨基酸)，就可以使用自動(dòng)肽合成設(shè)備(可以向生產(chǎn)商購(gòu)買(mǎi)，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster城，CA)和技術(shù)(如Merrifield合成技術(shù))合成每個(gè)肽。合成后，這些肽可以用于篩選正?；蛉橄侔┗颊叩难?，以確定乳腺癌患者是否具有與這些肽反應(yīng)的抗體。在乳腺癌患者中存在這種抗體將證實(shí)正在討論的特異B細(xì)胞表位的免疫原性。也可以檢驗(yàn)這些肽在體內(nèi)免疫動(dòng)物(小鼠、大鼠、兔、chimps等等)后產(chǎn)生血清或體液免疫的能力。這種免疫后，肽-特異抗血清的產(chǎn)生進(jìn)一步證實(shí)了所討論的特異B-細(xì)胞表位的免疫原性。
為了鑒定T細(xì)胞表位，可以使用不同的計(jì)算機(jī)算法(這些算法在鑒定能夠與HLA I類(lèi)MHC分子結(jié)合的B18Ag1序列的8-10個(gè)氨基酸基元中是有用的)篩選B18Ag1序列。(例如參見(jiàn)Rammensee等，免疫遺傳學(xué)41178-228(1995))。合成后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定方法(例如Sette等，免疫學(xué)雜志1535586-92(1994))檢驗(yàn)這些肽與I類(lèi)MHC結(jié)合的能力，更重要的是檢驗(yàn)這些肽在體外刺激患者或者正常外周單核細(xì)胞后產(chǎn)生抗原反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的能力，例如使用Bakker等(癌癥研究555330-34(1995))、Visseren等(免疫學(xué)雜志1543991-98(1995))、Kawakami等(免疫學(xué)雜志1543961-68(1995))和Kast等(免疫學(xué)雜志1523904-12(1994))的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。體外肽刺激后，體外成功地產(chǎn)生能夠殺死自體固有的(含有同樣的I類(lèi)MHC分子)腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞進(jìn)一步證明了B18Ag1抗原的免疫原性。此外，這種肽在體內(nèi)免疫含有表達(dá)特定的人MHC I類(lèi)單元型的轉(zhuǎn)基因的小鼠后，可以使用它們產(chǎn)生鼠肽和B18Ag1反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Vitiello等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1731007-15(1991)。
下面是代表性的預(yù)料B18Ag1 B-細(xì)胞和T-細(xì)胞表位，根據(jù)預(yù)料的HLA I類(lèi)MHC結(jié)合抗原進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)的Th基元(B細(xì)胞表位)(SEQ ID NO131-133)SSGGRTFDDFHRYLLVGIQGAAQKPINLSKXIEVVQGHDESPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA預(yù)測(cè)的HLA A2.1基元(T細(xì)胞表位)(SEQ ID NO134-140)YLLVGIQGAGAAQKPINLNLSKXIEVVEVVQGHDESHLQEAYRIYNLAFVAQAAFVAQAAPDS實(shí)施例5B11AG1的T細(xì)胞表位的鑒定本實(shí)施例顯示B11Ag1(也稱(chēng)為B305D)表位的鑒定。稱(chēng)為B11-8、B11-1、B11-5和B11-12的4個(gè)肽(分別為SEQ ID NO309-312)來(lái)源于B11Ag1基因。
利用樹(shù)突細(xì)胞根據(jù)VAN Tsai等人(免疫學(xué)綜述(Critical Reviewsin Immunology)1865-75，1998)的方法體外對(duì)人CD8 T細(xì)胞用肽B11-8引發(fā)(prime)。得到的CD8 T細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定其識(shí)別B11-8肽或陰性對(duì)照肽(由B-LCL系JY呈遞的)的能力。簡(jiǎn)言之，在存在10μg/ml肽、10ng/ml IL-7和10μg/ml IL2下T細(xì)胞與自體單核細(xì)胞溫育，在標(biāo)準(zhǔn)51-Cr釋放分析中鑒定其特異性裂解靶細(xì)胞的能力。如圖22中所示，多數(shù)培養(yǎng)物系顯示對(duì)B11-8肽的強(qiáng)識(shí)別，而對(duì)肽B11-1為弱識(shí)別。
利用單克隆抗體OKT3和人IL2在快速擴(kuò)增之后從此CTL系分離克隆。如圖23所示，除了能識(shí)別特異性肽，此克隆(稱(chēng)為A1)識(shí)別用B11Ag1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的JY LCL。這一數(shù)據(jù)表明，B11-8是B11Ag1基因的天然加工表位。另外，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞識(shí)別并裂解(以一種HLA-A2限制性的方式)天然表達(dá)B11Ag1的建立的腫瘤細(xì)胞系(圖24)。T細(xì)胞強(qiáng)烈識(shí)別用B11Ag1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然表達(dá)B11Ag1的肺腺癌(LT-140-22)，以及用B11Ag1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的A2+乳腺癌(CAMA-1)，但是不識(shí)別未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系或其它陰性腫瘤系(SW620)。
這些數(shù)據(jù)清楚的顯示，這些人T細(xì)胞不僅識(shí)別B11-特異性肽，還識(shí)別轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，以及天然表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
發(fā)現(xiàn)利用上述方法制備的針對(duì)抗原B11-5和B11-12之CTL細(xì)胞系識(shí)別相應(yīng)的肽包被的靶。實(shí)施例6通過(guò)差示PCR發(fā)現(xiàn)的乳腺癌基因之表征使用RT-PCR確定由差示PCR發(fā)現(xiàn)的乳腺癌基因的特異性與靈敏性。這種方法在不使用大量RNA的情況下就能快速半定量地評(píng)價(jià)乳腺癌基因mRNA的表達(dá)。使用基因特異引物，在多種組織中檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，所述組織包括8個(gè)乳腺腫瘤、5個(gè)正常的乳腺、2個(gè)前列腺腫瘤、2個(gè)結(jié)腸腫瘤、1個(gè)肺腫瘤、14個(gè)其它的正常成年人組織(包括正常的前列腺、結(jié)腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、骨胳肌、皮膚、胃和睪丸)。
為了確保RT-PCR的半定量特性，以β-肌動(dòng)蛋白作為所檢驗(yàn)的每種組織的內(nèi)部對(duì)照。制備第一條cDNA鏈的系列稀釋溶液，使用β-肌動(dòng)蛋白特異引物進(jìn)行RT-PCR測(cè)定。選擇能夠使β-肌動(dòng)蛋白模板實(shí)現(xiàn)線(xiàn)性范圍擴(kuò)增的稀釋溶液，此稀釋溶液能足以反映出原拷貝數(shù)差異的敏感度。使用此條件測(cè)定每種組織中的每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的β-肌動(dòng)蛋白水平。通過(guò)DNase處理和確保陰性結(jié)果(當(dāng)使用的第一條cDNA鏈?zhǔn)窃跊](méi)有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下制備的)來(lái)最大限度地減少DNA污染。
使用基因特異引物確定各種組織中的mRNA表達(dá)水平。到目前為止，已經(jīng)通過(guò)RT-PCR成功地檢驗(yàn)了32個(gè)基因，其中的三個(gè)對(duì)乳腺癌表現(xiàn)出很好的特異性和靈敏度。圖21A和21B描述了這三個(gè)基因的結(jié)果B15AG-1(SEQ ID NO27)、B31GAlb(SEQ ID NO148)和B38GA2a(SEQ ID NO157)。表1總結(jié)了在乳腺組織、乳腺腫瘤和其它組織中測(cè)試的所有基因之表達(dá)水平。
表1在多種組織中表達(dá)的乳腺癌抗原的百分率

從上文的描述應(yīng)該理解，雖然為了具體說(shuō)明本發(fā)明，本文描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是在不背離本發(fā)明的宗旨和范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改進(jìn)。
SEQUENCE LISTING<110>Corixa Corporation<120>用于治療和診斷乳腺癌的組合物和方法<130>210121.41926PC<140>PCT<141>2000-04-07<160>317<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>363<212>DNA<213>Homo sapien<400>1ttagagaccc aattgggacc taattgggac ccaaatttct caagtggagg gagaactttt 60gacgatttcc accggtatct cctcgtgggt attcagggag ctgcccagaa acctataaac 120ttgtctaagg cgattgaagt cgtccagggg catgatgagt caccaggagt gtttttagag 180cacctccagg aggcttatcg gatttacacc ccttttgacc tggcagcccc cgaaaatagc 240catgctctta atttggcatt tgtggctcag gcagccccag atagtaaaag gaaactccaa 300aaactagagg gattttgctg gaatgaatac cagtcagctt ttagagatag cctaaaaggt 360ttt363<210> 2<211> 121<212> PRT<213> Homo sapien<400> 2Leu Glu Thr Gln Leu Gly Pro Asn Trp Asp Pro Asn Phe Ser Ser Gly1 5 10 15Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln20 25 30Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu Ser Lys Ala Ile Glu Val Val35 40 45Gln Gly His Asp Glu Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu50 55 60Ala Tyr Arg Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ala Pro Glu Asn Ser65 70 75 80His Ala Leu Asn Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser Lys85 90 95Arg Lys Leu Gln Lys Leu Glu Gly Phe Cys Trp Asn Glu Tyr Gln Ser100 105 110Ala Phe Arg Asp Ser Leu Lys Gly Phe115 120<210> 3
<211>1080<212>DNA<213>Homo sapien<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(1080)<223>n＝A，T，C or G<400>3tcttagaatc ttcatacccc gaactcttgg gaaaacttta atcagtcacc tacagtctac 60cacccattta ggaggagcaa agctacctca gctcctccgg agccgtttta agatccccca 120tcttcaaagc ctaacagatc aagcagctct ccggtgcaca acctgcgccc aggtaaatgc 180caaaaaaggt cctaaaccca gcccaggcca ccgtctccaa gaaaactcac caggagaaaa 240gtgggaaatt gactttacag aagtaaaacc acaccgggct gggtacaaat accttctagt 300actggtagac accttctctg gatggactga agcatttgct accaaaaacg aaactgtcaa 360tatggtagtt aagtttttac tcaatgaaat catccctcga cgtgggctgc ctgttgccat 420agggtctgat aatggaacgg ccttcgcctt gtctatagtt taatcagtca gtaaggcgtt 480aaacattcaa tggaagctcc attgtgccta tcgacccaga gctctgggca agtagaacgc 540atgaactgca ccctaaaaaa acactcttac aaaattaatc ttaaaaaccg gtgttaattg 600tgttagtctc cttcccttag ccctacttag agttaaggtg caccccttac tgggctgggt 660tctttacctt ttgaaatcat ntttnggaag gggctgccta tctttnctta actaaaaaan 720gcccatttgg caaaaatttc ncaactaatt tntacgtncc tacgtctccc caacaggtan 780aaaaatctnc tgcccttttc aaggaaccat cccatccatt cctnaacaaa aggcctgccn 840ttcttccccc agttaactnt tttttnttaa aattcccaaa aaangaaccn cctgctggaa 900aaacnccccc ctccaanccc cggccnaagn ggaaggttcc cttgaatccc ncccccncna 960anggcccgga accnttaaan tngttccngg gggtnnggcc taaaagnccn atttggtaaa 1020cctanaaatt ttttcttttn taaaaaccac nntttnnttt ttcttaaaca aaaccctntt 1080<210>4<211>1087<212>DNA<213>Homo sapien<220>
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<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>88agtagttgcc 10<210>89<211>11<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>89ttccgttatg c 11<210>90<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>90tggtaaaggg 10<210>91<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>91tcggtcatag 10<210>92<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>92tacaacgagg 10<210>93<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>93tggattggtc10<210>94<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>94ctttctaccc 10<210>95<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>95ttttggctcc 10<210>96<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>96ggaaccaatc 10<210>97<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>97tcgatacagg 10<210>98<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>98ggtactaagg 10<210>99<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>99agtctatgcg10<210>100<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>100ctatccatgg10<210>101<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>101tctgtccaca10<210>102<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>102aagagggtac10<210>103<211>10<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>103cttcaacctc10<210>104<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>104gctcctcttg ccttaccaac 20<210>105<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>105gtaagtcgag cagtgtgatg 20<210>106<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>106gtaagtcgag cagtctgatg 20<210>107<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>107gacttagtgg aaagaatgta 20<210>108<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>108gtaattccgc caaccgtagt 20<210>109<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>109atggttgatc gatagtggaa20<210>110<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>110acggggaccc ctgcattgag 20<210>111<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>111tattctagac cattcgctac 20<210>112<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>112acataaccac tttagcgttc 20<210>113<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>113cgggtgatgc ctcctcaggc 20<210>114<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>114agcatgttga gcccagacac 20<210>115<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>115gacaccttgt ccagcatctg 20<210>116<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>116tacgctgcaa cactgtggag 20<210>117<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>117cgttagggtc tctatccact 20<210>118<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>118agactgactc atgtccccta 20<210>119<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>119tcatcgctcg gtgactcaag 20<210>120<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>120caagattcca taggctgacc 20<210>121<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>121acgtactggt cttgaaggtc 20<210>122<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>122gacgcttggc cacttgacac 20<210>123<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>123gtatcgacgt agtggtctcc 20<210>124<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>124tagtgacatt acgacgctgg 20<210>125<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>125cgggtgatgc ctcctcaggc 20<210>126<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>126atggctattt tcgggggctg aca 23<210>127<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>127ccggtatctc ctcgtgggta tt 22<210>128<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA<400>128ctgcctgagc cacaaatg 18<210>129<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer for amplification from breast tumor cDNA
<400>129ccggaggagg aagctagagg aata24<210>130<211>14<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>130tttttttttt ttag 14<210>131<211>18<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited Th Motifs (B-cell epitopes)<400>131set Ser Gly Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val1 5 10 15Gly Ile<210>132<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited Th Motifs(B-cell epitopes)<221>VARIANT<222>(1)...(22)<223>＝Any Amino Acid<400>132Gln Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val1 5 10 15Val Gln Gly His Asp Glu20<210>133<211>23<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited Th Motifs(B-cell epitopes)
<400>133Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu Ala Tyr Arg Ile Tyr1 5 10 15Thr Pro Phe Asp Leu Ser Ala20<210>134<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<400>134Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln Gly Ala1 5<210>135<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<400>135Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu1 5<210>136<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<221>VARIANT<222>(1)...(9)<223>Xaa＝Any Amino Acid<400>136Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val Val1 5<210>137<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<400>137Glu Val Val Gln Gly His Asp Glu Ser1 5<210>138<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<400>138His Leu Gln Glu Ala Tyr Arg Ile Tyr1 5<210>139<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs (T-cell epitopes)<400>139Asn Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala1 5<210>140<211>9<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Predicited HLA A2.1 Motifs(T-cell epitopes)<400>140Phe Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser1 5<210>141<211>9388<212>DNA<213>Homo sapien<400>141gctcgcggcc gcgagctcaa ttaaccctca ctaaagggag tcgactcgat cagactgtta 60ctgtgtctat gtagaaagaa gtagacataa gagattccat tttgttctgt actaagaaaa 120attcttctgc cttgagatgc tgttaatctg taaccctagc cccaaccctg tgctcacaga 180gacatgtgct gtgttgactc aaggttcaat ggatttaggg ctatgctttg ttaaaaaagt 240gcttgaagat aatatgcttg ttaaaagtca tcaccattct ctaatctcaa gtacccaggg 300acacaataca ctgcggaagg ccgcagggac ctctgtctag gaaagccagg tattgtccaa 360gatttctccc catgtgatag cctgagatat ggcctcatgg gaagggtaag acctgactgt 420cccccagccc gacatccccc agcccgacat cccccagccc gacacccgaa aagggtctgt 480gctgaggagg attagtaaaa gaggaaggcc tctttgcagt tgaggtaaga ggaaggcatc 540tgtctcctgc tcgtccctgg gcaatagaat gtcttggtgt aaaacccgat tgtatgttct 600acttactgag ataggagaaa acatccttag ggctggaggt gagacacgct ggcggcaata 660ctgctcttta atgcaccgag atgtttgtat aagtgcacat caaggcacag cacctttcct 720taaacttatt tatgacacag agacctttgt tcacgttttc ctgctgaccc tctccccact 780attaccctat tggcctgcca catccccctc tccgagatgg tagagataat gatcaataaa 840tactgaggga actcagagac cagtgtccct gtaggtcctc cgtgtgctga gcgccggtcc 900cttgggctca cttttctttc tctatacttt gtctctgtgt ctctttcttt tctcagtctc 960tcgttccacc tgacgagaaa tacccacagg tgtggagggg caggccaccc cttcaataat 1020ttactagcct gttcgctgac aacaagactg gtggtgcaga aggttgggtc ttggtgttca 1080ccgggtggca ggcatgggcc aggtgggagg gtctccagcg cctggtgcaa atctccaaga 1140aagtgcagga aacagcacca agggtgattg taaattttga tttggcgcgg caggtagcca 1200ttccagcgca aaaatgcgca ggaaagcttt tgctgtgctt gtaggcaggt aggccccaag 1260cacttcttat tggctaatgt ggagggaacc tgcacatcca ttggctgaaa tctccgtcta 1320tttgaggctg actgagcgcg ttcctttctt ctgtgttgcc tggaaacgga ctgtctgcct 1380agtaacatct gatcacgttt cccattggcc gccgtttccg gaagcccgcc ctcccatttc 1440cggaagcctg gcgcaaggtt ggtctgcagg tggcctccag gtgcaaagtg ggaagtgtga 1500gtcctcagtc ttgggctatt cggccacgtg cctgccggac atgggacgct ggagggtcag 1560cagcgtggag tcctggcctt ttgcgtccac gggtgggaaa ttggccattg ccacggcggg 1620aactgggact caggctgccc cccggccgtt tctcatccgt ccaccggact cgtgggcgct 1680cgcactggcg ctgatgtagt ttcctgacct ctgacccgta ttgtctccag attaaaggta 1740aaaacggggc tttttcagcc cactcgggta aaacgccttt tgatttctag gcaggtgttt 1800tgttgcacgc ctgggaggga gtgacccgca ggttgaggtt tattaaaata cattcctggt 1860ttatgttatg tttataataa agcaccccaa cctttacaaa atctcacttt ttgccagttg 1920tattatttag tggactgtct ctgataagga cagccagtta aaatggaatt ttgttgttgc 1980taattaaacc aatttttagt tttggtgttt gtcctaatag caacaacttc tcaggcttta 2040taaaaccata tttcttgggg gaaatttctg tgtaaggcac agcgagttag tttggaattg 2100ttttaaagga agtaagttcc tggttttgat atcttagtag tgtaatgccc aacctggttt 2160ttactaaccc tgtttttaga ctctcccttt ccttaaatca cctagccttg tttccacctg 2220aattgactct cccttagcta agagcgccag atggactcca tcttggctct ttcactggca 2280gccccttcct caaggactta acttgtgcaa gctgactccc agcacatcca agaatgcaat 2340taactgttaa gatactgtgg caagctatat ccgcagttcc gaggaattca tccgattgat 2400tatgcccaaa agccccgcgt ctatcacctt gtaataatct taaagcccct gcacctggaa 2460ctattaactt tcctgtaacc atttatcctt ttaacttttt tgcttacttt atttctgtaa 2520aattgtttta actagacctc ccctcccctt tctaaaccaa agtataaaag aagatctagc 2580cccttcttca gagcggagag aattttgagc attagccatc tcttggcggc cagctaaata 2640aatggacttt taatttgtct caaagtgtgg cgttttctct aactcgctca ggtacgacat 2700ttggaggccc cagcgagaaa cgtcaccggg agaaacgtca ccgggcgaga gccgggcccg 2760ctgtgtgctc ccccggaagg acagccagct tgtagggggg agtgccacct gaaaaaaaaa 2820tttccaggtc cccaaagggt gaccgtcttc cggaggacag cggatcgact accatgcggg 2880tgcccaccaa aattccacct ctgagtcctc aactgctgac cccggggtca ggtaggtcag 2940atttgacttt ggttctggca gagggaagcg accctgatga gggtgtccct cttttgactc 3000tgcccatttc tctaggatgc tagagggtag agccctggtt ttctgttaga cgcctctgtg 3060tctctgtctg ggagggaagt ggccctgaca ggggccatcc cttgagtcag tccacatccc 3120aggatgctgg gggactgagt cctggtttct ggcagactgg tctctctctc tctctttttc 3180tatctctaat ctttccttgt tcaggtttct tggagaatct ctgggaaaga aaaaagaaaa 3240actgttataa actctgtgtg aatggtgaat gaatggggga ggacaagggc ttgcgcttgt 3300cctccagttt gtagctccac ggcgaaagct acggagttca agtgggccct cacctgcggt 3360tccgtggcga cctcataagg cttaaggcag catccggcat agctcgatcc gagccggggg 3420tttataccgg cctgtcaatg ctaagaggag cccaagtccc ctaaggggga gcggccaggc 3480gggcatctga ctgatcccat cacgggaccc cctccccttg tttgtctaaa aaaaaaaaaa 3540gaagaaactg tcataactgt ttacatgccc tagggtcaac tgtttgtttt atgtttattg 3600ttctgttcgg tgtctattgt cttgtttagt ggttgtcaag gttttgcatg tcaggacgtc 3660gatattgccc aagacgtctg ggtaagaact tctgcaaggt ccttagtgct gattttttgt 3720cacaggaggt taaatttctc atcaatcatt taggctggcc accacagtcc tgtcttttct 3780gccagaagca agtcaggtgt tgttacggga atgagtgtaa aaaaacattc gcctgattgg 3840gatttctggc accatgatgg ttgtatttag attgtcatac cccacatcca ggttgattgg 3900acctcctcta aactaaactg gtggtgggtt caaaacagcc accctgcaga tttccttgct 3960cacctctttg gtcattctgt aacttttcct gtgcccttaa atagcacact gtgtagggaa 4020acctaccctc gtactgcttt acttcgttta gattcttact ctgttcctct gtggctactc 4080tcccatctta aaaacgatcc aagtggtcct tttcctcctc cctgccccct accccacaca 4140tctcgttttc cagtgcgaca gcaagttcag cgtctccagg acttggctct gctctcactc 4200cttgaaccct taaaagaaaa agctgggttt gagctatttg cctttgagtc atggagacac 4260aaaaggtatt tagggtacag atctagaaga agagagagaa cacctagatc caactgaccc 4320aggagatctc gggctggcct ctagtcctcc tccctcaatc ttaaagctac agtgatgtgg 4380caagtggtat ttagctgttg tggtttttct gctctttctg gtcatgttga ttctgttctt 4440tcgatactcc agccccccag ggagtgagtt tctctgtctg tgctgggttt gatatctatg 4500ttcaaatctt attaaattgc cttcaaaaaa aaaaaaaaaa gggaaacact tcctcccagc 4560cttgtaaggg ttggagccct ctccagtata tgctgcagaa tttttctctc ggtttctcag 4620aggattatgg agtccgcctt aaaaaaggca agctctggac actctgcaaa gtagaatggc 4680caaagtttgg agttgagtgg ccccttgaag ggtcactgaa cctcacaatt gttcaagctg 4740tgtggcgggt tgttactgaa actcccggcc tccctgatca gtttccctac attgatcaat 4800ggctgagttt ggtcaggagc accccttcca tggctccact catgcaccat tcataatttt 4860acctccaagg tcctcctgag ccagaccgtg ttttcgcctc gaccctcagc cggttcagct 4920cgccctgtac tgcctctctc tgaagaagag gagagtctcc ctcacccagt cccaccgcct 4980taaaaccagc ctactccctt agggtcatcc catgtctcct cggctatgtc ccctgtaggc 5040tcatcaccca ttgcctcttg gttgcaaccg tggtgggagg aagtagcccc tctactacca 5100ctgagagagg cacaagtccc tctgggtgat gagtgctcca cccccttcct ggtttatgtc 5160ccttctttct acttctgact tgtataattg gaaaacccat aatcctccct tctctgaaaa 5220gccccaggct ttgacctcac tgatggagtc tgtactctgg acacattggc ccacctggga 5280tgactgtcaa cagctccttt tgaccctttt cacctctgaa gagagggaaa gtatccaaag 5340agaggccaaa aagtacaacc tcacatcaac caataggccg gaggaggaag ctagaggaat 5400agtgattaga gacccaattg ggacctaatt gggacccaaa tttctcaagt ggagggagaa 5460cttttgacga tttccaccgg tatctcctcg tgggtattca gggagctgct cagaaaccta 5520taaacttgtc taaggcgact gaagtcgtcc aggggcatga tgagtcacca ggagtgtttt 5580tagagcacct ccaggaggct tatcggattt acaccccttt tgacctggca gcccccgaaa 5640atagccatgc tcttaatttg gcatttgtgg ctcaggcagc cccagatagt aaaaggaaac 5700tccaaaaact agagggattt tgctggaatg aataccagtc agcttttaga gatagcctaa 5760aaggtttttg acagtcaaga ggttgaaaaa caaaaacaag cagctcaggc agctgaaaaa 5820agccactgat aaagcatcct ggagtatcag agtttactgt tagatcagcc tcatttgact 5880tcccctccca catggtgttt aaatccagct acactacttc ctgactcaaa ctccactatt 5940cctgttcatg actgtcagga actgttggaa actactgaaa ctggccgacc tgatcttcaa 6000aatgtgcccc taggaaaggt ggatgccacc gtgttcacag acagtagcag cttcctcgag 6060aagggactac gaaaggccgg tgcagctgtt accatggaga cagatgtgtt gtgggctcag 6120gctttaccag caaacacctc agcacaaaag gctgaattga tcgccctcac tcaggctctc 6180cgatggggta aggatattaa cgttaacact gacagcaggt acgcctttgc tactgtgcat 6240gtacgtggag ccatctacca ggagcgtggg ctactcacct cagcaggtgg ctgtaatcca 6300ctgtaaagga catcaaaagg aaaacacggc tgttgcccgt ggtaaccaga aagctgattc 6360agcagctcaa gatgcagtgt gactttcagt cacgcctcta aacttgctgc ccacagtctc 6420ctttccacag ccagatctgc ctgacaatcc cgcatactca acagaagaag aaaactggcc 6480tcagaactca gagccaataa aaatcaggaa ggttggtgga ttcttcctga ctctagaatc 6540ttcatacccc gaactcttgg gaaaacttta atcagtcacc tacagtctac cacccattta 6600ggaggagcaa agctacctca gctcctccgg agccgtttta agatccccca tcttcaaagc 6660ctaacagatc aagcagctct ccggtgcaca acctgcgccc 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<221>misc_feature<222>(1)...(1855)<223>n＝A，T，C or G<400>297tgcacgcatc ggccagtgtc tgtgccacgt acactgacgc cccctgagat gtgcacgccg 60cacgcgcacg ttgcacgcgc ggcagcggct tggctggctt gtaacggctt gcacgcgcac 120gccgcccccg cataaccgtc agactggcct gtaacggctt gcaggcgcac gccgcacgcg 180cgtaacggct tggctgccct gtaacggctt gcacgtgcat gctgcacgcg cgttaacggc 240ttggctggca tgtagccgct tggcttggct ttgcattytt tgctkggctk ggcgttgkty 300tcttggattg acgcttcctc cttggatkga cgtttcctcc ttggatkgac gtttcytyty 360tcgcgttcct ttgctggact tgacctttty tctgctgggt ttggcattcc tttggggtgg 420gctgggtgtt ttctccgggg gggktkgccc ttcctggggt gggcgtgggk cgcccccagg 480gggcgtgggc tttccccggg tgggtgtggg ttttcctggg gtggggtggg ctgtgctggg 540atccccctgc tggggttggc agggattgac ttttttcttc aaacagattg gaaacccgga 600gtaacntgct agttggtgaa actggttggt agacgcgatc tgctggtact actgtttctc 660ctggctgtta aaagcagatg gtggctgagg ttgattcaat gccggctgct tcttctgtga 720agaagccatt tggtctcagg agcaagatgg gcaagtggtg cgccactgct tcccctgctg 780cagggggagc ggcaagagca acgtgggcac ttctggagac 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<223>Made in the lab<400>311Gly Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Ile1 5<210>312<211>10<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Made in the lab<400>312Lys Leu Val Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu1 5 10<210>313<211>1852<212>DNA<213>Homo sapiens<400>313ggcacgagaa ttaaaaccct cagcaaaaca ggcatagaag ggacatacct taaagtaata 60aaaaccacct atgacaagcc cacagccaac ataatactaa atggggaaaa gttagaagca 120tttcctctga gaactgcaac aataaataca aggatgctgg attttgtcaa atgccttttc 180tgtgtctgtt gagatgctta tgtgactttg cttttaattc tgtttatgtg attatcacat 240ttattgactt gcctgtgtta gaccggaaga gctggggtgt ttctcaggag ccaccgtgtg 300ctgcggcagc ttcgggataa cttgaggctg catcactggg gaagaaacac aytcctgtcc 360gtggcgctga tggctgagga cagagcttca gtgtggcttc tctgcgactg gcttcttcgg 420ggagttcttc cttcatagtt catccatatg gctccagagg aaaattatat tattttgtta 480tggatgaaga gtattacgtt gtgcagatat actgcagtgt cttcatctct tgatgtgtga 540ttgggtaggt tccaccatgt tgccgcagat gacatgattt cagtacctgt gtctggctga 600aaagtgtttg tttgtgaatg gatattgtgg tttctggatc tcatcctctg tgggtggaca 660gctttctcca ccttgctgga agtgacctgc tgtccagaag tttgatggct gaggagtata 720ccatcgtgca tgcatctttc atttcctgca tttcttcctc cctggatgga cagggggagc 780ggcaagagca acgtgggcac ttctggagac cacaacgact cctctgtgaa gacgcttggg 840agcaagaggt gcaagtggtg ctgccactgc ttcccctgct gcagggggag cggcaagagc 900aacgtggtcg cttggggaga ctacgatgac agcgccttca tggatcccag gtaccacgtc 960catggagaag atctggacaa gctccacaga gctgcctggt ggggtaaagt ccccagaaag l020gatctcatcg tcatgctcag ggacacggat gtgaacaaga gggacaagca aaagaggact 1080gctctacatc tggcctctgc caatgggaat tcagaagtag taaaactcgt gctggacaga 1140cgatgtcaac ttaatgtcct tgacaacaaa aagaggacag ctctgacaaa ggccgtacaa 1200tgccaggaag atgaatgtgc gttaatgttg ctggaacatg gcactgatcc aaatattcca 1260gatgagtatg gaaataccac tctacactat gctgtctaca atgaagataa attaatggcc 1320aaagcactgc tcttatacgg tgctgatatc gaatcaaaaa acaagcatgg cctcacacca 1380ctgctacttg gtatacatga gcaaaaacag caagtggtga aatttttaat caagaaaaaa 1440gcgaatttaa atgcgctgga tagatatgga agaactgctc tcatacttgc tgtatgttgt 1500ggatcagcaa gtatagtcag ccctctactt gagcaaaatg ttgatgtatc ttctcaagat 1560ctggaaagac ggccagagag tatgctgttt ctagtcatca tcatgtaatt tgccagttac 1620tttctgacta caaagaaaaa cagatgttaa aaatctcttc tgaaaacagc aatccagaac 1680aagacttaaa gctgacatca gaggaagagt cacaaaggct taaaggaagt gaaaacagcc 1740agccagagct agaagattta tggctattga agaagaatga agaacacgga agtactcatg 1800tgggattccc agaaaacctg actaacggtg ccgctgctgg caatggtgat ga 1852<210>314<211>879<212>DNA<213>Homo sapiens<400>314atgcatcttt catttcctgc atttcttcct ccctggatgg acagggggag cggcaagagc 60aacgtgggca cttctggaga ccacaacgac tcctctgtga agacgcttgg gagcaagagg 120tgcaagtggt gctgccactg cttcccctgc tgcaggggga gcggcaagag caacgtggtc 180gcttggggag actacgatga cagcgccttc atggatccca ggtaccacgt ccatggagaa 240gatctggaca agctccacag agctgcctgg tggggtaaag tccccagaaa ggatctcatc 300gtcatgctca gggacacgga tgtgaacaag agggacaagc aaaagaggac tgctctacat 360ctggcctctg ccaatgggaa ttcagaagta gtaaaactcg tgctggacag acgatgtcaa 420cttaatgtcc ttgacaacaa aaagaggaca gctctgacaa aggccgtaca atgccaggaa 480gatgaatgtg cgttaatgtt gctggaacat ggcactgatc caaatattcc agatgagtat 540ggaaatacca ctctacacta tgctgtctac aatgaagata aattaatggc caaagcactg 600ctcttatacg gtgctgatat cgaatcaaaa aacaagcatg gcctcacacc actgctactt 660ggtatacatg agcaaaaaca gcaagtggtg aaatttttaa tcaagaaaaa agcgaattta 720aatgcgctgg atagatatgg aagaactgct ctcatacttg ctgtatgttg tggatcagca 780agtatagtca gccctctact tgagcaaaat gttgatgtat cttctcaaga tctggaaaga 840cggccagaga gtatgctgtt tctagtcatc atcatgtaa879<210>315<211>293<212>PRT<213>Homo sapiens<400>315Met His Leu Ser Phe Pro Ala Phe Leu Pro Pro Trp Met Asp Arg Gly5 10 15Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp His Asn Asp Ser Ser20 25 30Val Lys Thr Leu Gly Ser Lys Arg Cys Lys Trp Cys Cys His Cys Phe35 40 45Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val Val Ala Trp Gly Asp50 55 60Tyr Asp Asp Ser Ala Phe Met Asp Pro Arg Tyr His Val His Gly Glu65 70 75 80Asp Leu Asp Lys Leu His Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg85 90 95Lys Asp Leu Ile Val Met Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Arg Asp100 105 110Lys Gln Lys Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser115 120 125Glu Val Val Lys Leu Val Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu130 135 140Asp Asn Lys Lys Arg Thr Ala Leu Thr Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu145 150 155 160Asp Glu Cys Ala Leu Met Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile165 170 175Pro Asp Glu Tyr Gly Asn Thr Thr Leu His Tyr Ala Val Tyr Asn Glu180 185 190Asp Lys Leu Met Ala Lys Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu195 200 205Ser Lys Asn Lys His Gly Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Ile His Glu210 215 220Gln Lys Gln Gln Val Val Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu225 230 235 240Asn Ala Leu Asp Arg Tyr Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys245 250 255Cys Gly Ser Ala Ser Ile Val Ser Pro Leu Leu Glu Gln Asn Val Asp260 265 270Val Ser Ser Gln Asp Leu Glu Arg Arg Pro Glu Ser Met Leu Phe Leu275 280 285Val Ile Ile Met290<210>316<211>584<212>DNA<213>Homo sapiens<400>316agttgggcca aattcccctc cccctacagc ttgaagggga cataaccaat agcctggggt 60ttttttgtgg tcctttggag atttctttgc ttattttctt ctgggtgggg gtgattagag 120gaggcttatc actaatagga aggggagcta tagggaggct aggatatggg ggtaagctga 180gaggtcctcc tgtgggatgt aaatttcaag ctttgcatag tgtattctcc ttcaatgaaa 240agaaagcttg gacataaggt atttcactcc atttgccttc cctcttacag aaaaggtcaa 300gctgcaggat agtattgtaa tctgtacttc cctcaggtgg ccatttttcc ccatcagaga 360gagaatgttg gggccaagcc atagtgcaga aaaaaaaatg agccacctct ttttccaggg 420tttgtgggtc aaatttgtcc cattggctta ggatgcattt caaaggtgag cctgttgatg 480cctgagtgtt tcccatctga aagacaaaac tgcccatggt tttggtttgt tttgtttctc 540cccctgccca agaactatca aactcctgag ccaacaacta aaaa 584<210>317<211>829<212>DNA<213>Homo sapiens<400>317attagcttcc gcttctgaca acactagaga tccctcccct ccctcagggt atggccctcc 60acttcatttt tggtacataa catctttata ggacaggggt aaaatcccaa tactaacagg 120agaatgctta ggactctaac aggtttttga gaatgtgttg gtaagggcca ctcaatccaa 180tttttcttgg tcctccttgt ggtctaggag gacaggcaag ggtgcagatt ttcaagaatg 240catcagtaag ggccactaaa tccgaccttc ctcgttcctc cttgtggtct gggaggaaaa 300ctagtgtttc tgttgctgtg tcagtgagca caactattcc gatcagcagg gtccagggac 360cactgcaggt tcttgggcag ggggagaaac aaaacaaacc aaaaccatgg gcagttttgt 420ctttcagatg ggaaacactc aggcatcaac aggctcacct ttgaaatgca tcctaagcca 480atgggacaaa tttgacccac aaaccctgga aaaagaggtg gctcattttt tttgcactat 540ggcttggccc caacattctc tctctgatgg ggaaaaatgg ccacctgagg gaagtacaga 600ttacaatact atcctgcagc ttgacctttt ctgtaagagg gaaggcaaat ggagtgaaat 660accttatgtc caagctttct tttcattgaa ggagaataca ctatgcaaag cttgaaattt 720acatcccaca ggaggacctc tcagcttacc cccatatcct agcctcccta tagctcccct 780tcctattagt gataagcctc ctctaatcac ccccacccag aagaaaata 829
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其包含至少一個(gè)蛋白質(zhì)的免疫原性部分，或其變體，其中蛋白質(zhì)包含一種由選自如下的多核苷酸序列編碼的氨基酸序列(a)如下所述的序列SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317；(b)在中等嚴(yán)格條件下可與如下所述任一個(gè)序列雜交的序列SEQID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317；和(c)(a)或(b)的序列之互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中多肽包含一種由如下所述任一個(gè)多核苷酸序列編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，或前述多核苷酸序列任一個(gè)的互補(bǔ)物。
3.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO299、300、304-306、308和315中任一個(gè)所述的序列。
4.一種分離的多核苷酸，其編碼一種蛋白質(zhì)的至少15個(gè)氨基酸，或與該蛋白質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)替代、刪除、添加和或插入上不同的變體，使得該變體與抗原特異性抗血清的反應(yīng)基本上不減弱，其中腫瘤蛋白包含由所述多核苷酸所編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有如下所述序列的任一個(gè)SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，或前述序列任一個(gè)的互補(bǔ)物。
5.一種編碼一種蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸，或其變體，其中腫瘤蛋白包含由所述多核苷酸所編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有如下所述序列的任一個(gè)SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，或前述序列任一個(gè)的互補(bǔ)物。
6.一種分離的多核苷酸，其含有如下所述序列的任一個(gè)SEQ IDNO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317。
7.一種分離的多核苷酸，其包含在中等嚴(yán)格條件下可與如下所述序列的任一個(gè)雜交的序列SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317。
8.一種互補(bǔ)于權(quán)利要求4-7中任一個(gè)的多核苷酸的分離的多核苷酸。
9.一種包含權(quán)利要求4-8中任一個(gè)的多核苷酸的表達(dá)載體。
10.一種用權(quán)利要求9的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
11.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含由如下所述任一個(gè)的多核苷酸序列編碼的一種氨基酸序列SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，或前述多核苷酸序列任一個(gè)的互補(bǔ)物。
12.一種融合蛋白，其包含至少一種權(quán)利要求1的多肽。
13.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中融合蛋白含一種在用編碼該融合蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中增加該融合蛋白表達(dá)的表達(dá)增強(qiáng)子。
14.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中融合蛋白包含在權(quán)利要求1的多肽中不存在的T幫助細(xì)胞表位。
15.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中融合蛋白包含一種親和標(biāo)記。
16.一種編碼權(quán)利要求12的融合蛋白之分離的多核苷酸。
17.一種藥物組合物，其包含生理可接受的載體和至少一種選自以下的成分(a)權(quán)利要求1的多肽；(b)權(quán)利要求4的多核苷酸；(c)權(quán)利要求11的抗體；(d)權(quán)利要求12的融合蛋白；和(e)權(quán)利要求16的多核苷酸。
18.一種疫苗，其包含免疫刺激劑和至少一種選自以下的成分(a)權(quán)利要求1的多肽；(b)權(quán)利要求4的多核苷酸；(c)權(quán)利要求11的抗體；(d)權(quán)利要求12的融合蛋白；和(e)權(quán)利要求16的多核苷酸。(c)表達(dá)(a)中多肽的抗原呈遞細(xì)胞；其中接觸步驟是在足以刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的條件和時(shí)間下進(jìn)行的。
36.一種分離的T細(xì)胞群，其包含根據(jù)權(quán)利要求35的方法制備的T細(xì)胞。
37.一種用于抑制患者中癌癥發(fā)展的方法，包括向患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求36的T細(xì)胞群。
38.一種用于抑制患者中癌癥發(fā)展的方法，包括如下步驟(a)與至少一種選自如下的成分一起溫育從患者分離的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞(i)包含蛋白質(zhì)的至少一個(gè)免疫原性部分的多肽，或其變體，其中蛋白質(zhì)包含由選自如下多核苷酸序列編碼的一種氨基酸序列(1)SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317所述的序列；(2)在中等嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317所述序列中任一個(gè)雜交的序列；和(3)(1)或(2)序列的互補(bǔ)物；(ii)編碼(i)的多肽之多核苷酸；和(iii)表達(dá)(i)的多肽之抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；并且(b)向患者施用有效量的增殖的T細(xì)胞，由此抑制患者中癌癥的發(fā)展。
39.一種用于抑制患者中癌癥發(fā)展的方法，包括如下步驟(a)與至少一種選自如下的成分一起溫育從患者分離的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞(i)包含蛋白質(zhì)的至少一個(gè)免疫原性部分的多肽，或其變體，其中蛋白質(zhì)包含由選自如下多核苷酸序列編碼的一種氨基酸序列(1)SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317所述的序列；(2)在中等嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317所述序列中任一個(gè)雜交的序列；和(3)(1)或(2)序列的互補(bǔ)物；(ii)編碼(i)的多肽之多核苷酸；和(iii)表達(dá)(i)的多肽之抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；并且(b)克隆至少一種增殖的細(xì)胞以提供克隆的T細(xì)胞；且(c)向患者施用有效量的克隆的T細(xì)胞，由此抑制患者中癌癥的發(fā)展。
40.一種用于確定患者中是否存在癌癥的方法，包括如下步驟(a)將獲自患者的生物學(xué)樣品與一種可結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合劑相接觸，其中蛋白質(zhì)包含一種氨基酸序列，其由SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317中所述任一個(gè)多核苷酸序列，或者任一前述多核苷酸序列的互補(bǔ)物所編碼；(b)檢測(cè)樣品中與結(jié)合劑結(jié)合的多肽之量；和(c)將該多肽的量與預(yù)定的閾值比較，由此確定患者中是否存在癌癥。
41.權(quán)利要求40的方法，其中結(jié)合劑是一種抗體。
42.權(quán)利要求43的方法，其中抗體是一種單克隆抗體。
43.權(quán)利要求40的方法，其中癌癥是乳腺癌。
44.一種用于監(jiān)測(cè)患者中癌癥進(jìn)程的方法，包括如下步驟(a)將獲自患者的生物學(xué)樣品與一種可結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合劑在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)相接觸，其中蛋白質(zhì)包含一種氨基酸序列，其由SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317中所述任一個(gè)多核苷酸序列，或者任一前述多核苷酸序列的互補(bǔ)物所編碼；(b)檢測(cè)樣品中與結(jié)合劑結(jié)合的多肽之量；和(c)在隨后的時(shí)間點(diǎn)利用獲自患者的生物學(xué)樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)將在步驟(c)中檢測(cè)的該多肽的量與在步驟(b)中檢測(cè)的量比較，由此監(jiān)測(cè)患者中癌癥的進(jìn)程。
45.權(quán)利要求44的方法，其中結(jié)合劑是一種抗體。
46.權(quán)利要求45的方法，其中抗體是一種單克隆抗體。
47.權(quán)利要求44的方法，其中癌癥是乳腺癌。
48.一種用于確定患者中是否存在癌癥的方法，包括如下步驟(a)將獲自患者的生物學(xué)樣品與一種可與編碼如下蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交之寡核苷酸相接觸，其中蛋白質(zhì)包含一種氨基酸序列，其由SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317中所述任一個(gè)多核苷酸序列，或者任一前述多核苷酸序列的互補(bǔ)物所編碼；(b)檢測(cè)樣品中與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量；和(c)將與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量與預(yù)定的閾值比較，由此確定患者中是否存在癌癥。
49.權(quán)利要求48的方法，其中與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量利用聚合酶鏈反應(yīng)確定。
50.權(quán)利要求48的方法，其中與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量利用雜交檢驗(yàn)確定。
51.一種用于監(jiān)測(cè)患者中癌癥進(jìn)程的方法，包括如下步驟(a)將獲自患者的生物學(xué)樣品與一種可與編碼如下蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交之寡核苷酸相接觸，其中蛋白質(zhì)包含一種氨基酸序列，其由SEQ ID NO1、3-26、28-86、142-253、255-298、301-303、307、313、314、316和317中所述任一個(gè)多核苷酸序列，或者任一前述多核苷酸序列的互補(bǔ)物所編碼；(b)檢測(cè)樣品中與寡核苷酸雜交之多核苷酸的量；和(c)在隨后的時(shí)間點(diǎn)利用獲自患者的生物學(xué)樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)將在步驟(c)中檢測(cè)的多核苷酸的量與在步驟(b)中檢測(cè)的量比較，由此監(jiān)測(cè)患者中癌癥的進(jìn)程。
52.權(quán)利要求51的方法，其中與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量利用聚合酶鏈反應(yīng)確定。
53.權(quán)利要求51的方法，其中與寡核苷酸雜交的多核苷酸之量利用雜交檢驗(yàn)確定。
54.一種診斷試劑盒，包含(a)權(quán)利要求11的一種或多種抗體；和(b)包含報(bào)道基團(tuán)的檢測(cè)試劑。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其中抗體被固定在固體支持物上。
56.權(quán)利要求54的試劑盒，其中檢測(cè)試劑包含一種抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。
57.權(quán)利要求54的試劑盒，其中報(bào)道基團(tuán)選自放射性同位素、熒光基團(tuán)、螢光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒。
58.一種包含在中等嚴(yán)格條件下可與一種多核苷酸雜交之10-40個(gè)相鄰核苷酸的寡核苷酸，所述多核苷酸編碼如下蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含由如下所述任一個(gè)的多核苷酸序列編碼的一種氨基酸序列SEQID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317，或前述多核苷酸序列任一個(gè)的互補(bǔ)物。
59.權(quán)利要求58的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含如下任一個(gè)中所述的10-40個(gè)相鄰核苷酸SEQ ID NO1、3-26、28-77、142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-240、243-245、247、250、251、253、255、257-266、268、269、271-273、275、276、278、280、281、284、288、291-298、301-303、307、313、314、316和317。
60.一種診斷試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求59的一種寡核苷酸；和(b)用在聚合酶鏈反應(yīng)或雜交檢驗(yàn)中的檢測(cè)試劑。
全文摘要
公開(kāi)了用于治療和診斷乳腺癌的組合物和方法。提供的化合物包括在乳腺腫瘤組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的核苷酸序列,以及由這些核苷酸序列編碼的多肽。還提供了用于例如預(yù)防和治療乳腺癌的包含上述化合物的疫苗和藥物組合物。多肽也可用于制備抗體,其用于診斷和監(jiān)測(cè)乳腺癌在患者中的進(jìn)程。
文檔編號(hào)C07K16/32GK1352683SQ00807022
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者T·N·弗魯達(dá)克斯, J·M·史密斯, S·G·瑞德, L·E·米施爾, M·W·雷特, D·C·狄隆 申請(qǐng)人:科里克薩有限公司