專利名稱：一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及將乙醇脫氫酶作為外源活性蛋白展示在枯草芽孢桿菌表面的方法和重組芽孢。而言是指利用枯草芽孢桿菌在極端的溫度、干燥以及暴露于有機溶劑和其他毒性化學(xué)物質(zhì)等不利條件下能長期存活的性質(zhì)，通過分子生物學(xué)方法將有活性的乙醇脫氫酶基因與芽孢衣殼蛋白基因重組后進行表達，使原先對溫度和PH不穩(wěn)定的乙醇脫氫酶成為可在不同環(huán)境條件下具有相對穩(wěn)定活性的乙醇脫氫酶融合蛋白。
背景技術(shù)：
乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)屬于氧化還原酶家族，能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)。ADHs在很多生理過程中都起著重要作用，參與例如類固醇、類維生素A、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、脂肪酸、乙醇等代謝過程。在人和哺乳動物體內(nèi)，ADH與乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)構(gòu)成了乙醇脫氫酶系，參與體內(nèi)乙醇代謝，是人和動物體內(nèi)重要的代謝酶。目前，ADH的應(yīng)用研究主要體現(xiàn)在以下幾個方面①ADH生物電極和乙醇生物傳感器，可用于工業(yè)分析乙醇濃度；②ADH的催化特性，在化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用于許多原材料及中間反應(yīng)物的生產(chǎn)；③ADH作為人和動物重要的生理指標用于各項研究；④伴隨生物技術(shù)和酶工業(yè)的發(fā)展，ADH被作為新的實驗材料，用于開展各種新的研究。其中，利用乙醇脫氫酶開發(fā)有效的解酒產(chǎn)品已受到廣泛關(guān)注。在肝臟中，ADH與ALDH總活力的高低決定了乙醇代謝的速度。因此，在眾多的解酒藥物研究方面，ADH活性已被作為一項重要的檢測指標，用于觀察解酒藥物對ADH是否具有誘導(dǎo)作用，以便了解藥物能否加快乙醇分解代謝，從而減少乙醇對人體的損害。同時開發(fā)高活性的ADH與ALDH也已經(jīng)成為解酒藥研究的重要方向之

然而，ADH對乙醇的催化活力對環(huán)境條件敏感，如溫度和PH值不適則易失活，這一缺點極大地影響了 ADH的應(yīng)用前景。隨著生物工業(yè)生產(chǎn)對酶催化功能需求的日益增加，尋求一種新方法生產(chǎn)催化活性更穩(wěn)定的酶蛋白是十分必要的?？莶菅挎邨U菌OfeciBm subtilis)是好氧型的革蘭氏陽性菌，它在營養(yǎng)缺乏或其他脅迫條件下，能形成具有抗逆性的休眠體——芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發(fā)成具有繁殖能力的營養(yǎng)細胞。芽孢易培養(yǎng)易分離，可以免去復(fù)雜的分離純化操作。芽孢是生命世界中抗逆性最強的一種結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性好，能耐氧化，耐高溫，并且在抗化學(xué)藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環(huán)境中存活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，從而順利通過動物消化道。研究證明，枯草芽孢桿菌對生物體無致病性，能作為抑制有害細菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的益生素被人或動物口月艮(Mazza, P. 1994. The use of Bacillus subtil is as an antidiarrhoeal microorganism. Boll. Chim. Farm. 133:3 - 18.)目前市面上已有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產(chǎn)品，北京紫竹藥業(yè)有限公司，國藥準字S20030018(http://WWW. 777aaa. com/html/ yao/20079182;3402711963569(^9.htm)，表明枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產(chǎn)生藥效性。由于以上理化及生理特性，再加上其基因組的破譯和可操作的遺傳系統(tǒng)的建立，枯草芽孢桿菌芽孢成為備受關(guān)注的新型蛋白或酶類藥物載體。芽孢衣殼上的三種蛋白 CotBXotC和CotG由于暴露在芽孢表面而成為外源蛋白的新型表達系統(tǒng)，目前已有報道利用這種新型表達系統(tǒng)成功表達了一些外源蛋白，如對蝦白斑綜合征病毒蛋白Vp^等，但是由于生物的特異性、基因表達受多種因素影響等原因，利用該表達系統(tǒng)是否能成功表達其他特定的活性蛋白仍有待研究。本發(fā)明以從模式生物家蠶力凡niori體內(nèi)克隆得到的乙醇脫氫酶作為外源分子，以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將家蠶乙醇脫氫酶 (BmADH, GeneBank登錄號NP_001037610. 1)展示在芽孢表面，使BmADH獲得大量表達的同時具有良好的抗逆性，提供了快速大量制備具有穩(wěn)定活性的重組乙醇脫氫酶產(chǎn)品的方法。 本發(fā)明的產(chǎn)品在保持了枯草芽孢桿菌芽孢生理特性的基礎(chǔ)上，對乙醇的催化穩(wěn)定性較之原家蠶乙醇脫氫酶蛋白有明顯提高，迄今尚未見類似的報道和發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決乙醇脫氫酶因在極端條件下的不穩(wěn)定性而在工業(yè)應(yīng)用上存在的困難，本發(fā)明以家蠶乙醇脫氫酶BmADH為例，提供了一種表面展示乙醇脫氫酶ADH的重組芽孢的制備方法和產(chǎn)品。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)將 BmADH展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，得到在不同溫度、PH條件下具有較穩(wěn)定活性的融合蛋白，可用于動物直接口服，成為一種新型的乙醇脫氫酶藥物營養(yǎng)品。相對于其他乙醇脫氫酶蛋白產(chǎn)品，本發(fā)明表面展示乙醇脫氫酶蛋白的制備方法和分離過程簡單快速，產(chǎn)生的融合蛋白生物活性更穩(wěn)定，具有更廣泛的應(yīng)用價值。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為
一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶BmADH重組芽孢的制備方法，利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因重組，構(gòu)建融合表達的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生芽孢，在芽孢表面展示具有乙醇脫氫酶活性的融合蛋白。本發(fā)明的具體操作是通過反轉(zhuǎn)錄PCR的方法從家蠶cDNA文庫中擴增獲得家蠶乙醇脫氫酶BmADH的cDNA，將獲得的基因連接到克隆載體中測序正確之后，再將家蠶乙醇脫氫酶基因及aaofe連接到融合表達質(zhì)粒pJS700(本實驗室保存)，構(gòu)建出整合型重組質(zhì)粒 pJS700-BmADH。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，采用耗竭法誘導(dǎo)宿主菌產(chǎn)生芽孢，在芽孢表面展示有融合蛋白CotC-BmADH。本發(fā)明選擇具有良好的轉(zhuǎn)化能力并且可以產(chǎn)生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株為重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，例如feciBtts subtilis 168及其衍生的一系列菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210，USA)；選擇芽孢衣殼蛋白基因 coiC (GenBank 序列號 NP_389653)作為表面展示蛋白的分子載體，選擇家蠶乙醇脫氫酶基因及腕逾為重組基因。 枯草芽孢桿菌為環(huán)境友好型細菌，其在營養(yǎng)缺乏時會分化形成休眠體芽孢，芽孢具有極強的抗逆性，可耐酸堿、耐高溫，存活能力較強；并因其比重大，容易進行分離純化?？莶菅挎邨U菌的培養(yǎng)方法簡單方便，生長迅速，營養(yǎng)要求簡單，容易進行工業(yè)放大培養(yǎng)。在枯草芽孢桿菌的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶，使其在獲得快速大量表達的同時具有良好的抗逆性和穩(wěn)定性，并且分離純化簡便快捷。本發(fā)明涉及發(fā)明所選擇的芽孢衣殼蛋白基因⑶M與ifeai/A基因編碼序列重組后構(gòu)建的重組質(zhì)粒，在此重組質(zhì)粒中含有芽孢衣殼蛋白基因的啟動子、不含終止密碼子的編碼序列與iMaofe基因的編碼序列重組后的基因，可在枯草芽孢桿菌分化形成芽孢時融合表達CotC-BmADH。通過構(gòu)建整合型重組質(zhì)粒，使得融合基因cotC-Bmadh整合于枯草芽孢桿菌染色體上的特定位點并穩(wěn)定地進行遺傳繁殖，避免了質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌細胞中容易丟失的缺點。納Bnmdh的表達載體可以通過熱擊法或電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主細胞。使用本領(lǐng)域熟知的方法鑒定經(jīng)過成功轉(zhuǎn)化帶有本發(fā)明構(gòu)建的融合基因的細胞。如細胞的收集、裂解、淀粉板鑒定、提取染色體和PCR鑒定等，也可以在誘導(dǎo)表達后用BmADH特異抗體進行Western blotting 鑒定。本發(fā)明還涉及所構(gòu)建的重組整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌篩選所得到的重組菌株，這些重組菌株誘導(dǎo)形成的芽孢表面展示有重組家蠶乙醇脫氫酶，可通過SDS-PAGE和 Western blotting檢測其芽孢表面展示的重組蛋白，并檢測其對乙醇的催化活力。本發(fā)明涉及基因ifeai/A編碼序列片段克隆的引物序列
Bmadh-Y :5，-GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3‘，下劃線表示 KpnI 限制性酶切位點；
Bmadh-R :5，-CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3’，下劃線表示 SacI 限制性酶切位
點ο本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌淀粉酶基因也(GenBank序列號NP_388186)片段擴增的引物序列
awE-F :ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG amy^-R :GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT
本發(fā)明的突出優(yōu)點表現(xiàn)為將家蠶乙醇脫氫酶BmADH展示在枯草芽孢桿菌表面，利用芽孢所具有的獨特抗逆性，使得原本對溫度、PH值不穩(wěn)定的酶蛋白成為具有相對穩(wěn)定的乙醇催化活力的融合蛋白，克服了乙醇脫氫酶普遍具有的不穩(wěn)定性缺點。本發(fā)明構(gòu)建的表面展示家蠶乙醇脫氫酶BmADH的枯草芽孢桿菌重組芽孢可通過動物消化道屏障直接用于口服，成為一種新型的乙醇脫氫酶營養(yǎng)品或動物營養(yǎng)品。本發(fā)明產(chǎn)品表達量大、制備方法和分離過程相對于其他乙醇脫氫酶樣品更為簡單快速，具有更好的穩(wěn)定性和更廣泛的應(yīng)用價值，在一定程度上拓展了其工業(yè)應(yīng)用前景，也為提高其他酶蛋白的穩(wěn)定性提供了參考。


圖1是發(fā)明人克隆的家蠶乙醇脫氫酶BmADH在GenBank中檢索到的核苷酸序列和氨基酸序列，登錄號NP_001037610. 1。小寫字母為核苷酸序列，起始密碼子和終止密碼子用方框標出；大寫字母為氨基酸序列，TATA-box用斜體帶下劃線標出，Poly-A信號用下劃線標出，方框中的為保守氨基酸序列。圖2是融合表達CotC-BmADH整合型重組質(zhì)粒pJS700-BmADH的構(gòu)建方法及其結(jié)構(gòu)圖譜。amyE 5’ -end和a 對3’ -end分別表示淀粉酶基因編碼序列的5’端和3’端’Aapr, Enf分別表示氨芐青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因。姚Bacillus subtil is 168 (trpl的芽孢中融合表達CotC-BmADH重組蛋白的基因片段。oriC為大腸桿菌復(fù)制子片段。戰(zhàn)1MEmr-COtC-Bmadh^M六後在Bacillus subtilis 168 (ir/O 染色體中的整合示意圖。圖 4 是重組菌株 ^aciWw1S 力iihi 168 (ir/O/pJS700_BmADH 的淀粉酶活性分析。A 在淀粉平板上培養(yǎng)野生型菌株feciB^s subtilis 168 {trpl和重組菌株feciBm subtilis 168 (ir/O/pJS700-BmADH ；B 在淀粉平板上被碘液染色后的野生型菌株和重組菌株。圖 5是PCR檢測重組菌株中的片段。Marker: λ -EcoT14 I digest Marker ；分別以 feci/A/s 仰況i/is 168 {trpl (Wild-type, W) ^WBacillus subtilis 168 {trpl /pJS700-BmADH (Mutant, M)的染色體為模板，用 amyE-F/amyE-R、BmADH-F/ BmADH -R,BmADH -F/ amyE-R和amyE_F/ BmADH -R四對引物(引物對的在染色體中的位置見附圖3)進行PCR鑒定重組基因。圖6是轉(zhuǎn)基因重組芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白的SDS-PAGE和^festern blotting 鑒定。M 為 Marker，泳道 1 為野生型菌株feci/^As subtilis 168 (ir/O 對照， 泳道2為重組菌株融合蛋白。圖7是轉(zhuǎn)基因重組芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白與原BmADH蛋白在不同 PH值和溫度條件下的乙醇脫氫酶活力比較。實線所示PJS700-BmADH表示本發(fā)明所得融合蛋白，虛線所示BmADH表示原BmADH蛋白。
具體實施例方式實驗材料
各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase, 7 ^、7 《酶，pMD18_T載體均購至寶生物工程 (大連)有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測序由百奧邁科(Biomics) 生物技術(shù)有限公司完成，用于本發(fā)明的所有DNA片段的回收均采用Omega Bio-Tek Gel Extraction Kit分離純化，大腸桿菌菌株DH5 α (中國普通微生物保藏管理中心CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中科院微生物研究所，100101)為本實驗室保存，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，非特別說明的情況下，一般為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的含義。以下實施例中未作具體說明的實驗操作方法均參照《分子克隆實驗指南》 (Sambrook等編著，科學(xué)出版社，1992年版)、試劑盒說明書、及產(chǎn)品說明書進行。以下的實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，并非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實施例中，未詳細描述的一些過程和方法都為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉和了解的常規(guī)方法。所用試劑的來源、 商品名，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的相同。本發(fā)明實施例中涉及的由發(fā)明人保存的生物材料，均可向公眾提供20年。實施例1 家蠶乙醇脫氫酶及 基因的克隆、測序及鑒定
本發(fā)明所用家蠶品種由江蘇大學(xué)生命科學(xué)院飼養(yǎng)提供。取家蠶中腸組織，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮進行研磨，用RNA提取試劑盒分離mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得家蠶乙醇脫氫酶基因的cDNA序列。家蠶乙醇脫氫酶及腕逾基因片段的PCR擴增引物為
Bmadh-Y 5' -GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3' ( SEQ ID NO. 1),下劃線表示KpnI限制性酶切位點；
Bmadh-R 5 -CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3’ (SEQ ID NO. 2)，下劃線表示 SacI限制性酶切位點。PCR反應(yīng)體系按TaKaRa LA Taq使用說明書嚴格進行，25 μ L反應(yīng)體系中含TaKaRa LA Taq 0. 2 μ L, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 2. 5 μ L，模板DNA 1 μ L，上下游引物(20 μ Μ)各0. 5 μ L，加滅菌超純水補齊。PCR條件為 94°C變性 5min，94°C lmin,61°C 40 s，72°C 2min，30 個循環(huán)。將大小為 825bp 的 PCR 產(chǎn)物克隆于PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選克隆菌株，提取質(zhì)粒，通過PCR及^和 SacI雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆后，對重組質(zhì)粒進行測序?？寺〉闹亟M質(zhì)粒命名為pMD18-T-BmADH，重組子菌株命名為DH5 α /pMD18-T_BmADH。陽性重組菌株保存在含有 15%甘油的LB培養(yǎng)基中，凍存于_80°C。經(jīng)測序重組質(zhì)粒中乙醇脫氫酶Bmadh基因序列為SEQ ID NO. 3所示，測序結(jié)果與 GenBank ψ (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) WtlifSlj^^lJ—fji, JAL 1。實施例2 以CotC為載體展示BmADH的枯草芽孢桿菌重組芽孢的制備 1.重組整合型質(zhì)粒pJS700-BmADH的構(gòu)建
質(zhì)粒pJS700(李倩.以CotX為分子載體表面展示W(wǎng)SSV囊膜蛋白Vpl9和Vp^的枯草芽孢桿菌重組芽孢的研究[D].江蘇鎮(zhèn)江江蘇大學(xué)，2010:36-38)由江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院寧德剛副教授惠贈，該質(zhì)粒大小約為5. 51Λ。在pJS700質(zhì)粒中，也5’_end和也3'-end 分別表示淀粉酶基因amyE (GenBank登錄號NP_388186)編碼序列的5’端和3’端，通過同源重組整合在feciBm subtilis 168 (trpl染色體的淀粉酶基因中。淀粉酶基因_yE的PCR擴增引物為 amy^-￥ :ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG (SEQ ID NO. 4) amy^-R :GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT (SEQ ID NO. 5)
Ampr, Emr分別表示氨芐青霉素抗性基因和紅霉素抗性基因，在大腸桿菌和ifeciBm subtilis 168 (trpl中作為篩選標記。coM為枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC基因，該基因片段含有⑶乂基因(GenBank序列號NP_389653)的啟動子序列、不含有coM終止密碼子的CotC編碼序列。oriC為大腸桿菌復(fù)制子片段。分別用KpnY和5^1酶切質(zhì)粒pMD18-T_BmADH和pJS700，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收汝 片段和？幾700，用T4 DNA Iigase連接兩雙酶切后純化好的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB平板中 37°C培養(yǎng)過夜，次日挑選陽性單克隆菌株于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)12至16h，提取質(zhì)粒，通過PCR及f/wl和feci雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，鑒定正確后將重組整合型質(zhì)粒命名為pJS700-BmADH，陽性重組菌株命名為DH5 α / pJS700-BmADHo該重組整合型質(zhì)粒pJS700-BmADH中含有重組基因，該質(zhì)粒的構(gòu)建過程及其圖譜見圖2。
2.融合表達重組芽孢的枯草芽孢桿菌菌株的篩選與鑒定
將整合型重組質(zhì)粒 pJS700-BmADH 轉(zhuǎn)化 feci/A/s subtil is 168 {trpl (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210, USA)，兩者的同源區(qū)域發(fā)生重組，且重組基因插入淀粉酶基因破壞了其淀粉水解酶活性，見圖3。用含有0.4yg/mL紅霉素 (Sigma)的LB平板篩選重組子，從平板上挑選單菌落接種于含1%淀粉的LB平板中，37°C 過夜培養(yǎng)，次日用碘-碘化鉀溶液對淀粉平板染色來鑒定重組菌株。1%淀粉平板的制備方法100mL LB固體培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0. Ig,高壓蒸汽滅菌后倒制平板。碘-碘化鉀溶液的配制碘化鉀2g，碘lg，蒸餾水300mL，先將碘化鉀溶于少量去離子水中，待全部溶解后再加入碘，振蕩溶解后稀釋至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用時可稀釋2 10倍。 取適量碘-碘化鉀溶液滴于淀粉平板上，菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈表明重組基因沒有插入淀粉水解酶基因a 對中，菌落及其周圍顏色變藍表明重組基因成功的插入到了 subtiHs 168 {trpl染色體上的淀粉酶基因也中，因而導(dǎo)致淀粉水解酶失去活性，見圖 4。為了進一步鑒定重組菌株中正確插入了基因，發(fā)明人以枯草芽孢桿菌的染色體為模板，分別以 a _FE-F/a _FE-R、BmADH-F/BmADH-R、BmADH-F/amyE-R 和 amyE-F/BmADH-R四對引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系按TM^Tfe LA Ti^使用說明書嚴格進行，25 μ L 反應(yīng)體系中含 TaKaRa LA Taq 0. 2 μ L, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP Mixture (各 2.5 mM)2. 5 μ L，模板 DNA 1 μ L，上下游引物(20 μ Μ)各 0· 5 μ L， 最后加滅菌超純水補齊。PCR反應(yīng)條件根據(jù)各個引物對的特征分別設(shè)置。在重組菌株中分別檢測到大小約為4200bp、825bp、700bp和2650bp的擴增片段，而野生型菌株中只檢測到約IlOObp的淀粉酶基因，見圖5。這表明重組菌株染色體上含有^/-coiC-^^ofe重組基因， 務(wù)lEnf-cotC-Bmadh重組片段成功的插入到了淀粉水解酶基因a 對中。將鑒定后的重組 MW^ Bacillus subti lis 168 {trpl /pJS700-BmADHo枯草芽孢桿菌染色體的提取方法為挑單菌落接于LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)至OD600值為1. 0左右。取1. 5mL菌液于Eppendorf管中，8000rpm離心IOmin,棄上清，加 100 μ L ρΗ8. 0的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl，1 mM EDTA)洗沉淀，離心去上清，再加100 μ L TE懸浮沉淀；向懸浮液中加30 μ L 100mg/ml溶菌酶溶液，不要搖晃，在37°C培養(yǎng)箱中放 lh，加 50 μ L 10%SDS 和 20 μ L 20mg/mL 蛋白酶 K，37°C繼續(xù)培養(yǎng) Ih ；補 TE 至 300 μ L，分別加150 μ L苯酚和氯仿抽提，12000rpm離心lOmin，取上清；再加300 μ 1氯仿，12000rpm離心 5min,取上清，加1/4體積5M的NaCl，2倍體積的無水乙醇，室溫下沉淀DNA 2h，12000rpm 離心lOmin，收集沉淀，用500yL 70%的乙醇洗沉淀，待揮發(fā)干后，加IOyL TE緩沖液溶解沉淀，取1 μ L用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度，剩余的可放于_20°C中保存?zhèn)溆谩?.表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的誘導(dǎo)及鑒定
用 DSM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組菌株 Bacillus subti lis 168 {trpl /pJS700-BmADH 形成芽孢。DSM 培養(yǎng)基的配方為0. 8% nutrient broth (營養(yǎng)肉湯 Difo)，0. 1% KCl,0. 025% MgSO4 · 7H20,1. OmM Ca(NO3)2 · 4Η20,10μΜ MnCl2,1. ΟμΜ FeSO4。將和重組菌株分別接種于 DSM培養(yǎng)基中，采用耗竭法培養(yǎng)48小時誘導(dǎo)宿主菌產(chǎn)生芽孢，取培養(yǎng)物進行處理。芽孢蛋白的處理方法12000rpmX IOmin離心收集菌體，重懸于相同體積的GTE Buffer (50mM葡萄糖，20mM pH7. 5 Tris-HCl, IOmM EDTA, 2mg/mL溶菌酶)中，37°C處理30分鐘用以破壞營養(yǎng)細胞，12000rpmX IOmin沉淀芽孢，用pH7. 4的PBS洗3次后重懸于相同體積的SDS-DTT緩沖液(0. ImM pH 7.4 PBS,50mM DTT，1. 5%SDS)中，65°C水浴處理 lOmin，進行 SDS-PAGE 后用考馬斯亮藍染色得到大小約為41kD的條帶。為了鑒定該條帶是否為目標融合蛋白，以兔抗 BmADH血清為一抗做Wfestern blotting檢測重組菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。雜交結(jié)果顯示野生型菌株48h的培養(yǎng)物中沒有檢測到蛋白條帶，而重組菌株泳道出現(xiàn)大小約為 41kD的條帶，表示在芽孢形成的過程中，BmADH隨著芽孢衣殼蛋白CotC —同得到表達，因而能作為融合蛋白被BmADH特異抗體檢測到，見圖6。這表明重組芽孢中家蠶乙醇脫氫酶通過衣殼蛋白載體CotC被展示在了重組芽孢的表面。并且從PAGE膠上可以看出，孢子上的其他蛋白相對目標融合蛋白表達量十分小，即雜蛋白量少，體現(xiàn)了本發(fā)明純化步驟簡單的優(yōu)點。4.融合蛋白的乙醇脫氫酶活力測定
由于乙醇脫氫酶在催化乙醇的過程中消耗輔酶NAD+產(chǎn)生NADH，其酶活力可通過用紫外分光光度計在;MOnm處檢測NAD+/NADH的含量測得。反應(yīng)液成分及體積比為2 M乙醇 0. 5M NAD+ 緩沖液=1 3 :2。將本反應(yīng)體系在一定溫度下孵育10分鐘后，按30 1的體積比加入重組孢子蛋白。在第1、4、6、8、10分鐘分別取混合液離心后記錄上清液在340nm處吸光值，讀數(shù)差值記為ΔΑ34。。以野生型菌株feciBm subtilis 168 (ir/7_)的孢子蛋白作為負對照。每分鐘消耗lymol NAD+被定義為1個單位(unit)的乙醇脫氫酶活力。計算公式(AA34tlXV) / (6.22 XbXWX At)，V為反應(yīng)液總體積，b為比色皿厚度，W為樣本蛋白含量，用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測得，Δ t為吸光值改變的前后時間差(分鐘)。為了測得融合蛋白酶活力在不同PH值下的穩(wěn)定性，發(fā)明人選取了 0. IM醋酸鈉緩沖液，pH 4. 0 ；0. IM 磷酸鹽緩沖液(NaH2P04 - Na2HP04)，pH 7· 0 ；0. IM NaOH/ 甘氨酸緩沖液，ρΗ8. 0、9. 0、10. 0，分別作為緩沖液加入反應(yīng)液體系，測定25°C時不同PH值條件下的酶活力。為了測得融合蛋白酶活力在不同溫度下的穩(wěn)定性，發(fā)明人以PH9.0的0. IM NaOH/ 甘氨酸為緩沖液，分別測定融合蛋白在16°C、20°C、25°C、3(TC、37°C下的酶活力。將結(jié)果與原來的 BmADH 蛋白酶活力做比較(Nan Wang, et al. 2QII. Genetics and Molecular Biology, acc印ted)，結(jié)果顯示本發(fā)明所的產(chǎn)品的酶活力穩(wěn)定性大大增加，見圖7。
權(quán)利要求
1.一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的制備方法，其特征在于利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因重組，構(gòu)建融合表達的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢。
2.按照權(quán)利要求1所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢的制備方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為⑶^。
3.按照權(quán)利要求2所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢的制備方法，其特征在于所述的融合表達的整合型重組質(zhì)粒是將枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因⑶M與家蠶乙醇脫氫酶基因重組構(gòu)建的質(zhì)粒。
4.按照權(quán)利要求3所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢的制備方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌重組菌株是整合型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌所得到的菌株，該菌株染色體上含有適用于枯草芽孢桿菌的選擇標記基因、以及芽孢衣殼蛋白基因與家蠶乙醇脫氫酶基因的編碼序列重組后的基因，這些基因插入淀粉酶基因中導(dǎo)致重組菌株的淀粉酶基因失活。
5.按照權(quán)利要求4所述的表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢，其特征在于，重組芽孢是枯草芽孢桿菌重組菌株誘導(dǎo)形成的枯草芽孢桿菌的芽孢，芽孢表面展示有家蠶乙醇脫氫酶BmADH。
6.一種表面展示家蠶乙醇脫氫酶重組芽孢，其特征在于是通過以下方法制備利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶的基因重組，構(gòu)建融合表達的整合型重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導(dǎo)重組菌株產(chǎn)生的芽孢表面展示家蠶乙醇脫氫酶的重組芽孢。
全文摘要
將家蠶乙醇脫氫酶作為外源蛋白展示在枯草芽孢桿菌表面，屬于重組融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因cotC為分子載體，與家蠶乙醇脫氫酶基因Bmadh重組，構(gòu)建出融合表達家蠶乙醇脫氫酶BmADH的整合型重組質(zhì)粒。以之轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，通過同源重組使外源基因整合于染色體上特定位點的淀粉酶基因amyE中，使淀粉酶基因被破壞而導(dǎo)致重組菌株無淀粉酶活性，以此成功地篩選出含有融合表達CotC-BmADH的重組枯草芽孢桿菌菌株。通過誘導(dǎo)表達該重組菌株得到表面展示有家蠶乙醇脫氫酶融合蛋白的芽孢。本發(fā)明使原本對溫度和pH不穩(wěn)定的乙醇脫氫酶成為可在不同環(huán)境條件下具有相對穩(wěn)定活性的乙醇脫氫酶融合蛋白，所產(chǎn)生的重組芽孢可用于動物直接口服。
文檔編號C12R1/125GK102174557SQ20111006327
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者姚勤, 寧德剛, 李國輝, 王楠, 陳克平 申請人:江蘇大學(xué)