本發(fā)明涉及酶工程領(lǐng)域。更具體地，涉及一種玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)主要是由鐮刀菌屬(fusariumspecies)產(chǎn)生的次生代謝物，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素，易受zen污染的糧食作物包括玉米、大麥、小麥、高粱和黑麥等。zen的化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)與雌性激素雌二醇(estradiol)的結(jié)構(gòu)相似，zen能夠與動物細胞膜上的雌激素受體(estrogenreceptor，er)結(jié)合，引起er的構(gòu)象改變，zen/er復(fù)合物被進一步轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與雌激素效應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進而影響細胞的生長和分裂。zen被攝入到哺乳動物體內(nèi)，可引起哺乳動物陰道炎、假發(fā)情及發(fā)情周期延長、流產(chǎn)、不育以及畸形等的“高雌性激素癥”(hyperestrogenism)。zen通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，可導(dǎo)致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等發(fā)病率增加，對人類健康造成巨大威脅。

目前，國內(nèi)外zen的去毒方法主要有物理去除、化學(xué)處理等。對已經(jīng)污染zen真菌毒素谷物的物理、化學(xué)處理方法主要有：沖洗和漂洗、熱處理、離子輻射、無機吸附、化學(xué)試劑的處理及臭氧氧化等。但是，物理化學(xué)脫毒效率并沒有預(yù)期的高，且改變了食品的品質(zhì)，易造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失，且歐盟不允許在食品生產(chǎn)過程中應(yīng)用化學(xué)方法消除真菌毒素。

微生物降解法消除zen污染是利用微生物在代謝過程中產(chǎn)生的酶與zen作用，破壞zen分子的毒性基團，使其被降解或轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物的過程。生物降解法降解zen特異性強、zen分子被轉(zhuǎn)化效率高、不會引起環(huán)境污染，可科學(xué)有效的消除糧食作物中的zen污染，具有極好的應(yīng)用前景

因此，提供一種可有效降解zen的酶類具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因，該酶可以降解玉米赤霉烯酮(zen)。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種表達上述玉米赤霉烯酮降解酶的方法。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種上述玉米赤霉烯酮降解酶的應(yīng)用。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種玉米赤霉烯酮降解酶，被命名為zendease-n1，來源于楊盤二孢菌(marssoninabrunnea)，所述玉米赤霉烯酮降解酶為如(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)：

(a)由序列表sedidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

(b)由序列表sedidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸的取代和/或缺失和/或插入而衍生得到的具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白質(zhì)。

其中，所述序列表sedidno.1所示的氨基酸序列由286個氨基酸殘基組成。

在本發(fā)明中上述玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述編碼基因如(a)或(b)所示：

(a)如序列表sedidno.2所示的核苷酸序列；

(b)編碼如序列表sedidno.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

其中，本發(fā)明中序列表sedidno.2所示的核苷酸序列由861個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第861位堿基，編碼具有序列表sedidno.1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

需要注意的是，含有本發(fā)明上述編碼基因的表達載體、細胞系、工程菌及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明還提供了一種表達玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是將含有上述玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因的重組表達載體導(dǎo)入宿主細胞，表達得到玉米赤霉烯酮降解酶。

其中，所述宿主包括但不限于大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、枯草桿菌、芽孢桿菌或乳桿菌等；優(yōu)選為大腸桿菌，更優(yōu)選的為大腸桿菌bl21。

用于構(gòu)建所述重組大腸桿菌及重組酵母表達載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達外源基因的表達載體，如可在大腸桿菌中表達的pet載體，以及在巴氏德畢赤酵母(pichiapastoris)中表達的ppic9k、ppic9、ppic3.5k等。

上述重組表達載體均可按常規(guī)方法構(gòu)建。

本發(fā)明還提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明得到的玉米赤霉烯酮降解酶可對糧食中真菌毒素玉米赤霉烯酮進行降解，對控制糧食污染起到有效的作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n1的表達產(chǎn)物的sds-page圖；

其中，泳道1，表達產(chǎn)物；泳道m(xù)，蛋白分子量標準(97kd，66kd，45kd，31kd，21.5kd，14.4kd，6.5kd)。

圖2示出玉米赤霉烯酮降解酶能力測定圖。

圖3示出不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解情況。

圖4示出了不同溫度條件下zendease-n1對zen分子的降解情況。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1玉米赤霉烯酮降解酶zendease-n1的獲得及表達

1、玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因的獲得

通過化學(xué)合成方法得到zendease-n1全長基因，以此合成的基因為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進行pcr反應(yīng)，擴增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物1：5'-gaaattcatatgccttcttcactt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.3所示，劃線部分堿基為ndei識別位點)

引物2：5'-cccgtcgacagccccatcctt-3'(其核苷酸序列如序列表sedidno.4所示，劃線部分堿基為sali識別位點)

在pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)條件為：94℃，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次：升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至54℃，保持1分鐘，升溫至68℃，保持2分鐘；然后于68℃，保持10分鐘，最后于4℃保溫10分鐘，結(jié)束擴增反應(yīng)。通過瓊脂糖電泳分析獲得約0.8kb的單一帶，擴增之后的pcr產(chǎn)物檢測之后將目的帶大小的擴增產(chǎn)物用dna凝膠回收試劑盒進行回收，并檢測其濃度?；厥誴cr產(chǎn)物連接pet30avector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，獲得重組質(zhì)粒pet30a-zendease-n1測序鑒定。該玉米赤霉烯酮降解酶基因dna序列如序列表sedidno.2所示，其對應(yīng)的氨基酸序列如序列表sedidno.1所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構(gòu)建

上述所獲得的pcr產(chǎn)物兩端具有ndei和sali限制性內(nèi)切酶位點，用(ndei)和(sali)限制性內(nèi)切酶對pcr產(chǎn)物和質(zhì)粒pet30a同時進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系50μl：目的片段或質(zhì)粒20μl，10×kbuffer5μl，ndei2μl，sali2μl，ddh2o21μl，酶切條件是37℃反應(yīng)3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)柱回收后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，重組表達載體經(jīng)pcr鑒定、酶切鑒定，測序驗證。經(jīng)瓊脂糖電泳后載體?；厥盏哪康钠魏洼d體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用t4dna連接酶進行體外連接，連接反應(yīng)體系10μl：目的片段5μl，pet30a載體2μl10×t4dna連接緩沖液1μl，t4dna連接酶(350u/μl)1μl,ddh2o1μl。16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，分別進行pcr鑒定和重組質(zhì)粒的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為后pet30a-zendease-n1。

超聲波破碎，離心收集上清，取15μl上清用sds-page電泳進行檢測。對pet30a-zendease-n1進行測序，結(jié)果證明融合連接入載體pet30a的dna序列與序列表sedidno.2所示序列相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重組表達載體pet30a-zendease-n1正確。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大腸桿菌中的表達純化

將重組表達載體pet30a-zendease-n1轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布卡那霉素抗性lb平板。挑取平板平板上的單菌落到1llb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細菌生長到od值為1左右時，加入0.5ml濃度為0.6mol/l的iptg誘導(dǎo)表達過夜，次日收菌純化蛋白。將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30ml重懸緩沖液，將細菌沉淀懸起后超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉(zhuǎn)入高速離心管中，高速離心后把上清加入到ni-nta親和柱中，讓其流過親和介質(zhì)。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質(zhì)，洗掉非特異性結(jié)合的雜蛋白，用5ml洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來。用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行zendease-n1蛋白的表達純化分析。用sds-page電泳進行檢測。結(jié)果如圖1所示：泳道1為表達產(chǎn)物，箭頭表示目的條帶，這表明重組菌株表達的蛋白質(zhì)的分子量約31.5kd，與從氨基酸推段出的理論分子量(31.5kd)大小一致。

實施例2玉米赤霉烯酮降解酶的活性檢測

取純化的zendease-n1蛋白50μl，加入到含zen濃度為10μg/ml的eppendorf管中，以不加zendease-n1蛋白的同濃度zen溶液作對照，37℃反應(yīng)6h，100℃加熱10min終止反應(yīng)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干反應(yīng)體系，加入1ml甲醇，超聲萃取，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用高效液相色譜檢測，根據(jù)zen濃度的變化來分析zendease-n1蛋白對zen是否具有降解活性。高效液相色譜檢測zen的色譜條件為：色譜柱：c18柱(250mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流動相：超純水/色譜級乙腈＝50/50(v/v)；流動相流速：1.0ml/min；色譜柱溫度設(shè)定：25℃；進樣量：10μl；熒光檢測器：激發(fā)波長(ex)274nm，發(fā)射波長(em)440nm；采集時間：13min。在上述色譜條件下，對照組樣品在保留時間rt＝10.715min處有強吸收峰，而反應(yīng)組樣品基本無zen目標峰檢出，經(jīng)吸收峰面積計算，已有98％的zen分子被降解，如圖2所示，可以表明，zendease-n1基因克隆表達出的降解酶具有降解玉米赤霉烯酮的活性。

實施例3玉米赤霉烯酮降解酶的反應(yīng)條件檢測

本發(fā)明探索zendease-n1降解zen分子的最佳反應(yīng)條件，測試了不同溫度、ph值等條件下zendease-n1對zen分子降解活性的影響。

首先，測試不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解率。取純化后的zendease-n1降解酶2ml，用pbs緩沖液稀釋100倍，備用；取8只50ml離心管，每支加入稀釋后的降解酶5ml，以鹽酸和氨水調(diào)ph分別至2、3、4、5、6、7、8、9，4℃放置12h后，分別吸取500μl到8支含10μgzen的ep管中，37℃反應(yīng)30min終止反應(yīng)，以不加zendease-n1降解酶的同濃度zen溶液作對照，用高效液相色譜檢測不同ph值條件下zendease-n1對zen分子的降解活性影響。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，在ph＝7的中性條件下，zendease-n1對zen的降解活性最高，而在ph＝4的酸性條件下，zendease-n1對zen分子仍然有較高的降解活性，說明zendease-n1降解酶具有較好的耐酸性。

同樣方法，在ph＝7的條件下，測試4℃、20℃、37℃、45℃、60℃、70℃不同溫度條件下zendease-n1對zen分子的降解活性影響，結(jié)果如圖4所示，表明當溫度為20-37℃時，zendease-n1對zen均具有較好的降解效果，37℃時效果最佳。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。

sequencelisting

<110>國家糧食局科學(xué)研究院

<120>一種玉米赤霉烯酮毒素降解酶zendease-n1及其編碼基因與應(yīng)用

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<213>玉米赤霉烯酮降解酶zendease-n1氨基酸序列

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<213>玉米赤霉烯酮毒素降解酶zendease-n1編碼基因序列

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<213>人工合成引物1

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