專利名稱：抗-α_vβ₆抗體及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域中。具體而言，本發(fā)明涉及識(shí)別αvβ6整聯(lián)蛋白的人源化抗體，所述抗體包含非人起源的可變區(qū)和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本發(fā)明還涉及關(guān)于其制備的過程、包含其的藥物組合物，以及通過施用人源化抗αvβ6抗體治療各種疾病的方法。本發(fā)明還涉及在腫瘤細(xì)胞和組織表面上差異表達(dá)的整聯(lián)蛋白αvβ6的鑒定，這種差異表達(dá)在確定腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能中的用途，以及使用與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的配體特別是抗體，診斷和治療/預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移以及用于清除殘留轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法。
相關(guān)領(lǐng)域 整聯(lián)蛋白是結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白且介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用(一般稱為細(xì)胞粘附事件)的細(xì)胞表面糖蛋白受體(Ruoslahti，E.，J.Clin.Invest.871-5(1991)；Hynes，R.O.，Cell 6911-25(1992))。這些受體由非共價(jià)結(jié)合的alpha(α)和beta(β)鏈構(gòu)成，所述α鏈和β鏈組合以產(chǎn)生具有不同細(xì)胞和粘附特異性的各種異二聚蛋白質(zhì)(Albeda，S.M.，Lab.Invest.684-14(1993))。近期研究已暗示某些整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞粘附、遷移、侵襲、分化、增殖、凋亡和基因表達(dá)(Albeda，S.M.，Lab. Invest.684-14(1993)；Juliano，R.，Cancer Met.Rev.1325-30(1994)；Ruoslahti，E.和Reed，J.C.，Cell 77477-478(1994)；以及Ruoslahti，E.和Giancotti，F(xiàn).G.，Cancer Cells 1119-126(1989)；Plow，Haas等人2000；van der Flier和Sonnenberg 2001)。
αvβ6受體是作為細(xì)胞表面異二聚蛋白質(zhì)表達(dá)的整聯(lián)蛋白家族成員之一(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267(9)5790-5796(1992))。盡管αv亞單位可以與各種β亞單位(β1、β3、β5、β6和β8)形成異二聚體，但β6亞單位只能與αv亞單位作為異二聚體表達(dá)。αvβ6整聯(lián)蛋白已知是纖連蛋白、潛伏相關(guān)肽(LAP)和腱生蛋白C結(jié)合細(xì)胞表面受體，通過其上的RGD三肽結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.2675790-5796(1992)；Weinacker，A.等人，J.Biol.Chem.2696940-6948(1994)；Prieto，A.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9010154-10158(1993))。盡管αvβ6整聯(lián)蛋白在超過10年前首次被鑒定和測(cè)序，但αvβ6特別是在疾病中的生物學(xué)意義仍有待研究。αvβ6的表達(dá)局限于上皮細(xì)胞，在其中它在健康組織中以相對(duì)低的水平表達(dá)，且在發(fā)育、損傷和創(chuàng)傷愈合期間顯著上調(diào)(Breuss，J.M.等人，J.Histochem.Cytochem.411521-1527(1993)；Breuss，J.M.等人，J.Cell Sci.1082241-2251(1995)；Koivisto，L.等人，CellAdhes.Communic.7245-257(1999)；Zambruno，G.等人，J.CellBiol.129(3)853-865(1995)；Hakkinen，L.等人，J.Histochem.Cytochem.48(6)985-998(2000))。日益增加的近期報(bào)道證實(shí)αvβ6在上皮起源的癌癥中是上調(diào)的，所述癌癥包括結(jié)腸癌(Niu，J.等人，Int.J.Cancer 9240-48(2001)；Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115339-347(2005))、卵巢癌(Ahmed，N.等人，J.Cell Biochem.84675-686(2002)；Ahmed，N.等人，J.Histochem.Cytochem.501371-1379(2002)；Ahmed，N.等人，Carcinogen.23237-244(2002))、鱗狀細(xì)胞癌(Koivisto，L.等人，Exp.Cell Res.25510-17(2000)；Xue，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.288610-618(2001)；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Dermatol 11767-73(2001)；Thomas，G.J.等人，Int.J.Cancer 92641-650(2001)；Ramos，D.M.等人，Matrix Biol.21297-307(2002)；(Agrez，M.等人，Br.J.Cancer8190-97(1999)；Hamidi，S.等人，Br.J.Cancer 82(8)1433-1440(2000)；Kawashima，A.等人，Pathol.Res.Pract.99(2)57-64(2003))，和乳腺癌(Arihiro，K.等人，Breast Cancer 719-26(2000))。已報(bào)道αv亞單位可能涉及腫瘤轉(zhuǎn)移，和阻斷這種亞單位從而可以預(yù)防轉(zhuǎn)移(關(guān)于綜述，參見Imhof，B.A.等人，in″Attempts toUnderstand Metastasis Formation I.″U.Günthert和W.Birchmeier，eds.，BerlinSpringer-Verlag，第195-203頁(yè)(1996))。
αvβ6整聯(lián)蛋白在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中可能具有多重調(diào)節(jié)功能。近期研究已證實(shí)β6亞單位的細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)不同細(xì)胞活性。細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域已顯示介導(dǎo)TGF-β活化和粘附(Sheppard，D.，Cancerand Metastasis Rev.24395-402(2005)；Munger，J.S.等人，Cell96319-328(1999))。β6亞單位的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含獨(dú)特的11氨基酸序列，所述氨基酸序列在介導(dǎo)αvβ6調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖、MMP生產(chǎn)、遷移和前存活中是重要的(Li，X.等人，J.Biol.Chem.278(43)41646-41653(2003)；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Derm.117(1)67-73(2001)；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer 87(8)859-867(2002)；Janes，S.M.和Watt，F(xiàn).M.，J.Cell Biol 166(3)419-431(2004))。β6亞單位已被克隆、表達(dá)和純化(Sheppard等人，美國(guó)專利號(hào)6,787,322B2，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考)，和與αvβ6整聯(lián)蛋白選擇性結(jié)合的功能阻斷性抗體已被報(bào)道(Weinreb等人，J.Biol.Chem.27917875-17877(2004)，其公開內(nèi)容整體引入本文作為參考)。αvβ6拮抗劑(包括某些單克隆抗體)已提議作為某些形式的急性肺損傷和纖維化的可能治療(參見美國(guó)專利號(hào)6,692,741 B2和WO 99/07405，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考)。
αvβ6可以通過與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)基序的直接相互作用與幾種配體結(jié)合，所述配體包括纖連蛋白、腱生蛋白、和潛伏相關(guān)肽1和3(LAP1和LAP3)，潛伏前體形式的TGF-β1的N末端278氨基酸(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267(9)5790-5796(1992)；Yokosaki，Y.等人，Biol.Chem.271(39)24144-24150(1996)；Huang，X.Z.等人，J.Cell Sci.1112189-2195(1998)；Munger，J.S.等人，Cell 96319-328(1999))。TGF-β細(xì)胞因子作為潛伏復(fù)合物合成，所述潛伏復(fù)合物具有與成熟活性TGF-β細(xì)胞因子的C末端非共價(jià)結(jié)合的N末端LAP。潛伏TGF-β復(fù)合物不能與其同源受體結(jié)合，且因此直到轉(zhuǎn)換成活性形式才是生物學(xué)活性的(Barcellos-Hoff，M.H.，JMamm.Gland Biol.1(4)353-363(1996)；Gleizes，P.E.等人，Stem Cells 15(3)190-197(1997)；Munger，J.S.等人，Kid.Iht.511376-1382(1997)；Khalil，N.，Microbes Infect.1(15)1255-1263(1999))。αvβ6與LAP1或LAP3結(jié)合導(dǎo)致潛伏前體形式的TGF-β1和TGF-β3活化(Munger，J.S.等人，Cell 96319-328(1999))，被提議是因?yàn)闈摲鼜?fù)合物中的構(gòu)象變化允許TGF-β與其受體結(jié)合。因此，αvβ6的表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致TGF-β局部活化，這依次可以激活下游事件級(jí)聯(lián)事件。
TGF-β1細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和免疫應(yīng)答的多效生長(zhǎng)因子(Wahl，S.M.，J.Exp.Med.1801587-1590(1994)；Massague，J.，Annu.Rev.Biochem.67753-791(1998)；Chen，W.和Wahl，S.M.，TGF-βReceptors，Signaling Pathways and Autoimmunity，BaselKarger，第62-91頁(yè)(2002)；Thomas，D.A.和Massague，J.，Cancer Cell 8369-380(2005))。TGF-β1在癌癥中發(fā)揮的作用是兩面的。雖然TGF-β被公認(rèn)是腫瘤抑制物和生長(zhǎng)抑制活性，但許多腫瘤進(jìn)化出針對(duì)TGF-β1的生長(zhǎng)抑制活性的抗性(Yingling，J.M.等人，Nature Rev.Drug Discov.3(12)1011-1022(2004)；Akhurst，RJ.等人，Trends Cell Biol.11(11)S44-S51(2001)；Balmain，A.和Akhurst，R.J.，Nature 428(6980)271-272(2004))。在已建立的腫瘤中，TGF-β1表達(dá)和活性已涉及促進(jìn)腫瘤存活、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移(Akhurst，R.J.等人，Trends Cell Biol.11(11)S44-S51(2001)；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109(12)1551(2002)；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109(12)1607-1615(2002))。這假定通過局部腫瘤-基質(zhì)環(huán)境中的自分泌和旁分泌效應(yīng)介導(dǎo)，所述效應(yīng)包括TGF-β對(duì)免疫監(jiān)督、血管發(fā)生和增加的腫瘤組織間隙壓的影響。幾項(xiàng)研究已顯示抑制TGF-β1的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)(Akhurst，R.J.，J.Clin.Invest.109(12)1533-1536(2002)；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109(12)1551(2002)；Yingling，J.M.等人，Nat.Rev.DrugDiscov.3(12)1011-1022(2004)；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109(12)1607-1615(2002)；Halder，S.K.等人，Neoplasia 7(5)509-521(2005)；Iyer，S.等人，Cancer Biol.Ther.4(3)261-266(2005))。
αvβ6在腫瘤特別是在腫瘤-基質(zhì)界面上的表達(dá)增加，可能反映TGF-β1局部激活的獨(dú)特機(jī)制以及促進(jìn)腫瘤存活、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。在人轉(zhuǎn)移灶中高水平的表達(dá)推斷αvβ6在建立轉(zhuǎn)移灶中的潛在作用，這與αvβ6可以介導(dǎo)上皮至間充質(zhì)過渡、腫瘤細(xì)胞體外侵襲、和表達(dá)與小鼠模型中的轉(zhuǎn)移相關(guān)的先前報(bào)道一致(Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115(2)339-347(2005)；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer 87(8)859-867(2002)；Morgan，M.R.等人，J.Biol.Chem.279(25)26533-26539(2004))。
我們先前已描述了有效和選擇性抗αvβ6單克隆抗體(mAbs)的產(chǎn)生，所述抗αvβ6單克隆抗體與人和鼠類形式的αvβ6結(jié)合，且阻斷αvβ6與其配體的結(jié)合和αvβ6介導(dǎo)的TGF-β1激活(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)17875-17887(2004))。同樣在整體引入本文作為參考的PCT公開WO 03/100033中描述，開發(fā)和表征了針對(duì)αvβ6的高親和力抗體，包括此類抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)中的關(guān)鍵氨基酸殘基的鑒定和分析。特別地，這些高親和力抗體(a)與αvβ6特異性結(jié)合；(b)抑制αvβ6與其配體例如LAP、纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白的結(jié)合，其IC50值低于10D5的那種(國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO 99/07405)；(c)阻斷TGF-β激活；(d)包含在CDRs中提供針對(duì)αvβ6的結(jié)合特異性的某些氨基酸序列；(e)與β6亞單位特異性結(jié)合；和/或(f)在免疫染色操作中識(shí)別αvβ6，例如石蠟包埋組織的免疫染色。
WO 03/100033還描述了下述發(fā)現(xiàn)與αvβ6結(jié)合的抗體可以分類為生物物理學(xué)不同的類別和亞類。一類抗體顯示阻斷配體(例如，LAP)與αvβ6結(jié)合的能力(阻斷劑)。這類抗體可以進(jìn)一步分成陽(yáng)離子依賴性阻斷劑和陽(yáng)離子非依賴性阻斷劑亞類。某些陽(yáng)離子依賴性阻斷劑包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而陽(yáng)離子非依賴性阻斷劑不包含RGD序列。另一類抗體顯示與αvβ6結(jié)合的能力，但不阻斷αvβ6與配體的結(jié)合(非阻斷劑)。
此外，WO 03/100033公開了包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2和3由某些氨基酸序列組成，所述氨基酸序列提供針對(duì)αvβ6的結(jié)合特異性。WO 03/100033還提供了與αvβ6特異性結(jié)合但不抑制αvβ6與潛伏相關(guān)肽(LAP)結(jié)合的抗體，以及與相同表位結(jié)合的抗體。
WO 03/100033進(jìn)一步公開了雜交瘤6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G 5和7.1C5細(xì)胞，包含編碼序列的分離核酸，和包含抗αvβ6抗體的氨基酸序列的分離多肽。特別地，WO03/100033公開了作為通過雜交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5生產(chǎn)的抗體，包含重和輕鏈多肽序列的抗αvβ6抗體。幾種雜交瘤根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”；P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。特別地，雜交瘤克隆6.3G9和6.8G6于2001年8月16日保藏，且分別具有登記號(hào)ATCC PTA-3649和PTA-3645。由雜交瘤6.3G9和6.8G6生產(chǎn)的鼠類抗體在本申請(qǐng)中進(jìn)一步探究其作為人源化抗體的潛在發(fā)展。
鼠類單克隆抗體3G9是鼠類IgG1，從用人可溶性αvβ6免疫的β6整聯(lián)蛋白-/-小鼠中分離的κ抗體(Huang等人，J.Cell Biol.133921-928(1996))。3G9抗體特異性識(shí)別在損傷、纖維化和癌癥期間以上調(diào)水平表達(dá)的αvβ6整聯(lián)蛋白表位(參見，例如，Thomas等人，J.Invest.Dermatology 11767-73(2001)；Brunton等人，Neoplasia 3215-226(2001)；Agrez等人，Int.J.Cancer 8190-97(1999)；Breuss，J.Cell Science 1082241-2251(1995))。它不與其他αv整聯(lián)蛋白結(jié)合且與人和鼠類分子交叉反應(yīng)。鼠類單克隆抗體3G9已描述阻斷αvβ6與LAP的結(jié)合，如通過阻斷配體與純化的人可溶性αvβ6或β6表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制TGF-β受體活化的促纖維化活性所確定的(參見WO03/100033)。它還已顯示抑制αvβ6介導(dǎo)的TGF-β活化，其IC50值低于已知αvβ6抗體10D5的那種(Huang等人，J Cell Sci.1112189-2195(1998))。
如WO 03/100033中所述，鼠類單克隆抗體8G6是鼠類IgG1，同樣識(shí)別αvβ6整聯(lián)蛋白表位的κ抗體。鼠類單克隆抗體8G6是陽(yáng)離子依賴性、高親和力αvβ6阻斷劑，顯示抑制αvβ6介導(dǎo)的TGF-β活化的能力，其IC50值低于已知10D5的那種(參見WO 03/100033)。
如WO 03/100033中所述，3G9和8G6鼠類抗體在預(yù)防腎和肺纖維化方面有效。此外，鼠類抗體3G9能夠有效抑制人腫瘤異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)，暗示αvβ6在癌癥病理學(xué)中的潛在作用和使用針對(duì)αvβ6抗體的此類阻斷的效力。
因此，需要開發(fā)在人中抗原性更少、且可以用于治療涉及αvβ6途徑的疾病的αvβ6抗體。隨著重組DNA方法的出現(xiàn)，已可能在結(jié)構(gòu)上改造抗體基因、和產(chǎn)生具有不能通過雜交瘤技術(shù)獲得的特性的改良抗體分子。在治療領(lǐng)域中，這種方法的一個(gè)目標(biāo)是通過修飾其初級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)減少嚙齒類動(dòng)物單克隆抗體在人中的免疫原性。治療抗體免疫原性的減少是希望的，因?yàn)槊庖邞?yīng)答的誘導(dǎo)可以在患者中引起一系列不利效應(yīng)，從治療抗體的加速清除，功效隨之喪失，至最極端的致命性過敏反應(yīng)。
減少外源單克隆抗體的免疫原性的一種策略是用人起源的類似結(jié)構(gòu)域替換單克隆抗體的輕和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，而使外源抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域保持完整。輕和重鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)抗體和抗原之間的相互作用。具有與人恒定結(jié)構(gòu)域連接的小鼠可變結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體分子，通常以與嵌合體來源于其的小鼠抗體相同的親和常數(shù)結(jié)合抗原。此類嵌合抗體在人中比其完全小鼠配對(duì)物免疫原性更少。然而，保留完整鼠類可變結(jié)構(gòu)域的抗體往往在大部分患者中引起免疫應(yīng)答。
可預(yù)測(cè)人將設(shè)定針對(duì)整個(gè)鼠類可變結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答，因此，甚至在此類標(biāo)準(zhǔn)嵌合抗體的臨床試驗(yàn)已報(bào)道前，就已開始獲得具有更多人特征的可變結(jié)構(gòu)域的努力。通常稱為“人源化”的一類方法旨在通過重組構(gòu)建具有小鼠和人特征的抗體可變結(jié)構(gòu)域，將鼠類單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)變成更人的形式。人源化策略基于抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的幾個(gè)一致同意的理解。首先，可變結(jié)構(gòu)域包含在種類內(nèi)保守、但在進(jìn)化上遙遠(yuǎn)的種類例如小鼠和人之間不同的肽序列鄰接段。其次，其他鄰接段在種類內(nèi)不是保守的、但即使在相同個(gè)體內(nèi)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞之間也不同。第三，抗體和抗原之間的接觸主要通過可變結(jié)構(gòu)域的非保守區(qū)域發(fā)生。第四，抗體可變結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)構(gòu)在種類中非常相似，使得種類之間的相應(yīng)氨基酸殘基位置可以無需實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)單獨(dú)基于位置來鑒定。
人源化策略共有下述前提用人抗體相應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的殘基替換鼠類序列特征的氨基酸殘基，將減少所得到的抗體在人中的免疫原性。然而，種類之間的序列替換通常導(dǎo)致抗體與其抗原的結(jié)合減少。人源化技術(shù)因此存在下述平衡替換原始鼠類序列以減少免疫原性，和需要人源化分子以保留足夠的抗原結(jié)合以在治療上有用。這種平衡已使用2種方法達(dá)到。
在由美國(guó)專利號(hào)No.5,869,619例示的一種方法中，特有的人殘基代替鼠類可變結(jié)構(gòu)域殘基，所述鼠類可變結(jié)構(gòu)域殘基被確定或預(yù)測(cè)(i)在與抗原的相互作用中不發(fā)揮顯著的化學(xué)作用、和(ii)與伸出到溶劑內(nèi)的側(cè)鏈一起放置。因此，遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)的外部殘基被人源化，而內(nèi)部殘基、抗原結(jié)合位點(diǎn)、和形成可變結(jié)構(gòu)域之間的界面的殘基保留鼠類的。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是需要相當(dāng)廣泛的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以確定殘基在抗原結(jié)合中不發(fā)揮顯著的化學(xué)作用，還是在特定三維抗體結(jié)構(gòu)中將位于溶劑中。
在由美國(guó)專利號(hào)5,225,539例示的另一種更普遍的方法中，視為保守的鼠類可變結(jié)構(gòu)域肽序列的鄰接段用來自人抗體的相應(yīng)段替換。在這種更普遍的方法中，所有可變結(jié)構(gòu)域殘基都是人源化的，除了涉及抗原結(jié)合的非保守區(qū)域外。為了確定用于替換的合適鄰接段，美國(guó)專利號(hào)5,225,539利用先前已由Wu和Kabat，J Exp Med.132(2)211-250(1970)開發(fā)的抗體可變結(jié)構(gòu)域序列分類。
Wu和Kabat開創(chuàng)了抗體肽序列比對(duì)，并且他們?cè)谶@點(diǎn)上的貢獻(xiàn)是數(shù)倍首先，通過研究可變結(jié)構(gòu)域之間的序列相似性，他們鑒定了在所有脊椎動(dòng)物種類的所有抗體中或多或少同源的相應(yīng)殘基，因?yàn)樗鼈儾扇☆愃频娜S結(jié)構(gòu)、發(fā)揮類似的功能作用、與鄰近殘基類似地相互作用、和存在于類似的化學(xué)環(huán)境中。其次，他們?cè)O(shè)計(jì)了其中同源免疫球蛋白殘基被分配相同位置編號(hào)的肽序列編號(hào)系統(tǒng)。無需依賴除序列自身以外的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員即可明確地將現(xiàn)在通常稱為Kabat編號(hào)分配給任何可變結(jié)構(gòu)域序列。第三，對(duì)于每個(gè)Kaba t編號(hào)序列位置，Kabat和Wu計(jì)算出變異性，所述變異性意指當(dāng)可變結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)時(shí)更少或更多可能的氨基酸的發(fā)現(xiàn)。他們鑒定了包埋在4個(gè)變異性較少的鄰接區(qū)域內(nèi)的3個(gè)高變異性的鄰接區(qū)域。其他工作者先前已指出大約在這些區(qū)域(高變區(qū))中的變異性，且斷定高變區(qū)表示用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基。Kabat和Wu正式區(qū)分構(gòu)成這些可變段的殘基，且將這些命名為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDRs)，指抗體和抗原之間的化學(xué)互補(bǔ)性。在可變結(jié)構(gòu)域三維折疊而不是抗原識(shí)別中的作用，歸于現(xiàn)在稱為“框架區(qū)”的剩余變異性較少的區(qū)域。第四，Kabat和Wu建立了抗體肽和核酸序列的公眾數(shù)據(jù)庫(kù)，所述公眾數(shù)據(jù)庫(kù)繼續(xù)被維持且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
由美國(guó)專利號(hào)5,225,539公開的使用Kabat分類的人源化方法，產(chǎn)生包含來自一種抗體的CDR和來自另一種抗體的框架區(qū)的嵌合抗體，所述第二種抗體在種類起源、特異性、亞類或其他特征方面不同。然而，沒有具體序列或特性歸于框架區(qū)，事實(shí)上，美國(guó)專利號(hào)5,225,539教導(dǎo)任何框架組可以與任何CDR組進(jìn)行組合?？蚣苄蛄幸虼艘驯蛔R(shí)別為對(duì)賦予抗體可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)是重要的，所述三維結(jié)構(gòu)是保持良好的抗原結(jié)合所需的。本領(lǐng)域中的后續(xù)發(fā)展已在美國(guó)專利號(hào)5,225,539的范圍內(nèi)改進(jìn)，以處理相對(duì)于相應(yīng)的小鼠抗體，使用某些人源化抗體觀察到的對(duì)于抗原的親合力喪失。
美國(guó)專利號(hào)5,693,761公開了關(guān)于美國(guó)專利號(hào)5,225,539用于抗體人源化的一種改進(jìn)，且基于下述前提將親合力喪失歸于人源化框架中的結(jié)構(gòu)基序問題，由于立體或其他化學(xué)不相容性，所述結(jié)構(gòu)基序干擾CDRs折疊成在小鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的能夠結(jié)合的構(gòu)象。為了解決這個(gè)問題，美國(guó)專利號(hào)5,693,761教導(dǎo)使用在線性肽序列中與待人源化的小鼠抗體的框架序列緊密同源的人框架序列。因此，美國(guó)專利號(hào)5,693,761的方法集中于種類間的框架序列比較。一般地，所有可用的人可變結(jié)構(gòu)域序列與特定小鼠序列比較，且計(jì)算出相應(yīng)框架殘基之間的同一性百分比。選擇具有最高百分比的人可變結(jié)構(gòu)域以提供用于人源化計(jì)劃的框架序列。美國(guó)專利號(hào)5,693,761還教導(dǎo)在人源化框架中保留來自小鼠框架的某些氨基酸殘基是重要的，所述氨基酸殘基對(duì)支持能夠結(jié)合的構(gòu)象的CDRs是關(guān)鍵的。
在其他方法中，通過使單個(gè)殘基回復(fù)小鼠序列且如Riechmann等人，Nature 332(6162)323-327(1988)所述測(cè)定抗原結(jié)合，獲得低親和力的人源化構(gòu)建體后，在實(shí)驗(yàn)上測(cè)定特定框架氨基酸殘基的關(guān)鍵性。用于鑒定框架序列中的氨基酸關(guān)鍵性的另一種示例方法由美國(guó)專利號(hào)5,821,337和美國(guó)專利號(hào)5,859,205公開。這些參考文獻(xiàn)公開了框架中的特異性Kabat殘基位置，所述殘基位置在人源化抗體中可能需要用相應(yīng)的小鼠氨基酸置換，以保留親合力。因此，所得到的部分人和部分小鼠的構(gòu)建框架仍經(jīng)常顯示人免疫原性或減少的抗原結(jié)合，從而在框架構(gòu)建中需要眾多反復(fù)以獲得用于治療用途的合適框架。
本領(lǐng)域因此需要開發(fā)在人中抗原性更少的αvβ6抗體。本發(fā)明為產(chǎn)生與αvβ6特異性反應(yīng)的人源化抗體作準(zhǔn)備。本發(fā)明還提供了用于制備此類人源化抗體的方法，通過提供可靠鑒定合適的人框架序列以支持非人CDR區(qū)域的人源化抗體，和進(jìn)一步提供保留高抗原結(jié)合、在人中具有低免疫原性的人源化抗體。本發(fā)明還提供了與αvβ6反應(yīng)的此類人源化抗體在各種疾病和病癥治療、診斷和/或預(yù)防中的用途。
發(fā)明簡(jiǎn)述 本發(fā)明至少部分基于針對(duì)αvβ6的高親和力人源化抗體的開發(fā)和表征，包括此類抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)中的關(guān)鍵氨基酸殘基的鑒定和分析，以及框架序列中的關(guān)鍵氨基酸殘基的鑒定和分析。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有對(duì)于αvβ6整聯(lián)蛋白的結(jié)合特異性的人源化單克隆抗體，其中所述抗體分別包含SEQ ID NO1和SEQID NO2的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。此類人源化抗體來源于鼠類3G9抗體的人源化，在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含作為其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2和3的分別由SEQ ID NO1的氨基酸殘基31-35、50-65和98-109限定的重鏈。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含作為其CDR 1、2和3的分別由SEQ ID NO2的氨基酸殘基24-35、51-57和90-98限定的輕鏈。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含作為其框架區(qū)(FR)1、2、3和4的分別由SEQ ID NO1的氨基酸殘基1-30、36-49、66-97和110-120限定的重鏈。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含作為其框架區(qū)(FR)1、2、3和4的分別由SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-23、36-50、58-89和99-108限定的輕鏈。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含在SEQ ID NO1的重鏈，且在SEQ ID NO1的重鏈包含至少一個(gè)下述氨基酸置換Q3M和N74S。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含SEQ ID NO2的輕鏈，且SEQ ID NO2的輕鏈包含至少一個(gè)下述氨基酸置換E1Q、L47W、I58V、A60V和Y87F。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含重鏈形式1(“HV1”)，其中重鏈由具有氨基酸置換Q3M和N74S的SEQ ID NO1組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含重鏈形式2(“HV2”)，其中重鏈由具有氨基酸置換N74S的SEQ ID NO1組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含重鏈形式3(“HV3”)，其中重鏈由SEQ ID NO1組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式1(“LV1”)，其中輕鏈由具有氨基酸置換L47W、I58V、A60V和Y87F的SEQ ID NO2組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式2(“LV2”)，其中輕鏈由具有氨基酸置換L47W和I58V的SEQ ID NO2組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式3(“LV3”)，其中輕鏈由具有氨基酸置換L47W的SEQ ID NO2組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式4(“LV4”)，其中輕鏈由具有氨基酸置換E1Q和L47WSEQ ID NO2組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式5(“LV5”)，其中輕鏈由SEQ ID NO2組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含具有HV3和LV5的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈由SEQ ID NO1組成，和其中輕鏈由SEQ ID NO2組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體具有來源于鼠類6.3G9抗體(ATCC登記號(hào)PTA-3649)的CDR。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及具有對(duì)于αvβ6整聯(lián)蛋白的結(jié)合特異性的人源化單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。此類人源化抗體來源于鼠類8G6抗體的人源化。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述重鏈，作為其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2和3分別由SEQ ID NO3的氨基酸殘基(即，除了某些保守變異外)31-35、50-66和99-115限定。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述輕鏈，作為其CDR 1、2和3分別由SEQ ID NO4的氨基酸殘基24-38、54-60和93-101限定。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述重鏈，作為其框架區(qū)(FR)1、2、3和4分別由SEQ ID NO3的氨基酸殘基1-30、36-49、67-98和116-126限定。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述輕鏈，作為其FR 1、2、3和4分別由SEQ ID NO4的氨基酸殘基1-23、39-53、61-92和102-111限定。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述重鏈，所述重鏈由具有至少一個(gè)下述氨基酸置換A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO3組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含下述輕鏈，所述輕鏈由具有至少一個(gè)下述氨基酸置換E1D、L46F和Y49K的SEQ IDNO4組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含其中重鏈由SEQ ID NO3的氨基酸置換A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K組成的重鏈形式1(“HV1”)。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含重鏈形式2(“HV2”)，其中所述重鏈由具有氨基酸置換M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO3組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含重鏈形式3(“HV3”)，其中所述重鏈由具有氨基酸置換V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO3組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式1(light version 1，“LV1”)，其中所述輕鏈由具有氨基酸置換E1D、L46F和Y49K的SEQID NO4組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式2(“LV2”)，其中所述輕鏈由具有氨基酸置換L46F和Y49K的SEQ ID NO4組成。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈形式3(“LV3”)，其中所述輕鏈由具有氨基酸置換Y49K的SEQ ID NO4組成。
在某些實(shí)施方案中，人源化抗體具有來源于鼠類6.8G6抗體的CDR。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體可以與鼠類8G6抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合αvβ6。
本發(fā)明還包含結(jié)合與任何上述抗體相同的表位的人源化抗體。
本發(fā)明還包含通過重組載體產(chǎn)生的人源化抗體，所述重組載體包含編碼所述抗體的核酸。在某些實(shí)施方案中，重組載體是選自pKJS195(SEQID NO5)、pKJS189(SEQ ID NO6)和pKJS196(SEQ ID NO7)的質(zhì)粒。
本發(fā)明還包含包括關(guān)于SEQ ID NO1-7中任何一個(gè)的編碼序列的分離核酸，和包含SEQ ID NO1-7中任何一個(gè)的氨基酸序列的分離多肽。
本發(fā)明還包含包括任何上述人源化抗體的核酸的重組載體。
本發(fā)明還包含包括重組載體的宿主細(xì)胞，所述重組載體包含任何上述人源化抗體的核酸。
本發(fā)明還包含組合物，所述組合物包含本發(fā)明的一種或多種人源化抗體和藥學(xué)可接受的載體。在這些組合物的一些中，人源化抗體與細(xì)胞毒素劑(即損害細(xì)胞存活力和/或功能的試劑)例如毒素或放射性核素綴合。組合物可以施用于具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病、或處于具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病危險(xiǎn)中的受試者(例如哺乳動(dòng)物，例如人)，以便治療(例如，減輕、緩和、減低、預(yù)防、延緩發(fā)作)疾病。此類疾病的例子包括但不限于纖維化(例如，硬皮病、瘢痕化、肝纖維化、肺纖維化和腎纖維化)；牛皮癬；癌癥(如本文其他地方所述，例如上皮癌；口腔、皮膚、子宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、腎、胰腺、前列腺或結(jié)腸直腸癌)；阿爾波特氏綜合征；肺、肝、腎及其他內(nèi)臟器官的急性和慢性損傷；以及肺、肝、腎及其他內(nèi)臟器官的硬化癥。具有此類疾病的危險(xiǎn)可以起因于遺傳傾向；某些生活方式例如吸煙和酗酒；暴露于環(huán)境污染物例如石棉；生理?xiàng)l件例如糖尿病、肝炎病毒感染(丙型肝炎病毒感染)、自身免疫性疾?。缓歪t(yī)學(xué)處理例如放射療法。
本發(fā)明還包含通過在適合于人源化抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)任何上述宿主細(xì)胞，制備任何上述人源化抗體的方法，其中使人源化抗體鏈表達(dá)和產(chǎn)生人源化抗體。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括分離人源化抗體的步驟。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
雜交瘤克隆6.3G9和6.8G6根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年8月16日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”；P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，且分別具有登記號(hào)ATCC PTA-3649和-3645。
本發(fā)明的人源化抗體指完整抗體，例如包含2條重鏈和2條輕鏈的抗體，或完整抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或F(v)片段。本發(fā)明的人源化抗體可以是任何同種型和亞型，例如IgA(例如，IgA1和IgA2)、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ或λ類型。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體可以包含在重鏈的一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、4、5或6)特定位置上的突變(例如，缺失、置換或添加)，從而使得抗體的效應(yīng)子作用(例如，抗體與Fc受體或補(bǔ)體因子結(jié)合的能力)被改變，而不影響抗體的抗原結(jié)合能力。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體可以包含在糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基上的突變，從而使得糖基化位點(diǎn)被消除。此類人源化抗體可以具有臨床利益，減少效應(yīng)子作用或其他不希望有的功能，同時(shí)保留其抗原結(jié)合親和力。糖基化位點(diǎn)的突變還可以有利于方法開發(fā)(例如，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，人源化抗體包含其CDRs來源于鼠類3G9抗體的去糖基輕鏈。在某些實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中CDR1區(qū)包含在SEQ ID NO2氨基酸殘基26上的天冬酰胺(N)至絲氨酸(S)的置換。鼠類3G9CDR1區(qū)包含在這個(gè)氨基酸位置上的天冬酰胺。然而，在3G9抗體的人源化形式中，所有5種輕鏈形式(LV1、LV2、LV3、LV4和LV5)包含在3G9 CDR1區(qū)內(nèi)的這個(gè)位置上的絲氨酸。在人源化3G9抗體的所有輕鏈形式中這個(gè)位點(diǎn)的去糖基化(aglycosyl)已顯示有利于蛋白質(zhì)表達(dá)和輕鏈純化。在某些其他實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含在通常是正常Fc受體結(jié)合所需的糖基化位點(diǎn)上的突變。在某些實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)的氨基酸置換。在某些實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含在重鏈形式3(HV3)中N至Q的氨基酸置換，所述HV3由包含質(zhì)粒pKJS196(SEQ ID NO7)的重組載體產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，N至Q的氨基酸置換在SEQ ID NO7的氨基酸殘基319上發(fā)生。人源化3G9抗體的重鏈形式3(HV3)中這個(gè)位點(diǎn)的去糖基化已顯示去除糖基化信號(hào)，而不影響人源化抗體的抗原結(jié)合親和力，所述糖基化信號(hào)是正常Fc受體結(jié)合所需的。在某些實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含由包含質(zhì)粒pKJS189(SEQID NO6)的重組載體產(chǎn)生的重鏈形式3(HV3)，和由包含質(zhì)粒pKJS195(SEQ ID NO5)的重組載體產(chǎn)生的輕鏈形式5(LV5)。在某些實(shí)施方案中，人源化3G9抗體包含由包含質(zhì)粒pKJS196(SEQ ID NO7)的重組載體產(chǎn)生的去糖基重鏈形式3(a-HV3)，和由包含質(zhì)粒pKJS195(SEQID NO5)的重組載體產(chǎn)生的輕鏈形式5(LV5)。
在再其他的實(shí)施方案中，重或輕鏈可以包含增加親和力或效力的突變。
本發(fā)明的人源化抗體對(duì)于治療任何臨床上不希望有的病狀或疾病(如本文所述)有用，所述病狀或疾病由αvβ6與其配體例如LAP和纖連蛋白結(jié)合來介導(dǎo)。這些人源化抗體經(jīng)由更高的親和力或親合力、以及與配體的陽(yáng)離子依賴性或非依賴性結(jié)合，可以比先前已知的αvβ6抗體更有效。與鼠類單克隆抗體形成對(duì)比，本發(fā)明的人源化抗體在受試者特別是人體內(nèi)將不引起抗小鼠免疫球蛋白抗體產(chǎn)生，而是顯示延長(zhǎng)的血液半衰期，不利反應(yīng)的頻率減少，從而使得可以預(yù)期它在治療由αvβ6介導(dǎo)的疾病功效方面優(yōu)于小鼠單克隆抗體。
在另外的方面，本發(fā)明涉及使用αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體，診斷、治療和預(yù)防癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于減少或預(yù)防患者中的原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移至次級(jí)部位的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與原發(fā)性腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏感性或侵襲力減少。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減少或預(yù)防患者中的轉(zhuǎn)移前腫瘤進(jìn)展至轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與轉(zhuǎn)移前腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致減少或預(yù)防轉(zhuǎn)移前癌癥細(xì)胞侵入原發(fā)性腫瘤周圍的組織區(qū)域內(nèi)。在本發(fā)明的某些此類實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是癌，例如腺癌。在更具體的實(shí)施方案中，癌是乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌或脾臟癌。更具體而言，癌是乳腺癌(包括但不限于原位乳腺癌，例如原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS))、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮頸癌或肺癌。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的合適實(shí)施方案使用αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體，所述結(jié)合配體是αvβ6結(jié)合抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。根據(jù)某些此類實(shí)施方案，抗體是單克隆抗體(它可以是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化的)，包括美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)US2005/0255102A1中公開的那些，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文。合適的此類抗體包括但不限于，命名為1A8、3G9、8G6、2B1、2B10、2A1、2E5、1G10、7G5、1C5、10D5(ATCC保藏號(hào)HB12382)和CSβ6的αvβ6結(jié)合單克隆抗體，及其片段、嵌合體和雜交物。特別適合于在本發(fā)明的此類實(shí)施方案中使用的是單克隆抗體3G9和8G6。同樣特別適合于在本發(fā)明的此類實(shí)施方案中使用的是人源化單克隆抗體，例如命名為hu3G9(BG00011)的人源化3G9抗體和命名為hu8G6的人源化8G6抗體。
在本發(fā)明的某些此類治療實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體(例如，αvβ6結(jié)合抗體)與一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑綴合或結(jié)合，在αvβ6結(jié)合配體-毒素化合物綴合物與細(xì)胞或組織上的一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合后，所述細(xì)胞毒素化合物或試劑導(dǎo)致或引起細(xì)胞或組織死亡。在本發(fā)明另外的治療實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體(例如，αvβ6結(jié)合抗體)結(jié)合一種或多種此類細(xì)胞毒素化合物或試劑施用于患者。可以根據(jù)本發(fā)明的這些方面適當(dāng)使用的細(xì)胞毒素化合物或試劑包括但不限于，細(xì)胞毒素劑(例如，順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、卡里奇霉素(calicheamicin)、美登素、trichothene、CC1065、白喉A鏈、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(zhì)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶)，放射性同位素(例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素)，和前體藥物活化酶(例如堿性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脫氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶)。在某些實(shí)施方案中，一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體以藥物組合物的形式施用于患者，所述藥物組合物包含有效量的一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體和/或包含一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體的一種或多種藥物組合物，可以通過施用藥物組合物的任何合適方式施用于患者，包括但不限于，口部施用、腸胃外施用(包括例如，經(jīng)由肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑注射)、顱內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、肺內(nèi)施用和鼻內(nèi)施用。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷或鑒定更可能進(jìn)展至侵襲癌的癌例如腺癌，和/或更可能響應(yīng)使用配體的治療的癌，所述配體與一種或多種整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合。合適的此類方法可以包括例如，(a)從患者獲得包含腫瘤或其部分的癌性上皮組織樣品，和非癌性上皮組織樣品；(b)使組織樣品與一種或多種配體接觸，所述配體與一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合；和(c)測(cè)定組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，其中相對(duì)于非癌性組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，癌性組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平增加指示在患者中存在癌，所述癌(a)從原位或非侵襲形式進(jìn)展至侵襲、轉(zhuǎn)移形式的可能性增加；和/或(b)更可能響應(yīng)使用一種或多種上述治療方法的治療，所述治療方法依賴于αvβ6結(jié)合配體的結(jié)合，特別是與一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑綴合的αvβ6結(jié)合配體，或與一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑結(jié)合施用的αvβ6結(jié)合配體，所述細(xì)胞毒素化合物或試劑例如上文描述的那些。此類方法適合于診斷或鑒定各種癌，包括但不限于上文所述涉及上皮組織的那些。在某些此類實(shí)施方案中，與一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合的配體是αvβ6x整聯(lián)蛋白結(jié)合抗體(它可以是單克隆抗體，例如上文描述的那些)或其αvβ6表位結(jié)合片段。特別適合于在本發(fā)明的此類診斷方法中使用的是可檢測(cè)標(biāo)記的αvβ6結(jié)合配體(例如，抗體)，即包含至少一種可檢測(cè)標(biāo)記、與至少一種可檢測(cè)標(biāo)記綴合或結(jié)合的αvβ6結(jié)合配體，所述可檢測(cè)標(biāo)記例如生色標(biāo)記(例如，二氨基聯(lián)苯胺或4-羥基偶氮苯-2-羧酸)，酶標(biāo)記(例如，蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶或乙酰膽堿酯酶)，放射性同位素標(biāo)記(例如，3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc或109Pd)，非放射性同位素標(biāo)記(例如，157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc或112In)，熒光標(biāo)記(例如，152Eu標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、異硫氰酸酯標(biāo)記、羅丹明標(biāo)記、藻紅蛋白標(biāo)記、藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記、鄰苯二醛標(biāo)記或熒光胺標(biāo)記)，毒素標(biāo)記(例如，白喉毒素標(biāo)記、蓖麻毒素標(biāo)記或霍亂毒素標(biāo)記)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(例如，魯米諾標(biāo)記、異魯米諾標(biāo)記、芳香族吖啶酯標(biāo)記、咪唑標(biāo)記、吖啶鎓鹽標(biāo)記、草酸酯標(biāo)記、螢光素標(biāo)記、螢光素酶標(biāo)記或水母素標(biāo)記)，X放射照相標(biāo)記(例如，鋇或銫)，自旋標(biāo)記(例如，氘)，和核磁共振對(duì)比劑標(biāo)記(例如，Gd、Mn和鐵)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了清除患者中的αvβ6陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與一種或多種αvβ6陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏化或侵襲力減少。此類方法適合于清除患者中的各種轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，例如起因于轉(zhuǎn)移癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮組織的那些。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的合適實(shí)施方案使用αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體，所述結(jié)合配體是αvβ6結(jié)合抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段，特別是上文所述的單克隆抗體、或其變體或片段。在本發(fā)明的某些此類治療實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體(例如，αvβ6結(jié)合抗體)與一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑綴合或結(jié)合，在αvβ6結(jié)合配體-毒素化合物綴合物與細(xì)胞或組織上的一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合后，所述細(xì)胞毒素化合物或試劑導(dǎo)致或引起細(xì)胞或組織死亡。在本發(fā)明另外的治療實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體(例如，αvβ6結(jié)合抗體)結(jié)合一種或多種此類細(xì)胞毒素化合物或試劑施用于患者?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的這些方面適當(dāng)使用的細(xì)胞毒素化合物或試劑包括但不限于，上文描述的細(xì)胞毒素劑、放射性同位素和前體藥物活化酶。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體，或包含配體和一種或多種藥學(xué)載體或賦形劑的藥物組合物，可以根據(jù)上述施用方式施用于患者。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了手術(shù)摘除來自患者組織或器官的腫瘤后清除來自患者的殘留αvβ6陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與組織或器官中的一種或多種殘留腫瘤細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與所述整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏感性或侵襲力減少。此類方法適合于清除各種患者組織中的各種轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，例如起因于癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮組織的那些。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的合適實(shí)施方案使用αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體，所述結(jié)合配體是αvβ6結(jié)合抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段，特別是上文所述的單克隆抗體、或其變體或片段。在本發(fā)明的某些此類治療實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體(例如，αvβ6結(jié)合抗體)與一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑綴合或結(jié)合，在αvβ6結(jié)合配體-毒素化合物綴合物與細(xì)胞或組織上的一種或多種αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合后，所述細(xì)胞毒素化合物或試劑導(dǎo)致或引起細(xì)胞或組織死亡。可以根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面適當(dāng)使用的細(xì)胞毒素化合物或試劑包括但不限于，上文描述的細(xì)胞毒素劑、放射性同位素和前體藥物活化酶。
根據(jù)本發(fā)明的下述附圖和描述以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)于普通技術(shù)人員將是顯而易見的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是純化的、嵌合化3G9變體與αvβ6的結(jié)合ELISA測(cè)定法。用可溶性αvβ6包被的板與下述抗體一起溫育純化的雜交瘤來源的鼠類3G9抗體(m3G9)、純化的嵌合3G9抗體(ch3G9)、或在輕鏈第1個(gè)CDR中的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)內(nèi)包含N至S置換的純化的嵌合3G9抗體(ch3G9S)。用洗滌緩沖液洗滌后，板與過氧化物綴合的抗小鼠IgG(對(duì)于雜交瘤來源的材料)或抗人IgG(對(duì)于嵌合抗體)一起溫育，隨后用洗滌緩沖液洗滌。板用TMB溶液顯色，反應(yīng)用硫酸中止且用板閱讀儀在A450處測(cè)定。在2種形式的嵌合3G9抗體之間沒有可檢測(cè)的顯著差異。
圖2所示結(jié)果顯示使用Easy Titer Assay(Pierce)來自轉(zhuǎn)染的293E細(xì)胞的3G9人源化變體表達(dá)。通過Easy Titer方法根據(jù)制造商的方案(Pierce)測(cè)定來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293E細(xì)胞的上清液的抗體滴度。分析人源化3G9抗體的不同變體的表達(dá)。包含輕鏈形式1的3G9變體表達(dá)很差，而包含輕鏈形式2的變體以較高水平表達(dá)。隨著漸增的人源化存在朝向更高表達(dá)的趨勢(shì)。
圖3顯示如通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法確定的，hu-3G9抗體變體與αvβ6整聯(lián)蛋白表達(dá)SW480細(xì)胞結(jié)合的FACS分析結(jié)果。SW480細(xì)胞通過胰酶消化進(jìn)行收獲、洗滌且重懸浮于FACS緩沖液中。2×105細(xì)胞隨后在冰上、在包含指示轉(zhuǎn)染上清液的FACS緩沖液中溫育1小時(shí)，所述上清液的滴度通過Easy Titer方法根據(jù)制造商的方案(Pierce)來測(cè)定。溫育后，細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌，且重懸浮于包含藻紅蛋白綴合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)的FACS緩沖液中，且在冰上溫育30分鐘。細(xì)胞隨后進(jìn)行洗滌且重懸浮于200μl FACS緩沖液中，標(biāo)記的次級(jí)抗體的結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)來監(jiān)控。測(cè)試的所有人源化形式與SW480細(xì)胞的結(jié)合至少與嵌合3G9一樣好。包含輕鏈形式2的變體顯著超過嵌合3G9的活性。抗淋巴毒素β受體抗體Hu-BHA10充當(dāng)陰性對(duì)照。
圖4顯示hu-3G9抗體形式2-5與FDCP1-β6細(xì)胞結(jié)合的FACS分析。FACS分析如圖3中所述進(jìn)行，除了使用FDCP1-β6細(xì)胞代替SW480細(xì)胞外。完全人源化的變體形式5(H3/L5)與FDCP1-β6的結(jié)合明顯比所有其他人源化形式更好。
圖5顯示純化的hu-3G9抗體形式2-5與FDCP1-β6細(xì)胞結(jié)合的FACS分析。FACS分析使用純化的3G9人源化形式如圖4中所述進(jìn)行。完全人源化的變體形式5(H3/L5)與FDCP1-β6的結(jié)合明顯比所有其他人源化形式更好。
圖6是純化的hu-3G9抗體形式2-5與αvβ6結(jié)合的結(jié)合ELISA測(cè)定法。結(jié)合ELISA如圖1中所述進(jìn)行。人源化3G9形式5(H3/L5)顯得比其他抗體衍生物略微更好地與αvβ6結(jié)合。
圖7是純化的hu-3G9抗體形式2-5與αvβ6結(jié)合的阻斷ELISA。板用0.3μg/ml LAP或2.5g/ml LAP-Fc融合蛋白包被，且于4℃溫育過夜。去除包被溶液并且將板阻斷、洗滌、且在鈣和鎂的存在下如圖例中標(biāo)明的與生物素化的αvβ6和3G9衍生物混合物一起溫育。板再次進(jìn)行洗滌、且與超抗生物素蛋白(extravidin)-辣根過氧化物酶綴合物(Sigma)一起溫育。結(jié)合蛋白使用TMB底物進(jìn)行檢測(cè)隨后在板閱讀儀中在A450處檢測(cè)。人源化3G9形式5(H3/L5)顯得比其他抗體衍生物略微更好地阻斷αvβ6與LAP的結(jié)合。
圖8顯示來自純化的hu-3G9抗體形式2-5的細(xì)胞粘附測(cè)定法結(jié)果。微量滴定板用50μl/孔的0.5μg/ml LAP于4℃包被過夜。板隨后進(jìn)行洗滌和阻斷。使FDCP1-β6細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml)與培養(yǎng)瓶分離，用熒光染料(Calcein-AM，Molecular Probes，Eugene，OR)標(biāo)記且重懸浮于測(cè)定緩沖液中。在鈣和鎂的存在下，板與上文所述的純化抗體以及標(biāo)記FDCP1-β6細(xì)胞一起溫育。將板洗滌且記錄由于板上捕獲細(xì)胞的熒光。結(jié)合百分比通過比較總細(xì)胞的熒光與結(jié)合細(xì)胞的那種進(jìn)行測(cè)定。人源化3G9形式5(H3/L5)顯得比其他抗體衍生物略微更好地阻斷αvβ6表達(dá)細(xì)胞與LAP的結(jié)合。
圖9是pKJS195的質(zhì)粒圖和3G9形式5輕鏈序列的圖示。這種質(zhì)粒包含3G9形式5輕鏈(LV5)和新霉素抗性基因。輕鏈表達(dá)盒包含人CMV立即早期啟動(dòng)子和第1個(gè)內(nèi)含子(包含小缺失)以及人生長(zhǎng)激素多腺苷酸化序列。
圖10是pKJS189的質(zhì)粒圖和3G9形式3重鏈序列的圖示。這種質(zhì)粒包含3G9形式3重鏈(HV3)和二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。重鏈表達(dá)盒包含人CMV立即早期啟動(dòng)子和第1個(gè)內(nèi)含子(包含小缺失)以及人生長(zhǎng)激素多腺苷酸化序列。dhfr表達(dá)盒包含SV40早期啟動(dòng)子和SV40多腺苷酸化序列。
圖11是pKJS196的質(zhì)粒圖和去糖基3G9形式3重鏈序列的圖示。這種質(zhì)粒包含去糖基-3G9形式3重鏈(a-HV3)和dhfr基因。這種構(gòu)建體等同于pKJS189，除了消除重鏈恒定區(qū)中的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)的N319Q置換外。
圖12顯示使用Easy Titer Assay(Pierce)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)的hu-3G9CHO表達(dá)載體的裝配和表達(dá)結(jié)果。Easy Titer測(cè)定法如圖2中所述根據(jù)制造商的方案(Pierce)進(jìn)行。將野生型(H3/L5)和去糖基(a-H3/L5)人源化3G9形式5載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)，以證實(shí)來自這些細(xì)胞的人源化3G9的有效裝配和分泌。2種形式的hu3G9抗體在CHO細(xì)胞中同樣裝配和表達(dá)。
圖13的復(fù)合顯微照片描述了某些人癌中的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平，所述癌已從所示原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)(圖13A-13D)或肺(圖13E-13F)。
圖14的復(fù)合顯微照片描述了某些人癌中的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平，所述癌已從所示原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至所示轉(zhuǎn)移性腫瘤位點(diǎn)。
圖15的復(fù)合顯微照片描述了在原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌腫瘤(圖15A，15C)和匹配的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(圖15B，15D)中觀察到的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平。
圖16的復(fù)合顯微照片描述了在人乳腺腫瘤樣品中觀察到的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平。圖16A來自具有原位管瘤(DCIS)患者的原發(fā)性腫瘤樣品中的表達(dá)。圖16B來自具有侵襲乳腺癌患者的原發(fā)性腫瘤樣品中的表達(dá)。
圖17的復(fù)合顯微照片描述了來自3個(gè)不同患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺管腺癌腫瘤的匹配樣品中觀察到的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平。圖17A-17C來自3個(gè)不同患者的原發(fā)性腫瘤樣品中的表達(dá)。圖17D-17F來自這3個(gè)相同患者的匹配淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)。圖17G-17H從3個(gè)患者中的2個(gè)獲得的正常胰腺組織中的表達(dá)。
圖18的復(fù)合顯微照片描述了來自5個(gè)不同患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺腺癌腫瘤的匹配樣品中觀察到的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))水平。圖18A-18E來自5個(gè)不同患者的原發(fā)性腫瘤樣品中的表達(dá)，3個(gè)具有表征為腺鱗狀的腫瘤(圖18A-18C)，和2個(gè)具有表征為低分化的腫瘤(圖18D-18E)。圖18F-18J來自這5個(gè)相同患者的匹配淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)。圖18K-18L從5個(gè)患者中的2個(gè)獲得的正常胰腺組織中的表達(dá)。
圖19表示抗αvβ6單克隆抗體(3G9)在人胰腺癌的BxPC-3小鼠異種移植模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。圖19A經(jīng)由免疫組織化學(xué)用抗αvβ6單克隆抗體(3G9)染色的異種移植腫瘤切片的顯微照片。圖19B在用αvβ6mAb 3G9(▲)、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白

、或媒介物PBS(■)處理期間，BxPC-3異種移植腫瘤的生長(zhǎng)曲線。圖19C在研究結(jié)束時(shí)(第66天)單個(gè)腫瘤大小的散布圖。
圖20的一系列條形圖表示抗αvβ6單克隆抗體(3G9)、和可溶性TGF-β受體-抗體片段綴合物(sTGF-βRII-Fc)，對(duì)表達(dá)β6(用β6轉(zhuǎn)染)的VB6細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的跨基質(zhì)遷移、侵襲和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)生產(chǎn)的影響。圖20A和20B細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞外基質(zhì)的遷移(圖20A)或侵襲(圖20B)?！癠nt”未處理的細(xì)胞；“3G9”用10μg/ml 3G9抗αvβ6單克隆抗體處理的細(xì)胞；“sTGFbR-Fc”用10μg/ml可溶性TGF-βRII-Fc綴合物處理的細(xì)胞?？招臈l用β6整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染且表達(dá)β6整聯(lián)蛋白的細(xì)胞(VB6細(xì)胞)；實(shí)心條不表達(dá)β6整聯(lián)蛋白的模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞(C1細(xì)胞)。圖20C通過未處理(空心條)、用10g/ml 3G9處理(陰影條)、或用10μg/ml sTGF-βRII-Fc綴合物處理(實(shí)心條)的C1或VB6細(xì)胞生產(chǎn)的MMP9(ng/ml)。
圖21是免疫組織化學(xué)切片的顯微照片，表示在侵襲到LIM1863異種移植模型基質(zhì)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞上的αvβ6表達(dá)(暗區(qū))。關(guān)于連續(xù)切片的抗人角蛋白染色(未顯示)確定這些細(xì)胞是人上皮(即，LIM1863)腫瘤衍生的。
圖22A-22F描述了αvβ6mAb 3G9和重組可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白在LIM1 863異種移植腫瘤模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和基質(zhì)侵襲的影響。圖22A在用αvβ6mAb 3G9(▲)、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白

、或媒介物PBS(■)處理期間，LIM1863異種移植腫瘤的生長(zhǎng)曲線。圖22B在研究結(jié)束時(shí)(第52天)單個(gè)腫瘤大小的散布圖。圖22C在整個(gè)腫瘤切片上αvβ6陽(yáng)性區(qū)的定量。圖22D-22F描述從每個(gè)所示處理組收獲的腫瘤中的代表性αvβ6染色的顯微照片。
圖23A-23D是來自各種細(xì)胞系的熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析的直方圖，所述細(xì)胞系用鼠類3G9mAb或?qū)φ誱Ab處理，且表示m3G9與NHPαvβ6表達(dá)細(xì)胞系的結(jié)合水平(A，Vero；B，LLC-MK2；C，12MBr6；D，4MBr5)。
圖24A-24B的滴定曲線表示鼠類3G9與NHP αvβ6表達(dá)細(xì)胞系的結(jié)合水平(A，12MBr6；B，4MBr5)。
圖25的條形圖表示NHP αvβ6表達(dá)細(xì)胞系與LAP的粘附(A，12MBr6；B，4MBr5)。
圖26A-26B的滴定曲線表示經(jīng)由m3G9抑制NHP αvβ6表達(dá)細(xì)胞系與LAP的粘附(A，12MBr6；B，4MBr5)。
圖27的條形圖表示經(jīng)由人和靈長(zhǎng)類αvβ6表達(dá)細(xì)胞系的潛伏TGFβ活化。
圖28的滴定曲線表示在SW480β6和4MBr5細(xì)胞系上經(jīng)由m3G9抑制TGFβ活化。
圖29的一系列顯微照片表示人腎臟疾病中的αvβ6免疫染色。(A)用αvβ6mAb(紅色)和泛細(xì)胞角蛋白mAb(綠色)免疫染色的冷凍人腎切片。(B)用αvβ6mAb免疫染色的石蠟包埋的人腎切片。
圖30表示Co14A3+/-和Co14A3-/-小鼠腎中的αvβ6免疫染色。圖30A來自7周大的Co14A3+/-小鼠和Co14A3-/-小鼠的冷凍腎切片的顯微照片，所述小鼠用αvβ6mAb(紅色)和泛細(xì)胞角蛋白mAb(綠色)免疫染色。圖30B來自用αvβ6mAb免疫染色的、4和8周大的Co14A3+/-小鼠和Co14A3-/-小鼠的石蠟包埋的腎切片。圖30C表示在來自4、7和8周大的Co14A3+/-小鼠和Co14A3-/-小鼠(n＝3)腎中αvβ6免疫染色定量的條形圖。
圖31表示αvβ6mAb結(jié)合的特異性。圖31Aαvβ6mAbs(3G9、8G6、8B3)、抗αv mAb(RMV-7)、陰性對(duì)照mAbs(1E6和MOPC21)、和同位素對(duì)照(大鼠IgG1)與NIH3T3細(xì)胞和NIH3T3b6細(xì)胞結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖31B用抗αvβ6mAb(人/小鼠嵌合3G9)免疫染色的Co14A3-/-、和Co14A3-/-；β6-/-腎切片。圖31C用抗αv多克隆抗體免疫染色的Co14A3-/-、和Co14A3-/-；β6-/-腎切片。
圖32表示使用各種處理的Co14A3-/-腎中的SMA免疫染色。圖32A顯示關(guān)于3周-8.5周大的處理的Co14A3-/-小鼠、和年齡相一致的未處理的Co14A3+/-小鼠腎中免疫染色的SMA(紅色)和層粘連蛋白(綠色)。顯示了關(guān)于每個(gè)處理組的代表性切片的免疫染色(皮質(zhì)和髓質(zhì))(n＝8/組)。圖32B和32C3-7周大或3周-8.5周大的未處理的Co14A3+/-小鼠、和用各種試劑處理的Co14A3-/-小鼠腎中的SMA定量。顯示相對(duì)于全圖像大小，關(guān)于皮質(zhì)(32B)和髓質(zhì)(32C)的陽(yáng)性免疫染色百分比。關(guān)于每個(gè)處理組的N值在散布圖中指定。(*＝p＜0.01，**＝p＜0.05，***＝p＜0.001比較處理組與陰性對(duì)照mAb，1E6，處理的)。
圖33A和33B的散布圖表示mRNA水平的膠原1α1(圖33A)、和膠原1α2(圖33B)的Taqman分析。RNA從7周大的未處理或處理的Co14A3-/-小鼠和7周大的未處理的Co14A3+/+小鼠腎中分離。
圖34的一對(duì)散布圖表示用延遲mAb處理的SMA免疫染色的Co14A3-/-腎。未處理的8.5周Co14A3+/-；未處理的6周Co14A3-/-；未處理的8.5周Co14A3-/-；和用1E6和3G9處理6周-8.5周的8.5周Co14A3-/-小鼠。N值在散布圖中指定。*＝p＜0.0005，比較處理與陰性對(duì)照1E6，處理的Co14A3-/-小鼠。**＝p＜0.02比較處理與未處理的6周Co14A3-/-小鼠。
圖35描述了7周大的Co14A3-/-小鼠腎中的基因表達(dá)和調(diào)節(jié)模式。顯示的是對(duì)于在p＜0.01時(shí)野生型(WT)和未處理的Alport(UN)組之間2倍或更多的差異選擇的395個(gè)GeneChip探針組。熱柱圖顯示關(guān)于單個(gè)實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)基因表達(dá)水平模式。每個(gè)柱表示對(duì)于5只小鼠的單個(gè)實(shí)驗(yàn)組395個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的平均探針組信號(hào)強(qiáng)度值。如色帶所示，在實(shí)驗(yàn)條件中基因表達(dá)的變化反映在顏色變化中。進(jìn)行二維分級(jí)聚類以探究實(shí)驗(yàn)組中的關(guān)系(由樹狀圖顯示)。
圖36A-36D的條形圖顯示與Co14A3-/-腎中的腎臟疾病相關(guān)的αvβ6依賴基因的功能注釋。分別對(duì)探針組列表進(jìn)行Ingenuity PathwaysAnalysis(IPA)，所述列表對(duì)應(yīng)與野生型比較Alport腎中過量表達(dá)或表達(dá)不足的基因。對(duì)于IPA使用的列表是最初對(duì)于Alport和野生型組之間的顯著(＞2倍，p＜0.01)差異選擇的395個(gè)探針組的子集。顯示的是與基因相關(guān)的生物學(xué)功能(A，C)和正規(guī)途徑(B，D)的等級(jí)次序列表，所述基因在7周大的Alport小鼠腎中過量表達(dá)(A，B)和下調(diào)(C，D)。
圖37A-37C是基因的子集和網(wǎng)絡(luò)分析圖示，所述基因在Co14A3-/-腎中差異表達(dá)且由阻斷性αvβ6mAb處理來調(diào)節(jié)。圖37A探針組列表的Venn圖。Venn圓圈、其并集、和交集面積與相應(yīng)列表中的探針組數(shù)目成比例。圖37B，37C最高評(píng)分的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)推斷顯著(處理和天然Alport腎之間的差異＞2倍，p＜0.05)受αvβ6阻斷性mAbs 3G9(圖37B)和8G6(圖37C)影響的探針組列表。網(wǎng)絡(luò)邊緣顯示基因中的相互作用方向，所述基因描述為節(jié)點(diǎn)且根據(jù)其細(xì)胞定位來排列。
圖38描述了TGF-β1表達(dá)的免疫組織化學(xué)和Taqman分析。圖38A來自對(duì)于TGF-β1表達(dá)進(jìn)行免疫染色、用所示試劑處理的Co14A3+/-和Co14A3-/-小鼠的腎切片。顯示關(guān)于來自每個(gè)處理組的代表性切片的染色。圖38B在處理組中TGF-β1mRNA水平的Taqman分析。
圖39描述了關(guān)于腎中膠原表達(dá)的三色染色法。對(duì)于10周大的Co14A3+/+；β6+/+，Co14A3-/-；β6+/+，和Co14A3-/-；β6-/-小鼠進(jìn)行染色。顯示關(guān)于腎皮質(zhì)(圖39A)和髓質(zhì)(圖39B)區(qū)域的代表性組織切片。
圖40A和40B的散布圖描述使用劑量逐漸增加的3G9處理的SMA免疫染色。顯示關(guān)于用指定劑量的mu 3G9、或10mg/kg mulE6(IgG對(duì)照)處理后，腎小球(皮質(zhì))(圖40A)、和間質(zhì)(髓質(zhì))(圖40B)區(qū)域的SMA免疫染色的定量分析，所述處理為每周3次，從3到7周大。關(guān)于皮質(zhì)的ED50＝0.4mg/kg；關(guān)于髓質(zhì)的ED50＝0.3mg/kg。水平線表示平均值。
圖41的一系列顯微照片表示正常腎和UUO后的腎中αvβ6表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。圖41A正常未損傷的腎；圖41BUUO后7天；圖41CUUO后10天；圖41DUUO后14天。
圖42的一系列顯微照片表示αvβ6上調(diào)在照射后18周時(shí)發(fā)生。用14Gy照射的C57BL/6小鼠在所示時(shí)間點(diǎn)時(shí)被處死，且肺切片用抗β6抗體染色。
圖43的一對(duì)顯微照片表示αvβ6表達(dá)上調(diào)在纖維化區(qū)域中持續(xù)。肺切片如圖1中對(duì)于β6表達(dá)進(jìn)行染色。切片來自14-Gy照射后24周(左)或27周(右)時(shí)被處死的小鼠。兩種切片都顯示具有表達(dá)高水平αvβ6的許多上皮細(xì)胞的纖維化損傷。在鄰近的非纖維化上皮中，αvβ6表達(dá)在24周時(shí)仍然很高但到27周時(shí)明顯少得多。
圖44的一系列顯微照片表示Itgb6-/-小鼠被保護(hù)不受輻射誘導(dǎo)的肺纖維化。Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠(C57BL/6背景)暴露于14-Gy胸部輻射。27周后，小鼠被處死且左肺用Masson′s三色進(jìn)行染色。顯示代表性肺；總之，21/23只Itgb6+/+小鼠具有明顯的纖維化，而17只Itgb6-/-小鼠中沒有一只具有纖維化。
圖45的條形圖表示如通過羥脯氨酸測(cè)量的，Itgb6-/-小鼠被保護(hù)不受輻射誘導(dǎo)的肺纖維化。照射的Itgb6+/+肺的膠原含量顯著大于未照射的Itgb6+/+肺以及照射和未照射的Itgb6-/-肺的那種(對(duì)照射的Itgb6+/+p＜0.03，對(duì)于每個(gè)組N＝5-6)。
圖46的線條圖表示在αvβ6整聯(lián)蛋白缺乏不影響在肺照射后的存活。Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠組用14Gy照射。關(guān)于2個(gè)組的存活曲線沒有顯著不同(WT＝Itgb6+/+，KO＝Itgb6-/-)。
圖47的散布圖描述了在照射后26周時(shí)被處死，接受3G9、可溶性TGFβR或?qū)φ誂bIP的小鼠中的肺纖維化測(cè)量。肺纖維化在接受1mg/kg/周3G9的小鼠中被預(yù)防。每個(gè)點(diǎn)表示單個(gè)小鼠，條表示平均值。在0.3-mg/kg組和對(duì)照組之間在纖維化中沒有差異。1-mg/kg組的纖維化明顯少于對(duì)照。10-mg/kg和可溶性TGFβ受體組具有更少的纖維化，但與對(duì)照的差異沒有達(dá)到顯著性。
圖48的散布圖描述了在接受3G9、可溶性TGFβR或?qū)φ誂b IP的所有小鼠(從照射后20到26周被處死的小鼠、垂死小鼠、和被發(fā)現(xiàn)死亡的小鼠)中的肺纖維化測(cè)量。數(shù)據(jù)如圖47中呈現(xiàn)。在0.3-mg/kg組和對(duì)照組之間在纖維化中沒有差異。1-mg/kg、10-mg/kg和可溶性TGFβ受體組的纖維化明顯少于對(duì)照。
圖49的條形圖描述了來自在照射后26周時(shí)被處死，接受3G9、可溶性TGFβR或?qū)φ誂b IP的小鼠的BAL細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
圖50的線條圖表示接受IP 3G9抗體注射的14-Gy照射小鼠具有與對(duì)照類似的存活。對(duì)所有組進(jìn)行存活分析作為復(fù)合分析(p＝0.088，C＝對(duì)照，0.3＝0.3mg/kg，1＝1mg/kg，SolR＝可溶性TGFβ受體，10＝10mg/kg)。
圖51的條形圖描述了用3G9(1、3、6或10mg/kg)每周1次SC處理的小鼠中的肺纖維化測(cè)量。顯示了關(guān)于所有小鼠(被發(fā)現(xiàn)死亡/垂死小鼠和被處死的小鼠)、在28或32周時(shí)被處死的小鼠、和被發(fā)現(xiàn)死亡/垂死小鼠的分別結(jié)果。與所有抗體組比較，在對(duì)照中存在顯著增加的纖維化(對(duì)于所有劑量對(duì)對(duì)照p＜0.05)。
圖52的條形圖描述了來自在照射后28或32周時(shí)被處死，接受3G9或?qū)φ誂b SC的小鼠的BAL細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。3、6和10mg/kg的3G 9劑量導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比明顯增加(對(duì)于所有比較p＜0.05)。
圖53的一系列顯微照片描述了在對(duì)照對(duì)3G9處理小鼠中的BAL細(xì)胞外觀。在對(duì)照細(xì)胞離心涂片器(cytospin)中可見正常肺泡巨噬細(xì)胞。來自用1mg/kg 3G9處理的小鼠的BAL細(xì)胞類似于對(duì)照。在3mg/kg劑量時(shí)，許多大的泡沫狀巨噬細(xì)胞變得明顯。(類似巨噬細(xì)胞在Itgb6-/-小鼠中可見。)在更高劑量時(shí)(本文顯示的6mg/kg和10mg/kg)，增加數(shù)目的嗜中性粒細(xì)胞(箭頭)和淋巴細(xì)胞以及某些細(xì)胞碎片是顯而易見的。
圖54的線條圖描述了在照射后28周時(shí)被處死的小鼠股的卡普蘭-邁耶存活曲線。
圖55的線條圖描述了在照射后32周時(shí)被處死的小鼠股的卡普蘭-邁耶存活曲線。
圖56的條形圖表示與照射后存活32周的小鼠比較，RV/LV質(zhì)量比在照射后29-32周之間死亡的小鼠中增加。將小鼠心臟固定在福爾馬林中。解剖不含左心室加隔膜(LV)的右心室(RV)，且對(duì)組織進(jìn)行稱重。相同品系的7只未照射小鼠用作對(duì)照。條表示平均值+/-SD。顯示關(guān)于所有小鼠(用1E6對(duì)照抗體或任何劑量的3G9處理的小鼠)、用對(duì)照抗體1E6處理的小鼠、和用任何劑量的3G9處理的小鼠的照射小鼠數(shù)據(jù)。小鼠數(shù)目如下未照射小鼠，N＝7；1E6處理的小鼠存活的N＝10，死亡的N＝5；3G9處理的小鼠存活的，N＝8，死亡的N＝9。RV/LV比在存活的小鼠中與未照射對(duì)照沒有顯著不同。相比之下，與未照射小鼠比較，RV/LV比在死亡的小鼠(所有小鼠以及1E6和3G9子集)中顯著增加(P＜0.02)。同樣，與存活的等價(jià)小鼠組比較，RV/LV比在死亡的小鼠(所有小鼠以及1E6和3G9子集)中顯著增加(P＜0.0007)。
圖57的一對(duì)顯微照片描述了來自被發(fā)現(xiàn)死亡的小鼠的肺，所述小鼠已用對(duì)照抗體(1E6)，左，或用抗αvβ6抗體(3G9，1mg/kg/周)，右處理。指出在肺泡壁中缺乏紅細(xì)胞的周圍區(qū)域。這種表現(xiàn)與灌注喪失一致。
圖58的一系列顯微照片描述了人肺病中的αvβ6表達(dá)，表明αvβ6表達(dá)在人肺病中顯著上調(diào)。人和小鼠肺的石蠟組織切片用αvβ6特異性抗體進(jìn)行免疫染色，以顯示正常(圖58A)以及患病肺特發(fā)性肺纖維化(圖58B)、彌漫性間質(zhì)性肺病(圖58C)和彌漫性間質(zhì)性肺病(圖58D)中的相對(duì)表達(dá)水平。染色代表在下文表16-1(實(shí)施例16)中概述的41個(gè)不同患者樣品中可見的上調(diào)水平。
圖59的一系列顯微照片描述了博來霉素肺纖維化模型中的αvβ6表達(dá)，表明αvβ6表達(dá)在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中顯著上調(diào)。小鼠肺的石蠟組織切片用αvβ6特異性抗體進(jìn)行免疫染色，以顯示博來霉素滴注肺中的相對(duì)表達(dá)水平。
圖60的一系列條形圖描述了mu 3G9處理對(duì)博來霉素處理的SV129小鼠中肺羥脯氨酸含量的影響。在對(duì)于列出的各種治療期所示的前3次實(shí)驗(yàn)中，小鼠各自接受4mg/kg mu 3G9(阻斷性αvβ6mAb)、1E6(對(duì)照IgG1)。在第4次實(shí)驗(yàn)中，小鼠各自接受PBS、4mg/kg mu3G9(阻斷性αvβ6mAb)、4B4(非阻斷性αvβ6mAb)、或8G6(第二種阻斷性αvβ6mAb)，每周3次，博來霉素處理后15到60天。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄A中提供。
圖61的一系列條形圖描述了mu 3G9處理對(duì)博來霉素處理的C57B16小鼠中膠原含量(組織形態(tài)測(cè)定術(shù))的影響。小鼠接受每周3次劑量的mu 3G9(阻斷性αvβ6mAb)、8G6(第二種阻斷性αvβ6mAb)、8B3(非阻斷性αvβ6mAb)、1E6(對(duì)照IgG1 mAb)、或sTGFbR(可溶性TGF-β受體-關(guān)于TGF-β抑制的陽(yáng)性對(duì)照)。在所示的前3次實(shí)驗(yàn)中(圖61A、61B和61C)，小鼠在博來霉素攻擊前1天開始處理、且在第14天時(shí)實(shí)施安樂死。在前2次實(shí)驗(yàn)中(圖61A和61B)，每種試劑的劑量是4mg/kg，而在第3次實(shí)驗(yàn)(圖61C)中，mu3G9的劑量如所示的改變。在最后一次實(shí)驗(yàn)中(圖61D)，小鼠在博來霉素攻擊后14天開始處理、且在第28天時(shí)實(shí)施安樂死。組織學(xué)切片用三色染色、成像、且使用Metamorph軟件計(jì)算藍(lán)染(含膠原)組織的面積作為組織總面積百分比。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄B中提供。*＝通過ANOVA與PBS處理組顯著不同。
圖62的條形圖描述了使用膠原報(bào)道小鼠在博來霉素肺纖維化中的mu3G9。將博來霉素氣管內(nèi)滴注到膠原-螢光素酶報(bào)道小鼠內(nèi)。小鼠在博來霉素?fù)p傷前當(dāng)天用PBS，5mg/kg可溶性TGF-bRII-Ig，或劑量為0.1、0.3、1.0、3和10mg/kg的mu 3G9開始處理，每周1次，共2周。還包括用4mg/kgmu 3G9每周處理3次的另外小鼠組(3X4mg/kg)。假小鼠用氣管內(nèi)鹽水滴注且用PBS處理。肺螢光素酶含量在第14天時(shí)測(cè)定。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄C中提供。*＝通過ANOVA與PBS處理組顯著不同。
圖63的一系列線條圖描述了時(shí)程，以評(píng)估在博來霉素攻擊小鼠中低有效劑量的mu 3G9對(duì)主要BAL細(xì)胞群體的影響。小鼠在第0天時(shí)用博來霉素滴注到肺內(nèi)。在第-1和+6天時(shí)，小鼠用PBS，劑量為0.3、1.0和3.0mg/kg的mu 3G9，或劑量為1.0mg/kg的對(duì)照IgG1(1E6)處理。細(xì)胞在第2、5、8和11天時(shí)被處死，且收集肺并評(píng)估總BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)。巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群體通過細(xì)胞涂片離心器區(qū)分染色進(jìn)行分析。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄C中提供。
圖64的一系列條形圖描述了在第5天時(shí)在博來霉素攻擊小鼠中，高劑量的mu3G9對(duì)主要BAL細(xì)胞群體的影響。小鼠在第0天時(shí)用博來霉素滴注到肺內(nèi)。在第-1、+1和+3天時(shí)，小鼠用PBS，劑量為4、20和40mg/kg的mu 3G9，或劑量為20和40mg/kg的對(duì)照IgG1 mAb(1E6)處理。小鼠在第5天時(shí)被處死，且收集肺并評(píng)估總BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)。巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群體通過細(xì)胞涂片離心器區(qū)分染色進(jìn)行分析。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄D中提供。*＝p＜0.05相對(duì)于博來霉素攻擊的用PBS處理的對(duì)照，而不是相對(duì)于用1E6IgG1 mAb處理的對(duì)照。
圖65描述了mu 3G9在倉(cāng)鼠的多劑量博來霉素模型中缺乏功效。在第0、7和14天時(shí)，用博來霉素(BL)或鹽水(SA)滴注到倉(cāng)鼠肺內(nèi)。倉(cāng)鼠在第0天時(shí)用PBS、mu3G9(Ab1)、或?qū)φ誌gG1(1E6)開始處理。另外的組在第7天(Ab2)或第14天(Ab3)時(shí)用mu3G9處理。所有抗體以5mg/kg的劑量每周施用3次。存活的倉(cāng)鼠在第28天時(shí)被處死，且收集肺并評(píng)估羥脯氨酸含量(圖65AA)和脂質(zhì)過氧化(圖65B)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤。在多劑量博來霉素研究自始至終的倉(cāng)鼠存活(圖65C)。當(dāng)與PBS或IgG處理的對(duì)照組比較時(shí)，在用mu3G9處理的倉(cāng)鼠存活中沒有看到顯著差異。組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差在實(shí)施例16的附錄C中提供。
圖66描述了關(guān)于鑒定為顯著受實(shí)驗(yàn)處理影響的基因的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度曲線圖。在第1、8、15和22天時(shí)，小鼠用5mg/kg sTGFbRII-Ig(sR)、或用PBS、或用劑量指定為0.3-30mg/kg的mu3G9處理，且在第29天時(shí)(無恢復(fù)期)或在第78天時(shí)(7周的恢復(fù)期)實(shí)施安樂死。由處理小鼠的肺制備RNA并分析轉(zhuǎn)錄物。
圖67描述了在3mg/kg 3G9處理組中顯示向上趨勢(shì)的基因的基因表達(dá)曲線圖。在第1、8、15和22天時(shí)，小鼠用5mg/kg sTGFbRII-Ig(sR)、或用PBS、或用劑量指定為0.3-30mg/kg的mu3G9處理，且在第29天時(shí)(無恢復(fù)期)或在第78天時(shí)(7周的恢復(fù)期)實(shí)施安樂死。由處理小鼠的肺制備RNA并分析轉(zhuǎn)錄物。
圖68的一對(duì)條形圖描述了顯著受mu3G9影響的基因的IPA注釋。
圖69A和69B的網(wǎng)狀圖示意性描述了在小鼠肺中受mu3G9影響的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。
圖70的條形圖描述了MMP-12轉(zhuǎn)錄物對(duì)mu3G9處理的劑量響應(yīng)。
圖71是正常和照射小鼠中BAL流體蛋白水平的一系列散布圖。
圖72的一系列散布圖描述了由輻射誘導(dǎo)的纖維化上調(diào)、和在28周時(shí)由mu 3G9處理下調(diào)的蛋白質(zhì)。
發(fā)明詳述 除非本文另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。雖然下文描述了優(yōu)選方法和材料，但類似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用。雖然下文描述了示例性方法和材料，但類似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。本文提及的所有出版物和其他參考文獻(xiàn)整體引入作為參考。在沖突的情況下，以本說明書包括定義為準(zhǔn)。材料、方法和實(shí)施例僅是舉例說明性的且不希望是限制性的。本說明書自始至終，單詞“包含”應(yīng)當(dāng)理解為指包含所述整數(shù)或整數(shù)群、但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)群。
定義 約如本文使用的，當(dāng)涉及任何數(shù)值時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”意指所述值±10％的值(例如，“約50℃”包含45℃-55℃的溫度范圍，包括45℃和55℃；類似地，“約100mM”包含90mM-110mM的濃度范圍，包括90mM和110mM)。
拮抗劑如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”指減少、基本上減少或完全抑制αvβ6整聯(lián)蛋白在細(xì)胞、組織或生物中的生物和/或生理效應(yīng)的化合物、分子、部分或復(fù)合物。可以是對(duì)于αvβ6的配體的拮抗劑，可以以各種方式進(jìn)行此類效應(yīng)，包括但不限于，與另一種配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面上的αvβ6；以這樣的方式與αvβ6相互作用以便減少、基本上減少或抑制整聯(lián)蛋白結(jié)合其他配體的能力；與細(xì)胞表面αvβ6結(jié)合且誘導(dǎo)αvβ6中的構(gòu)象變化，從而使得整聯(lián)蛋白呈現(xiàn)其他配體不能再與之結(jié)合的結(jié)構(gòu)(或只能以減少或基本上減少的親和力和/或功效結(jié)合)；誘導(dǎo)細(xì)胞、組織或生物中的生理學(xué)變化(例如，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)復(fù)合物增加；轉(zhuǎn)錄抑制劑增加；細(xì)胞表面αvβ6表達(dá)減少；等)，從而使得在與細(xì)胞上的αvβ6結(jié)合后，其他配體的結(jié)合，或通過此類配體誘導(dǎo)的生理學(xué)信號(hào)被減少、基本上減少或完全抑制；以及通過其拮抗劑可以實(shí)現(xiàn)其活性的其他機(jī)制，所述機(jī)制將是普通技術(shù)人員熟悉的。如普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，拮抗劑可以具有與它拮抗的另一種αvβ6結(jié)合部分(例如，αvβ6結(jié)合配體)類似的結(jié)構(gòu)(例如，拮抗劑可以是激動(dòng)劑的突變型蛋白、變體、片段或衍生物)，或可以具有完全無關(guān)的結(jié)構(gòu)。
結(jié)合如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指可以是共價(jià)例如通過化學(xué)偶聯(lián)，或非共價(jià)例如離子相互作用、疏水性相互作用、氫鍵等的結(jié)合或附著。共價(jià)鍵可以是例如，酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、烏拉坦、酰胺、胺、肽、酰亞胺、腙、酰肼、碳-硫鍵、碳-磷鍵等。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”比術(shù)語(yǔ)例如“偶聯(lián)”、“綴合”和“附著”更廣泛，且包括“偶聯(lián)”、“綴合”和“附著”。
綴合物/綴合如本文使用的，“綴合物”指部分例如化學(xué)藥品或放射性同位素與配體的共價(jià)附著產(chǎn)物，所述配體與αvβ6例如αvβ6結(jié)合抗體或其片段結(jié)合。“綴合”指如前句中限定的綴合物的形成。使化學(xué)藥品或放射性同位素與生物學(xué)活性材料例如蛋白質(zhì)或多肽(包括抗體)綴合、由本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的任何方法都可以在本發(fā)明中使用。
疾病、病癥、病狀如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“疾病”或“病癥”指人或動(dòng)物的任何不利條件，包括腫瘤、癌癥、變態(tài)反應(yīng)、成癮、自身免疫性、感染、最佳精神或軀體功能中毒或損害。如本文使用的，“病狀”包括疾病和病癥但還指生理學(xué)狀態(tài)。例如，生育力是生理學(xué)狀態(tài)但不是疾病或病癥。因此適合于通過降低生育力預(yù)防妊娠的本發(fā)明組合物將被描述為病狀(生育力)治療，而不是病癥或疾病治療。其他病狀將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的。
有效量如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”指實(shí)現(xiàn)所需生物學(xué)效應(yīng)所需或足夠的給定化合物、綴合物或組合物量。依照本發(fā)明方法給定化合物、綴合物或組合物的有效量將是達(dá)到這個(gè)選擇結(jié)果的量，且此類量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定，使用本領(lǐng)域已知和/或本文描述的測(cè)定法，無需過度實(shí)驗(yàn)。例如，用于治療或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的有效量可以是在體內(nèi)預(yù)防腫瘤細(xì)胞經(jīng)過基底膜或經(jīng)過內(nèi)皮層移動(dòng)和侵襲所需的量。該術(shù)語(yǔ)還與“足夠量”同義。關(guān)于任何具體應(yīng)用的有效量可以依此類因素而變，如待治療的疾病、病癥或病狀，待施用的具體組合物，施用途徑，受試者大小，和/或疾病或病狀的嚴(yán)重度。依照本文提供的指導(dǎo)，無需過度實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員即可以經(jīng)驗(yàn)為主地確定本發(fā)明的具體化合物、綴合物或組合物的有效量。
一個(gè)(種)、a或an當(dāng)術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(種)”、“a”或“an”在本公開內(nèi)容中使用時(shí)，除非另有說明，它們意指“至少一個(gè)(種)”或“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”。像這樣，術(shù)語(yǔ)“a”(或“an”)、“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”和“至少一個(gè)(種)”在本文中可以互換使用。
肽、多肽、蛋白質(zhì)如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”意欲包含單數(shù)“多肽”以及復(fù)數(shù)“多肽”，且指通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”指2個(gè)或更多氨基酸的任何一條或多條鏈，且不涉及產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”、或用于指2個(gè)或更多氨基酸的任何一條或多條鏈的任何其他術(shù)語(yǔ)，包括在“多肽”的定義內(nèi)，和術(shù)語(yǔ)“多肽”可以代替任何這些術(shù)語(yǔ)使用，或可與任何這些術(shù)語(yǔ)互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”還意指多肽的表達(dá)后修飾產(chǎn)物，所述表達(dá)后修飾包括但不限于，糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、通過已知保護(hù)/阻斷基衍生化、蛋白酶剪切、或通過非天然存在的氨基酸修飾。多肽可以來源于天然生物源或通過重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必由指定核酸序列翻譯。它可以以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。依照這個(gè)定義，本發(fā)明中使用的多肽大小可以為約3個(gè)或更多、5個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、25個(gè)或更多、50個(gè)或更多、75個(gè)或更多、100個(gè)或更多、200個(gè)或更多、500個(gè)或更多、1,000個(gè)或更多、或2000個(gè)或更多氨基酸。多肽可以具有限定三維結(jié)構(gòu)，盡管它們不必具有此類結(jié)構(gòu)。具有限定三維結(jié)構(gòu)的多肽稱為折疊的，和沒有限定三維結(jié)構(gòu)、而是可以采取大量不同構(gòu)象的多肽稱為未折疊的。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)糖蛋白指與至少一種碳水化合物部分偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，所述碳水化合物部分經(jīng)由氨基酸殘基的含氧或含氮側(cè)鏈與蛋白質(zhì)附著，所述氨基酸殘基例如絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基。依照本發(fā)明使用的優(yōu)選多肽包括是配體或與細(xì)胞表面上的αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的多肽，包括但不限于，識(shí)別且與αvβ6上的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合的抗體(特別是單克隆抗體)。
“分離”多肽或其片段、變體或衍生物意指不在其天然環(huán)境中的多肽。不要求具體純化水平。例如，分離多肽可以取自其天然或自然環(huán)境。為了本發(fā)明的目的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組生產(chǎn)的多肽和蛋白質(zhì)被視為分離的，與已通過任何合適技術(shù)分離、分餾、或部分或基本上純化的天然或重組多肽一樣。
作為本發(fā)明多肽還包括的是前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體，或其任何組合。術(shù)語(yǔ)“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”當(dāng)指抗αvβ6抗體或抗體多肽時(shí)，包括保留相應(yīng)天然抗體或多肽的至少某些抗原結(jié)合特性的任何多肽，即保留與αvβ6整聯(lián)蛋白上的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合能力的那些多肽。本發(fā)明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，除了本文其他地方討論的具體抗體片段。依照本發(fā)明有用的抗αvβ6抗體和抗體多肽變體包括如上所述的片段，以及由于氨基酸置換、刪除、或插入具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然發(fā)生或非天然發(fā)生。非天然發(fā)生的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)來產(chǎn)生。變體多肽可以包含保守或非保守氨基酸置換、刪除或添加。依照本發(fā)明有用的抗αvβ6抗體和抗體多肽衍生物是已被改變以便顯示天然多肽上未發(fā)現(xiàn)的另外特征的多肽。例子包括融合蛋白。變體多肽在本文中還可以稱為“多肽類似物”。如本文使用的，抗αvβ6多肽或多肽片段“衍生物”指具有通過功能側(cè)基反應(yīng)化學(xué)衍生的一個(gè)或多個(gè)殘基的主題多肽。作為“衍生物”還包括的是包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可以代替脯氨酸；5-羥賴氨酸可以代替賴氨酸；3-甲基組氨酸可以代替組氨酸；高絲氨酸可以代替絲氨酸；和鳥氨酸可以代替賴氨酸。
基本上，基本如本文使用的，如果綴合蛋白質(zhì)與受體的結(jié)合比率和/或量不小于未綴合的相應(yīng)細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子或多肽激素的結(jié)合比率和/或量的約40％、約50％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％或更多，那么蛋白質(zhì)綴合被說成“基本上”不干擾蛋白質(zhì)與其一種或多種受體結(jié)合的能力。
處理如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“處理”指特別是其中目的是預(yù)防或減緩(減少)不希望有的生理學(xué)變化或紊亂的預(yù)防和/或治療，所述生理學(xué)變化或紊亂例如多發(fā)性硬化癥的進(jìn)展。有利或希望的臨床結(jié)果包括但不限于，無論是可檢測(cè)的還是不可檢測(cè)的癥狀減輕、病變范圍減少、疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)、疾病進(jìn)展延遲或減慢、疾病狀態(tài)改善或減輕、和好轉(zhuǎn)(無論是部分還是全部)?！疤幚怼边€可以指與未接受處理時(shí)的預(yù)期存活比較延長(zhǎng)的存活。需要處理的那些包括已具有病狀或病癥的那些，以及易于具有病狀或病癥的那些，或其中病狀或病癥待預(yù)防的那些?！笆茉囌摺被颉皞€(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”意指需要診斷、預(yù)后或治療的任何受試者，特別是哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人和其他靈長(zhǎng)類、家畜、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、和動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)、或?qū)櫸飫?dòng)物例如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
概括 本發(fā)明的特征在于對(duì)整聯(lián)蛋白αvβ6特異的人源化抗體。本文描述了制備本發(fā)明抗體的各種方法。本領(lǐng)域已知但本文未具體描述的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白αvβ6在腫瘤細(xì)胞表面上差異表達(dá)，其中相對(duì)于在非轉(zhuǎn)移性或具有較低轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞上觀察到的表達(dá)水平，它在轉(zhuǎn)移性或具有較高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞上以增加的量表達(dá)。為了分析這種差異表達(dá)，本發(fā)明使用與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的配體，特別是抗體(和更具體而言由本發(fā)明提供的人源化抗體)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了在確定腫瘤細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛能中、以及在更可能進(jìn)展至侵襲或轉(zhuǎn)移癌的那些癌的鑒定中使用這種差異表達(dá)鑒定的方法，所述癌例如某些腺癌和原位癌(包括DCIS和LCIS)。本發(fā)明還提供了鑒定其中構(gòu)成腫瘤的細(xì)胞更可能響應(yīng)治療的那些腫瘤的方法，所述治療使用與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的一種或多種配體。本發(fā)明還提供了診斷和治療/預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移，以及用于在腫瘤手術(shù)摘除后清除殘留轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法。
人源化抗體 在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的抗體是單克隆抗體，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是來源于其他種類的同類抗αvβ6抗體的人源化形式。人源化抗體是由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體，其中并非抗原結(jié)合所需的人免疫球蛋白輕或重鏈的某些或所有氨基酸(例如，可變結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)和框架區(qū))，用于代替來自同類非人抗體的輕或重鏈的相應(yīng)氨基酸。例如，針對(duì)給定抗原的人源化形式的鼠類抗體在其重和輕鏈上具有(1)人抗體的恒定區(qū)；(2)來自人抗體的可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)；和(3)來自鼠類抗體的CDRs。必要時(shí)，人框架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)殘基可以變成鼠類抗體相應(yīng)位置上的殘基，以便保留人源化抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和力。這種變化有時(shí)稱為“回復(fù)突變”。與嵌合人抗體比較，人源化抗體在人中一般更不可能引發(fā)免疫應(yīng)答，因?yàn)槿嗽椿贵w包含明顯更少的非人組分。
用于制備本發(fā)明的人源化抗體的合適方法在下述參考文獻(xiàn)中描述例如Winter EP 0 239 400；Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science2391534-1536(1988)；Queen等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8610029(1989)；美國(guó)專利6,180,370；以及Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833(1989)，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部整體引入本文作為參考。一般地，鼠類(或其他非人)CDRs到人抗體上的移植如下完成。編碼重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的cDNAs從雜交瘤中分離?？勺兘Y(jié)構(gòu)域包括CDRs的DNA序列通過測(cè)序來確定。通過定點(diǎn)誘變將編碼CDRs的DNAs轉(zhuǎn)移至人抗體重或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼序列的相應(yīng)區(qū)域。隨后添加所需同種型(例如γ1對(duì)于CH和κ對(duì)于CL)的人恒定區(qū)基因區(qū)段。人源化重和輕鏈基因在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，CHO或NSO細(xì)胞)中共表達(dá)，以產(chǎn)生可溶性人源化抗體。為了促進(jìn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn)，通常希望在包含抗體表達(dá)細(xì)胞的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)此類人源化抗體，或產(chǎn)生在乳中表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(例如，山羊、奶牛或綿羊)(參見，例如，美國(guó)專利5,827,690)。
有時(shí)候，CDRs至人框架的直接轉(zhuǎn)移導(dǎo)致所得到的抗體的抗原結(jié)合親和力喪失。這是因?yàn)樵谀承┩惪贵w中，在框架區(qū)內(nèi)的某些氨基酸與CDRs相互作用，且因此影響抗體的總體抗原結(jié)合親和力。在此類情況下，在受體抗體的框架區(qū)中引入“回復(fù)突變”(同上)以便保留同類抗體的抗原結(jié)合活性將是關(guān)鍵的。
進(jìn)行回復(fù)突變的一般方法是本領(lǐng)域已知的。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 882869-2873(1991)，和WO 90/07861(Protein Design Labs Inc.)描述了涉及2個(gè)關(guān)鍵步驟的方法。首先，通過計(jì)算機(jī)分析對(duì)于與同類鼠類抗體的可變區(qū)框架的最佳蛋白質(zhì)序列同源性選擇人可變框架區(qū)。隨后，通過計(jì)算機(jī)模擬鼠類可變區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以便顯示可能與鼠類CDRs相互作用的框架氨基酸殘基，且隨后將這些鼠類氨基酸殘基疊加在同源人框架上。
根據(jù)這種2步方法，存在關(guān)于設(shè)計(jì)人源化抗體的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是使用來自特定人免疫球蛋白的框架作為人受體，所述人免疫球蛋白通常與非人供體免疫球蛋白同源，或使用來自許多人抗體的共有框架。第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是如果人受體殘基是罕見的、和供體殘基在框架的特定殘基上對(duì)于人序列是一般的，那么使用供體而不是受體氨基酸。第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在緊鄰CDRs的位置上使用供體而不是受體框架氨基酸殘基。
還可以使用如例如Tempest，Biotechnology 9266-271(1991)中所述的不同方法。根據(jù)這種方法，來源于NEWM和REI重和輕鏈的可變區(qū)框架分別用于CDR移植，而不是自由引入小鼠殘基。使用這種方法的優(yōu)點(diǎn)是NEWM和REI可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)由于X射線晶體學(xué)是已知的，且因此可以容易地模擬CDRs和可變區(qū)框架殘基之間的特異性相互作用。
如WO 03/100033中所述，本發(fā)明人由從雜交瘤6.3G9和6.8G6分離的mRNAs制備抗體重鏈可變區(qū)cDNA和輕鏈可變區(qū)cDNAs。這些雜交瘤生產(chǎn)與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的IgG1類小鼠單克隆抗體。嵌合人抗體表達(dá)載體通過將cDNA插入表達(dá)載體內(nèi)來構(gòu)建，所述表達(dá)載體包含人抗體重鏈恒定區(qū)或人抗體輕鏈恒定區(qū)編碼序列。隨后將此類載體引入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)以實(shí)現(xiàn)抗αvβ6嵌合人抗體的生產(chǎn)。在生產(chǎn)的嵌合抗體中，發(fā)現(xiàn)抗αvβ6嵌合人抗體3G9和8G6與αvβ6整聯(lián)蛋白反應(yīng)，且顯示阻斷活性。
使用上述方法，產(chǎn)生人源化形式的嵌合抗體3G9和8G6。如本文實(shí)施例中所述，對(duì)于3G9抗體，這包括克隆鼠類3G9可變重和輕鏈區(qū)域。如本文實(shí)施例中所述，編碼鼠類3G9輕和重鏈可變區(qū)的cDNA隨后用于構(gòu)建用于表達(dá)鼠類-人嵌合體的載體，其中鼠類3G9可變區(qū)與人IgG1(對(duì)于重鏈)和人κ(對(duì)于輕鏈)恒定區(qū)連接。轉(zhuǎn)染到293-EBNA細(xì)胞內(nèi)后輕鏈和重鏈3G9表達(dá)載體的表達(dá)表明，嵌合3G9轉(zhuǎn)染細(xì)胞、合成且有效裝配重和輕鏈且分泌抗體(參見實(shí)施例2)。此外，還制備了去糖基突變型嵌合3G9抗體。在3G9輕鏈第1個(gè)CDR的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)內(nèi)天冬酰胺(N)至絲氨酸(S)的氨基酸置換顯示極大地改善蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，而不改變結(jié)合親和力(圖1)。
為了生產(chǎn)人源化3G9抗體，通過與人種系序列相配的同源性選擇人受體框架結(jié)構(gòu)域。如實(shí)施例3中所述，對(duì)于輕鏈，發(fā)現(xiàn)人L6受體框架是最同源的，和對(duì)于重鏈，發(fā)現(xiàn)人3-7受體框架是最同源的。使用這些選擇的人受體框架，設(shè)計(jì)輕和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，且產(chǎn)生和表達(dá)每一種的許多變體/形式(實(shí)施例4)。
本發(fā)明描述了作為包含SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的人源化3G9抗體。
SEQ ID NO1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLE WVASISSGGRMYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCARGSIYDGYYVFPYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSTYPPTFG GGTKVEIK 產(chǎn)生具有不同程度回復(fù)突變的3G9重和輕鏈的不同變體/形式，以確定哪個(gè)組合產(chǎn)生具有對(duì)于αvβ6的較好結(jié)合親和力和阻斷活性的最佳人源化抗體。在產(chǎn)生的5種不同形式的輕鏈和3種不同形式的重鏈中，3G9重鏈形式3(HV3)與3G9輕鏈形式5(LV5)的配對(duì)產(chǎn)生最佳的人源化抗體(實(shí)施例4)。這種人源化3G9形式5(H3/L5)抗體通過下述產(chǎn)生表達(dá)關(guān)于重鏈形式3(H3)包含質(zhì)粒pKJS189(SEQ ID NO6)的重組載體，與關(guān)于輕鏈形式5(LV5)包含質(zhì)粒pKJS195(SEQ ID NO5)的重組載體組合。





449 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 在人源化8G6抗體的設(shè)計(jì)中使用類似方法(實(shí)施例7)。設(shè)計(jì)3種形式的8G6可變輕鏈和可變重鏈，其中第一種形式包含最多的回復(fù)突變和第三種形式包含最少的回復(fù)突變(最“人源化”)(實(shí)施例5)。
SEQ ID NO75(hu8G6形式1輕鏈) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO76(hu8G6形式2輕鏈) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO77(hu8G6形式3輕鏈) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEK SEQ ID NO78(hu8G6形式1重鏈) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFTDYAMHWVRLAPGQGLE WIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAV YYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO79(hu8G6形式2重鏈) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL EWIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO80(hu8G6形式3重鏈) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL EWMGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS 其他部分 如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的，本發(fā)明的人源化單克隆抗體可以進(jìn)一步包含其他部分以實(shí)現(xiàn)所需功能。例如，人源化抗體可以包括毒素部分(例如，破傷風(fēng)類毒素或蓖麻毒素)或放射性核素(例如，111In或90Y)用于殺死由抗體靶向的細(xì)胞(參見，例如，美國(guó)專利6,307,026)。人源化抗體可以包含用于容易分離或檢測(cè)的部分(例如，生物素、熒光部分、放射性部分、組氨酸標(biāo)記或其他肽標(biāo)記)。人源化抗體還可以包含可以延長(zhǎng)其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分。
各種化學(xué)治療劑可以與靶向人源化抗體偶聯(lián)。優(yōu)選地，結(jié)合后內(nèi)在化的人源化抗體將是最佳的，然而，不預(yù)先排除非內(nèi)在化人源化抗體的使用。例如，取決于使用的藥物，抗體-藥物綴合物的使用可以提供抗腫瘤活性，所述抗體-藥物組合物與腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合，在腫瘤內(nèi)或腫瘤細(xì)胞附近釋放藥物，且擴(kuò)散或運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)?？梢杂糜谥苽渚Y合物的藥物名單是廣泛的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何對(duì)所需化合物進(jìn)行化學(xué)修飾，以便進(jìn)行反應(yīng)使得那種化合物更方便地用于制備本發(fā)明綴合物目的。例如，藥物可以經(jīng)由“可釋放的連接體”偶聯(lián)，所述可釋放的連接體在血清中明顯更穩(wěn)定，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放活性藥物。取決于具體藥物，可以使用幾種釋放機(jī)制。這些釋放機(jī)制的例子包括使用酸敏感性腙、氧還反應(yīng)敏感性連接體例如二硫化物、和蛋白酶切割的肽連接體。下述是來自幾個(gè)不同種類的某些代表性藥物 (A)烷化劑。這些藥物的某些具體例子是環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法侖和亞硝基脲。
(B)抗代謝物和抗增殖劑例如蒽環(huán)類抗生素、長(zhǎng)春花藥物、絲裂霉素、博來霉素、核苷、蝶啶、一烯二炔(endiynes)。例子是亞德里亞霉素、道諾紅霉素、阿霉素、氨蝶呤、氨甲喋呤、絲裂霉素C、放線菌素D、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、紅豆杉醇、紫杉烷、細(xì)胞松弛素B、秋水仙堿、和嘌呤霉素依托泊苷、美法侖、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、卡里奇霉素、美登素衍生物、和dolistatin衍生物。
(C)激素和激素拮抗劑例如皮質(zhì)類固醇、孕酮和雌激素 前體藥物定義為當(dāng)與抗體附著時(shí)以“較不有效”的化學(xué)形式存在，而內(nèi)在化后被酶促切割以產(chǎn)生更有效的藥物形式的藥物。這種相同應(yīng)用可以對(duì)不內(nèi)在化的抗體綴合物進(jìn)行，例如，酶促切割在腫瘤細(xì)胞表面上發(fā)生，且藥物被釋放到緊靠腫瘤的環(huán)境內(nèi)且被腫瘤細(xì)胞同化。這個(gè)的某些例子是包含磷酸鹽、硫酸鹽和肽的藥物。
生物學(xué)活性蛋白質(zhì)毒素例如蓖麻毒素A鏈、白喉毒素、志賀毒素、破傷風(fēng)，或有毒酶的附著是本發(fā)明考慮的另一種形式的抗體-綴合物。此類綴合物可以使用化學(xué)綴合方法或使用遺傳工程技術(shù)來制備，所述遺傳工程技術(shù)允許直接表達(dá)抗體-毒素構(gòu)建體，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明的人源化單克隆抗體還可包含其他部分例如放射性核素。為了放射免疫療法的目的，本發(fā)明考慮了人源化αvβ6抗體的使用，以特異性靶向治療性放射同位素用于治療癌癥。相關(guān)同位素的名單可以包括但不限于，90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。還考慮了α發(fā)射體同位素例如211At、212Bi。同位素附著的方法是不同的且取決于使用的具體同位素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉且能夠確定用于任何具體同位素附著的綴合化學(xué)方法。
對(duì)于放射免疫診斷的目的，人源化αvβ6抗體可以提供對(duì)靶向癌癥和/或任何特定疾病的患病器官/組織成像和進(jìn)行放射量測(cè)定的機(jī)會(huì)。這對(duì)于證實(shí)已知腫瘤位點(diǎn)的定位以及使得能夠優(yōu)化定量治療施用將是有用的。特別地，除了純?chǔ)猛凰?9MTc外，正電子放射性同位素(例如，86Y)可以在治療施用期間給予。
上述放射免疫療法/放射免疫診斷應(yīng)用不限于非內(nèi)在化抗體的使用。存在有效使用內(nèi)在化抗體用于靶向放射性同位素的例子，特別是對(duì)于分解代謝后作為螯合物保留在細(xì)胞中的同位素。例如，90Y標(biāo)記的抗體使用高親和力螯合劑例如MX-DTPA或CHX-DTPA制備。
任何上述抗體綴合物還包括片段Fab、F(ab′)2、scFvs、微型抗體、CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體構(gòu)建體、和FcRn突變體的使用。這些Ab片段或種屬修飾的構(gòu)建體具有不同于完整IgG的藥代動(dòng)力學(xué)、腫瘤穿透、和腫瘤定位特性，這可以在具體應(yīng)用中提供優(yōu)點(diǎn)。例如，更快清除的Fab可以用于關(guān)于放射免疫診斷應(yīng)用的診斷應(yīng)用。另一方面，對(duì)于免疫放射療法或藥物靶向，選擇具有更長(zhǎng)血清t1/2的靶向媒介物可能更有效。
患病條件和動(dòng)物模型 本發(fā)明的人源化抗體在αvβ6介導(dǎo)的疾病的診斷和治療，包括預(yù)防中有用。例如，這些人源化抗體可以通過阻斷TGF-β活化或阻斷αvβ6與任何其他配體的結(jié)合，所述配體例如纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白，用于治療纖維化(例如，肺纖維化、急性肺損傷、腎纖維化、肝纖維化、阿爾波特氏綜合征和硬皮病)，以及本文其他地方描述的其他疾病和病癥。特別地，本發(fā)明的人源化抗體可以用于治療與損傷/纖維化相關(guān)的肺病，例如但不限于，特發(fā)性肺纖維化、輻射誘導(dǎo)的纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、硬皮病、博來霉素誘導(dǎo)的纖維化、慢性哮喘、硅肺病、石棉誘導(dǎo)的纖維化、急性肺損傷和急性呼吸窘迫、(包括細(xì)菌性肺炎誘導(dǎo)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)、病毒性肺炎誘導(dǎo)、空調(diào)機(jī)誘導(dǎo)、非肺膿毒誘導(dǎo)和抽吸誘導(dǎo)的)。本發(fā)明的人源化抗體可以用于治療與損傷/纖維化相關(guān)的慢性腎病，例如但不限于，狼瘡、糖尿病、硬皮病、腎小球腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化、IgA腎病、高血壓、同種異體移植和阿爾波特氏病。人源化抗體還可以用于治療腸纖維化、硬皮病、輻射誘導(dǎo)的纖維化。本發(fā)明的人源化抗體還可以用于治療肝纖維化，例如但不限于，膽管損傷誘導(dǎo)的纖維化。本發(fā)明的人源化抗體可以用于治療的其他適應(yīng)癥還包括頭與頸纖維化、輻射誘導(dǎo)的纖維化、角膜瘢痕形成、LASIX、角膜移植、小梁切除術(shù)、肥厚性瘢痕、燒傷誘導(dǎo)的纖維化、手術(shù)纖維化、肉狀瘤病、牛皮癬和脊髓損傷/纖維化。
如下文詳細(xì)描述的，除了纖維化疾病或病狀外，本發(fā)明的人源化抗體在癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移(包括腫瘤生長(zhǎng)和侵襲)，特別是上皮癌治療中有用。上皮癌的子集是鱗狀細(xì)胞癌，例如頭與頸(包括口腔、喉、咽、食道)，乳腺、肺，前列腺，子宮頸，結(jié)腸，胰腺，皮膚(基底細(xì)胞癌)和卵巢癌。使用新αvβ6單克隆抗體的研究證實(shí)αvβ6在許多上皮癌中，特別是在腫瘤前緣上高度表達(dá)。新抗體還可以用于由αvβ6介導(dǎo)的任何其他疾病，包括牛皮癬。
本發(fā)明抗體的功效可以在各種動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試，其中一些在下文的非限制性例子中描述。關(guān)于肺纖維化的小鼠模型包括博來霉素(Pittet等人，J.Clin.Invest.107(12)1537-1544(2001)；和Munger等人，同上)和輻射誘導(dǎo)的肺纖維化(Franko等人，Rad.Res.140347-355(1994))。在博來霉素處理的小鼠中，αvβ6表達(dá)在肺的肺泡上皮細(xì)胞中增加。但β6敲除小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的損傷和纖維化。
關(guān)于腎纖維化的小鼠模型包括COL4A3-/-小鼠(參見，例如，Cosgrove等人，Amer.J.Path.1571649-1659(2000))，具有亞德里亞霉素誘導(dǎo)的損傷的小鼠(Wang等人，Kidney International 581797-1804(2000)；Deman等人，Nephrol Dial Transplant 16147-150(2001))，db/db小鼠(Ziyadeh等人，PNAS USA 978015-8020(2000))，和具有單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠(Fogo等人，Lab Investigation 81189A(2001)；和Fogo等人，Journal of the American Society of Nephrology12819A(2001))。在所有這些模型中，小鼠發(fā)展可以進(jìn)展至腎衰竭的腎損傷和纖維化。αvβ6在COL4A3-/-小鼠、亞德里亞霉素處理小鼠、和經(jīng)歷單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠的腎小管升支和降支的上皮層中是上調(diào)的?？赡堞羦β6表達(dá)在各種腎損傷模型中也增加。
同樣在下文詳細(xì)描述的是，還可以在此類動(dòng)物模型如標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移模型中測(cè)試抗αvβ6單克隆抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展、和轉(zhuǎn)移的能力。參見，例如，Rockwell等人，J.Natl.Cancer Inst.49735(1972)；Guy等人，Mol.Cell Biol.12954(1992)；Wyckoff等人，Cancer Res.602504(2000)；和Oft等人，Curr.Biol.81243(1998)。在癌癥中重要的αvβ6配體可以包括TGF-β、纖連蛋白和玻連蛋白，所述TGF-β涉及轉(zhuǎn)移(關(guān)于綜述參見Akhurst等人，Trendsin Cell Biology 11S44-S51(2001))。
本發(fā)明的治療功效可以通過許多可用的診斷工具來測(cè)量，包括體格檢查、血試驗(yàn)、蛋白尿測(cè)量、肌酸酐水平和肌酸酐清除率、肺功能測(cè)試、血漿尿素氮(BUN)水平、瘢痕化或纖維化損害的觀察和評(píng)分、細(xì)胞外基質(zhì)例如膠原沉積、平滑肌肌動(dòng)蛋白和纖連蛋白、腎功能測(cè)試、超聲、磁共振成像(MRI)、和CT掃描。
藥物組合物 本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的一種或多種人源化抗體，或其藥學(xué)可接受的衍生物，任選具有任何藥學(xué)可接受的載體。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”包括已知可接受的佐劑和媒介物。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可以是無菌可注射制劑的形式，例如無菌可注射的水或油懸浮液。這種懸浮液可以根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用任何合適的分散、濕潤(rùn)或懸浮劑來配制。
本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)需要經(jīng)口、局部、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、干內(nèi)(intrasternally)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、或顱內(nèi)給予，或僅局部性地在炎癥或腫瘤生長(zhǎng)位點(diǎn)上給予。本發(fā)明的藥物組合物還可以通過吸入經(jīng)由使用例如噴霧器、干粉吸入器或定量吸入器來施用。
有效產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)的本發(fā)明抗體的劑量和劑量率將取決于各種因素，例如待治療的疾病的性質(zhì)、受試者大小、治療目標(biāo)、使用的具體藥物組合物、和治療醫(yī)生的判斷。約0.001-約100mg/kg體重/天的劑量水平，例如約0.1-約50mg/kg體重/天的活性成分化合物是有用的。例如，本發(fā)明的抗體將以約0.01mg/kg體重/天-約20mg/kg體重/天的劑量，例如約0.1mg/kg體重/天-約10mg/kg體重/天，和每1-14天的間隔施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)腹膜內(nèi)施用時(shí)，抗體以約0.3-1mg/kg體重的劑量施用。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，抗體以約5-12.5mg/kg體重的劑量施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體組合物以有效提供至少1mg/ml抗體血漿水平的量施用。
其他合適的劑量以及施用方案和方式將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的；再其他的在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。
與整聯(lián)蛋白avβ6結(jié)合的配體 在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還指向通過測(cè)定細(xì)胞的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，用于鑒定轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，或用于預(yù)測(cè)腫瘤中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能(即，腫瘤中的細(xì)胞將從原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至體內(nèi)的次級(jí)，或轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的可能性)的方法，其中αvβ6的細(xì)胞表面表達(dá)增加表明癌細(xì)胞更可能是轉(zhuǎn)移性的。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明指向在去除腫瘤的醫(yī)學(xué)干預(yù)后(例如，手術(shù)摘除腫瘤，或化學(xué)治療或放射治療性減少或切除腫瘤)，用于清除表達(dá)αvβ6的殘留腫瘤細(xì)胞，特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法。在另外相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定非侵襲形式的癌，特別是腺癌或原位癌(例如乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)或原位小葉癌(LCIS))的方法，所述癌更可能進(jìn)展至侵襲或轉(zhuǎn)移形式。某些此類實(shí)施方案包含測(cè)定癌細(xì)胞中、或癌周圍的肌上皮中、從患有此類癌的患者獲得的組織切片中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，其中相對(duì)于非腫瘤組織樣品(理想地，來自同一患者的同一器官)整聯(lián)蛋白αvβ6的表達(dá)水平增加，表明癌在不久將來的某時(shí)更可能進(jìn)展至侵襲或轉(zhuǎn)移形式的癌。在每個(gè)此類實(shí)施方案中，本發(fā)明依賴腫瘤細(xì)胞中αvβ6表達(dá)增加的鑒定或利用，所述鑒定通過使組織、腫瘤或腫瘤細(xì)胞與一種或多種配體接觸來完成，所述配體與組織、腫瘤或腫瘤細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，組織、腫瘤或腫瘤細(xì)胞是癌組織、腫瘤或腫瘤細(xì)胞，包括來自癌例如腺癌的那些。在更具體的實(shí)施方案中，癌是乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌或脾臟癌。更具體而言，癌是乳腺癌(包括但不限于原位乳腺癌，例如原位導(dǎo)管癌(DCIS)或原位小葉癌(LCIS))、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮頸癌、或肺癌。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，與αvβ6結(jié)合的配體是αvβ6拮抗劑。此類拮抗劑包括但不限于，與αvβ6特異性結(jié)合的抗體；與β6特異性結(jié)合的抗體；與αv特異性結(jié)合的抗體；與對(duì)于αvβ6的配體結(jié)合的抗體；對(duì)于αvβ6的配體；反義核酸；以及肽、非肽、和此類配體的擬肽類似物。
在本發(fā)明的某些此類實(shí)施方案中，與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的配體是與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的抗體，或其整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合片段、變體、或衍生物。此類抗體可以與整聯(lián)蛋白的1個(gè)亞單位(例如，與位于αv亞單位上的表位或位于β6亞單位上的表位結(jié)合的抗體)，或2個(gè)亞單位(例如，與位于橋接αv和β6亞單位的整聯(lián)蛋白異二聚體區(qū)域中的表位結(jié)合的抗體)結(jié)合。除非具體提及全長(zhǎng)抗體例如天然存在的抗體，術(shù)語(yǔ)“αvβ6抗體”包含全長(zhǎng)抗體以及此類抗體的αvβ6結(jié)合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子、或以類似于抗體分子的方式結(jié)合抗原的改造抗體分子或片段?？贵w可以是合成、單克隆或多克隆的，且可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來制備。對(duì)于治療應(yīng)用，具有人恒定區(qū)和可變區(qū)的“人”單克隆抗體通常是優(yōu)選的，以便使患者針對(duì)抗體的免疫應(yīng)答降到最低。此類抗體可以通過免疫包含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來產(chǎn)生(參見，例如，Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764525-535(1995))。關(guān)于合成和半合成抗體，此類術(shù)語(yǔ)意欲包含但不限于抗體片段、同種型轉(zhuǎn)換抗體、人源化抗體(例如，小鼠-人、人-小鼠等)、雜交物、具有多重特異性的抗體、全合成的抗體樣分子等。
術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用?？贵w或免疫球蛋白包含至少重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，且通常包含至少重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對(duì)充分了解的。參見，例如，Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版，1988)。如普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”包含可以在生物化學(xué)上區(qū)分的各種廣泛種類的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解重鏈被分類為gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ或ε)，其中具有某些亞類(例如，γ1-γ4)。這種鏈的性質(zhì)確定抗體“種類”分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等是充分表征的且已知賦予功能特化。由于本公開內(nèi)容，這些種類和同種型中每一種的修飾形式對(duì)于技術(shù)人員是容易辨別的，且因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
適合于在本發(fā)明中使用的與αvβ6結(jié)合的抗體，或其αvβ6結(jié)合片段、變體或衍生物，包括但不限于多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化、靈長(zhǎng)類化、或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵合的Fvs(sdFv)、包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段、通過Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、和抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括，例如針對(duì)本文公開的抗αvβ6抗體的抗Id抗體)。ScFv分子是本領(lǐng)域已知的且在例如美國(guó)專利5,892,019中描述。本發(fā)明的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
抗體片段包括單鏈抗體可以包含單獨(dú)或與下述全部或部分組合的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明中還包括的是抗原結(jié)合片段，所述抗原結(jié)合片段還包含一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。用于在本文公開的診斷和治療方法中使用的抗體或其免疫特異性片段可以來自任何動(dòng)物起源，包括鳥類和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，抗體是人、鼠科動(dòng)物、大鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、美洲駝、馬、牛科動(dòng)物或雞抗體。最優(yōu)選地，抗體是人、人源化或靈長(zhǎng)類化抗體，或嵌合抗體，特別是單克隆抗體。如本文使用的，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，且包括從人免疫球蛋白文庫(kù)或動(dòng)物中分離的抗體，如下文和例如Kucherlapati等人的美國(guó)專利號(hào)5,939,598中所述，所述動(dòng)物對(duì)于一種或多種人免疫球蛋白是轉(zhuǎn)基因的且不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”將意指其中免疫反應(yīng)區(qū)域或位點(diǎn)從第一個(gè)種類獲得或衍生，和恒定區(qū)(依照本發(fā)明這可以是完整、部分或修飾的)從第二個(gè)種類獲得的任何抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)域或位點(diǎn)將來自非人來源(例如，小鼠或靈長(zhǎng)類)，和恒定區(qū)是人的。
用于依照本發(fā)明使用的特別優(yōu)選的抗體是抗αvβ6單克隆抗體，例如Weinreb等人，J.Biol.Chrm.279(17)17875-17877(2004)(所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考)中公開的那些，包括其中公開的單克隆抗體6.8G6(“8G6”)和6.3G9(“3G9”)。與αvβ6結(jié)合且因此適合于依照本發(fā)明使用的另外抗體包括與整聯(lián)蛋白αvβ6的β6亞單位結(jié)合(且因此視為“抗β6抗體”)的抗體(或其片段、變體或衍生物)，例如整體引入本文作為參考的Weinacker等人，J.Cell Biol.2691-9(1994)；和整體引入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)6,692,741B2，特別是在第2-3和7-8欄中公開的那些，包括命名為10D5(ATCC保藏號(hào)HB12382，1997年8月6日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108)(參見美國(guó)專利號(hào)6,692,741，在第3欄，7-13行，和第7-8欄)和CSβ6(參見美國(guó)專利號(hào)6,692,741，在第7-8欄)的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的合適實(shí)施方案使用αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體，所述αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合配體是αvβ6結(jié)合抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。適合于依照本發(fā)明這個(gè)方面使用的另外抗體包括但不限于，美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)US 2005/0255102A1中公開的αvβ6結(jié)合單克隆抗體，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文，包括其中命名為3G9、8G6、1A8、2B1、2B10、2A1、2E5、1G10、7G5、1C5的那些，及其片段、嵌合體和雜交物。用于依照本發(fā)明使用的特別合適的抗體是單克隆抗體2B1、3G9和8G6。
在某些實(shí)施方案中，抗體包含與由雜交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5生產(chǎn)的抗體相同的重和輕鏈多肽序列。用于依照本發(fā)明使用的特別合適的抗體是包含與下述抗體相同的重和輕鏈多肽序列的單克隆抗體由雜交瘤6.2B1(ATCC保藏號(hào)PTA-3646，2001年8月16日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)生產(chǎn)的2B1抗體，由雜交瘤6.8G6(ATCC保藏號(hào)PTA-3645，2001年8月16日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)生產(chǎn)的8G6抗體，和由雜交瘤6.3G9(ATCC保藏號(hào)PTA-3649，2001年8月16日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)生產(chǎn)的3G9抗體(參見公開的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S 2005/0255102A1，所述專利整體引入本文作為參考，特別是在第1頁(yè)，第0008段；在第2頁(yè)，第0032和0036段；和在第6-14頁(yè)的實(shí)施例中)，和命名為10D5的抗體(分泌所述抗體的雜交瘤于1997年8月6日作為ATCC保藏號(hào)HB 12382保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)(參見美國(guó)專利號(hào)6,692,741，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考，特別是在第3欄，7-13行，和第7-8欄)。
在某些實(shí)施方案中，抗體包含其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、2和3與下表1中所示序列基本上一致(即，除了某些保守變異外)的重鏈。在某些此類實(shí)施方案中，抗體包含其CDR1與SEQ ID NO101-105中任何一個(gè)基本上一致；其CDR2與SEQ ID NO106-111中任何一個(gè)基本上一致；和其CDR3與SEQ ID NO112-117中任何一個(gè)基本上一致的重鏈；和/或其CDRs1、2和3分別與序列SEQ ID NO118-123、124-127和128-133中任何一個(gè)基本上一致的輕鏈。
表1

在其他相關(guān)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體是嵌合抗體，即，其中來自一個(gè)種類(例如，鼠科動(dòng)物、大鼠或兔)的同類抗體通過重組DNA技術(shù)改變，從而使得重和/或輕鏈的部分或全部鉸鏈和/或恒定區(qū)用來自另一個(gè)種類(例如，人)的抗體的相應(yīng)組分替換的那些。一般地，改造抗體的可變結(jié)構(gòu)域保留等同于或基本上等同于同類抗體的可變結(jié)構(gòu)域。此類改造抗體被稱為嵌合抗體，且在給鉸鏈和/或恒定區(qū)來源于其的種類(例如，人)個(gè)體施用時(shí)，比同類抗體的抗原性更少。制備嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
在其他相關(guān)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體是全人抗體。用于生產(chǎn)此類全人單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，US 2005/0255102A1，在第4頁(yè)，第0069-0070段，所述專利引入本文作為參考)。
在其他相關(guān)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體是來源于其他種類的人源化形式的同類抗αvβ6抗體。人源化抗體是由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體，其中并非抗原結(jié)合所需的人免疫球蛋白輕或重鏈的某些或所有氨基酸(例如，可變結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)和框架區(qū))，用于代替來自同類非人抗體的輕或重鏈的相應(yīng)氨基酸。例如，針對(duì)給定抗原的人源化形式的鼠類抗體在其重和輕鏈上具有(a)人抗體的恒定區(qū)；(b)來自人抗體的可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)；和(c)來自鼠類抗體的CDRs。必要時(shí)，人框架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)殘基可以變成鼠類抗體相應(yīng)位置上的殘基，以便保留人源化抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和力。這種變化有時(shí)稱為“回復(fù)突變”。與嵌合人抗體比較，人源化抗體在人中一般更不可能引發(fā)免疫應(yīng)答，因?yàn)槿嗽椿贵w包含明顯更少的非人組分。用于生產(chǎn)此類人源化單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，引入本文作為參考的US 2005/0255102A1，在第4-5頁(yè)，第0072-0077段)。
在另外的此類實(shí)施方案中，人源化抗體在重和/或輕鏈中包含的一個(gè)或多個(gè)CDRs來源于不同抗體的重和/或輕鏈中的相應(yīng)CDRs。此類抗體的一個(gè)合適的非限制性例子是人源化3G9抗體，所述人源化3G9抗體包含的輕鏈CDR1具有來源于2B1抗體(SEQ ID NO20)的輕鏈CDR1序列、而不是關(guān)于保藏的3G9抗體(SEQ ID NO21)的輕鏈CDR1序列。具有SEQ ID NO20中所示輕鏈CDR1序列的此類人源化3G9抗體在本文中命名為hu3G9(或BG00011)。此類抗體的另一個(gè)合適的非限制性例子是人源化8G6抗體，所述人源化8G6抗體包含的輕鏈CDR1具有來源于2B1抗體(SEQ ID NO20)的輕鏈CDR1序列、而不是關(guān)于保藏的8G6抗體(SEQ ID NO18)的輕鏈CDR1序列。具有SEQ ID NO20中所示輕鏈CDR1序列的此類人源化8G6抗體在本文中命名為hu3G96。其中一個(gè)或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDRs已用來自另一種抗體的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)重鏈和/或輕鏈CDRs替換，且適合于依照本發(fā)明使用的此類衍生抗體的另外例子，由于表1中所示序列和本文提供的指導(dǎo)，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。用于制備此類人源化抗體，包括此類衍生人源化抗體的合適方法是普通技術(shù)人員熟悉的，且在例如美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?005/0255102A1中闡述，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。
αvβ6結(jié)合配體的綴合和其他修飾 在某些實(shí)施方案中，與αvβ6結(jié)合的配體例如抗體可以以未綴合形式使用。在其他實(shí)施方案中，與αvβ6結(jié)合的配體例如抗體可以與例如可檢測(cè)標(biāo)記、藥物、前體藥物或同位素綴合。
在下文更詳細(xì)描述的本發(fā)明的某些方法中，例如檢測(cè)細(xì)胞或組織中的αvβ6表達(dá)的方法，作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的測(cè)量，或作為鑒定組織中的原位癌(例如DCIS或LCIS)的方式，αvβ6結(jié)合配體(例如，抗體)與一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記綴合。對(duì)于此類用途，αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體，可以通過生色、酶、放射性同位素、同位素、熒光、毒素、化學(xué)發(fā)光、核磁共振對(duì)比劑或其他標(biāo)記的共價(jià)或非共價(jià)附著進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。
合適的生色標(biāo)記的例子包括二氨基聯(lián)苯胺和4-羥基偶氮-苯-2-羧酸。
合適的酶標(biāo)記的例子包括蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
合適的放射性同位素標(biāo)記的例子包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。當(dāng)使用體內(nèi)成像時(shí)111In是優(yōu)選同位素，因?yàn)樗苊饬?25I或131I-標(biāo)記的αvβ6結(jié)合配體被肝脫鹵化的問題。此外，這種放射性核苷酸具有用于成像的更有利的γ發(fā)射能量(Perkins等人，Eur.J.Nucl.Med.10296-301(1985)；Carasquillo等人，J.Nucl.Med.28281-287(1987))。例如，與具有1-(P-異硫氰酸酯基芐基)-DPTA的單克隆抗體偶聯(lián)的111In已顯示在非腫瘤性組織特別是肝中很少攝取，且因此增強(qiáng)腫瘤定位的特異性(Esteban等人，J.Nucl.Med.28861-870(1987))。
合適的非放射性同位素標(biāo)記的例子包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合適的熒光標(biāo)記的例子包括152Eu標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、異硫氰酸酯標(biāo)記、羅丹明標(biāo)記、藻紅蛋白標(biāo)記、藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記、鄰苯二醛標(biāo)記和熒光胺標(biāo)記。
合適的毒素標(biāo)記的例子包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍亂毒素。
發(fā)光標(biāo)記的例子包括魯米諾標(biāo)記、異魯米諾標(biāo)記、芳香族吖啶酯標(biāo)記、咪唑標(biāo)記、吖啶鎓鹽標(biāo)記、草酸酯標(biāo)記、螢光素標(biāo)記、螢光素酶標(biāo)記和水母素標(biāo)記。
核磁共振對(duì)比劑標(biāo)記的例子重金屬核例如Gd、Mn和鐵。
用于使上述標(biāo)記與αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體結(jié)合的一般技術(shù)由Kennedy等人，Clin.Chim.Acta701-31(1976)，和Schurs等人，Clin.Chim.Acta 811-40(1977)提供。后一篇參考文獻(xiàn)中提及的偶聯(lián)技術(shù)是戊二醛法，高碘酸鹽法、二馬來酰亞胺法、間馬來酰亞胺芐基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯法，所有這些方法引入本文作為參考。
對(duì)于在本發(fā)明的某些治療方法，例如在手術(shù)后除去殘留腫瘤細(xì)胞或預(yù)防轉(zhuǎn)移中的用途，αvβ6結(jié)合配體可以與一種或多種藥物、前體藥物或同位素綴合。優(yōu)選的此類綴合物包含與αvβ6結(jié)合、與一種或多種細(xì)胞毒素劑綴合的一種或多種配體，例如一種或多種抗體，或其片段、衍生物或變體；此類綴合物可用于由本發(fā)明提供的治療和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法中。根據(jù)本發(fā)明的某些此類實(shí)施方案，αvβ6結(jié)合配體例如抗體與細(xì)胞毒素劑綴合。在產(chǎn)生αvβ6結(jié)合配體-細(xì)胞毒素劑綴合物中有用的細(xì)胞毒素例如化學(xué)治療劑是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括但不限于，順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺和博來霉素。適合于依照本發(fā)明這個(gè)方面使用的其他化學(xué)治療劑是眾所周知的且是普通技術(shù)人員熟悉的。
一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體，和一種或多種小分子毒素例如卡里奇霉素、美登素(美國(guó)專利號(hào)5,208,020)、trichothene和CC1065的綴合物的使用也是本文考慮的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體與一個(gè)或多個(gè)美登素分子綴合(例如約1-約10個(gè)美登素分子/αvβ6結(jié)合配體)。美登素可以例如轉(zhuǎn)變成May-SS-Me，所述May-SS-Me可以還原成May-SH3且與修飾的αvβ6結(jié)合配體反應(yīng)(Chari等人Cancer Research 52127-131(1992))，以產(chǎn)生美登醇-αvβ6結(jié)合配體綴合物。
可替代地，αvβ6結(jié)合配體可以與一種或多種卡里奇霉素分子綴合?？ɡ锲婷顾乜股丶易迥軌蛟趤喥つ枬舛壬袭a(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？梢允褂玫目ɡ锲婷顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于，γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和Φ1I(Hinman等人Cancer Research533336-3342(1993)和Lode等人Cancer Research 582925-2928(1998))。
可以用于與一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體，生產(chǎn)綴合物的酶促活性毒素及其片段，包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene。參見，例如，于1993年10月28日以英文公開的WO 93/21232，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。美登醇也可以與一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體綴合。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮了與具有核溶解活性的化合物綴合的αvβ6結(jié)合配體(例如，核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶，例如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)。
各種放射性同位素也可用于生產(chǎn)用于在本發(fā)明的治療方法中使用的放射綴合的αvβ6結(jié)合配體。例子包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。
αvβ6結(jié)合配體和細(xì)胞毒素劑的綴合物可以使用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，所述偶聯(lián)劑例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸酯、硫醇亞胺(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如，二甲基己二亞氨HCl)、活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、his-疊氮化合物(例如二(對(duì)疊氮基苯甲酰)己二酸酯)、二重氮基衍生物(例如二(對(duì)重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如亞芐基2，6-二異氰酸酯)，和雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，Science 2381098(1987)中所述進(jìn)行制備。14碳標(biāo)記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸與αvβ6結(jié)合配體綴合的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接體可以是促進(jìn)胞毒藥物釋放到細(xì)胞中的“可切割連接體”。例如，可以使用酸敏感性連接體、肽酶敏感性連接體、二甲基連接體或含二硫化物連接體(Chari等人Cancer Research 52127-131(1992))。
可替代地，包含αvβ6結(jié)合配體和細(xì)胞毒素劑的融合蛋白可以例如通過重組技術(shù)或肽合成來制備。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體可以與“受體”(例如鏈霉親和素)綴合用于在“預(yù)靶向”中使用，其中給患者施用αvβ6結(jié)合配體-受體綴合物，隨后使用清除劑從循環(huán)中去除未結(jié)合的綴合物，和隨后施用與細(xì)胞毒素劑(例如，放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如抗生物素蛋白)。
本發(fā)明的αvβ6結(jié)合配體也可以與前體藥物活化酶綴合，所述前體藥物活化酶使前體藥物(例如肽基化學(xué)治療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)變成活性藥物。參見，例如，WO 88/07378和美國(guó)專利號(hào)4,975,278。此類綴合物的酶組分包括能夠以這樣的方式作用于前體藥物的任何酶，以便使其轉(zhuǎn)變成其更有活性的細(xì)胞毒素形式。
在本發(fā)明方法中有用的酶包括但不限于，用于使含磷酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的堿性磷酸酶；用于使含硫酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于使無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用于使含肽前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的蛋白酶，例如沙雷氏菌(Serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)變含D氨基酸取代基前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；用于使糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的碳水化合物切割酶，例如O-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于使由P-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變成游離藥物的P-內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如用于分別使在其胺氮上由苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。
酶可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)與αvβ6結(jié)合配體共價(jià)結(jié)合，例如使用異雙功能交聯(lián)劑。可替代地，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，所述融合蛋白包含與酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明αvβ6結(jié)合配體的至少抗原結(jié)合區(qū)域(參見，例如，Neuberger等人，Nature 312604-608(1984))。
疾病診斷和預(yù)后 目前已發(fā)現(xiàn)當(dāng)與轉(zhuǎn)移性較少或無轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞比較時(shí)，來自某些轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞表達(dá)顯著增強(qiáng)水平的整聯(lián)蛋白αvβ6。此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌的腫瘤細(xì)胞和相對(duì)于正常乳腺組織，在某些形式的原位癌例如乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)或原位小葉癌(LCIS)中，腫瘤周圍的肌上皮表達(dá)顯著增強(qiáng)水平的整聯(lián)蛋白αvβ6。因此，本發(fā)明提供了可用于診斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的方法，包括來自癌例如腺癌的腫瘤。在更具體的實(shí)施方案中，癌是乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌或脾臟癌。更具體而言，癌是乳腺癌(包括但不限于原位乳腺癌，例如原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS))、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮頸癌或肺癌。
根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法包括測(cè)定腫瘤細(xì)胞中或組織樣品的肌上皮中的αvβ6表達(dá)水平，且比較這些表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)αvβ6表達(dá)水平(例如，優(yōu)選從同一動(dòng)物例如人患者獲得的正常細(xì)胞、非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、或正常組織中)，其中腫瘤或其細(xì)胞中的αvβ6表達(dá)增加指示那種腫瘤或其細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛能更高，或其中腫瘤周圍肌上皮或組織切片的上皮細(xì)胞群中的αvβ6表達(dá)增加，指示存在更可能變得侵襲性且可能形成轉(zhuǎn)移灶的原位癌例如DCIS或LCIS。
當(dāng)癌癥診斷已根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明可用作預(yù)后指示劑，由此顯示αvβ6表達(dá)水平增加的腫瘤細(xì)胞將預(yù)示更可能變得侵襲性、且從原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)側(cè)的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。類似地，當(dāng)原位癌的可疑診斷已根據(jù)常規(guī)方法(例如，乳房中鈣化性結(jié)節(jié)的乳房造影檢測(cè))進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明可用作證實(shí)指示劑，由此來自鈣化區(qū)域的活檢組織顯示肌上皮中的αvβ6表達(dá)水平增加，指示存在將變得侵襲性且可能響應(yīng)αvβ6mAb治療的原位癌，例如DCIS或LCIS。基于此類預(yù)后和診斷結(jié)果，治療醫(yī)生隨后可以相應(yīng)地調(diào)整治療方案，從而提供轉(zhuǎn)移前或癌前期病狀的盡早檢測(cè)、且因此為患者提供更有利的臨床結(jié)果。
“測(cè)定αvβ6表達(dá)水平”意指直接(例如，通過測(cè)定或估計(jì)樣品中的αvβ6絕對(duì)量)或相對(duì)地(例如，通過比較第一種生物樣品中的αvβ6表達(dá)水平與第二種生物樣品中的那種)定性或定量測(cè)量或估計(jì)第一種生物樣品(例如，腫瘤樣品，組織活檢或抽吸物等)中的αvβ6水平。優(yōu)選地，測(cè)量或估計(jì)第一種生物樣品中的αvβ6水平，且與從第二種生物樣品獲取的標(biāo)準(zhǔn)的那種比較，所述第二種生物樣品從沒有癌癥或癌前期損害的個(gè)體獲得。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，已知關(guān)于給定非癌性組織的標(biāo)準(zhǔn)αvβ6表達(dá)水平后，它可以重復(fù)用作關(guān)于比較的標(biāo)準(zhǔn)。
“生物樣品”意指從個(gè)體(例如患者)、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)、或可能包含細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物的其他來源例如細(xì)胞外基質(zhì)獲得的任何生物樣品。此類生物樣品包括哺乳動(dòng)物身體組織和細(xì)胞，包括可能表達(dá)αvβ6的白細(xì)胞、卵巢、前列腺、心臟、胎盤、胰腺、肝、脾臟、肺、乳房、頭與頸組織(例如，口腔、咽、舌和喉組織)、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸(或結(jié)腸直腸)、子宮頸、胃和臍帶組織。用于從哺乳動(dòng)物獲得組織活檢和體液的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選哺乳動(dòng)物包括猴、猿、貓、狗、奶牛、豬、馬、兔和人。特別優(yōu)選的是人。
生物樣品中的αvβ6表達(dá)水平測(cè)定可以使用人本領(lǐng)域已知方法來完成。對(duì)于生物樣品中的αvβ6表達(dá)水平測(cè)定優(yōu)選的是免疫技術(shù)。例如，組織中的αvβ6表達(dá)可以用常規(guī)免疫組織學(xué)方法來研究。在這些中，特異性識(shí)別由與αvβ6結(jié)合的初級(jí)配體提供，例如抗體(多克隆或單克隆)。這種初級(jí)配體可以例如用熒光、化學(xué)發(fā)光、發(fā)磷光、酶或放射性同位素標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記?？商娲兀景l(fā)明的這些方法可以使用次級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)，其中識(shí)別且與αvβ6結(jié)合配體結(jié)合的第二種配體，例如，識(shí)別且與第一種αvβ6結(jié)合抗體結(jié)合的所謂的“次級(jí)”抗體，是如上所述可檢測(cè)標(biāo)記的。因此，獲得用于病理學(xué)檢查的免疫組織學(xué)染色的組織切片。可替代地，組織和細(xì)胞樣品也可以用尿素和中性清潔劑提取，以釋放αvβ6蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)印跡或斑點(diǎn)/狹縫測(cè)定法(Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))，用于相對(duì)于已知具有較低αvβ6表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)組織或細(xì)胞樣品直接定量。
如上所述，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)移癌，用于測(cè)定腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能(即，預(yù)測(cè)給定腫瘤細(xì)胞將從原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)側(cè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的可能性)，和用于測(cè)定非侵襲性或原位癌將進(jìn)展至侵襲或轉(zhuǎn)移癌的可能性。特別地，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)上皮組織的侵襲和/或轉(zhuǎn)移癌(即，侵襲和/或轉(zhuǎn)移癌)，包括乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、胰腺、結(jié)腸(或結(jié)腸直腸)、頭與頸組織(例如，口腔、咽、舌和喉組織)、子宮內(nèi)膜、子宮頸、胃和脾臟。特別適合于通過本發(fā)明的方法檢測(cè)的是進(jìn)展至侵襲和/或轉(zhuǎn)移表型的可能性增加的侵襲和/或轉(zhuǎn)移腺癌，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、和原位癌，例如某些乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)或原位小葉癌(LCIS)。此類癌的早期鑒定和治療與對(duì)于患者更佳的長(zhǎng)期預(yù)后相關(guān)。例如，已報(bào)道如果未處理，那么顯著比例的DCIS腫瘤變得侵襲性、且可以導(dǎo)致預(yù)后差得多的轉(zhuǎn)移癌(參見Sakorafas，G.H.和Tsiotou，A.G.H.，CancerTreatment Rev.26103-125(2000))。
因此，本發(fā)明考慮了通過下述治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移癌的方法鑒定患者中的侵襲前損害或癌，且治療患者以在其有機(jī)會(huì)進(jìn)化成侵襲形式之前消除侵襲前損害。此類方法包括例如，(a)獲得懷疑包含癌或侵襲前損害的組織樣品，和不包含癌或侵襲前損害的組織樣品(優(yōu)選來自與懷疑含有癌或侵襲前損害的那種相同的組織或器官)；(b)在支持一種或多種αvβ6結(jié)合配體與無論哪里存在的組織中的αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的條件下，使組織樣品與一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體或其片段接觸；和(c)檢測(cè)一種或多種αvβ6結(jié)合配體與組織的結(jié)合水平或模式，其中相對(duì)于增生自身(或其細(xì)胞)的結(jié)合，增生(例如腫瘤)周圍的肌上皮中αvβ6結(jié)合配體的局部結(jié)合增加，或相對(duì)于非癌性組織樣品(或其細(xì)胞)中的結(jié)合，包含癌或侵襲前損害的組織樣品中的αvβ6結(jié)合配體結(jié)合水平增加，指示更可能變得侵襲性和可能轉(zhuǎn)移的癌。在其他相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了減少或預(yù)防患者中的轉(zhuǎn)移前或侵襲前腫瘤進(jìn)展至轉(zhuǎn)移性或侵襲性腫瘤的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與轉(zhuǎn)移前或侵襲前腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致減少或預(yù)防轉(zhuǎn)移前或侵襲前癌癥細(xì)胞侵入原發(fā)性腫瘤周圍的組織區(qū)域內(nèi)。
樣品可以由其獲得用于依照本發(fā)明的這些方法使用的合適組織和器官包括但不限于，本文其他地方描述的上皮組織?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的此類方法有利地治療或預(yù)防的癌癥和腫瘤包括但不限于，癌，特別是腺癌，包括本文其他地方詳細(xì)描述的癌和腺癌。此類癌已根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)后，它隨后可以經(jīng)由手術(shù)、化學(xué)療法、放射學(xué)、或本領(lǐng)域眾所周知且因此是普通技術(shù)人員熟悉的其他癌癥治療方法從患者中清除。可替代地，此類癌可以通過給患者或患者器官或組織施用一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體或其片段，使用本發(fā)明的治療方法清除。在此類實(shí)施方案的某些非限制性例子中，一種或多種αvβ6結(jié)合配體已與如上文詳細(xì)描述的一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑綴合。在此類實(shí)施方案的另外非限制性例子中，給受試者例如患者施用一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體或其片段，結(jié)合如上文詳細(xì)描述的一種或多種細(xì)胞毒素化合物或試劑。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了通過測(cè)量由腫瘤或癌細(xì)胞表達(dá)的αvβ6來確定腫瘤或癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。在此類實(shí)施方案中，腫瘤或細(xì)胞樣品如上所述從患者獲得，且根據(jù)本文描述的方法測(cè)定腫瘤或癌細(xì)胞上的αvβ6表達(dá)水平。優(yōu)選的此類方法包括免疫組織化學(xué)，使用αvβ6結(jié)合抗體(或其片段、變體或衍生物)，例如本文描述的那些。根據(jù)本發(fā)明的這些方法，腫瘤或癌細(xì)胞的αvβ6表達(dá)水平和腫瘤或癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能之間存在直接關(guān)聯(lián)由腫瘤或癌細(xì)胞表達(dá)的αvβ6增加指示那種腫瘤或癌細(xì)胞更可能從原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到次級(jí)部位。因此，腫瘤或癌細(xì)胞的αvβ6表達(dá)水平可以用作腫瘤或癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能的預(yù)后指示劑，這可以幫助癌癥患者及其醫(yī)生基于癌癥的目前或預(yù)測(cè)的未來侵占性或侵襲力做出合適的治療決定。
除了測(cè)定從個(gè)體獲得的生物樣品例如組織或腫瘤細(xì)胞樣品中的αvβ6表達(dá)水平，αvβ6的表達(dá)水平和模式也可以通過成像在體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明的此類方法中，一種或多種αvβ6結(jié)合配體，例如一種或多種αvβ6結(jié)合抗體，用適合于體內(nèi)成像的一種或多種標(biāo)記可檢測(cè)地標(biāo)記。對(duì)于體內(nèi)成像合適的標(biāo)簽或標(biāo)記包括可通過X放射照相術(shù)、NMR或ESR檢測(cè)的那些。對(duì)于X放射照相術(shù)，合適的標(biāo)記包括放射性同位素例如鋇或銫，所述放射性同位素發(fā)出可檢測(cè)的輻射但對(duì)受試者沒有明顯傷害。對(duì)于NMR和ESR合適的標(biāo)記包括具有可檢測(cè)特性自旋的那些，例如氘。
已用合適的可檢測(cè)成像部分標(biāo)記的與αvβ6結(jié)合的配體，例如αvβ6結(jié)合抗體或抗體片段，被引入(例如，腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))哺乳動(dòng)物內(nèi)以檢查癌或原位癌，所述可檢測(cè)成像部分例如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射線的物質(zhì)、或可通過核磁共振檢測(cè)的材料，本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解的是，受試者的大小和使用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像所需的成像部分量。在放射性同位素部分的情況下，對(duì)于人受試者，注入的放射性量通常為約5-20毫居里99mTc。標(biāo)記的αvβ6配體，例如αvβ6結(jié)合抗體或抗體片段，隨后將優(yōu)先積聚在包含或表達(dá)αvβ6整聯(lián)蛋白的細(xì)胞或組織部位。體內(nèi)腫瘤成像隨后如S.W.Burchiel等人，″Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and TheirFragments″(第13章in Tumor ImagingThe Radiochemical Detectionof Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson PublishingInc.(1982))中所述完成。
αvβ6結(jié)合配體的治療用途 在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體或其片段，可以在用于治療患有某些疾病特別是具有某些癌的哺乳動(dòng)物的治療方案中使用，所述癌例如本文其他地方描述的那些。本發(fā)明的此類方法可用于治療癌癥和相關(guān)事件，包括腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生。特別順應(yīng)此類方法的是下述疾病或癌癥特征在于患有該病的哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中的αvβ6表達(dá)水平增加，以及響應(yīng)靶向表達(dá)增加水平的αvβ6的組織或細(xì)胞且清除那些組織或細(xì)胞的治療?？赏ㄟ^這些方法特別治療的疾病包括上皮組織的轉(zhuǎn)移癌(即，轉(zhuǎn)移癌和/或腺癌)，包括乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、胰腺、結(jié)腸、頭與頸組織(例如，口腔、咽、舌和喉組織)、子宮內(nèi)膜、子宮頸、胃和脾臟。特別適合于通過本發(fā)明的這些方法治療的是子宮內(nèi)膜、胰腺、結(jié)腸(例如，結(jié)腸直腸癌)、子宮頸、肺和乳腺癌(包括乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS))。對(duì)于治療優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括猴、猿、貓、狗、奶牛、豬、馬、兔和人。特別優(yōu)選的是人。
在某些此類治療方案中，本發(fā)明的方法適合于通過不同方法去除、治療或根除腫瘤后清除殘留腫瘤細(xì)胞，例如殘留轉(zhuǎn)移細(xì)胞。例如，本發(fā)明的此類方法可以用于清除殘留腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移細(xì)胞，所述殘留腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移細(xì)胞在手術(shù)摘除腫瘤，或通過例如照射、化學(xué)療法等方法根除腫瘤后可能殘留在患者中。在此類治療方案中，本發(fā)明的方法可以包括在手術(shù)、放射學(xué)和/或化學(xué)治療除去腫瘤之前、之時(shí)和/或之后，給患者施用αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體或其片段。
在相關(guān)實(shí)施方案中，如上所述，本發(fā)明提供了減少或預(yù)防患者中的轉(zhuǎn)移前腫瘤進(jìn)展至轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與轉(zhuǎn)移前腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中配體與整聯(lián)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致減少或預(yù)防轉(zhuǎn)移前癌癥細(xì)胞侵入原發(fā)性腫瘤周圍的組織區(qū)域內(nèi)。
在本發(fā)明的這些治療方法的執(zhí)行中，αvβ6結(jié)合配體例如αvβ6結(jié)合抗體或其片段可以以治療制劑(這在本文中也可互換地稱為藥物組合物，且等價(jià)于藥物組合物)的形式施用于患者。通過使具有所需純度的αvβ6結(jié)合配體與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington′sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合，制備依照本發(fā)明使用的αvβ6結(jié)合配體的治療制劑，用于例如以凍干制劑或水溶液的形式貯藏。除了藥理學(xué)活性化合物例如αvβ6結(jié)合配體，本發(fā)明的治療方法中使用的組合物可以包含一種或多種合適的藥學(xué)可接受的載體，所述載體包含促進(jìn)活性化合物加工成可以藥學(xué)使用的制劑的賦形劑和助劑。本發(fā)明的藥物制劑以其自身已知的方式制備，所述方式例如通過常規(guī)混合、顆粒化、錠劑制備、溶解或凍干方法。因此，用于口部使用的藥物制劑可以通過下述方法獲得使活性化合物與固體賦形劑組合，任選研磨所得到的混合物，且在需要或必要時(shí)加入合適的助劑后加工顆?；旌衔?，以獲得片劑或錠劑核。
合適的賦形劑特別是充填劑例如糖類，例如，乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨糖醇、纖維素制劑和/或磷酸鈣，例如，磷酸三鈣或磷酸氫鈣，以及結(jié)合劑，例如淀粉糊，使用例如玉米淀粉、小米淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮。需要時(shí)，可以加入崩解劑，例如上述淀粉以及羧甲基-淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽，例如褐藻酸鈉。助劑尤其是流動(dòng)調(diào)節(jié)劑和潤(rùn)滑劑，例如硅石、滑石、硬脂酸及其鹽，例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、和/或聚乙二醇。錠劑核與合適的涂層一起提供，需要時(shí)所述涂層對(duì)胃液有抵抗力。為了這個(gè)目的，可以使用濃縮糖溶液，所述糖溶液可以任選包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了生產(chǎn)對(duì)胃液有抵抗力的涂層，使用合適的纖維素制劑溶液，例如鄰苯二酸乙酰纖維素或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯。染料材料或色素可以加入片劑或錠劑涂層中，例如用于鑒定或?yàn)榱吮碚骰钚曰衔飫┝拷M合。
可以口部使用的其他藥物制劑包括由明膠制成的推入配合膠囊，以及由明膠和可塑劑例如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊。推入配合膠囊可以包含顆粒形式的活性化合物，所述活性化合物可以與充填劑例如乳糖、結(jié)合劑例如淀粉、和/或潤(rùn)滑劑例如滑石或硬脂酸鎂、和任選地穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物優(yōu)選溶解或懸浮于合適的液體例如脂肪油或液體石蠟中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。
用于腸胃外施用的合適制劑包括水溶性形式的活性化合物水溶液，例如水溶性鹽和堿性溶液。堿性鹽可以包括例如用Tris、膽堿氫氧化物、二-Tris丙烷、N-甲基葡糖胺、或精氨酸制備的銨鹽。此外，可以施用活性化合物懸浮液如合適的油注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯或聚乙二醇400(該化合物溶于PEG-400)。水注射懸浮液可以包含增加懸浮液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、和/或葡聚糖。任選地，懸浮液可以包含穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的化合物可以作為滴劑，或在軟膏、凝膠、脂質(zhì)體、或生物相容性聚合體圓盤、丸內(nèi)或攜帶在隱形眼鏡內(nèi)施用于動(dòng)物和人的眼睛。眼內(nèi)組合物還可以包含如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)選擇的生理學(xué)相容性眼媒介物。媒介物可以選自已知的眼媒介物，所述眼媒介物包括但不限于，水，聚醚例如聚乙二醇400，聚乙烯例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，纖維素衍生物例如羧甲基纖維素、甲基纖維素和羥丙基甲基纖維素、石油衍生物例如礦物油和白凡士林，動(dòng)物脂例如羊毛脂，植物油例如花生油，丙烯酸聚合體例如羧基聚亞甲基凝膠，多糖例如葡聚糖和氨基葡聚糖例如氯化鈉和氯化鉀、氯化鋅和緩沖劑例如碳酸氫鈉或乳酸鈉。還可以使用高分子量分子。不會(huì)滅活組合物中的本發(fā)明化合物的生理學(xué)相容性防腐劑包括醇例如氯代丁醇，氯芐烷銨和EDTA，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他合適的防腐劑。
適合于皮下施用的抗體凍干制劑在美國(guó)專利號(hào)6,267,958中描述，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。此類凍干制劑可以用合適的稀釋劑重建成高蛋白濃縮物，且重建制劑可以皮下施用于本文待治療的患者。
αvβ6結(jié)合配體還可以誘陷在微膠囊中，所述微膠囊例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合法制備，例如羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳劑中。此類技術(shù)公開于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。
可以制備αvβ6結(jié)合配體的緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括包含αvβ6結(jié)合配體的固體疏水性聚合體的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形物品的形式，例如薄膜、或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、L谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這經(jīng)由無菌過濾膜通過過濾容易地完成。
αvβ6結(jié)合配體可以通過任何合適的方法施用于受試者或患者，所述方法包括腸胃外、肺內(nèi)、顱內(nèi)、經(jīng)皮和鼻內(nèi)。腸胃外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。此外，αvβ6結(jié)合配體可以通過脈沖輸注適當(dāng)?shù)厥┯?，例如使用劑量減少的αvβ6結(jié)合配體。優(yōu)選地劑量通過注射給予，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，部分取決于施用是短暫的還是長(zhǎng)期的。
在本發(fā)明的某些示例性實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體以約1mg/m2-約500mg/m2的劑量施用于患者(例如靜脈內(nèi))。例如，αvβ6結(jié)合配體可以以下述劑量施用約1mg/m2、2mg/m2、3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、35mg/m2、40mg/m2、45mg/m2、50mg/m2、55mg/m2、60mg/m2、65mg/m2、70mg/m2、75mg/m2、80mg/m2、85mg/m2、90mg/m2、95mg/m2、100mg/m2、105mg/m2、110mg/m2、115mg/m2、120mg/m2、125mg/m2、130mg/m2、135mg/m2、140mg/m2、145mg/m2、150mg/m2、155mg/m2、160mg/m2、165mg/m2、170mg/m2、175mg/m2、180mg/m2、185mg/m2、190mg/m2、195mg/m2、200mg/m2、205mg/m2、210mg/m2、215mg/m2、220mg/m2、225mg/m2、230mg/m2、235mg/m2、240mg/m2、245mg/m2、250mg/m2、255mg/m2、260mg/m2、265mg/m2、270mg/m2、275mg/m2、280mg/m2、285mg/m2、290mg/m2、295mg/m2、300mg/m2、305mg/m2、310mg/m2、315mg/m2、320mg/m2、325mg/m2、330mg/m2、335mg/m2、340mg/m2、345mg/m2、350mg/m2、355mg/m2、360mg/m2、365mg/m2、370mg/m2、375mg/m2、380mg/m2、385mg/m2、390mg/m2、395mg/m2或400mg/m2。
αvβ6結(jié)合配體可以根據(jù)廣泛多樣的給藥方案施用。例如αvβ6結(jié)合配體可以每天1次施用預(yù)定時(shí)間量(例如，4-8周，或更多)，或根據(jù)每周時(shí)間表(例如，每周1天、每周2天、每周3天、每周4天、每周5天、每周6天或每周7天)施用預(yù)定時(shí)間量(例如，4-8周，或更多)?！懊恐?次”給藥方案的具體例子是在治療期的第1、8、15和22天時(shí)施用αvβ6結(jié)合配體。在可替代的實(shí)施方案中，αvβ6結(jié)合配體可以經(jīng)過數(shù)月的時(shí)間段間歇地施用。例如，αvβ6結(jié)合配體可以每周施用，每半年連續(xù)三周(即，每6個(gè)月重復(fù)每周給藥方案)。應(yīng)當(dāng)理解此類施用方案可以繼續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段(約數(shù)年)以維持由最初治療提供的有利療效。在再其他的實(shí)施方案中，此類維持療法可以在急性給藥方案后實(shí)現(xiàn)，所述急性給藥方案設(shè)計(jì)為減少癌性、轉(zhuǎn)移或原位癌病狀的立即癥狀。
治療期自始至終每次施用的αvβ6結(jié)合配體量可以是相同的；可替代地，在治療期間每次施用的量可以不同(例如，給定時(shí)間點(diǎn)施用的量可以多于或少于先前施用的量)。例如，在維持療法期間給予的劑量可以少于治療急性期間施用的那些。取決于具體環(huán)境的合適給藥方案對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，多種類型或種類的αvβ6結(jié)合配體互相組合，且施用于患者以治療一種或多種癌性、轉(zhuǎn)移或原位癌病狀。例如，本發(fā)明考慮了給患者施用2種或更多不同的αvβ6結(jié)合抗體，例如本文公開的那些。當(dāng)多種αvβ6結(jié)合配體施用于患者時(shí)，不同的αvβ6結(jié)合配體可以在單個(gè)藥物組合物中一起施用，或更優(yōu)選地，可以在分開劑量中順次施用。此類其他試劑的有效量取決于制劑中存在的αvβ6結(jié)合配體量，疾病或病癥或治療類型，及其他因素。
本發(fā)明還包括用于治療癌性、轉(zhuǎn)移或原位癌病狀的方法，所述方法包括給患者施用第一種試劑連同第二種試劑，其中第一種試劑是αvβ6結(jié)合配體，和第二種試劑是可用于治療一種或多種癌性、轉(zhuǎn)移或原位癌病狀但不必是αvβ6結(jié)合配體的試劑。施用第一種試劑“連同”第二種試劑意指第一種試劑可以在給患者施用第二種試劑之前、之時(shí)、或之后施用于患者，從而使得2種試劑在治療方案期間施用于患者。例如，根據(jù)本發(fā)明的某些此類實(shí)施方案，給患者施用αvβ6結(jié)合配體，連同(即，之前、之時(shí)、或之后)給患者施用一種或多種其他整聯(lián)蛋白受體(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ5、α5β1等)拮抗劑，包括本領(lǐng)域已知的對(duì)一種或多種整聯(lián)蛋白受體(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ5、α5β1等)特異的抗體、多肽拮抗劑和/或小分子拮抗劑。
在本發(fā)明這個(gè)方面的某些實(shí)施方案中，連同αvβ6結(jié)合配體施用的第二種試劑是例如，類固醇、細(xì)胞毒素化合物(包括本文其他地方描述的那些)、放射性同位素(包括本文其他地方描述的那些)、前體藥物活化酶(包括本文其他地方描述的那些)、秋水仙堿、氧、抗氧化劑(例如，N-乙酰半胱氨酸)、金屬螯合劑(例如，四硫鉬酸鹽)，IFN-β、IFN-γ、α-抗胰蛋白酶等。為了根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的治療用途，可以連同一種或多種第一種試劑例如一種或多種αvβ6結(jié)合配體施用于患者的另外的第二種試劑或化合物，將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的；此類另外的第二種試劑或化合物的使用因此被視為由本發(fā)明包含。
對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的是，本文所述方法和應(yīng)用的其他合適的修改和適應(yīng)是明顯的，且無需背離本發(fā)明范圍或其任何實(shí)施方案即可進(jìn)行?，F(xiàn)在已詳細(xì)描述本發(fā)明，通過參考下述實(shí)施例將更易于理解，所述實(shí)施例僅為了舉例說明的目的隨同包括且不希望限制本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1mu3G9可變區(qū)的克隆 來自3G9鼠類雜交瘤細(xì)胞的總細(xì)胞RNA使用Qiagen RNeasy mini試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案來制備。編碼重和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)DNA通過RT-PCR從總細(xì)胞RNA克隆，使用Amersham/Pharmacia第一鏈cDNA合成試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案使用隨機(jī)六聚物用于啟動(dòng)。
用于PCR擴(kuò)增鼠類3G9免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的引物是 5′AGGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC 3′(SEQ ID NO8)； 5′GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3′(SEQ ID NO9)；(S＝C/G、M＝A/C、R＝A/G、K＝G/T、W＝A/T和Y＝CT)。
反應(yīng)由下述組成于95℃最初解鏈2.5分鐘，隨后為于94℃解鏈30秒，于60℃退火45秒、每個(gè)循環(huán)減1℃，和于68℃延伸1分鐘的10個(gè)循環(huán)，使用Clontech′s Advantage Taq DNA聚合酶。反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行另外10個(gè)循環(huán)于94℃解鏈30秒，于55℃退火45秒，于68℃延伸1分鐘和于68℃最后延伸9分鐘。反應(yīng)使用Qiagen Qiaquick PCR純化試劑盒根據(jù)制造商的方案進(jìn)行純化。在過量dNTP′s的存在下，Advantage Taq擴(kuò)增DNA的末端用T7DNA聚合酶磨光以產(chǎn)生平端。使用Invitrogen的TOPO克隆試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案，將純化且變鈍的3G9重鏈可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物亞克隆到Invitrogen′s pCR4Blunt-TOPO克隆載體內(nèi)。重鏈RT-PCR亞克隆命名為pKJS062。
3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域基因使用下述引物擴(kuò)增 5′GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAGATGGA 3′(SEQ ID NO10)； 5′GGGGATATCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG S′(SEQ ID NO11)。
反應(yīng)由下述組成于95℃最初解鏈2.5分鐘，隨后為于94℃解鏈30秒，于60℃退火45秒、每個(gè)循環(huán)減1℃，和于68℃延伸2分鐘的6個(gè)循環(huán)，使用Clontech′s Advantage Taq DNA聚合酶。反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行另外24個(gè)循環(huán)于94℃解鏈30秒，于54℃退火45秒，于68℃延伸2分鐘和于68℃最后延伸10分鐘。將該反應(yīng)的十分之一用作使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)的第二輪擴(kuò)增的模板。那種反應(yīng)由下述組成于95℃最初解鏈2.5分鐘，隨后為于94℃解鏈30秒，于55℃退火45秒，和于72℃延伸1分鐘的20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物使用Qiagen Qiaquick凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案進(jìn)行凝膠純化。使用Invitrogen的TOPO克隆試劑盒，將純化的3G9輕鏈可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物亞克隆到Invitrogen′s pCR4Blunt-TOPO克隆載體內(nèi)。輕鏈RT-PCR亞克隆命名為pKJS054。
測(cè)序來自pKJS054和pKJS062的多個(gè)獨(dú)立亞克隆的插入片段。在2種情況下，多個(gè)獨(dú)立亞克隆的插入片段序列是相同的?？勺兘Y(jié)構(gòu)域序列的Blast分析證實(shí)其免疫球蛋白同一性。3G9重鏈可變結(jié)構(gòu)域是鼠類亞群IIID成員。3G9輕鏈可變區(qū)是鼠類κ亞群IV成員。
實(shí)施例2ch3G9的構(gòu)建和表達(dá) 使用編碼鼠類3G9重和輕鏈可變區(qū)的cDNAs構(gòu)建用于表達(dá)鼠類-人嵌合體(ch3G9)的載體，在所述ch3G9中mu3G9可變區(qū)與人IgG1和κ恒定區(qū)連接。
為了構(gòu)建重鏈嵌合體，將來自3G9重鏈可變結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒pKJS062的508bp EcoRI片段，亞克隆到線性化去磷酸化的pUC衍生克隆載體pNN09的EcoRI位點(diǎn)內(nèi)。這個(gè)步驟將側(cè)翼NotI位點(diǎn)加到所得到的質(zhì)粒pKJS093中。質(zhì)粒pKJS093中的重鏈序列通過DNA測(cè)序來證實(shí)。使用Stratagene′sQuickchange誘變?cè)噭┖懈鶕?jù)制造商的推薦方案，通過定點(diǎn)誘變使用下述誘變寡核苷酸，將緊接著HindIII限制位點(diǎn)的剪接供體位點(diǎn)加到質(zhì)粒pKJS093的可變區(qū)編碼序列緊下游 5′CTGTCTCTGCAGGTAAGCTTACACCCCCATCTG 3′(SEQ ID NO12)， 5′CAGATGGGGGTGTAAGCTTACCTGCAGAGACAG 3′(SEQ ID NO13) 這個(gè)步驟產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS116。將來自pKJS116的0.48kbNotI-HindIII重鏈可變結(jié)構(gòu)域片段，和包含人IgG1恒定區(qū)、來自質(zhì)粒pEAG964的1.22kb HindIII-NotI片段，亞克隆到pCEP4(Invitrogen)EBV表達(dá)載體衍生質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS136。
為了構(gòu)建輕鏈嵌合體，將來自3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒pKJS054的474堿基對(duì)EcoRI片段，亞克隆到線性化去磷酸化的克隆載體pNN09的EcoRI位點(diǎn)內(nèi)，在所得到的質(zhì)粒pKJS112中添加側(cè)翼NotI位點(diǎn)。質(zhì)粒pKJS112中的輕鏈序列通過DNA測(cè)序來證實(shí)。使用Stratagene′sQuickchange誘變?cè)噭┖校ㄟ^定點(diǎn)誘變使用下述誘變寡核苷酸，將BgIII限制位點(diǎn)加到質(zhì)粒pKJS112的可變區(qū)編碼序列緊下游 5′GGCACCAAGCTGGAGATCTAACGGGCTGATGCTGC 3′(SEQ ID NO14)， 5′GCAGCATCAGCCCGTTAGATCTCCAGCTTGGTGCC 3′(SEQ ID NO15) 產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS132。將來自pKJS132的453bp NotI-BgIII輕鏈可變結(jié)構(gòu)域片段，和包含人κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域、來自質(zhì)粒pEAG963的678bpBgIII-NotI片段，亞克隆到pCEP4(Invitrogen)EBV表達(dá)載體衍生質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS141。應(yīng)當(dāng)指出在mu3G9克隆期間，輕鏈的第1個(gè)CDR包含糖基化信號(hào)序列(NXT1S)。使用下述寡核苷酸的單輪Quickchange定點(diǎn)誘變 5′GGAACTTACACTTGAGCTGGCACTGCATGTCAAGG 3′(SEQ ID NO16)， 5′CCTTGACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCC 3′(SEQ ID NO17)， 將NSS基序轉(zhuǎn)變成SSS且產(chǎn)生表達(dá)載體pKJS157，去除了這個(gè)糖基化信號(hào)序列。質(zhì)粒pKJS157的輕鏈可變區(qū)序列通過DNA測(cè)序來證實(shí)。
將表達(dá)載體(輕鏈pKJS141或pKJS157和重鏈pKJS136)共轉(zhuǎn)染到293-EBNA細(xì)胞內(nèi)，且測(cè)試轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗體分泌和特異性?？蛰d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和用關(guān)于chM92(分子克隆的CD154特異性mAb)的EBV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞充當(dāng)對(duì)照。使用Pierce Easy Titer試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案的抗體滴度分析，和來自條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡分析(用抗人重和輕鏈抗體顯色)，指出ch3G9轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成且有效裝配重和輕鏈且分泌抗體。針對(duì)αvβ6的ELISA測(cè)定法顯示ch3G9與αvβ6的結(jié)合類似于mu3G9，而chM92則不是。
如圖1中所示，由大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)的嵌合3G9(ch3G9；由三角形符號(hào)指示)、和在輕鏈第1個(gè)CDR的N聯(lián)糖基化位點(diǎn)內(nèi)包含N至S置換的去糖基突變型嵌合3G9(ch3G9S；由正方形符號(hào)指示)，進(jìn)行純化且在ELISA測(cè)定法中顯示與αvβ6類似的結(jié)合。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR1內(nèi)的糖基化位點(diǎn)的去除已顯示改善蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，而不改變或影響抗體的結(jié)合親和力。
實(shí)施例3hu3G9形式1、2和3的構(gòu)建 改造可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生人源化3G9(hu3G9)的設(shè)計(jì)如下進(jìn)行。3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)人κ3，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)人重亞群3。人受體框架的選擇使用程序IgBLAST通過與人種系序列匹配的同源性人L6(具有來源于人JK4的J區(qū))用于輕鏈，和人3-7(具有來源于人JH4的J區(qū))用于重鏈。如表1中所示，設(shè)計(jì)可變改造輕和重鏈中每一個(gè)的3種形式。第1種形式包含關(guān)于鼠類供體序列最多的回復(fù)突變，而第3種形式包含最少的回復(fù)突變(即，最“人源化”)。如表1中所示的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR區(qū)域通過常規(guī)Kabat編號(hào)分類系統(tǒng)來限定。然而，下文呈現(xiàn)的序列編號(hào)基于不同序列就彼此而言的相對(duì)線性定位。
3G9LV3(51) STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSTYPPT 3G9LV4(51) STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSTYPPT 3G9LV5(51) STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSTYPPT L6(50) ----- GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC ----- hu3G9重鏈形式1和2以及輕鏈形式1、2和3通過下述合成制備使用Taq DNA連接酶(New England Biolabs)，連接磷酸化頂端鏈寡核苷酸與并列放置的短底部鏈寡核苷酸組合。反應(yīng)進(jìn)行溫育經(jīng)過于94℃1分鐘、于55℃1分鐘每個(gè)循環(huán)-1℃和65℃4分鐘的15個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生單鏈模板DNA′s，包括5′限制位點(diǎn)(NotI和BamHI)、信號(hào)序列、可變區(qū)，且延伸直至(輕鏈)或進(jìn)入(重鏈)恒定結(jié)構(gòu)域內(nèi)至第一個(gè)可能獨(dú)特的限制位點(diǎn)(BsiWI對(duì)于輕鏈和AgeI對(duì)于重鏈)。關(guān)于合成基因的引物如下所述?；蚰０逋ㄟ^PCR使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)使用下述寡聚物來擴(kuò)增 用于重鏈的 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC 3′(SEQ ID NO18)，和 5′GCTCACGGTCACCGGTTCGGGG 3′(SEQ ID NO19)以及 用于輕鏈的 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC 3′(SEQ ID NO20)和 5′GGAAGATGAACACACTGGGTGCGG 3′(SEQ ID NO21) 以產(chǎn)生雙鏈DNA′s。反應(yīng)由下述組成于95℃最初解鏈2.5分鐘，隨后為于94℃解鏈30秒，于64℃退火30秒，和于72℃延伸1分鐘的16個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物使用Qiagen Qiaquick凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案進(jìn)行凝膠純化。
重鏈形式1由下述頂端鏈5′磷酸化寡核苷酸合成制備 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAGCTGGGTGTTCCTGGTGCTGGTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGATGCTGGTGGAGAGCGGCGGC 3′(SEQ ID NO22)， 5′GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAG 3′(SEQ ID NO23)， 5′CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGAC 3′(SEQ ID NO24)， 5′ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACC 3′(SEQ ID NO25)， 5′AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGAGC 3′(SEQ ID NO26)。
這些寡聚物與下述底部鏈非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部鏈寡核苷酸與并列的頂端鏈寡核苷酸重疊約15bp。底部鏈寡核苷酸是 5′GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC 3″(SEQ ID NO27)， 5′CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC 3″(SEQ ID NO28)， 5′GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG 3″(SEQ ID NO29)， 5′GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG 3″(SEQ ID NO30)。
重鏈形式2由下述頂端鏈5′磷酸化寡核苷酸合成制備 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAGCTGGGTGTTCCTGGTGCTGGTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGC 3′(SEQ ID NO31) 5′GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAG 3′(SEQ ID NO32)， 5′CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGAC 3′(SEQID NO33)， 5′ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACC 3′(SEQ ID NO34)， 5′AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGAGC 3′(SEQ ID NO35)。
這些寡聚物與下述底部鏈非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部鏈寡核苷酸與并列的頂端鏈寡核苷酸重疊約15bp。底部鏈寡核苷酸是 5′GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC 3″(SEQ ID NO36)， 5′CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC 3″(SEQ ID NO37)， 5’GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG 3″(SEQ ID NO38)， 5′GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG 3″(SEQ ID NO39)。
關(guān)于hu 3G9重鏈形式1和2的表達(dá)載體通過下述制備將來自合成產(chǎn)生的人源化變體、包括人IgG1恒定區(qū)第1個(gè)105bp的538bpNotI-AgeI重鏈可變結(jié)構(gòu)域片段，和來自質(zhì)粒pKJS160的919bpAgeI/BamHI片段，亞克隆到NotI/BamHI消化的pKJS160(等同于pCEP4(Invitrogen)衍生EBV表達(dá)載體pCH269)內(nèi)，產(chǎn)生重鏈表達(dá)載體pKJS166(形式1)和pKJS167(形式2)。
重鏈形式3通過在pKJS167質(zhì)粒上用下述寡核苷酸執(zhí)行單輪Quickchange定點(diǎn)誘變來制備 5′CCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTG 3′(SEQ ID NO40)，和 5′CAGGCTGTTCTTGGCGTTGTCGCGGCTGATGG 3′(SEQ ID NO41). 所得到的形式3重鏈質(zhì)粒命名為pKJS168。所得到的質(zhì)粒中的可變區(qū)cDNA序列通過DNA測(cè)序來證實(shí)。
輕鏈形式1由下述頂端鏈5′磷酸化寡核苷酸合成制備 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC 3′(SEQ ID NO42)， 5′CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC 3′(SEQ IDNO43)， 5′CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC 3′(SEQ IDNO44)， 5′TTCGCCGTGTACTTCTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC 3′(SEQ ID NO45)。
這些寡聚物與下述底部鏈非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部鏈寡核苷酸與并列的頂端鏈寡核苷酸重疊約15bp。底部鏈寡核苷酸是 5′GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3″(SEQ ID NO46)， 5’CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3″(SEQ ID NO47)， 5′GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3″(SEQ ID NO48)。
輕鏈形式2由下述頂端鏈5′磷酸化寡核苷酸合成制備 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC 3′(SEQ ID NO49)， 5′CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC 3′(SEQ IDNO50)， 5′CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC 3′(SEQ IDNO51)， 5′TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC 3′(SEQ ID NO52)。
這些寡聚物與下述底部鏈非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部鏈寡核苷酸與并列的頂端鏈寡核苷酸重疊約15bp。底部鏈寡核苷酸是 5′GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3″(SEQ ID NO53)， 5′CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3″(SEQ ID NO54)， 5′GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3″(SEQ ID NO55)。
輕鏈形式3由下述頂端鏈5′磷酸化寡核苷酸合成制備 5′GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC 3′(SEQ ID NO56)， 5′CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC 3′(SEQ ID NO57)， 5′CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC 3′(SEQ ID NO58)， 5′TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC3′(SEQ ID NO59)。
這些寡聚物與下述底部鏈非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部鏈寡核苷酸與并列的頂端鏈寡核苷酸重疊約15bp。底部鏈寡核苷酸是 5′GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3″(SEQ ID NO60)， 5′CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3″(SEQ ID NO61)， 5′GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3″(SEQ ID NO62)。
關(guān)于hu 3G9輕鏈形式1、2和3的表達(dá)載體通過下述制備將來自合成產(chǎn)生的人源化變體的400bp NotI/BsiWI輕鏈可變結(jié)構(gòu)域片段，和包含人免疫球蛋白κ恒定區(qū)、來自質(zhì)粒pKJS162的324bp BsiWI/BamHI片段，亞克隆到NotI/BamHI消化的pKJS161(同樣等同于pCEP4(Invitrogen)衍生EBV表達(dá)載體pCH269)內(nèi)。所得到的質(zhì)粒命名為pKJS172(形式1)、pKJS173(形式2)和pKJS174(形式3)。
實(shí)施例4hu3G9形式1、2和3的表達(dá)以及形式4和5的構(gòu)建 將人源化以及嵌合重和輕鏈表達(dá)載體的所有組合共轉(zhuǎn)染到293-EBNA細(xì)胞內(nèi)(16個(gè)組合)。測(cè)試轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗體分泌和特異性。蛋白質(zhì)印跡分析(用抗人重和輕鏈抗體檢測(cè))和條件培養(yǎng)基的Easy Titer(Pierce)分析，指出hu3G9轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成且有效分泌重和輕鏈，和表達(dá)水平看起來伴隨抗體人源化的增加而增加。如圖2中所示，包含輕鏈形式1的變體表達(dá)很差，而包含輕鏈形式2的變體以較高的水平表達(dá)，暗示人源化增加趨向?qū)е赂叩谋磉_(dá)。
用來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基染色的αvβ6表達(dá)SW480細(xì)胞的FACS分析指出，3G9重鏈的人源化對(duì)抗體與αvβ6表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的能力沒有負(fù)面影響，其中與形式1和2比較，重鏈形式3(CDR移植形式)具有增加的結(jié)合活性(圖3)。FACS分析還顯示包含輕鏈形式3的hu3G9mAb變體的結(jié)合比包含hu3G9輕鏈形式2的變體略微差些，盡管2種形式看起來至少與嵌合3G9一樣好地結(jié)合(圖3)。在輕鏈形式2和3與CDR移植3G9之間分別只有2和1個(gè)氨基酸差異。因?yàn)檫@些輕鏈形式具有與嵌合3G9類似的αvβ6結(jié)合活性，所以制備2種另外形式，以確定結(jié)合活性是否能被改善，或CDR移植形式是否將是功能性的。
形式4探究在輕鏈第1位上的谷氨酰胺至谷氨酸置換的影響，和形式5是完全CDR移植3G9輕鏈(表1)。為了檢測(cè)這些變化各自的分別影響，構(gòu)建新輕鏈表達(dá)載體。質(zhì)粒pKJS186-輕鏈形式3的E1Q變體-使用Stratagene′s Quickchange誘變?cè)噭┖?，通過質(zhì)粒pKJS174的定點(diǎn)誘變使用下述寡核苷酸來制備 5′GTCAGCACGATCTGGCCGCGGCTCATGATC 3′(SEQ ID NO63)和 5′GATCATGAGCCGCGGCCAGATCGTGCTGAC 3′(SEQ ID NO64) 且命名為輕鏈形式4。質(zhì)粒pKJS188-CDR移植3G9輕鏈-通過質(zhì)粒pKJS174的定點(diǎn)誘變使用下述寡核苷酸來制備 5′CCCAGGCTGCTGATCTACAGCACC 3′(SEQ ID NO65)和 5′GGTGCTGTAGATCAGCAGCCTGGG 3′(SEQ ID NO66) 且命名為輕鏈形式5。這些輕鏈形式進(jìn)行序列證實(shí)，且隨后與重鏈形式2或3一起共轉(zhuǎn)染到293-EBNA細(xì)胞內(nèi)。FACS分析指出重鏈形式3和輕鏈形式5-完全CDR移植對(duì)-與αvβ6表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合至少等于或優(yōu)于任何其他人源化變體對(duì)(圖4)。pKJS168和pKJS188配對(duì)命名為hu3G9形式5(H3/L5)。
用ch3G9和hu3G9形式2-5共轉(zhuǎn)染293-EBNA細(xì)胞進(jìn)行按比例擴(kuò)大，且收獲條件培養(yǎng)基?？贵w在A蛋白-Sepharose上進(jìn)行純化，且測(cè)定純化mAbs的活性。與αvβ6的結(jié)合通過對(duì)細(xì)胞系FDCP1-β6的FACS分析(圖5)、ELISA(圖6)、以及生物素化αvβ6與LAP的阻斷(圖7)來確定。結(jié)合活性的等級(jí)次序是形式5(H3/L5)＞形式3(H3/L3)＝ch3G9＝形式2(H2/L2)。阻斷性αvβ6介導(dǎo)的對(duì)于LAP的FDCP1-β6細(xì)胞粘附顯示于圖8中。生物活性的等級(jí)次序是ch3G9＝形式5(H3/L5)＝形式2(H2/L2)＞形式3(H3/L3)。因?yàn)樾问?比形式2更人源化，所以選擇它用于產(chǎn)生穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系。
不同形式的hu3G9重(形式1、2、3和5)和輕(形式1-5)可變結(jié)構(gòu)域的DNA和相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列顯示于表2中。對(duì)于重鏈可變結(jié)構(gòu)域，序列包含 (a)來源于VH3-7的FR1的人FR1； (b)鼠類3G9 CDR1重鏈序列； (c)來源于VH3-7的FR2的人FR2； (d)鼠類3G9 CDR2重鏈序列； (e)來源于VH3-7的FR3的人FR3； (f)鼠類3G9 CDR3重鏈序列；和 (g)來源于存在于大多數(shù)人抗體中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4 WGQGTLVTVSS。
對(duì)于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，序列包含 (a)來源于L6的FR1的人FR1； (b)具有天冬酰胺(N)至絲氨酸(S)的氨基酸置換的鼠類3G9CDR1輕鏈序列； (c)來源于L6的FR2的人FR2； (d)鼠類3G9CDR2輕鏈序列； (e)來源于L6的FR3的人FR3； (f)鼠類3G9 CDR3輕鏈序列；和 (g)來源于存在于大多數(shù)人抗體中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4FGGGTKVEIK。
表2hu3G9可變結(jié)構(gòu)域的重和輕鏈序列 hu3G9形式1輕鏈(SEQ ID NO67) 1 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCE I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T 61 CTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGL S C S A S S S V S S S Y L Y W Y Q Q K 121 CCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCC P G Q A P R L W I Y S T S N L A S G V P 181 GTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGV R F S G S G S G T D F T L T I S S L E 241 CCCGAGGACTTCGCCGTGTACTTCTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGC P E D F A V Y F C H Q W S T Y P P T F G 301 GGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGG G T K V E I K hu3G9形式2輕鏈(SEQ ID NO68) 1 GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACC E I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T 61 CTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAG L S C S A S S S V S S S Y L Y W Y Q Q K 121 CCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCC P G Q A P R L W I Y S T S N L A S G V P 181 GCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAG A R F S G S G S G T D F T L T I S S L E 241 CCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCP E D F A V Y Y C H Q W S T Y P P T F G 301 GGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGG G T K V E I K hu3G9形式3輕鏈(SEQ ID NO69) 1 AGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCE I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T 61 CTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAG L S C S A S S S V S S S Y L Y W Y Q Q K 121 CCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCC P G Q A P R L W I Y S T S N L A S G I P 181 CCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAG A R F S G S G S G T D F T L T I S S L E 241 AGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCP E D F A V Y Y C H Q W S T Y P P T F G 301 GGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG G G T K V E I K hu3G9形式4輕鏈(SEQ ID NO70) 1 CAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCQ I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T 61 CTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGL S C S A S S S V S S S Y L Y W Y Q Q K 121 CCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCCP G Q A P R L W I Y S T S N L A S G I P 181 GCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGA R F S G S G S G T D F T L T I S S L E 241 CCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCP E D F A V Y Y C H Q W S T Y P P T F G 301 GGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG G G T K V E I K hu3G9形式5輕鏈(SEQ ID NO71) 1 AGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCE I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T 61 TGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAG L S C S A S S S V S S S Y L Y W Y Q Q K 121 CCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCC P G Q A P R L L I Y S T S N L A S G I P 181 CCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAG A R F S G S G S G T D F T L T I S S L E 241 CCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCP E D F A V Y Y C H Q W S T Y P P T F G 301 GGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGG G T K V E I K hu3G9形式1重鏈(SEQ ID NO72) 1 AGGTGATGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGE V M L V E S G G G L V Q P G G S L R L 61 GCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCS C A A S G F T F S R Y V M S W V R Q A 121 CCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCC P G K G L E W V A S I S S G G R M Y Y P 181 ACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGD T V K G R F T I S R D S A K N S L Y L 241 AGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATC Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R G S I 301 ACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCC Y D G Y Y V F P Y W G Q G T L V T V S S hu3G9形式2重鏈(SEQ ID NO73) 1 AGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGE V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L 61 GCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCC S C A A S G F T F S R Y V M S W V R Q A 121 CCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCC P G K G L E W V A S I S S G G R M Y Y P 181 ACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGD T V K G R F T I S R D S A K N S L Y L 241 AGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCQ M N S L R A E D T A V Y Y C A R G S I 301 ACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCY D G Y Y V F P Y W G Q G T L V T V S S hu3G9形式3和5重鏈(SEQ ID NO74) 1 AGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L 61 GCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCC S C A A S G F T F S R Y V M S W V R Q A 121 CCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCP G K G L E W V A S I S S G G R M Y Y P 181 ACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTG D T V K G R F T I S R D N A K N S L Y L 241 AGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATC Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R G S I 301 ACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCY D G Y Y V F P Y W G Q G T L V T V S S 實(shí)施例5關(guān)于野生型和去糖基hu3G9形式5的穩(wěn)定CHO表達(dá)載體的構(gòu)建 上文描述的EBV載體包含不希望有的外來5′和3′UTRs。制備穩(wěn)定的CHO表達(dá)載體用于hu-3G9重鏈形式3和輕鏈形式5(H3/L5)，統(tǒng)稱為形式5，其中外來序列被去除。此外，制備去糖基重鏈載體以去除表達(dá)的3G9抗體和Fcγ受體之間可能的相互作用。
如圖9中所示，輕鏈穩(wěn)定CHO表達(dá)載體通過下述構(gòu)建將pKJS188的723堿基對(duì)BamH1片段連接到pKJS077(PDM-64-02-13)的6188堿基對(duì)、含neo BamH1消化的載體片段內(nèi)，產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS195。
重鏈穩(wěn)定CHO表達(dá)載體通過下述構(gòu)建最初將來自pKJS168的1449堿基對(duì)BamH1片段連接到pKJS078(PDM-64-02-13)的6051堿基對(duì)、BamH1消化的載體片段內(nèi)，以去除重鏈編碼序列側(cè)翼的NotI限制位點(diǎn)且產(chǎn)生質(zhì)粒pKJS171。為了從由pKJS171編碼的重鏈中遺傳去除C末端賴氨酸殘基，pKJS171的2190堿基對(duì)BsrG1-Xba1片段用pKJS078(PDM-64-02-13)的2187堿基對(duì)BsrG1-Xbal片段替換，產(chǎn)生pKJS189。如圖10中所示，質(zhì)粒pKJS189表示含dhfr野生型hu-3G9穩(wěn)定CHO表達(dá)載體。為了產(chǎn)生去糖基形式的重鏈，pKJS189的587堿基對(duì)Agel/BsrG1片段用來自pCR076的587堿基對(duì)Age1/BsrG1片段替換，產(chǎn)生pKJS196。如圖11中所示，這種載體表示含dhfr去糖基hu-3G9穩(wěn)定CHO表達(dá)載體，包含去除正常Fc受體結(jié)合所需的糖基化信號(hào)的N319Q置換。
證實(shí)pKJS189、pKJS196和pKJS195中的BamHI cDNA插入片段的DNA序列。將表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)，且測(cè)試轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗體分泌。如圖12中所示，條件培養(yǎng)基的Easy-Titer(Pierce)人抗體檢測(cè)測(cè)定法指出，轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成且有效分泌來自CHO表達(dá)載體的重和輕鏈。
因此，存在可以在hu-3G9抗體中進(jìn)行修飾而不影響抗體結(jié)合親和力的2個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)(1)在hu-3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR1區(qū)域內(nèi)SEQ ID NO2的氨基酸殘基26上，其中天冬酰胺(N)至絲氨酸(S)的置換去除改善蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的糖基化位點(diǎn)(這個(gè)位點(diǎn)在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的所有5種形式中進(jìn)行修飾)；和(2)在hu-3G9重鏈形式3恒定區(qū)中，其中天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)的置換去除Fc受體結(jié)合所需的糖基化位點(diǎn)。
實(shí)施例6表達(dá)hu3G9形式5的CHO細(xì)胞系 將關(guān)于hu3G9形式5的表達(dá)質(zhì)粒pKJS189、pKJS196和pKJS195轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)。從具有顯示對(duì)于αvβ6的結(jié)合特異性的抗體分泌的轉(zhuǎn)染細(xì)胞觀察到hu3G9形式5(H3/L5)和去糖基hu3G9形式5(a-H3/L5)表達(dá)。
實(shí)施例78G6抗αvβ6抗體的人源化設(shè)計(jì) 在人源化抗體的設(shè)計(jì)中，互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)包含最可能結(jié)合抗原且必須保留在改造抗體中的殘基。根據(jù)Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest.第5版，U.S.Dept.Health andHuman Services，U.S.Govt.Printing Office(1991)，CDRs由序列確定。CDRs包含在規(guī)范種類內(nèi)(Chothia等人，Nature，342877-883(1989))，其中關(guān)鍵殘基在很大程度上決定CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。這些殘基幾乎一直保留在改造抗體中。重和輕鏈CDRs如下分類成規(guī)范種類 輕鏈 重鏈 L115個(gè)殘基 種類4H15個(gè)殘基 種類 1 L27個(gè)殘基 種類1H217個(gè)殘基 種類 2 L39個(gè)殘基 種類1H317個(gè)殘基無規(guī)范種類 對(duì)于這些種類重要的規(guī)范殘基在表3中指出。所有規(guī)范殘基如由規(guī)則所述。不存在關(guān)于環(huán)H3的規(guī)范種類。
表3 L1種類4 2(I)25(A)29(V)33(M)71(F) L2種類1 48(I)51(A)52(S)64(G) L3種類1 90(H)95(P) H1種類1 24(G)26(S)27(Y)29(F)34(M)94(R) H2種類2 52a(T)55(G)71(V) H3 無規(guī)范種類 使用程序FASTA比較可變輕和重鏈與關(guān)于小鼠和人亞群的共有序列(Kabat等人，1991)。
8G6可變輕鏈?zhǔn)切∈髞喨害?成員，在112個(gè)氨基酸重疊中具有81.250％的同一性，和8G6可變重鏈?zhǔn)切∈髞喨?a成員，在129個(gè)氨基酸重疊中具有71.318％的同一性。8G6可變輕鏈對(duì)應(yīng)人亞群κ4，在113個(gè)氨基酸重疊中具有65.487％的同一性。8G6可變重鏈對(duì)應(yīng)人亞群1，在134個(gè)氨基酸重疊中具有58.955％的同一性。VH/VL包裝界面殘基是保守的，除了輕鏈(SEQ ID NO4)中氨基酸位置50上的罕見F，和重鏈(SEQ ID NO3)中氨基酸位置39上的罕見L。
可變區(qū)結(jié)構(gòu)建模如下進(jìn)行。輕和重鏈針對(duì)最近PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的局部拷貝進(jìn)行比對(duì)，以確定用于構(gòu)建輕和重鏈三維模型的結(jié)構(gòu)框。使用FASTA，發(fā)現(xiàn)8G6輕鏈在111個(gè)氨基酸重疊中與鼠類N10Fab(INSN；2.9

分辨率)具有90.991％的序列同一性。發(fā)現(xiàn)8G6重鏈在126個(gè)氨基酸重疊中與鼠類JEL42Fab(2JEL；2.5

分辨率)具有80.952％的序列同一性。全結(jié)構(gòu)模板通過將2JEL重鏈和1NSN輕鏈組合來獲得。使用分子建模包Modeler 5.0(Accelrys Inc.)，使用模板結(jié)構(gòu)建立輕和重鏈的三維結(jié)構(gòu)。制備同源性模型，且選擇就Modeler能量而言最佳的一個(gè)。Procheck分析顯示在phi/psi帽的不接受區(qū)域中沒有殘基。
在改造可變區(qū)的設(shè)計(jì)中，嘗試找到最相似的人表達(dá)抗體序列用作抗體框架。為了找到最接近的表達(dá)序列，在NCBI NR數(shù)據(jù)庫(kù)、TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)和Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行最同源表達(dá)的人框架搜索。對(duì)于重和輕鏈序列，進(jìn)行2種搜索(CDR遮蔽和暴露的)。最合適的表達(dá)序列的選擇包括檢查規(guī)范和界面殘基的序列同一性，以及檢查CDR環(huán)長(zhǎng)度中的相似性?？贵w來源也是決定因素。排除先前的人源化抗體。對(duì)于NCBI NR和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，使用BLAST，和對(duì)于Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，使用FASTA。
最相似的表達(dá)輕鏈在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中找到(kabat標(biāo)識(shí)026520AC21B′CL；Ohlin等人，Mol.Immunol.，3347-56(1996))。這是來自噬菌體展示的PCR擴(kuò)增scFv，但它在框架區(qū)中100％等同于L6種系。對(duì)于重鏈，選擇在NCBI上來自NR數(shù)據(jù)庫(kù)的人框架gi|392715。它在框架區(qū)中100％等同于種系VH1-2。針對(duì)種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索2種序列，且這導(dǎo)致下述選擇的種系L6對(duì)于輕鏈，和1-2對(duì)于重鏈。
單克隆抗體人源化中的最重要程序是鑒定從人框架殘基到小鼠的回復(fù)突變。經(jīng)驗(yàn)已顯示保留規(guī)范殘基、界面包裝殘基、和接近于結(jié)合位點(diǎn)的罕見鼠類殘基是特別重要的。此外，位于任何CDR殘基6

內(nèi)的殘基需要嚴(yán)密分析對(duì)CDRs構(gòu)象的潛在影響。
已設(shè)計(jì)了3種形式的8G6可變改造輕鏈和3種形式的8G6可變改造重鏈。第一種形式包含最多的回復(fù)突變和第三種形式包含最少的回復(fù)突變(即，最“人源化”)。表4顯示關(guān)于人源化8G6(hu8G6)抗體的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
表4-關(guān)于hu8G6的重和輕鏈序列 表4a-重鏈序列 FR1 CDR1 FR2 鼠類 (1)QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSSYTFT DYAMH WVKLSHAKSLEWIG 8G6HV1(1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFT DYAMH WVRLAPGQGLEWIG 8G6HV2(1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYAMH WVRQAPGQGLEWIG 8G6HV3(1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYAMH WVRQAPGQGLEWMG VH1-2 (1)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT---WVRQAPGQGLEWMG CDR2FR3 鼠類 (50)VISTYYGNTNYNQKFKG KATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAVYYCAR 8G6HV1 (50)VISTYYGNTNYNQKFKG RATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR 8G6HV2(50)VISTYYGNTNYNQKFKG RATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR 8G6HV3(50)VISTYYGNTNYNQKFKG RATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR VH1-2 (50)RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR 表4b-輕鏈序列 FR1 CDR1FR2 鼠類 (1)DIVLTQSPASLAVSLGQRAIISC RASQSVSTSSYSYMY WYQQKPGQSPKFLIK 8G6LV1(1)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSTSSYSYMY WYQQKPGQAPRFLIK 8G6LV2(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSTSSYSYMY WYQQKPGQAPRFLIK 8G6LV3(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSTSSYSYMY WYQQKPGQAPRLLIK LS(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC ----- WYQQKPGQAPRLLIY CDR2 FR3 CDR3 鼠類 (54)YASNLES GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHNWEIP 8G6LV1(54)YASNLES GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIP 8G6LV2(54)YASNLES GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIP 8G6LV3(54)YASNLES GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIP L6(50)----GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC----- 不同形式的hu8G6重(形式1、2和3)和輕(形式1、2和3)可變結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列顯示于表5中。對(duì)于重鏈可變結(jié)構(gòu)域，序列包含 (a)來源于VH1-2的FR1的人FR1； (b)鼠類8G6CDR1重鏈序列； (c)來源于VH1-2的FR2的FR2； (d)鼠類8G6CDR2重鏈序列； (e)來源于VH1-2的FR3的人FR3； (f)鼠類8G6CDR3重鏈序列；和 (g)來源于共有框架序列的人FR4，所述共有框架序列100％等同于來自NR數(shù)據(jù)庫(kù)的人框架gi|392715，且存在于大多數(shù)人抗體中、具有下述序列WGQGTLVTVSS。
對(duì)于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，序列包含 (a)來源于L6的FR1的人FR1； (b)鼠類8G6 CDR1輕鏈序列； (c)來源于L6的FR2的人FR2； (d)鼠類8G6CDR2輕鏈序列； (e)來源于L6的FR3的人FR3； (f)鼠類8G6 CDR3輕鏈序列；和 (g)來源于存在于大多數(shù)人抗體中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4FGGGTKVEIK。
表5-hu8G6可變結(jié)構(gòu)域的重和輕鏈序列 hu8G6形式1重鏈(SEQ ID NO78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFTDYAMHWVRLAPGQGLEWIGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS hu8G6形式2重鏈(SEQ ID NO79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS hu8G6形式3重鏈(SEQ ID NO80) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLQYAMDYWGQGTLVTVSS hu8G6形式1輕鏈(SEQ ID NO75) DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFL∏CYASNLESGΓ PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK hu8G6形式2輕鏈(SEQ ID NO76) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK hu8G6形式3輕鏈(SEQ ID NO77) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 下文描述了改造可變輕鏈中的回復(fù)突變 E1D-這已顯示影響CDR構(gòu)象/抗原結(jié)合(Kolbinger等人，ProteinEng.，8971-980(1993))。在模型中，它可能與CDRs L1和L3中的S26、Q27和/或E93的主鏈或側(cè)鏈相互作用。它在形式2和3中被去除，因?yàn)樵撝脫Q是保守的。
L46F-這是VH/VL包裝界面殘基。它看起來還正好在CDR-L2殘基E55的下面。它在形式3中被去除。
Y49K-這鄰近于CDR-L2且看起來在模型中與殘基E55相互作用。這可能是非常重要的回復(fù)突變，且因此未被去除。
下文描述了改造可變重鏈中的回復(fù)突變 A24G-這是關(guān)于CDR-H1的規(guī)范殘基。保守突變。在形式2中被去除。
G26S-這是關(guān)于CDR-H1的規(guī)范殘基。保守突變。在形式2中被去除。
Q39L-這是包裝界面殘基。它與輕鏈的相互作用非常有限，且因此在形式2中被去除。M48I-這是常見的回復(fù)突變。在模型中它可以與CDR-H2中的Y59和F63相互作用。它在形式3中被消除。V68A-這種殘基位于CDR-H2的下面，可能與Y59和F63相互作用。
R72V-這是關(guān)于CDR-H2的規(guī)范殘基。T74K-這種殘基位于CDR-H2的下面，可能與Y53相互作用或直接接觸抗原。
實(shí)施例8αvβ6抗體內(nèi)在化 由細(xì)胞內(nèi)在化的抗體提供用于某些臨床適應(yīng)癥例如癌癥的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭贵w隨后可以與毒素、放射性化合物或其他抗癌劑綴合，以選擇性靶向和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。被內(nèi)在化的抗αvβ6抗體的能力先前在WO03/100033中描述，所述專利整體引入本文作為參考。WO 03/100033公開了對(duì)于陽(yáng)離子依賴性單克隆抗體(含RGD的配體模擬物)例如6.8G6和6.1A8觀察到內(nèi)在化。然而，對(duì)于陽(yáng)離子非依賴性mAbs例如6.3G9、7.1C5和6.4B4沒有觀察到內(nèi)在化?？贵w例如8G6被細(xì)胞內(nèi)在化的能力提供了使內(nèi)在化抗體與治療部分/試劑偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)，以允許將部分/試劑遞送到細(xì)胞內(nèi)。例如藥物或毒素部分可以與8G6內(nèi)在化抗體綴合。然而，這種相同的應(yīng)用可以應(yīng)用于非內(nèi)在化抗體，例如3G9，其中化學(xué)部分可以與此類抗體綴合，以允許遞送至靶細(xì)胞表面(例如，腫瘤細(xì)胞表面)。
實(shí)施例9相對(duì)于原發(fā)性腫瘤αvβ6在轉(zhuǎn)移灶中是高度表達(dá)的 在本實(shí)驗(yàn)中，著手研究αvβ6在各種上皮起源的癌癥中和在轉(zhuǎn)移病灶上的表達(dá)，且確定功能阻斷性αvβ6mAbs是否能夠抑制αvβ6表達(dá)腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。評(píng)估了抗人αvβ6mAbs對(duì)人咽癌Detroit62的體內(nèi)抗腫瘤活性，且比較這個(gè)與TβRIIFc的體內(nèi)抗腫瘤活性。數(shù)據(jù)支持αvβ6在人癌癥中的作用和使用功能阻斷性αvβ6mAb的治療干預(yù)潛能。
A.材料和方法 對(duì)于免疫組織化學(xué)，將組織切片在二甲苯和乙醇中去石蠟化、在蒸餾水中再水合、且隨后浸入包含0.45％H2O的甲醇中。組織與胃蛋白酶(00-3009，Zymed，San Francisco，CA)一起溫育，且用抗生物素蛋白和生物素(SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封閉。初級(jí)抗體在包含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋，且使組織于4℃溫育過夜。為了免疫染色小鼠異種移植物組織上的β6，切片與人/小鼠嵌合型抗αvβ6mAb，2A1(Weinreb，P.H.等人，J.Biol，Chem.279(17)17875-17887(2004))，和抗人生物素化次級(jí)抗體(PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起溫育。為了免疫染色人組織上的β6，切片與鼠類2A1和抗小鼠-生物素化次級(jí)抗體(PK-6102，Vector Laboratories)一起溫育。將抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物-辣根過氧化物酶(PK-6102，Vector Kit)應(yīng)用于切片、在室溫下溫育30分鐘，且如示的(SK-4100，Vector Laboratories)制備3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，且于室溫應(yīng)用于切片5分鐘。組織切片用Mayer′s Hematoxylin染色1分鐘且在水和PBS中漂洗。
B.結(jié)果 1.αvβ6在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) αvβ6免疫染色對(duì)各種腫瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行評(píng)估。78％的轉(zhuǎn)移灶(43/55)是陽(yáng)性免疫染色的，顯示在大多數(shù)轉(zhuǎn)移灶上的強(qiáng)烈染色(圖13A-F；圖14A-I)。發(fā)現(xiàn)這種結(jié)果是陽(yáng)性免疫染色百分比中的增加，其中只發(fā)現(xiàn)頭與頸、子宮頸和胰腺腫瘤具有相等的表達(dá)水平(表1) 表1αvβ6在人腫瘤中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)) 組織 αvβ6/總數(shù) αvβ6％ 口腔4/4100％ 子宮頸 79/98 81％ 胰腺31/39 80％ 皮膚41/53 77％ 喉和咽 43/64 67％ 食道35/56 63％ 子宮內(nèi)膜17/32 53％ 肺 28/70 40％ 乳房41/101 41％ 結(jié)腸直腸181/48837％ 2.αvβ6在子宮內(nèi)膜腫瘤和患者匹配的轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) 如上表1中所述，αvβ6免疫染色在檢查的53％子宮內(nèi)膜腫瘤上是陽(yáng)性的。除少數(shù)例外，染色在更高分級(jí)腫瘤的更侵襲性區(qū)域中更顯著。3種原發(fā)性腫瘤樣品具有匹配的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。在3種情況的2種中，相對(duì)于匹配的原發(fā)性腫瘤，免疫染色在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶上明顯更高(比較圖15A與圖15B，和圖15C與圖15D)。在第3種情況下，免疫染色在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和匹配的原發(fā)性腫瘤上都很高(數(shù)據(jù)未顯示)。αvβ6陽(yáng)性腫瘤上皮染色百分比在3種原發(fā)性腫瘤中分別為10％、20％和90％，而匹配的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的αvβ6陽(yáng)性腫瘤上皮百分比分別為80％、100％和100％。在正常子宮內(nèi)膜中，染色局限于表面層上的偶然細(xì)胞以及囊。
3.αvβ6在侵襲性人乳腺腫瘤樣品中的表達(dá) 使用免疫組織化學(xué)根據(jù)上文材料和方法中所述操作，評(píng)估超過100個(gè)人乳腺癌樣品的αvβ6表達(dá)水平。在原位導(dǎo)管癌(DCIS)的幾種情況下，αvβ6表達(dá)限制于腫瘤周圍的肌上皮，且在腫瘤自身上未觀察到(參見，例如，BrCa19；圖16A)。然而，在侵襲性乳腺癌的幾種情況下，αvβ6同樣在腫瘤上表達(dá)(參見，例如，BrCa 23；圖16B)。
比較正常乳腺組織與包含非侵襲性腫瘤例如DCIS的乳腺組織、包含侵襲性乳腺癌的乳腺組織，存在乳腺組織細(xì)胞(上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)中的特異性基因表達(dá)改變的證據(jù)(Alinen，M.等人，Cancer Cell617-32(2004)；Burstein，H.J.等人，N.Engl.J.Med.3501430-1441(2004))。許多這些基因表達(dá)變化已在肌上皮細(xì)胞中檢測(cè)到。肌上皮(正常組織和DCIS中)上的αvβ6整聯(lián)蛋白表達(dá)可能導(dǎo)致支持腫瘤存活力、且促進(jìn)侵襲性腫瘤進(jìn)展的微環(huán)境，可能經(jīng)由局部TGF-β活化。可以進(jìn)展至侵襲性癌的DCIS體內(nèi)模型，例如MCF10DCIS.com(Miller，F(xiàn).R.等人，J.Natl.Canc.Inst.921185-1186(2000))，將提供評(píng)估進(jìn)展乳腺腫瘤背景中的αvβ6表達(dá)?？梢栽u(píng)估在腫瘤早期非侵襲階段的肌上皮中的αvβ6表達(dá)，和當(dāng)腫瘤進(jìn)展至體內(nèi)侵襲表型時(shí)的αvβ6表達(dá)。這種模型還允許使用阻斷性αvβ6mAbs測(cè)試αvβ6的功能作用，以及測(cè)試綴合的抗αvβ6mAbs的功效。
4.αvβ6在人胰腺腫瘤樣品、患者匹配的轉(zhuǎn)移灶和侵襲性胰腺腫瘤的小鼠異種移植模型中的表達(dá) 如上文表1中所示，αvβ6免疫染色在80％檢查的胰腺腫瘤上是陽(yáng)性的。當(dāng)通過免疫組織化學(xué)檢查來自8個(gè)不同患者的原發(fā)性胰腺腫瘤樣品時(shí)，染色在高分級(jí)腫瘤的侵襲性區(qū)域中顯著(圖17A-17C；18A-18E)。原發(fā)性腫瘤樣品還具有匹配的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(圖17D-17F；18F-18J)，所述淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶也顯示強(qiáng)烈的αvβ6染色，支持αvβ6陽(yáng)性細(xì)胞已從原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)散布的觀點(diǎn)。在正常胰腺(圖17G-17H；18K-18L)中，染色局限于表面層上的偶然細(xì)胞。
為了進(jìn)一步檢查αvβ6表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響，使用BxPC-3小鼠腫瘤異種移植物作為侵襲性人胰腺腺癌模型。動(dòng)物在脅腹用5×106細(xì)胞/小鼠進(jìn)行皮下植入(第0天)，所述細(xì)胞懸浮于無菌鹽水中，使用0.1ml/小鼠的注射。在第30天時(shí)，具有已建立的腫瘤(～60-100mm3)的小鼠互相配對(duì)成3個(gè)處理組(PBS；mAb 3G9；可溶性TGF-β受體H-Ig融合蛋白(solTGFβRII-Fc))用于所有研究。測(cè)試試劑以每周3次的處理時(shí)間表腹膜內(nèi)施用于小鼠。小鼠用10mg/kg的3G9、2mg/kg的solTGFβRII-Fc、或PBS(陰性對(duì)照)進(jìn)行注射。腫瘤生長(zhǎng)每周測(cè)量2次，且腫瘤體積根據(jù)下式評(píng)估[(寬度)2×長(zhǎng)度]/2。來自處理組的腫瘤被切除，固定在10％多聚甲醛中，進(jìn)行石蠟包埋且切片，用于使用非阻斷性v6嵌合mAb 6.2A1的免疫組織化學(xué)分析。
使用抗αvβ6mAb 3G9的處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有直接影響(圖19B，19C)，其中在用抗體處理約48天后觀察到腫瘤生長(zhǎng)顯著減少。使用solTGFβRII-Fc觀察到的生長(zhǎng)抑制水平略微低于對(duì)于3G9觀察到的那種。這些結(jié)果指出抗αvβ6mAb 3G9在人胰腺癌異種移植模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)，且暗示此類阻斷性抗體可以用于在原發(fā)性人胰腺腺癌中抑制腫瘤生長(zhǎng)，且延伸至抑制腫瘤侵襲。
實(shí)施例10αvβ6功能阻斷性mAbs抑制αvβ6表達(dá)腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、和MMP生產(chǎn) 評(píng)估αvβ6阻斷性單克隆抗體(mAb)3G9(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)17875-17887(2004))和可溶性重組TGF-βRII-Ig(Cosgrove，D.等人，Am.J.Pathol.157(5)1649-1659(2000))，在體外阻斷β6轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲、遷移和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)生產(chǎn)的能力。監(jiān)控這些活性是因?yàn)樗龌钚愿髯砸雅c腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)。3G9和TGF-βRII-Ig的效應(yīng)使用未轉(zhuǎn)染母細(xì)胞(C1)和β6轉(zhuǎn)染C1細(xì)胞衍生物(VB6)進(jìn)行評(píng)估。
遷移和侵襲測(cè)定法。C1和VB6人口腔鱗狀癌細(xì)胞如先前所述在KGM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Thomas，G.J.等人，J.Invest.Derm.117(1)67-73(2001)。為了測(cè)量遷移，根據(jù)制造商的說明書使用FLUOROBLOKTM板和內(nèi)眼板(BD Biosciences；Bedford，MA)。簡(jiǎn)言之，使空孔充滿KGM培養(yǎng)基或作為陰性對(duì)照的無血清KGM。細(xì)胞被收獲且在無血清培養(yǎng)基中與抗體一起預(yù)溫育。將50,000個(gè)細(xì)胞加入內(nèi)眼板中，所述內(nèi)眼板隨后置于孔內(nèi)且于37℃在組織培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)。溫育后，從內(nèi)眼板頂端取出細(xì)胞和培養(yǎng)基。遷移至過濾器下側(cè)的細(xì)胞通過下述定量用2μg/mL鈣黃綠素(Invitrogen Corpn.，Carlsbad，CA)標(biāo)記1小時(shí)，且以底部閱讀模式測(cè)量熒光。抑制百分比計(jì)算為與單獨(dú)的培養(yǎng)基比較，在抗體存在下遷移細(xì)胞數(shù)目的減少。侵襲以類似方式使用MATRIGEL

包被的FLUROBLOK內(nèi)眼板且溫育48小時(shí)進(jìn)行測(cè)量。
MMP生產(chǎn)的定量。在包含1％FBS培養(yǎng)基中的細(xì)胞在MATRIGEL包被孔(BD Biosciences)中培養(yǎng)所示時(shí)間。收獲上清液，離心以去除細(xì)胞碎片，且冷凍直至測(cè)試時(shí)。MMP水平通過ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)進(jìn)行定量。
結(jié)果 如圖20A-20C中所示，αvβ6阻斷性mAb 3G9在體外顯著抑制VB6細(xì)胞遷移、侵襲和MMP-9生產(chǎn)。使用重組可溶性TGF-βRII-Ig阻斷TGF-β活性也抑制VB6細(xì)胞侵襲和MMP-9生產(chǎn)(圖20B和20C)，但不影響其遷移(圖21A)。這些數(shù)據(jù)顯示比較αvβ6功能阻斷對(duì)TGF-β活性阻斷的不同功能差異。這個(gè)結(jié)論與αvβ6通過與纖連蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞粘附和遷移，以及活化潛伏前體TGF-β的能力一致(Sheppard，D.，CancerMetast.Rev.24395-402(2005))。
實(shí)施例11avβ6mAb在人結(jié)腸直腸癌異種移植模型(LIM1863)中抑制基質(zhì)侵襲 1.背景 新型結(jié)腸癌模型LIM1863近期被表征(Bates，R.C.和Mercurio，A.M.，Mol.Biol.Cell 141790-1800(2003)；Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115(2)339-347(2005))。在體外，LIM1863細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中以分化良好的3D球狀體(類器官)生長(zhǎng)。然而，暴露于TGF-β和TGFα后，這種細(xì)胞系轉(zhuǎn)變成遷移單層表型，具有由E-鈣粘蛋白喪失代表的上皮至間充質(zhì)過渡(EMT)的特有形態(tài)學(xué)變化。這種過渡伴隨αvβ6表達(dá)的顯著增加。在體內(nèi)，當(dāng)在裸小鼠脅腹中皮下注射時(shí)，LIM1863細(xì)胞是致瘤的(Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115(2)339-347(2005))。如圖6中所示，LIM1863細(xì)胞顯示驚人的αvβ6表達(dá)模式(同前)。具體地，αvβ6表達(dá)在看起來已從原發(fā)性腫瘤團(tuán)塊侵襲到腫瘤基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞上特別顯著。這種發(fā)現(xiàn)與先前已描述的這些細(xì)胞已經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)過渡(EMT)的觀點(diǎn)一致(參見同前)。
因此，選擇使用LIM1863細(xì)胞作為人結(jié)腸直腸癌的異種移植模型，以檢查αvβ6在這種模型的基質(zhì)侵襲中的可能牽涉。
2.材料和方法 LIM1863細(xì)胞在補(bǔ)充5％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640(GIBCO；Invitrogen Corp.，La Jolla，CA)中作為類器官生長(zhǎng)。LIM1863類器官(約8×106細(xì)胞)皮下接種到雌性裸小鼠脅腹內(nèi)。所有動(dòng)物研究都得到Biogen Idec實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用委員會(huì)(Institutional Animal Careand Use Committee)(IACUC)的支持。小鼠通過腹膜內(nèi)注射用10mg/kg抗αvβ6特異性鼠類單克隆抗體3G9(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)17875-17887(2004))、2mg/kg重組可溶性TGF-βRII-Ig融合蛋白(Cosgrove，D.等人，Am.J.Pathol.157(5)1649-1659(2000))、或媒介物對(duì)照(PBS)1周處理3次。腫瘤體積在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上使用測(cè)徑器進(jìn)行測(cè)量，且腫瘤體積使用式(L×W2)/2進(jìn)行計(jì)算。7周后收獲異種移植物且進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋切片用于免疫組織化學(xué)，所述免疫組織化學(xué)如上文實(shí)施例9中所述進(jìn)行(圖21)。
結(jié)果 抗αvβ6mAb 3G9和/或重組可溶性TGF-βRII-Ig對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒有直接影響(圖22A，22B)。然而，如通過定量基質(zhì)內(nèi)的αvβ6陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞面積評(píng)估的(圖22D-22F)，這些配體顯著抑制LIM1863細(xì)胞的基質(zhì)侵襲至約80％(圖22C)，所述評(píng)估由對(duì)處理不知情的病理學(xué)家來進(jìn)行。
實(shí)施例12鼠類6.3G9(m3G9)對(duì)非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞上表達(dá)的αvβ6整聯(lián)蛋白的親和力和生物活性 概述?？功羦β6阻斷性單克隆抗體6.3G9(m3G9)對(duì)非人靈長(zhǎng)類(NHP)αvβ6整聯(lián)蛋白的親和力和生物活性通過各種體外方法來測(cè)定。使用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)，從2個(gè)不同種類(來自非洲綠猴的12MBr6，和來自獼猴的4MBr5)中鑒定表達(dá)高水平αvβ6的NHP細(xì)胞系。m3G9分別以0.30μg/mL和0.38μg/mL的ED50值與12MBr6和4MBr5上表達(dá)的αvβ6結(jié)合。m3G9還分別以0.22μg/mL和0.29μg/mL的IC50值抑制12MBr6和4MBr5與TGFβ1潛伏相關(guān)肽(LAP)的結(jié)合。最后，如使用與TGFβ應(yīng)答性貂肺上皮受體細(xì)胞的共同培養(yǎng)測(cè)定法測(cè)定的，m3G9以0.31μg/mL的IC50值阻斷4MBr5細(xì)胞系激活潛伏TGFβ的能力，所述貂肺上皮受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)部分纖溶酶原激活物抑制劑1啟動(dòng)子(TMLC)。
引言。這項(xiàng)研究的目的是測(cè)定抗αvβ6阻斷性單克隆抗體6.3G9(m3G9)對(duì)非人靈長(zhǎng)類(NHP)細(xì)胞上表達(dá)的αvβ6整聯(lián)蛋白的親和力和生物活性。m3G9是人源化單克隆抗體hu3G9(BG00011)的鼠類前體。這種鼠類抗體是高親和力、特異性αvβ6整聯(lián)蛋白靶向試劑。1m3G9以高親和力(KD＝16pM)與其靶αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞表達(dá)的αvβ6與配體(TGFβ1潛伏相關(guān)肽(LAP)和纖連蛋白)的結(jié)合，且阻斷αvβ6激活潛伏TGFβ1的能力。1該抗體需要αv和β6亞單位的存在用于結(jié)合，且沒有觀察到與其他相關(guān)整聯(lián)蛋白(αvβ3、αvβ3、αvβ5、αvβ3和αIIbβ3)的交叉反應(yīng)性，指出m3G9對(duì)于αvβ6是高特異性的。1 鼠類和人β6整聯(lián)蛋白具有高度序列相似性(89.5％的同一性)2，如鼠類和人αv整聯(lián)蛋白一樣(92.8％的同一性)3。來自NHP的αvβ6序列仍未被測(cè)定，但也預(yù)期共有高水平的序列同一性。
為了測(cè)定m3G9對(duì)NHPαvβ6的親和力，結(jié)合通過FACS進(jìn)行測(cè)量。m3G9阻斷與人TGFβ1 LAP細(xì)胞粘附的能力在細(xì)胞粘附測(cè)定法中進(jìn)行評(píng)估。最后，m3G9阻斷NHPαvβ6介導(dǎo)的潛伏TGFβ活化的能力使用共同培養(yǎng)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
材料和方法 試劑。小鼠單克隆抗體6.3G9(m3G9)和6.4B4如參考1和上文所述來產(chǎn)生和純化。重組人LAP(LAP)購(gòu)自R&D Systems(目錄#246-LP)。人β6轉(zhuǎn)染SW480(人結(jié)腸直腸腺癌)細(xì)胞系(SW480β6)由Dean Sheppard(UCSF)提供。
NHP細(xì)胞系。下述細(xì)胞系從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得
熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)。細(xì)胞通過胰酶消化來收獲，在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌1次，且隨后重懸浮于FC緩沖液(PBS、2％FBS、0.1％NaN3、1mM CaCl2和1mM MgCl2)中。1×106細(xì)胞隨后在冰上在總共50μL FC緩沖液中，與10g/mL m3G9一起溫育0.5小時(shí)。溫育后細(xì)胞用冰冷的FACS緩沖液(PBS，2％FBS，0.1％NaN3)洗滌2次，且重懸浮于包含1∶200稀釋的Alexa488-綴合的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)的100μL FC緩沖液中，且在冰上溫育30分鐘。細(xì)胞隨后用冰冷的FC緩沖液洗滌2次，且重懸浮于100μL FC緩沖液和50μL 4％多聚甲醛中。標(biāo)記的次級(jí)抗體的結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)(BiogenIdec Research core facility)來監(jiān)控。
細(xì)胞粘附測(cè)定法。96孔微量滴定板于4℃用50μL/孔0.5g/mLLAP包被過夜，所述LAP在50mM碳酸氫鈉，pH 9.2中稀釋。板用PBS(100μL/孔)洗滌2次，用溶于PBS的1％BSA(100μL/孔)于25℃阻斷1小時(shí)，且用100μL/孔測(cè)定緩沖液(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2)洗滌2次。12MBr6或4MBr5細(xì)胞(4-12×106細(xì)胞/mL)與2μM熒光染料(BCECF-AM，Molecular Probes)一起在測(cè)定緩沖液中，伴隨輕柔振蕩在37℃水浴中溫育15分鐘，通過離心收集，且重懸浮于測(cè)定緩沖液中至4-12×106細(xì)胞/mL。向洗滌板的個(gè)別孔中加入25μL 2x濃縮m3G9和25μL標(biāo)記細(xì)胞，且使板于25℃溫育0.5小時(shí)。板用測(cè)定緩沖液(100μL/孔)洗滌4-6次，且在96孔熒光板閱讀儀(CytoFluor Series 4000，Perseptive Biosystems)上記錄由于板上捕獲細(xì)胞的熒光。結(jié)合百分比通過比較最終洗滌步驟前的熒光(即加入的總細(xì)胞)與洗滌后的那種(即結(jié)合細(xì)胞)來測(cè)定。
共同培養(yǎng)測(cè)定法。TMLC(用部分纖溶酶原激活物抑制劑1蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貂肺上皮細(xì)胞系Mv 1Lu)4在DMEM+10％胎牛血清中用2mML-谷酰胺、盤尼西林-鏈霉素和200μg/mL G418培養(yǎng)。細(xì)胞用PBS+5mM EDTA從燒瓶中取出，在PBS+0.1％BSA中洗滌，通過血球計(jì)來計(jì)數(shù)且在96孔板中鋪板。αvβ6表達(dá)細(xì)胞貯藏于冰上2小時(shí)，而TMLC在DMEM+0.1％FBS中以104細(xì)胞/孔在96孔板中鋪板，且允許于37℃粘附，這之后結(jié)合TMLC用DMEM+0.1％BSA洗滌1次。單克隆抗體在DMEM+0.1％BSA中稀釋，加入αvβ6表達(dá)細(xì)胞中，且于室溫預(yù)溫育20分鐘。αvβ6表達(dá)細(xì)胞隨后在DMEM+0.1％BSA中以4×104細(xì)胞/孔加入TMLC中(100uL/孔)。板于37℃在增濕、富含CO2的溫箱中溫育20小時(shí)。棄去上清液且替換為100μL PBS+1mM Ca+2和1mM Mg+2。細(xì)胞進(jìn)行裂解，且螢光素酶用LucLite試劑盒(Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA)使用微板光度計(jì)(Tropix TR717microplate luminometer，PerkinElmer Life Sciences)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果 1.小鼠6.3G9(m3G9)對(duì)于靈長(zhǎng)類αvβ6整聯(lián)蛋白的結(jié)合親和力和阻斷潛力。為了研究m3G9對(duì)于非人靈長(zhǎng)類(NHP)αvβ6整聯(lián)蛋白的親和力，從ATCC獲得4種NHP細(xì)胞系。最初篩選(圖23)指出αvβ6表達(dá)在12MBr6和4MBr5細(xì)胞系上是最高的，因此使用這2種細(xì)胞系表征m3G9。αvβ6非阻斷性抗體6.4B4也與12MBr 6和4MBr5結(jié)合，其平均熒光強(qiáng)度與對(duì)于m3G9觀察到的類似。
1.1與細(xì)胞表達(dá)的整聯(lián)蛋白的結(jié)合(FACS)。m3G9與12MBr6和4MBr5的結(jié)合使用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)如材料和方法中所述進(jìn)行測(cè)量。對(duì)每種細(xì)胞系進(jìn)行m3G9完全滴定，且使用非線性回歸測(cè)定ED50(產(chǎn)生半數(shù)最大信號(hào)的抗體濃度)。關(guān)于12MBr6和4MBr5的ED50值分別為0.30μg/mL(圖24A)和0.38μg/mL(圖24B)。
1.2與LAP的細(xì)胞粘附。12MBr6和4MBr5與LAP結(jié)合的能力使用細(xì)胞粘附測(cè)定法來證實(shí)。這種粘附被m3G9阻斷，但不被對(duì)照蛋白質(zhì)(BSA)或αvβ6非阻斷性抗體(6.4B4)阻斷(圖25)。m3G9阻斷這種相互作用的潛能通過測(cè)量在每種細(xì)胞系上的抑制濃度依賴性(圖26)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)測(cè)定IC50(產(chǎn)生半數(shù)最大抑制的抗體濃度)。關(guān)于12MBr6和4MBr5的IC50值分別為0.22μg/mL和0.29μg/mL。
1.3TGFβ活化(共同培養(yǎng)測(cè)定法)。12MBr6和4MBr5激活潛伏TGFβ的能力使用共同培養(yǎng)測(cè)定法來確定，在所述共同培養(yǎng)測(cè)定法中細(xì)胞與TGFβ應(yīng)答性貂肺上皮受體細(xì)胞一起溫育，所述貂肺上皮受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)部分纖溶酶原激活物抑制劑1啟動(dòng)子(TMLC)(圖27)。αvβ6表達(dá)不足以促進(jìn)TGFβ活化，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)信號(hào)和/或潛伏TGFβ產(chǎn)生方面的差異在這個(gè)測(cè)定法中也對(duì)活性產(chǎn)生影響。在這2種細(xì)胞系中，只有4MBr5有效激活潛伏TGFβ，而12MBr5沒有顯示效應(yīng)。使用陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞系SW480β6同樣觀察到活化，所述SW480β6是穩(wěn)定表達(dá)人αvβ6的β6轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系。如預(yù)期的，未轉(zhuǎn)染親本對(duì)照細(xì)胞系(SW480)沒有顯示活化。
m3G9阻斷TGFβ經(jīng)由4MBr5活化的能力在相同實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)量。TGFβ活化被1g/mL或10g/mL的m3G9添加阻斷，但不被非阻斷性抗αvβ6抗體6.4B4的添加阻斷。m3G9在這些濃度時(shí)對(duì)4MBr5細(xì)胞的抑制影響類似于使用SW480β6細(xì)胞系觀察到的那種。在分開實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定m3G9抑制4MBr5介導(dǎo)的TGFβ活化的劑量依賴性(圖28)。關(guān)于4MBr5和SW480β6的IC50值分別為0.31μg/mL和0.37μg/mL。
2.m3G9親和力在種類中的比較。m3G9對(duì)小鼠、NHP和人αvβ6的結(jié)合和活性產(chǎn)生的數(shù)據(jù)概括于下表中。表中的第1列顯示通過FACS測(cè)定的結(jié)合ED50s。在每種情況下測(cè)量的ED50≤0.38g/mL(2.5nM)。表中的第2列顯示通過m3G9抑制細(xì)胞粘附的IC50。在每種情況下m3G9阻斷細(xì)胞粘附的IC50≤0.29μg/mL(1.9nM)。表中的第3列顯示如使用共同培養(yǎng)測(cè)定法測(cè)定的，αvβ6介導(dǎo)的TGFβ活化的抑制IC50。NHP細(xì)胞系4MBr5顯示與人細(xì)胞系SW480β6類似的活性(IC50值分別為0.40和0.24μg/mL)。
使用小鼠、NHP和人細(xì)胞系的m3G9活性比較 a參考1 bn.d.，未測(cè)定。
3.參考文獻(xiàn)。
1.Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem，2004，279，17875-87. 2.Arend，L.J.等人，J Am.Soc.Nephrol.2000，11，2297-305. 3.Wada，J.等人，J.Cell Biol.，1996，132，1161-76. 4.Abe，M.等人，Anal.Biochem.，1994，216，276-84. 實(shí)施例13鼠類抗αvβ6mAbs在Alport(Co14A3-/-)小鼠中的作用 概述αvβ6是TGF-β誘導(dǎo)型整聯(lián)蛋白，在上皮重塑位點(diǎn)處優(yōu)先表達(dá)且已顯示結(jié)合和激活潛伏前體TGF-β。在本文中顯示αvβ6在人腎上皮中在膜性腎小球腎炎、糖尿病、IgA腎病、Goodpasture和Alport腎上皮中過量表達(dá)。為了評(píng)估αvβ6在腎臟疾病中的潛在調(diào)節(jié)作用，已研究功能阻斷性αvβ6mAbs和β6亞單位遺傳除去在Co14A3-/-小鼠中對(duì)腎纖維化的影響，所述Co14A3-/-小鼠是阿爾波特綜合征的小鼠模型。觀察到Alport小鼠腎中的αvβ6表達(dá)主要在皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞中且與纖維化進(jìn)展相關(guān)。用αvβ6阻斷性mAbs處理抑制活化成纖維細(xì)胞積聚和間質(zhì)膠原基質(zhì)沉積。在β6缺陷Alport小鼠中觀察到類似的腎纖維化抑制。腎組織的轉(zhuǎn)錄特征顯示αvβ6阻斷性mAbs顯著抑制在纖維化和炎癥介質(zhì)表達(dá)中的疾病相關(guān)變化。使用重組可溶性TGF-βRII處理產(chǎn)生了類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式，暗示共有的αvβ6和TGF-β調(diào)節(jié)功能。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)αvβ6可以促成腎纖維化調(diào)節(jié)，且暗示這種整聯(lián)蛋白是潛在的治療靶。
引言 進(jìn)行性纖維化是導(dǎo)致腎終末期疾病發(fā)展的共同過程，且通過上皮重塑、成纖維細(xì)胞活化、炎癥和與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的細(xì)胞相互作用的再組織得到促進(jìn)。促成這些事件的分子機(jī)制是復(fù)雜的，且包括TGF-β軸誤調(diào)節(jié)、異常ECM重塑、和整聯(lián)蛋白超家族細(xì)胞粘附受體的表達(dá)和功能改變1-5。近期研究已顯示幾種整聯(lián)蛋白和相關(guān)分子在腎上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中的重要調(diào)節(jié)功能3，6-8。
表達(dá)在腎臟疾病中強(qiáng)烈增加的整聯(lián)蛋白中有TGF-β誘導(dǎo)型整聯(lián)蛋白αvβ65，9，10。αvβ6表達(dá)一般限制于上皮細(xì)胞，在其中它在正常成人組織中以低水平表達(dá)且在發(fā)育、損傷和瘤形成期間升高9，11-13。盡管αvβ6在健康成人腎中以相當(dāng)?shù)退奖磉_(dá)，但它的表達(dá)在發(fā)展中的小鼠腎中是顯著的，特別是在近端小管、亨利氏袢和收集管中11，12，14。近期，已報(bào)道了關(guān)于各種形式的人腎病理學(xué)的αvβ6表達(dá)升高10。
與αvβ6在體內(nèi)組織重塑期間表達(dá)增加一致，αvβ6整聯(lián)蛋白在培養(yǎng)上皮細(xì)胞中的表達(dá)可以由細(xì)胞因子誘導(dǎo)，所述細(xì)胞因子調(diào)節(jié)上皮重塑，包括EGF和TGF-β5，9。此外，在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中過量表達(dá)的β6已顯示激發(fā)形成自發(fā)性長(zhǎng)期創(chuàng)傷15，暗示αvβ6可能在上皮組織重塑調(diào)節(jié)中起重要作用。
關(guān)于αvβ6的已知配體包括纖連蛋白、腱生蛋白、以及潛伏相關(guān)肽1和3(LAP1和LAP3)，潛伏前體形式的TGF-β1和-β3的N末端片段16-19。作為與這些配體結(jié)合的結(jié)果，αvβ6可以介導(dǎo)細(xì)胞粘附、擴(kuò)展、遷移、和潛伏TGF-β活化。TGF-β合成為被切割的潛伏蛋白質(zhì)，且與N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP與鼠類活性C末端TGF-β細(xì)胞因子非共價(jià)結(jié)合。潛伏TGF-β復(fù)合物不能與其同類受體結(jié)合且因此保持生物學(xué)無活性，直至通過幾種可替代機(jī)制之一轉(zhuǎn)變成活性形式，所述可替代機(jī)制包括通過蛋白酶切割、暴露于低pH或電離輻射、和潛伏復(fù)合物中的構(gòu)象變化允許其與其同類受體結(jié)合20-22。激活構(gòu)象變化可以由αvβ6誘導(dǎo)，包括整聯(lián)蛋白與包含在LAP1和LAP3內(nèi)的RGD基序直接結(jié)合。這種結(jié)合使TGF-β前體轉(zhuǎn)變成受體結(jié)合感受狀態(tài)17，19。這些發(fā)現(xiàn)暗示上皮細(xì)胞表面上的αvβ6表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致局部TGF-β活化，隨后為旁觀者細(xì)胞中的TGF-β依賴性事件的旁分泌活化。這將包括對(duì)TGF-β活性的間接下游影響的可能性，所述TGF-β活性可以通過改變最初在αvβ6表達(dá)位點(diǎn)處的炎癥和纖維化來介導(dǎo)。
因?yàn)門GF-β已暗示為腎纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，所以假設(shè)它由αvβ6局部活化可能是腎臟疾病發(fā)作和進(jìn)展中的重要過程，且αvβ6功能阻斷可以抑制腎纖維化發(fā)展。在本文所述研究中，顯示αvβ6在腎纖維化小鼠模型和具有纖維化病理狀態(tài)的人腎樣品中是高度上調(diào)的。使用Co14A3-/-小鼠，類似于在人阿爾波特綜合征中觀察到的那種的進(jìn)行性腎臟疾病模型，顯示阻斷配體結(jié)合和αvβ6的TGF-β活化功能的mAbs23，以及β6的遺傳除去，可能抑制腎小球和小管間質(zhì)性纖維化且延遲腎組織結(jié)構(gòu)的破壞。顯示盡管αvβ6整聯(lián)蛋白在腎中的表達(dá)已局限于小管上皮細(xì)胞，但它可以提供在組織遠(yuǎn)端部位處的保護(hù)效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)增加了除了小管上皮細(xì)胞上的αvβ6阻斷的直接效應(yīng)，抗纖維化效應(yīng)還可以經(jīng)由間接腎外效應(yīng)介導(dǎo)的可能性。延遲處理研究指出αvβ6的治療阻斷不僅抑制腎纖維化進(jìn)展，還具有允許現(xiàn)有纖維化損害消退的潛能。與腎臟疾病進(jìn)展相關(guān)且受αvβ6抑制影響的分子標(biāo)記分析指出，αvβ6阻斷性抗體的治療影響類似于系統(tǒng)TGF-β阻斷的那種，且在機(jī)制上與TGF-β活性減少相關(guān)。這些數(shù)據(jù)暗示αvβ6涉及腎纖維化調(diào)節(jié)且可以提供關(guān)于其治療調(diào)節(jié)的新型分子靶。
材料和方法 1.試劑。αvβ6mAbs如本文所述和先前所述23產(chǎn)生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分別的親本雜交瘤總RNAs產(chǎn)生，其中恒定區(qū)引物CDL-739用于重鏈和CDL-738用于輕鏈，使用First Strand cDNA合成試劑盒(Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ)。重和輕鏈可變區(qū)基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用用于cDNA合成的相同3′引物、和對(duì)大多數(shù)鼠類抗體基因信號(hào)序列(在檢索后可獲得的序列)特異的簡(jiǎn)并引物庫(kù)、以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)。將克隆的重和輕鏈可變區(qū)連接到具有人IgG1恒定區(qū)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。重組可溶性鼠類TGF-β受體II型-Ig融合蛋白(rsTGF-βRII-Ig)如先前所述7產(chǎn)生，且購(gòu)自R&D Systems(532-R2，Minneapolis，MN)。抗體如所述的購(gòu)買。FITC綴合的泛抗細(xì)胞角蛋白mAb(C-11)，Sigma-Aldrich(F3418，St.Louis，MO)；抗層粘連蛋白B1鏈mAb(LT3)，Chemicon(MAB1928，Temecula，CA)；藻紅蛋白(PE)綴合的抗αvmAb(RMV7)，Chemicon(CBL1346P)；兔抗αv，Chemicon(AB1930)；PE-大鼠IgG1，BD Biosciences(553925，San Jose，CA)；和抗平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)-Cy3，Sigma-Aldrich(C-6198)。與表達(dá)潛伏TGF-β的293細(xì)胞異種移植物切片比較，鑒定兔多克隆抗TGF-β，Santa Cruz Biotechnology(sc-146，Santa Cruz，CA)作為優(yōu)先結(jié)合表達(dá)組成活性形式TGF-β的293細(xì)胞異種移植物切片的抗體24。
2.動(dòng)物。129Sv/J背景中的Co14A3+/-小鼠從Dr.DominiqueCosgrove(Boy′s Town National Research Hospital，Omaha，NE)獲得，且進(jìn)行繁殖以產(chǎn)生用于注射研究的Co14A3-/-小鼠。129SV背景中的Beta6-/-小鼠從Dr.Dean Sheppard(University of California SanFrancisco，CA)獲得，且與Co14A3+/-小鼠進(jìn)行雜交。所有動(dòng)物都飼養(yǎng)在Biogen Idec，且所有動(dòng)物研究得到批準(zhǔn)且依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用委員會(huì)來進(jìn)行。
3.流式細(xì)胞術(shù)。鼠類β6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(NIH3T3b6)如先前所述產(chǎn)生23。細(xì)胞通過胰酶消化來收獲，在PBS中洗滌，且隨后重懸浮于FC緩沖液(1X PBS、2％FBS、0.1％NaN3、1mM CaCl2和1mM MgCl2)中。隨后使0.2×105細(xì)胞在冰上、在總體積100μl包含純化初級(jí)抗體的FC緩沖液中溫育1小時(shí)。溫育后，細(xì)胞用冰冷的FC緩沖液洗滌2次，且重懸浮于包含5g/ml PE-綴合的驢抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)的100μL FC緩沖液中，且在冰上溫育30分鐘。為了監(jiān)控αv表達(dá)，細(xì)胞與PE-綴合的大鼠抗小鼠αvmAb(RMV-7)和PE-綴合的大鼠IgG1對(duì)照一起溫育。細(xì)胞用冰冷的FC緩沖液洗滌2次，且通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)控標(biāo)記的次級(jí)抗體的結(jié)合。
4.免疫組織化學(xué)。將組織切片在二甲苯和乙醇中去石蠟化、在蒸餾水中再水合、且隨后浸入包含0.45％H2O的甲醇中。組織與胃蛋白酶(00-3009，Zymed，San Francisco，CA)一起溫育，且用抗生物素蛋白和生物素(SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封閉。初級(jí)抗體在包含0.1％BSA的PBS中稀釋，且使組織于4℃溫育過夜。為了免疫染色小鼠組織上的β6，切片與人/小鼠嵌合型抗αvβ6mAb-2A123，和抗人生物素化次級(jí)抗體(PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起溫育。為了免疫染色人組織上的β6，切片與鼠類2A123和抗小鼠-生物素化次級(jí)抗體(PK-6102，Vector Laboratories)一起溫育。將抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物-辣根過氧化物酶(PK-6102，Vector Kit)應(yīng)用于切片、在室溫下溫育30分鐘，且如示的(SK-4100，VectorLaboratories)制備3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，且于室溫應(yīng)用于切片5分鐘。組織切片用Mayer′s Hematoxylin染色1分鐘且在水和PBS中漂洗。
包埋在O.C.T.Compound(目錄#4583，Sakura Tokyo，Japan)中的冷凍組織切片在丙酮中進(jìn)行固定，且用溶于PBS的0.5％酪蛋白/0.05％硫柳汞阻斷。為了免疫染色人組織上的β6，切片與鼠類2A123和抗小鼠Alexa fluor 594次級(jí)抗體(A-11032，Molecular Probes Eugene，Oregon)一起溫育。為了免疫染色小鼠組織上的β6，切片與人/小鼠嵌合型2A1和抗人Alexa fluo 594綴合的次級(jí)抗體(A-11014，MolecularProbes)一起溫育。對(duì)于層粘連蛋白和αv的免疫染色，使用抗大鼠Alexafluor 488綴合的次級(jí)抗體(A-11006，Molecular Probes)。所有其他抗體如先前所述直接綴合。所有圖像在20X時(shí)獲取，除了圖2A在40X時(shí)獲取外。所有人組織樣品在地方檢查機(jī)構(gòu)同意和患者同意下獲得。
5.免疫組織化學(xué)定量。SMA免疫染色使用MetaMorph v5.0(Universal Imaging Corporation，Sunnyvale，CA)進(jìn)行定量，且表示為相對(duì)于總圖像大小的陽(yáng)性百分比。對(duì)于每個(gè)動(dòng)物，分析來自至少5個(gè)皮質(zhì)和1-2個(gè)髓質(zhì)切片的20X圖像。處理組的統(tǒng)計(jì)分析使用ANOVA進(jìn)行。
6.用mAbs和rsTGF-βRII-Ig處理Co14A3-/-小鼠。129Sv/J背景中的Co14A3+/-小鼠進(jìn)行繁殖以產(chǎn)生Co14A3-/-小鼠。如所示的，小鼠用蛋白質(zhì)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，每周3次，從3周大-7或8.5周大。mAbs以4mg/kg進(jìn)行腹膜內(nèi)注射和rsTGF-βRII-Ig以2mg/kg進(jìn)行注射。對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，且收集腎用于RNA和免疫染色。所有動(dòng)物研究得到批準(zhǔn)且依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用委員會(huì)來進(jìn)行。
7.總RNA純化和cDNA合成。將腎直接均質(zhì)化到TRIzol(155-96-018，Invitrogen，Carlsbad，CA)內(nèi)，且RNA根據(jù)制造商的方案進(jìn)行提取，使用另外1ml酸性苯酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1pH 6.6提取。將純化的總RNA重懸浮于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的H2O(AmbionInc，Austin，TX)中，且記錄260和280(Spectra max Plus，Moleculardevices，Sunnyvale，CA)。殘留DNA使用5單位DNA酶I擴(kuò)增等級(jí)(目錄#18068-015，Invitrogen)于20℃去除15分鐘。cDNA使用高容量cDNA存檔試劑盒根據(jù)制造商的方案(目錄#4322171，AppliedBiosystems Inc，F(xiàn)oster City，CA)來產(chǎn)生。
8.關(guān)于Taqman的引物、探針和寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)模板設(shè)計(jì)。寡核苷酸引物和Taqman MGB探針使用Primer Express版本2.0.0(AppliedBiosystems Inc.)由Affymetrix共有序列設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)具有5′共價(jià)連接的熒光報(bào)道染料(FAM)和與3′端共價(jià)連接的小溝結(jié)合劑/非熒光猝滅物(MGBNF)的Taqman MGB探針。通過給擴(kuò)增子的5′和3′末端添加10bp基因特異性序列來設(shè)計(jì)寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)模板。反相HPLC純化引物和寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)模板購(gòu)自Biosearch technologies Inc.，Novato，CA。關(guān)于鼠類甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的HPLC純化引物和探針在Biogen Idec合成[CATGGCCTTCCGTGTTCCTA，GCGGCACGTCAGATCC，6FAM-CCCCAATGTGTCCGTC]。
9.Taqman熱循環(huán)。關(guān)于樣品和標(biāo)準(zhǔn)的一式四份PCR反應(yīng)在7900HT(Applied Biosys tems Inc.)熱循環(huán)儀中在下述條件下循環(huán)50℃2分鐘(尿嘧啶N-去糖基化酶消化)，95℃10分鐘(Taq耐熱聚合酶活化)，以及95℃15秒和60℃60秒的40個(gè)循環(huán)。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)孔運(yùn)行長(zhǎng)度每7秒收集熒光發(fā)射。使用Sequence Detection Software(AppliedBiosystems Inc.)通過與寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測(cè)定關(guān)于每種樣品的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物量。
10.探針標(biāo)記、雜交和關(guān)于轉(zhuǎn)錄特征的掃描。樣品標(biāo)記、雜交和染色根據(jù)Eukaryotic Target Preparation方案進(jìn)行，所述方案在關(guān)于Genechip

Expression Analysis(Affymetrix，Santa Clara，CA)的Affymetrix Technical Manual(701021rev1)中?？傊?，在20μL第1條鏈反應(yīng)中使用5μg純化的總RNA，與200U SuperScript II(目錄#，18064-022，Invitrogen)和0.5ug(dT)-T7引物[5′-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24]于42℃1小時(shí)。第2條鏈合成通過下述進(jìn)行添加40U大腸桿菌DNA Polymerase(目錄#18010-025，Invitrogen)、2U大腸桿菌RNase H(目錄#18021-071，Invitrogen)和10U大腸桿菌DNA Ligase(目錄#18052-019，Invitrogen)，隨后于16℃溫育2小時(shí)。第2條鏈合成反應(yīng)使用Genechip

Sample Cleanup Module根據(jù)制造商的方案(目錄#900371，Affymetrix，Santa Clara，CA)來純化。純化的cDNA使用Bio Array高產(chǎn)量RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(目錄#42655-40，Enzo Life Sciences，Inc.，Parmingdale，NY)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生70-120μg生物素標(biāo)記的cRNA(互補(bǔ)RNA)。小鼠MgU74Av2、MgU74Bv2和MgU74Cv2GeneChip

探針陣列在GeneChip

Hybridization Oven 640(Affymetrix，Santa Clara，CA)中根據(jù)制造商的方案進(jìn)行預(yù)雜交。將片段化的標(biāo)記cRNA重懸浮于300μL 1X雜交緩沖液中，所述雜交緩沖液包含100mM 2-嗎啉乙磺酸，1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％Tween 20，0.5mg/mL乙酰化BSA，0.1mg/mL鯡魚精DNA，對(duì)照oligo B2，和對(duì)照bioB 1.5pM、bioC 5pM、bioD 25pM以及cre 100pM，且根據(jù)制造商的方案(Affymetrix，Santa Clara，CA)與Genechip

探針陣列雜交。雜交的Genechip

探針陣列進(jìn)行洗滌，且使用鏈霉親和素-藻紅蛋白(目錄#S866，Molecular Probes，Eugene，OR)進(jìn)行染色，且使用GeneChip

Fluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，CA)與生物素化的抗鏈霉親和素(BA-0500，Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起擴(kuò)增。Genechip

探針陣列使用Gene Array Scanner(HewlettPackard，Corvallis，OR)進(jìn)行掃描。
11.轉(zhuǎn)錄特征數(shù)據(jù)分析。將陣列掃描轉(zhuǎn)換成Affymetrix.CEL文件，且所得到的數(shù)據(jù)集(.CEL文件組表示完全實(shí)驗(yàn))使用Robust MicroarrayAverage(RMA)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。統(tǒng)計(jì)和聚類分析使用GeneSpring(Agilent)和Spotfire(Spotfire)數(shù)據(jù)采集工具來完成。使用2步ANOVA和倍數(shù)變化過濾，以鑒定與未處理的Co14a3-/-組比較，其信號(hào)強(qiáng)度通過實(shí)驗(yàn)處理改變?yōu)閜＜0.05和至少2倍的探針集合。類似地，使用統(tǒng)計(jì)截止p＜0.01和信號(hào)倍數(shù)變化截止2，對(duì)于未處理Co14a3-無效和首次用于實(shí)驗(yàn)的野生型組之間的差異表達(dá)選擇疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄物。所得到的基因組和實(shí)驗(yàn)條件分組的特征通過層級(jí)聚類進(jìn)行分析和顯示。虛擬途徑分析使用Ingenuity Pathway Analysis數(shù)據(jù)庫(kù)(Ingenuity Systems)來進(jìn)行。
結(jié)果 1.αvβ6在具有纖維化病理狀態(tài)的人腎樣品中的表達(dá)。與炎癥/纖維化病理狀態(tài)相關(guān)的幾種不同類型的人腎臟疾病，已顯示TGF-β在腎組織中相應(yīng)增加的表達(dá)25-27。使用免疫組織化學(xué)分析，檢查在與慢性炎癥和纖維化相關(guān)的人腎活檢樣品中的αvβ6表達(dá)，作為導(dǎo)致TGF-β活化增加的潛在機(jī)制(圖29A和29B)。來自膜性腎小球腎炎、糖尿病、IgA腎病、Goodpasture、Alport和狼瘡的組織樣品都顯示在擴(kuò)張和損傷小管上皮層中顯著的αvβ6染色。相比之下，形態(tài)學(xué)正常的腎(腎癌和正常組織)樣品顯示小管中最低限度的偶然免疫染色。在分析的所有腎樣品中不存在腎小球染色。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與下述先前報(bào)道一致，αvβ6在正常成人上皮中以低水平表達(dá)但在組織損傷和修復(fù)期間上調(diào)10，11，13，15，17。
2.αvβ6在與腎纖維化進(jìn)展相關(guān)的Co14A3-/-小鼠腎中的表達(dá)。Co14A3-/-小鼠，人Alport疾病小鼠模型，發(fā)展進(jìn)行性腎小球腎炎，導(dǎo)致在腎小球和脈間區(qū)中的ECM積聚，伴隨許多纖維化標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記的表達(dá)增加28，29。先前已報(bào)道用rsTGF-βRII-Ig處理Co14A3-/-小鼠導(dǎo)致腎纖維化抑制7。來自Co14A3-/-小鼠的腎在約5-6周大時(shí)開始顯示纖維化的組織學(xué)征兆。疾病隨著年齡快速進(jìn)展，且小鼠在約11周時(shí)死于腎衰竭。雜合Co14A3+/-小鼠不發(fā)展腎小球腎炎，且其腎在組織學(xué)上與野生型同窩產(chǎn)生者的那些不能區(qū)別。為了檢查在年齡漸增的Co14A3+/-、和Co14A3-/-(Alport)小鼠腎中的αvβ6表達(dá)動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行在從4、7和8周大的小鼠分離的腎中的αvβ6表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析(圖30A-C)。在4周大時(shí)，在Co14A3+/-和Co14A3-/-小鼠的腎小管中存在αvβ6的偶然表達(dá)。到7周時(shí)，αvβ6表達(dá)在Co14A3-/-小鼠小管上皮細(xì)胞中顯著增加，但在Co14A3+/-腎中則不是。αvβ6的這種增加表達(dá)在超過8周大的Co14A3-/-小鼠中持續(xù)。在6周大后的Co14A3-/-(Alport)小鼠的擴(kuò)張和損傷小管上皮細(xì)胞中同樣觀察到αvβ6染色強(qiáng)度增加，這伴隨顯示強(qiáng)烈αvβ6表達(dá)的腎組織面積的顯著增加。在7-8周大的時(shí)間段期間的表達(dá)增加與Co14A3-/-小鼠中腎纖維化的快速進(jìn)展一致。相比之下，時(shí)程自始至終在Co14A3+/-小鼠腎中只檢測(cè)到最低限度的αvβ6表達(dá)，和其免疫染色強(qiáng)度輕度可檢測(cè)的年齡依賴性增加。因?yàn)镃o14A3-/-小鼠腎中的αvβ6表達(dá)與纖維化進(jìn)展相關(guān)，所以希望確定αvβ6功能阻斷是否能夠抑制纖維化損害起始和進(jìn)展。
3.在Co14A3-/-小鼠腎中mAbs與αvβ6結(jié)合的特異性。先前已報(bào)道有效和選擇性抗αvβ6mAbs的產(chǎn)生23，包括與αvβ6結(jié)合而不影響其結(jié)合配體能力的mAbs(非阻斷性mAbs)，和阻斷配體結(jié)合和αvβ6介導(dǎo)的TGF-β活化的mAbs(阻斷性mAbs)。為了證實(shí)用于體內(nèi)研究的αvβ6阻斷性mAbs與αvβ6整聯(lián)蛋白的結(jié)合是選擇性的，進(jìn)行比較αvβ6mAbs與未轉(zhuǎn)染親本NIH3T3細(xì)胞和用β6cDNA鼠類轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(NIH3T3b6)的結(jié)合的FACS分析(圖31A)。盡管對(duì)照抗αvmAb-RMV7染色未轉(zhuǎn)染和αvβ6表達(dá)NIH3T3細(xì)胞，但抗αvβ6mAbs只選擇性結(jié)合NIH3T3b6細(xì)胞。為了證實(shí)在腎中結(jié)合αvβ6的選擇性，產(chǎn)生人/小鼠嵌合型阻斷性αvβ6mAbs之一3G9，且比較用兔抗αv多克隆抗體產(chǎn)生的免疫染色模式(圖31B和31C)。如通過FACS和ELISA測(cè)定的，嵌合和原始鼠類形式的3G9具有可比較的靶結(jié)合親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。嵌合型3G9特異性免疫染色在Co14A3-/-小鼠腎中的小管上皮細(xì)胞，且來自與β6-/-小鼠雜交的Co14A3-/-(Co14A3-/-；β6-/-)腎切片沒有顯示免疫染色。用抗αv抗體免疫染色腎沒有顯示Co14A3-/-小鼠或Co14A3-/-；β6-/-小鼠之間的顯著差異。
4.用抗αvβ6mAbs處理Co14A3-/-(Alport)小鼠抑制腎纖維化。為了確定αvβ6在腎纖維化調(diào)節(jié)中的潛在功能牽涉，已測(cè)試阻斷性αvβ6mAbs影響晚期纖維化損害起始和進(jìn)展的能力。為了評(píng)估αvβ6阻斷的預(yù)防效應(yīng)，Co/4A3-/-小鼠從3周到7周大或從3周到8.5周大用下述抗體處理2種不同阻斷性αvβ6mAbs，3G9或8G6；非阻斷性αvβ6mAbs，6.8B3；或同種型匹配的陰性對(duì)照mAb，1E6。為了表型參考和監(jiān)控系統(tǒng)性TGF-β抑制效應(yīng)，這些研究還包括用rsTGFβRII-Ig處理的Co14A3-/-小鼠。收集腎用于組織學(xué)評(píng)估和RNA分離。與來自年齡相一致的Co14A3+/-小鼠的腎比較，纖維化組織學(xué)標(biāo)記以及SMA表達(dá)在7和8.5周時(shí)在Co14A3-/-腎中急劇增加。來自陰性對(duì)照mAb處理的Co14A3-/-小鼠的腎呈現(xiàn)擴(kuò)張和纖維化腎小球膜以及鮑曼囊中的半月體形成(圖32A，1E6)。這些腎還顯示伴隨小管上皮損傷和擴(kuò)張的顯著成肌纖維細(xì)胞活化和間質(zhì)纖維化。用阻斷性αvβ6mAbs-6.3G9或8G6處理Co14A3-/-小鼠，顯著減少小球和間質(zhì)損傷和纖維化，導(dǎo)致腎結(jié)構(gòu)相當(dāng)大的總體保存(圖32A，3G9和8G6)。阻斷性αvβ6mAbs的這些效應(yīng)伴隨SMA表達(dá)在腎小球中減少＞65％和在脈間區(qū)中減少＞90％(圖32B和32C)。阻斷性αvβ6mAbs對(duì)腎小球中SMA表達(dá)的影響暗示，盡管αvβ6整聯(lián)蛋白表達(dá)限制于小管上皮細(xì)胞，但其功能阻斷可以在組織更遠(yuǎn)端部位處具有效應(yīng)。這可以至少部分由阻斷性αvβ6mAbs的間接系統(tǒng)效應(yīng)介導(dǎo)。在用非阻斷性αvβ6mAbs-8B 3注射的Co14A 3-/-小鼠腎中看不到對(duì)纖維化進(jìn)展的影響。與經(jīng)由TGF-β阻斷抑制腎纖維化的先前報(bào)道一致7，30-33，如通過組織學(xué)外觀和腎組織中的SMA含量變化判斷的，用rsTGFβRII-Ig處理Co14A3-/-小鼠產(chǎn)生的腎纖維化抑制類似于通過阻斷性αvβ6mAbs產(chǎn)生的那種。αvβ6阻斷性mAbs對(duì)SMA表達(dá)的影響與膠原1α1和膠原1α2mRNA的腎組織總水平減少平行(圖33A和33B)。用3G9、8G6或rsTGF-βRII-Ig處理Co14A3-/-小鼠導(dǎo)致膠原1α1和膠原1α2mRNA豐度的顯著減少，而非阻斷性αvβ6mAb和同種型對(duì)照mAb對(duì)這些轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有顯著影響。
為了測(cè)試αvβ6阻斷對(duì)晚期腎纖維化的影響，已研究αvβ6阻斷性mAbs在6周大的Co14A3-/-小鼠中對(duì)腎纖維化的影響，在這時(shí)腎病理學(xué)表現(xiàn)為可測(cè)量的損傷和SMA陽(yáng)性活化成纖維細(xì)胞積聚。小鼠用αvβ6阻斷性mAbs-3G9，或用同種型對(duì)照mAb-1E6處理2.5周，且隨后在8.5周大時(shí)處死。SMA免疫染色定量顯示，與同種型對(duì)照mAb處理的小鼠比較，在來自用3G9處理的Co14A3-/-小鼠腎中存在的SMA陽(yáng)性成纖維細(xì)胞減少(圖34A)。同樣重要的是，與在處理開始時(shí)(6周)觀察到的SMA水平比較，用延遲3G9處理的SMA免疫染色的強(qiáng)度和面積減少。與從用1E6處理的Co14A3-/-小鼠中分離的腎比較，用3G9延遲處理Co14A3-/-小鼠誘導(dǎo)病理學(xué)中的顯著回復(fù)，包括損害小管和間質(zhì)中纖維化的顯著減少。
這些結(jié)果暗示αvβ6的治療阻斷不僅抑制腎纖維化進(jìn)展，還可以允許現(xiàn)有的纖維化損害消退。
5.通過抗αvβ6mAbs調(diào)節(jié)腎基因表達(dá)。為了進(jìn)一步了解與αvβ6功能相關(guān)的疾病機(jī)制，已在來自野生型和Alport小鼠的腎組織中進(jìn)行基因表達(dá)的Affymetrix GeneChip分析。在Co14a3-/-腎中表達(dá)改變的基因組鑒定為395GeneChip探針組，顯示在p＜0.01時(shí)7周大Co14a3-/-年齡相一致的野生型腎之間標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度中至少2倍的平均差異(圖35)。差異表達(dá)基因的功能注釋使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)工具來進(jìn)行，且已指出在Co14a3-/-腎中過量表達(dá)的基因與炎癥和白細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的顯著相關(guān)，而表達(dá)減少的基因主要與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)(圖36)。
用αvβ6阻斷性mAbs處理動(dòng)物減少了Co14A3-/-腎中基因子集的差異表達(dá)。已使用變量分析(Welch ANOVA)鑒定在p＜0.05時(shí)受實(shí)驗(yàn)處理影響的轉(zhuǎn)錄物，且進(jìn)一步過濾所得到的探針組，以選擇在響應(yīng)處理的信號(hào)強(qiáng)度中顯示至少2倍差異的那些。這種操作產(chǎn)生分別受3G9、8G6和TGFβRII-Fc顯著影響的56、42和28個(gè)探針組。這些探針組群體顯示相當(dāng)大的重疊，且群體各自表示對(duì)應(yīng)Co14a3-/-腎中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的完全包括子集395(圖37A)。觀察到經(jīng)由αvβ6阻斷性mAbs3G9和8G6的類似基因表達(dá)調(diào)節(jié)(圖35，圖37A)，所述3G9和8G6先前顯示屬于2個(gè)不同生物化學(xué)種類23。非阻斷性αvβ6mAbs 8B3和同種型對(duì)照mAb 1E6對(duì)基因表達(dá)都沒有顯著影響。因此，αvβ6mAbs對(duì)腎基因表達(dá)的影響可能是由于αvβ6功能阻斷而不是整聯(lián)蛋白信號(hào)活化或非特異性事件。沒有發(fā)現(xiàn)阻斷性αvβ6mAbs 3G9對(duì)正常野生型腎組織中的基因表達(dá)的影響。這種觀察暗示在實(shí)驗(yàn)中觀察到的αvβ6阻斷性mAbs效應(yīng)反映αvβ6的主要疾病特異性調(diào)節(jié)功能。
為了探究由αvβ6-mAbs調(diào)節(jié)的基因與主要調(diào)節(jié)途徑的潛在關(guān)聯(lián)，使用IPA軟件對(duì)分別的基因列表實(shí)施虛擬調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析(圖37)。IPA比較作為輸入提供的基因列表與基因和蛋白質(zhì)中已知物理和調(diào)節(jié)相互作用的curated數(shù)據(jù)庫(kù)。這種分析產(chǎn)生了排序表和最可能由給定調(diào)節(jié)基因列表反映的調(diào)節(jié)途徑的個(gè)別構(gòu)型。盡管由3G9和8G6調(diào)節(jié)的基因列表并非完全相同，但I(xiàn) PA已顯示TGFβ依賴性網(wǎng)絡(luò)為受3G9(37A)以及8G6(圖37B)影響的最高得分調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。與這個(gè)發(fā)現(xiàn)一致，實(shí)驗(yàn)組平均基因表達(dá)特征的層級(jí)聚類已顯示經(jīng)由αvβ6mAbs和rsTGFβRII-Ig的基因調(diào)節(jié)模式之間的相似性(圖35)。
6.αvβ6阻斷減少Co14A3-/-腎中的TGFβ表達(dá)。為了確定用3G9和8G6mAb處理檢測(cè)到的腎纖維化減少是否與TGF-β表達(dá)減少相關(guān)，腎切片用抗TGF-β1mAb進(jìn)行免疫染色(圖38A)。用于免疫染色的mAb是與潛伏TGF-β比較，與表達(dá)組成活性TGF-β的組織切片優(yōu)先結(jié)合的mAb(數(shù)據(jù)未顯示)24。用3G9或8G6處理小鼠導(dǎo)致在腎脈間區(qū)和小球區(qū)域中的TGF-β1免疫染色顯著減少。TGF-β表達(dá)中的這些變化伴隨TGF-βmRNA腎組織總水平的類似變化(圖38B)。TGF-β1免疫染色模式指出盡管αvβ6表達(dá)限制于腎小管上皮層，但αvβ6功能抑制可以導(dǎo)致在遠(yuǎn)端部位例如小球區(qū)域處的TGF-β表達(dá)減少，所述小球區(qū)域不緊鄰αvβ6表達(dá)區(qū)域。這可能暗示盡管αvβ6可以充當(dāng)局部TGF-β活化的起始觸發(fā)物，但它還可以對(duì)TGF-β產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)影響。此類遠(yuǎn)程影響的一種可能機(jī)制可能基于TGF-β以自分泌或旁分泌方式激活其自身表達(dá)的能力，導(dǎo)致TGF-β表達(dá)組織區(qū)域擴(kuò)大。它還包括通過αvβ6阻斷起始局部抑制TGF-β活化干擾炎癥和纖維化過程的可能性，這隨后可以進(jìn)一步間接下調(diào)TGF-β活性。
7.在Co14A3-/-小鼠中遺傳除去β6基因。為了驗(yàn)證來自mAb實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生Co14A3和β6雙重敲除小鼠(Co14A3-/-；β6-/-)。年齡相一致的Co14A3-/-；β6+/-和Co14A3-/-；β6-/-小鼠腎的組織學(xué)檢查證實(shí)使用αvβ6阻斷性mAbs的研究中獲得的結(jié)果。與年齡相一致的Co14A3-/-；β6+/-小鼠比較，在來自7-10周大的Co14A3-/-；β6-/-小鼠的腎中存在SMA免疫染色的顯著減少(數(shù)據(jù)未顯示)。這伴隨腎小球和脈間區(qū)中纖維化的急劇減少(圖39)。與來自Co14A3-/-；β6+/-小鼠的年齡相一致的腎比較，如在三色masson染色的來自10周大的Co14A3-/-；β6-/-腎中觀察到的，這通過膠原表達(dá)減少和良好保存的腎結(jié)構(gòu)得到證實(shí)。與β6功能遺傳除去比較，使用阻斷性αvβ6mAbs處理觀察到的抗纖維化效應(yīng)的一致性指出，mAb處理是阻斷體內(nèi)αvβ6功能的有效方法。
7.3G9抑制Co14A3-/-小鼠中的腎纖維化的劑量響應(yīng)。Co14A3-/-小鼠用濃度漸增的3G9每周處理3次。小鼠從3周大處理到7周且隨后被處死。SMA的免疫組織化學(xué)分析在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)中進(jìn)行分析。劑量逐步增加顯示3G9在Co14A3-/-小鼠中以0.3-0.4mg/kg的ED50抑制SMA表達(dá)(圖40)。
討論 腎臟疾病的進(jìn)展伴隨強(qiáng)烈的組織重塑、炎癥和纖維化損害形成，最終導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)破壞和腎功能喪失。纖維化對(duì)于這個(gè)過程是關(guān)鍵的，且包括成纖維細(xì)胞活化和擴(kuò)充、患病組織新血管形成、和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。作為這些事件的主要驅(qū)動(dòng)物牽涉的分子機(jī)制包括TGF-β軸誤調(diào)節(jié)，伴隨在位于纖維化損害的細(xì)胞中的ECM蛋白質(zhì)及其受體表達(dá)改變34-36。TGF-β表達(dá)升高是人組織纖維化的標(biāo)記25-27，和TGF-β在促進(jìn)組織纖維化中的功能重要性已在體外和動(dòng)物疾病模型中得到文件證明。TGF-β過量表達(dá)足以在體內(nèi)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化和血管發(fā)生，且在器官型和細(xì)胞培養(yǎng)中激活ECM過量產(chǎn)生34，37，38。相反，TGF-β信號(hào)的遺傳或藥理學(xué)破壞在肺、皮膚、和腎纖維化模型中提供了不受纖維化的足夠保護(hù)30，32，33，39-41 指向系統(tǒng)抑制TGF-β功能(阻斷性mAbs、rsTGF-βRII-Ig、TGF-β受體激酶抑制劑)的幾項(xiàng)研究已顯示減少動(dòng)物疾病模型中的纖維化。然而，所有這些方法已針對(duì)阻斷活化形式的TGF-β，而可以阻斷TGF-β活化的試劑的治療潛能仍研究甚少。TGF-β作為潛伏前體表達(dá)，且可以通過許多機(jī)制轉(zhuǎn)變成生物學(xué)活性細(xì)胞因子，所述機(jī)制包括活性氧簇、pH、凝血酶敏感素-1、細(xì)胞外蛋白水解酶、和整聯(lián)蛋白21，42-44。在整聯(lián)蛋白中特別感興趣的是αvβ6，在上皮重塑位點(diǎn)處表達(dá)且顯示充當(dāng)潛伏TGF-β受體和激活物的TGF-β誘導(dǎo)型整聯(lián)蛋白11，17，45。β6亞單位在幾種形式的腎臟疾病是上調(diào)的10，且其遺傳除去顯示在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型中提供不受損傷誘導(dǎo)的腎纖維化的顯著保護(hù)46。β6缺陷小鼠不受纖維化的類似保護(hù)已在博來霉素肺纖維化模型中觀察到，暗示αvβ6可以在各種組織中介導(dǎo)纖維化17，47。有趣的是，UUO誘導(dǎo)的SMAD2磷酸化，TGF-β信號(hào)的關(guān)鍵介質(zhì)在β6缺陷腎中顯著減少，暗示αvβ6可能的確在體內(nèi)作為TGF-β調(diào)節(jié)線路部分起作用46。
使用β6敲除小鼠的先前研究已提供αvβ6可以在纖維化起始中起作用的證據(jù)，暗示這種整聯(lián)蛋白是潛在的新型治療靶。嘗試確定用阻斷性mAbs藥理學(xué)抑制αvβ6功能是否能夠減少Co14A3-/-小鼠中的腎纖維化，所述Co14A3-/-小鼠是常染色體隱形遺傳阿爾波特綜合征的動(dòng)物模型28，29。阿爾波特綜合征是由Co14A3、Co14A4或Co14A5基因中的突變引起的遺傳疾病48。這些基因中的缺陷導(dǎo)致膠原IV網(wǎng)絡(luò)的異常裝配和小球和血管基底膜的異常形成。Alport患者發(fā)展導(dǎo)致腎終末期疾病的進(jìn)行性腎小球腎炎。在人Alport以及小鼠Co14A3-/-腎組織中觀察到αvβ6的顯著上調(diào)。在Co14A3-/-小鼠腎中，αvβ6的表達(dá)增加在小管上皮中特別顯著，在其中它在SMA陽(yáng)性細(xì)胞廣泛擴(kuò)充和膠原沉積之前，且與之伴隨?；谶@種表達(dá)模式，假設(shè)αvβ6在響應(yīng)損傷的上皮周期早期變得上調(diào)，且可能是持續(xù)性上皮損害背景中的纖維化起始和維持中的重要介質(zhì)。研究結(jié)果顯示抗體介導(dǎo)的αvβ6阻斷可以抑制腎纖維化起始以及早期進(jìn)展，且抑制其維持。與來自β6缺陷UUO小鼠模型的先前發(fā)現(xiàn)一致46，在實(shí)驗(yàn)中觀察到的αvβ6阻斷性mAbs的抗纖維化效應(yīng)與TGF-β活性和表達(dá)減少相關(guān)。有趣的是，在αvβ6mAbs處理后TGF-β和SMA表達(dá)的明顯減少不僅緊在αvβ6陽(yáng)性細(xì)胞附近發(fā)生，也可在相對(duì)遠(yuǎn)側(cè)的組織區(qū)域中檢測(cè)。盡管這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能暗示αvβ6可以直接或以間接方式促成TGF-β軸活化，所述間接方式例如經(jīng)由TGF-β表達(dá)的旁分泌自體活化，但它不排除αvβ6阻斷可以經(jīng)由腎外效應(yīng)提供保護(hù)的可能性，所述腎外效應(yīng)包括改變?nèi)砻庖吖δ堋Ｒ言u(píng)估在αvβ6mAb處理4周后小鼠中的許多趨化因子和細(xì)胞因子的血清水平以及外周血群體，和沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化。此外，使用αvβ6mAb處理或β6基因遺傳敲除，通過免疫組織化學(xué)只檢測(cè)到Co14A3-/-腎(小鼠)腎中最低限度的單核細(xì)胞變化。評(píng)估使用αvβ6mAb處理或移植研究的免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)的進(jìn)一步研究可以更完全地解決這點(diǎn)。
TGF-β途徑誤調(diào)節(jié)和過興奮已暗示為涉及Co14A3-/-小鼠中腎臟疾病進(jìn)展的占優(yōu)勢(shì)機(jī)制6。TGF-β線路的一個(gè)有趣特征是TGF-β誘導(dǎo)其自身表達(dá)的能力，所述特征可以幫助解釋這種細(xì)胞因子在纖維化區(qū)域中的明顯優(yōu)勢(shì)作用。這增加了αvβ6阻斷的抗纖維化效應(yīng)可以至少部分由間接機(jī)制介導(dǎo)的可能性。這可以包括通過改變局部炎癥和纖維化且干擾后續(xù)增加的TGF-β活性對(duì)TGF-β表達(dá)的下游影響。因?yàn)棣羦β6可以由TGF-β誘導(dǎo)，且促進(jìn)潛伏TGF-β活化，所以探究在介導(dǎo)Co14A3-/-腎病理學(xué)中TGF-β和αvβ6之間的功能關(guān)聯(lián)。比較αvβ6mAbs和rsTGF-βRII-Ig在Co14A3-/-小鼠腎中對(duì)疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的影響。這種比較已顯示αvβ6依賴性基因與TGF-β的不同功能關(guān)聯(lián)，以及經(jīng)由αvβ6mAbs和rsTGF-βRII-Ig的基因調(diào)節(jié)模式的緊密相似性。此外，用αvβ6阻斷性mAbs處理Co14A3-/-小鼠抑制TGF-β的腎表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)顯示抑制性αvβ6mAbs的疾病調(diào)節(jié)效應(yīng)可以起因于TGF-β功能抑制，可能經(jīng)由抑制患病組織中αvβ6介導(dǎo)的潛伏TGF-β活化。上述數(shù)據(jù)的一個(gè)吸引人的方面是經(jīng)由αvβ6或TGF-β阻斷來抑制促炎基因表達(dá)。TGF-β具有充分確定的消炎和免疫抑制功能，然而，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)由rsTGF-βRII-Ig和抗αvβ6mAbs的基因調(diào)節(jié)模式指示TGF-β在Alport疾病模型中的促炎作用。盡管這種明顯促炎效應(yīng)的實(shí)際機(jī)制需要進(jìn)一步研究，但它可以基于TGF-β誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯和上皮細(xì)胞死亡的已知能力31，49-51。因?yàn)樯掀p害提供用于激活針對(duì)組織損傷的早期先天免疫應(yīng)答的重要機(jī)制，所以由數(shù)據(jù)暗示的TGF-β明顯促炎作用可以是間接的，且由TGF-β促進(jìn)的對(duì)腎上皮的損傷來介導(dǎo)。根據(jù)這種模型，αvβ6可以充當(dāng)TGF-β依賴性上皮重塑機(jī)制的重要組分，且其功能在疾病中的誤調(diào)節(jié)可以進(jìn)一步促進(jìn)疾病相關(guān)組織損傷和炎癥。
研究結(jié)果表明αvβ6在人腎臟疾病中是高度上調(diào)的，且用功能阻斷性抗體靶向αvβ6可以提供腎纖維化治療調(diào)節(jié)的有效新型方法。因?yàn)棣羦β6表達(dá)在很大程度上限制于患病組織中的上皮細(xì)胞，所以這種方法允許選擇性局部抑制TGFβ功能。因?yàn)門GFβ在各種細(xì)胞和組織類型中表達(dá)，且在許多不同內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程調(diào)節(jié)中起重要作用，所以αvβ6功能阻斷提供在其中αvβ6整聯(lián)蛋白上調(diào)的那些疾病中系統(tǒng)抑制TGF-β的可能較安全的可替代方法。
結(jié)論 αvβ6在與炎癥和纖維化病理狀態(tài)相關(guān)的人腎臟疾病中是過量表達(dá)的。
αvβ6阻斷性mAbs在Co14A3-/-(Alport)腎纖維化模型中抑制纖維化。
延遲處理研究指出αvβ6的治療阻斷不僅抑制腎纖維化進(jìn)展，還可以允許現(xiàn)有的纖維化損害消退。
β6遺傳敲除在Co14A3-/-小鼠中導(dǎo)致保護(hù)。
腎組織轉(zhuǎn)錄特征顯示αvβ6阻斷性mAbs顯著抑制在纖維化和炎癥介質(zhì)表達(dá)中的疾病相關(guān)變化。
使用重組可溶性TGF-βRII處理產(chǎn)生類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式，暗示共有的αvβ6和TGF-β調(diào)節(jié)功能。
參考文獻(xiàn) 1.Okada H，Kalluri RCellular and molecular pathways thatlead to progression and regression of renal fibrogenesis.Curr MoIMed 2005，5467-474 2.Sheppard DFunctions of pulmonary epithelial integrinsfrom development to disease.Physiol Rev 2003，83673-686 3.Norman JT，F(xiàn)ine LGProgressive renal diseasefibroblasts，extracellular matrix，and integrins.Exp Nephrol 1999，7167-177 4.Border WA，Noble NAInteractions of transforming growthfactor-beta and angiotensin II inrenal fibrosis.Hypertension1998，31181-188 5.Wang W，Koka V，Lan HYTransforming growth factor-beta andSmad signalling in kidney diseases.Nephrology 2005，1048-56 6.Sampson NS，Ryan ST，Enke DA，Cosgrove D，Koteliansky V，Gotwals PGlobal Gene Expression Analysis Reveals a Role for thealpha 1 Integrin in Renal Pathogenesis.J Biol Chem 2001，27634182-34188 7.Cosgrove D，Rodgers K，Meehan D，Miller C，Bovard K，GilroyA，Gardner H，Kotelianski V，Gotwals P，Amattucci A，KalluriRIntegrin α1β1 and transforming growth factor-β1play distinctroles in alport glomerular pathogenesis and serve as dual targetsfor metabolic therapy.Amer J of Pathol 2000，1571649-1659 8.Hamerski DA，Santoro SAIntegrins and the kidneybiologyand pathobiology.Curr Opin Nephrol Hypertens 1999，89-14 9.Zambruno G，Marchisio PC，Marconi A，Vaschieri C，MelchioriA，Giannetti A，De Luca MTransforming growth factor-β1 modulatesβ1 and β5 integrin receptors and induces the de novo expressionof the αv β6 heterodimer in normal human keratinocytesimplications for wound healing.J Cell Biol 1995，129853-865 10.Trevillian P，Paul H，Millar E，Hibberd A，Agrez MValpha(v)beta(6)Integrin expression in diseased and transplantedkidneys.Kidney Int 2004，661423-1433 11.Breuss JM，Gallo J，DeLisser HM，Klimanskaya rV，F(xiàn)olkessonHG5 Pittet JF，Nishimura S，Aldape K，Landers DV，Carpenter W，Gillett N，Sheppard D，Matthay MA，Albelda SM，Kramer RH，PytellaRExpression of the B6 subunit in development，neoplasia and tissuerepair suggests a role in epithelial remodeling.J Cell Sci 1995，1082241-2251 12.Breuss JM，Gillett N，Lu L5 Sheppard D，Pytella RRestricteddistribution of integrin β6 mRNA in primate epithelial tissues.J Histochem and Cytochem 1993，411521-1527 13.Hakkinen L，Hildebrand HC，Berndt A，Kosmehl H，LarjavaHImrnuno localization of tenascin-C，α9integrin subunit，andαvβ6 integrin during wound healing in human oral mucosa.J ofHistochem and Cytochem 2000，48985-998 14.Arend LJ，Smart AM，Briggs JPMouse β6 integrin sequence，pattern of expression，and role in kidney development.J Amer SocNephrol 2000，112297-2305 15.Hakkinen L，Koivisto L，Gardner H，Saarialho-Kere U，CarrollJM，Lakso M，Rauvala H，Laato M，Heino J，Larjava HIncreasedexpression of β6-integrin in skin leads to spontaneousdevelopment of chronic wounds.Am J Pathol 2004，164229-242 16.Huang XZ，J.W，Spong S，Sheppard DThe integrin αvB6is critical for keratinocyte migration on both its known ligand，fibronectin，and on vitronectin.J Cell Sci 1998，1112189-2195 17.Munger JS，Huang X，Kawakatsu H，Griffiths MJD，Dalton SL，Wu J，Pittet JF，KaminskiN，Garat C，Matthay MA，Rifkin DB，SheppardDThe integrin αvβ6binds and activates latent TGFB1amechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis.Cell 1999，96319-328. 18.Yokosaki Y，Monis H，Chen A，Sheppard DDifferential effectsof the integrins alpha9betal，alphavbeta 3，and alphavbeta6 on cellproliferative responses to tenascin.Roles of the beta subunitextracellular and cytoplasmic domains.J Biol Chem 1996，27124144-24150 19.Annes JP，Rifkin DB，Munger JSThe integrin αvβ6 bindsand activates latent TGFβ3.FEBS lett 2002，51165-68 20.Munger JS，Harpel JG，Gleizes PE，Mazzieri R，Nunes I，Rifkin DBLatent transforming growth factor-βstructuralfeature and mechanisms of activation.Kid Int 1997，511376-1382 21.Khalil NTGF-betafrom latent to active.MicrobesInfect 1999，11255-1263 22.Barcellos-Hoff MHLatency and activation in the controlof TGF-β.J Mamm Gland Biol 1996，1353-363 23.Weinreb PH，Simon KJ，Rayhorn P，Yang WJ，Leone DR，DolinskiBM，Pearse BR，Yokota Y，Kawakatsu H，Atakilit A，Sheppard D，Violette SMFunction-blocking integrin alphavbeta6monoclonalantibodies.J Biol Chem 2004，27917875-17887 24.Barcellos-Hoff MH，Ehrhart EJ，Kalia M，Jirtler，F(xiàn)landersKC，Tsang ML-SImmunohistochemical detection of activetransforming growth factor-βin situ using engineered tissue.Amer J of Pathol 1995，1471228-1237 25.Yamamoto T，Nakamura T，Noble NA，Ruoslahti E，Border WAExpression of transforming growth factor beta is elevated in humanand experimental diabetic nephropathy.Proc Natl Acad Sci，USA1993，901814-1818 26.Yamamoto T，Noble NA，Cohen AH，Nast CC，Hishida A，I.GL，Border WAExpression of transforming growth factor-beta isoformsin human glomerular diseases.Kidney Int 1996，49461-469 27.Shihab FS，Yamamoto T，Nast CC，H.CA，Noble NA，Gold LI，Border WATransforming growth factor-beta and matrix proteinexpression in acute and chronic rejection of human renalallografts.J Am Soc Nephrol 1995，6286-294 28.Cosgrove D，Meehan D，Grunkemeyer JA，Kornak JM，SayersR，Hunter WJ，Samuelson GCCollagen COL4A3 knockouta mouse modelfor autosomal Alport syndrome.Genes Dev 1996，102981-2992 29.Miner JH，Sanes JRMolecular and functional defects inkidneys of mice lacking collagen α3(IV)implications for alportsyndrome.J Cell Biol 1996，1351403-1413 30.Sharma K，Jin Y，Guo J，Ziyadeh FNNeutralization ofTGF-beta by an anti-TGF-beta antibody attenuates kidneyhypertrophy and the enhanced extracellular matrix geneexpresssion in STZ-induced diabetic mice.Diabetes 1996，45522-530 31.Miyajima A，Chen J，Lawrence C，Ledbetter S，Soslow RA，Stern J，Jha S，Pigato J，Lemer ML，Poppa DP，Darracott VaughanJr.E，F(xiàn)elson DAntibody to transforming growth factor-βameliorates tubular apoptosis in unilateral ureteral obstruction.Kid Int 2000，582310-2313 32.Ziyadeh FN，Hoffman BB，Han DC，Iglesias-de Ia Cruz MC，Hong SW，Isono M，Chen S，McGowan TA，Sharma KLong-term preventionof renal insufficiency，excess matrix gene expression，andglomerular mesangial matrix expansion by treatment withmonoclonal antitransforming growth factor-βantibody in db/dbdiabetic mice.Proc Natl Acad Sci，USA 2000，978015-8020 33.Ka suga H，Ito Y，Sakamoto S，Kawachi H，Shimizu F，YuzawaY，S.MEffects of anti-TGF-βtype II receptor antibody onexperimental glomerulonephritis.Kid Int 2001，601745-1755 34.Roberts AB，Sporn MBRegulation of endothelial cellgrowth，architecture，and matrix synthesis by TGF-beta.Am RevRespir Dis 1989，1401126-1128 35.Eickelberg O，Kohler E，Reichenberger F，Bertschin S，WoodtliT，Erne P，Perruchoud AP，Roth MExtracellular matrix depositionby primary human lung fibroblasts in response to TGF-betal andTGF-beta 3.Am J Physiol 1999，276L814-L824 36.Varga J，Rosenbloom J，Jimenez SATransforming growthfactor beta(TGF beta)causes a persistent increase in steady-stateamounts of type I and type III collagen and fibronectin mRNAs innormal human dermal fibroblasts.Biochem J 1987，247597-604 37.Konig A，Bruckner-Tuderman LTransforming growthfactor-beta promotes deposition of collagen VII in a modifiedorganotypic skin model.Lab Invest 1994，70203-209 38.Sime PJ，Xing Z，Graham FL，Csaky KG，Gauldie JAdenovector-mediated gene transfer of active transforming growthfactor-β1 induces prolonged severe fibrosis in rat lung.J clinInvest 1997，100768-776 39.Laping NJALK5Inhibition in renal disease.Curr OpinPharmacol 2003，3204-208 40.Bonniaud P，Kolb M，Gait T，Robertson J，Robbins C，StampfliM，Lavery C，Margetts PJ，Roberts AB，Gauldie JSmad3 null micedevelop airspace enlargement and are resistant to TGF-beta-mediated pulmonary fibrosis.J Immunol 2004，1732099-2108 41.Inazaki K，Kanamaru Y，Kojima Y，Sueyoshi N，Okumura K，Kaneko K，Yamashiro Y，Ogawa H，Nakao ASmad3 deficiency attenuatesrenal fibrosis，inflammation，and apoptosis after unilateralureteral obstruction.Kidney Int 2004，66597-604 42.Murphy-Ullrich JE，Poczatek MActivation of latentTGF-beta by thrombospondin-1 mechanisms and physiology.CytokineGrowth Factor Rev 2000，1159-69 43.Annes JP，Munger JS，Rifkin DBMaking sense of latent TGFBactivation.J Cell Sci 2003，116217-224 44.Sheppard DIntegrin-mediated activation of latenttransforming growth factor beta.Cancer Metastasis Rev 2005，24395-402 45.Sheppard DIntegrin-Mediated Activation of TransformingGrowth Factor-{beta}1in Pulmonary Fibrosis，chest 2001，12049S-53 46.Ma LJ，Yang H，Gaspert A，Carlesso G，Barty MM，DavidsonJM，Sheppard D，F(xiàn)ogo ABTransforming growth factor-β-dependentand independent pathways of induction of tubulointerstitialfibrosisin B6-/-mice.Am J Pathol 2003，1631261-1273 47.Kaminiski N，Allard JD，Pittet JF，F(xiàn)engrong Z，GriffithsMJD，Morris D，X.H，Sheppard D，Heller RAGlobal analysis of geneexpression in pulmonary fibrosis reveals distinct programsregulating lung inflammation and fibrosis.Proc Natl Acad Sci，USA 2000，971778-1783 48.Torra R，Ta zon-Vega B，Ars E，Ballarin JCollagen typeIV({alpha}3-{alpha}4)nephropa thyfromisolated haematuria torenal failure.Nephrol Dial Transplant 2004，192429-2432 49.Bottinger EP，Bitzer MTGF-betasignaling in renal disease.J Am Soc Nephrol 2002，132600-2610 50.Goumenos DS，Tsamandas AC，El Nahas AM，Thomas G，TsakasS，Sotsiou F，Bonikos DS，Vlachojannis JGApoptosis andmyofibroblast expression in human glomerular diseasea possiblelink with transforming growth factor-beta-1.Nephron 2002，92287-296 51.Dai C，Yang J，Liu YTrans forming growth factor-betalpotentiates renal tubular epithelial cell death by a mechanismindependent of Smad signaling.J Biol Chem 2003，27812537-12545 實(shí)施例14鼠類3G9(mu3G9)在腎纖維化小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中的功效 概述 單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)是良好建立的腎損傷動(dòng)物模型，導(dǎo)致加速的腎小管間質(zhì)性纖維化。尿路梗阻在輸尿管和腎小管中產(chǎn)生增加的管腔內(nèi)壓力，這導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)損害。UUO的特征在于腎積水、小管擴(kuò)張、腎小管凋亡、進(jìn)行性腎萎縮、間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)、腎TGF-β和腎間質(zhì)性纖維化增加。1整聯(lián)蛋白αvβ6功能可以參與TGF-β活化和上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。因?yàn)檫@些過程促成疾病進(jìn)展，所以UUO模型用于評(píng)估抗αvβ6單克隆抗體mu3G9和重組可溶性鼠類TGF-β受體II型Ig融合蛋白(rsTGF-βRII-Ig)針對(duì)快速進(jìn)行性腎纖維化的功效。對(duì)于10天的實(shí)驗(yàn)過程用mu3G9以4mg/kg腹膜內(nèi)每周給藥3次，平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的平均抑制百分比為32％。
引言 進(jìn)行性纖維化是導(dǎo)致腎終末期疾病發(fā)展的共同過程，且通過上皮重塑、成纖維細(xì)胞活化、炎癥和與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的細(xì)胞相互作用的再組織得到促進(jìn)。促成這些事件的分子機(jī)制是復(fù)雜的，且包括TGF-β軸誤調(diào)節(jié)、異常ECM重塑、和整聯(lián)蛋白超家族細(xì)胞粘附受體的表達(dá)和功能改變2-9。近期研究已顯示幾種整聯(lián)蛋白和相關(guān)分子在腎上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中的重要調(diào)節(jié)功能8，10-13。
表達(dá)在腎臟疾病中強(qiáng)烈增加的整聯(lián)蛋白中有TGF-β誘導(dǎo)型整聯(lián)蛋白αvβ63，14，15。αvβ6表達(dá)一般限制于上皮細(xì)胞，在其中它在正常成人組織中以低水平表達(dá)且在發(fā)育、損傷和瘤形成期間升高14，16-18。盡管αvβ6在健康成人腎中以相當(dāng)?shù)退奖磉_(dá)，但它的表達(dá)在發(fā)展中的小鼠腎中是顯著的，特別是在近端小管、亨利氏袢和收集管中16，17，19。近期，已報(bào)道了關(guān)于各種形式的人腎病理學(xué)的αvβ6表達(dá)升高15。
與αvβ6在體內(nèi)組織重塑期間表達(dá)增加一致，αvβ6整聯(lián)蛋白在培養(yǎng)上皮細(xì)胞中的表達(dá)可以由細(xì)胞因子誘導(dǎo)，所述細(xì)胞因子調(diào)節(jié)上皮重塑，包括EGF和TGF-β3，14。此外，在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中過量表達(dá)的β6已顯示激發(fā)形成自發(fā)性長(zhǎng)期創(chuàng)傷20，暗示αvβ6可能在上皮組織重塑調(diào)節(jié)中起重要作用。
關(guān)于αvβ6的已知配體包括纖連蛋白、腱生蛋白、以及潛伏相關(guān)肽1和3(LAP1和LAP3)，潛伏前體形式的TGF-β1和-β3的N末端片段21-25。作為與這些配體結(jié)合的結(jié)果，αvβ6可以介導(dǎo)細(xì)胞粘附、擴(kuò)展、遷移、和潛伏TGF-β活化。TGF-β合成為被切割的潛伏蛋白質(zhì)，且與N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP與鼠類活性C末端TGF-β細(xì)胞因子非共價(jià)結(jié)合。潛伏TGF-β復(fù)合物不能與其同類受體結(jié)合且因此保持生物學(xué)無活性，直至通過幾種可替代機(jī)制之一轉(zhuǎn)變成活性形式，所述可替代機(jī)制包括通過蛋白酶切割、暴露于低pH或電離輻射、和潛伏復(fù)合物中的構(gòu)象變化允許其與其同類受體結(jié)合26-29。激活構(gòu)象變化可以由αvβ6誘導(dǎo)，包括整聯(lián)蛋白與包含在LAP1和LAP3內(nèi)的RGD基序直接結(jié)合。這種結(jié)合使TGF-β前體轉(zhuǎn)變成受體結(jié)合感受狀態(tài)22，25。這些發(fā)現(xiàn)暗示上皮細(xì)胞表面上的αvβ6表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致局部TGF-β活化，隨后為旁觀者細(xì)胞中的TGF-β依賴性事件的旁分泌活化。
因?yàn)門GF-β已暗示為腎纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，所以假設(shè)它由αvβ6局部活化可能是腎臟疾病發(fā)作和進(jìn)展中的重要過程，且αvβ6功能阻斷可以抑制腎纖維化發(fā)展。在本文所述研究中，顯示αvβ6在腎纖維化小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中是顯著上調(diào)的。顯示阻斷配體結(jié)合和αvβ6的TGF-β活化功能的mAbs30抑制這種模型中的纖維化。
材料和方法 1.動(dòng)物。在該研究中使用雄性8-12周大的25.5±0.2g無病毒抗原的C57BL小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。動(dòng)物飼養(yǎng)在Biogen Idec無病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)隔離籠架中，且允許在研究開始前適應(yīng)7天。適應(yīng)和實(shí)驗(yàn)期間自始至終小鼠隨意使用被照射的標(biāo)準(zhǔn)小鼠食物(LabDiet Prolab

5P75

RMH 3000)和無菌水。每隔一段時(shí)間測(cè)量體重作為動(dòng)物健康監(jiān)控的一部分。
2.抗體和試劑。αvβ6mAbs如本文所述和先前所述30產(chǎn)生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分別的親本雜交瘤總RNAs產(chǎn)生，其中恒定區(qū)引物CDL-739用于重鏈和CDL-738用于輕鏈，使用First Strand cDNA合成試劑盒(Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ)。重和輕鏈可變區(qū)基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用用于cDNA合成的相同3′引物、和對(duì)大多數(shù)鼠類抗體基因信號(hào)序列(在檢索后可獲得的序列)特異的簡(jiǎn)并引物庫(kù)、以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)。將克隆的重和輕鏈可變區(qū)連接到具有人IgG1恒定區(qū)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。重組可溶性鼠類TGF-β受體II型-Ig融合蛋白(rsTGF-βRII-Ig)如先前所述11產(chǎn)生，且購(gòu)自R&D Systems(532-R2，Minneapolis，MN)。
3.免疫組織化學(xué)。將組織切片在二甲苯和乙醇中去石蠟化、在蒸餾水中再水合、且隨后浸入包含0.45％H2O的甲醇中。組織與胃蛋白酶(00-3009，Zymed，San Francisco，CA)一起溫育，且用抗生物素蛋白和生物素(SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封閉。初級(jí)抗體在包含0.1％BSA的PBS中稀釋，且使組織于4℃溫育過夜。為了免疫染色小鼠組織上的β6，切片與人/小鼠嵌合型抗αvβ6mAb-2A130，和抗人生物素化次級(jí)抗體(PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起溫育。為了免疫染色鼠類組織上的β6，2A130和抗小鼠-生物素化次級(jí)抗體(PK-6102，Vector Laboratories)一起溫育。將抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物-辣根過氧化物酶(PK-6102，Vector Kit))應(yīng)用于切片、在室溫下溫育30分鐘，且如示的(SK-4100，Vector Laboratories)制備3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，且于室溫應(yīng)用于切片5分鐘。組織切片用Mayer′s Hematoxylin染色1分鐘且在水和PBS中漂洗。
4.單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎纖維化。關(guān)于該研究的手術(shù)經(jīng)過2天的時(shí)間段進(jìn)行，且關(guān)于小鼠的給藥方案相對(duì)于輸尿管結(jié)扎當(dāng)天安排時(shí)間。左輸尿管在氯胺酮∶甲苯噻嗪(1000∶10mg/kg皮下)麻醉下經(jīng)由左中線(left-of-midline)剖腹術(shù)無菌分離。將2條緊密的咬合6-0結(jié)扎絲線置于輸尿管的腎較低極水平上，且在結(jié)扎線之間切割輸尿管。腹壁用4-0Vicryl縫線縫合，且皮膚用4-0尼龍縫合。允許動(dòng)物在熱墊上恢復(fù)，且在第0和1天皮下給予0.05mg/kg丁丙諾啡，一天2次。從手術(shù)前當(dāng)天開始，動(dòng)物用mu3G9每周給藥3次或用sTGF-βRII-Ig每周給藥2次。該操作由先前描述的報(bào)道修改31。
5.組織樣品收集和關(guān)于疾病指示劑的組織學(xué)分析。動(dòng)物在結(jié)扎后第10天時(shí)用二氧化碳實(shí)施安樂死。取出2個(gè)腎(左側(cè)結(jié)扎，右側(cè)未結(jié)扎)且穿過腎盂中心橫切平分。將每個(gè)腎的一半加入10％中性緩沖的福爾馬林中用于固定組織染色。將每個(gè)腎的另一半置于15％蔗糖中，隨后為30％蔗糖用于免疫組織化學(xué)染色平滑肌肌動(dòng)蛋白。
福爾馬林固定的腎切片對(duì)于膠原含量用Masson′s三色染色法進(jìn)行染色，和對(duì)于結(jié)構(gòu)解剖學(xué)用H&E進(jìn)行染色。三色染色的切片使用leicaQwin圖像分析系統(tǒng)在通過亮視野顯微術(shù)捕獲的圖像中進(jìn)行形態(tài)測(cè)量定量。圖像使用標(biāo)準(zhǔn)化照明條件和數(shù)碼相機(jī)曝光設(shè)定進(jìn)行捕獲，對(duì)于背景進(jìn)行校正，和對(duì)距離標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。
設(shè)定閾值以檢測(cè)關(guān)于Masson′s三色染色載玻片中的膠原染色的深藍(lán)色。膠原面積在200X時(shí)獲取的圖像中進(jìn)行分析。從每個(gè)動(dòng)物獲取覆蓋整個(gè)左腎切片的鄰接視野的圖像用于定量。
6.統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)測(cè)量視野中的膠原含量表示為200X視野內(nèi)的組織總面積百分比(排除任何空白)，即藍(lán)色面積％。測(cè)量來自每個(gè)腎的16-35個(gè)個(gè)別視野。這些包括來自切片的所有皮質(zhì)和髓質(zhì)組織且排除腎乳頭。對(duì)于每個(gè)動(dòng)物計(jì)算從左側(cè)結(jié)扎腎的所有視野中獲取的平均藍(lán)色面積％，且充當(dāng)動(dòng)物的纖維化得分用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。幾個(gè)處理組中藍(lán)色面積％的處理相關(guān)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過單因素方差分析來測(cè)定，隨后為Student-Newman-Keuls方法用于配對(duì)多重比較。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的。
結(jié)果 1.αvβ6在UUO后的腎中的表達(dá)。αvβ6整聯(lián)蛋白在UUO后的腎中的表達(dá)通過免疫組織化學(xué)分析來檢查。在未損害(正常)腎中檢測(cè)到最低限度的αvβ6表達(dá)，而在UUO后第7、10和14天時(shí)顯示顯著上調(diào)的表達(dá)(圖41)。在UUO后早至3天時(shí)測(cè)量到可檢測(cè)的表達(dá)。
2.使用mu3G9處理在UUO腎中抑制平滑肌肌動(dòng)蛋白的免疫染色。鼠類UUO模型中的纖維化程度通過組織形態(tài)測(cè)定術(shù)分析免疫組織化學(xué)α平滑肌肌動(dòng)蛋白染色(褐色染色)或Masson′s三色膠原基質(zhì)染色(藍(lán)色染色)來測(cè)量。在每個(gè)研究中，在接受媒介物或同種型對(duì)照mAb(陰性對(duì)照組)的UUO小鼠中、在接受測(cè)試處理處理的組中、和未結(jié)扎的正常小鼠中測(cè)定由纖維化占據(jù)的組織面積比例。通過計(jì)算陰性對(duì)照和測(cè)試處理之間的染色面積差異超過陰性對(duì)照和未結(jié)扎正常小鼠之間差異的比率，療效表示為Masson′s三色膠原基質(zhì)(藍(lán)色)染色或平滑肌肌動(dòng)蛋白(褐色)染色抑制百分比。
為了使多項(xiàng)研究中的結(jié)果關(guān)聯(lián)的目的，療效表示為α平滑肌肌動(dòng)蛋白染色抑制百分比。對(duì)于10天的實(shí)驗(yàn)過程在4mg/kgmu3G9腹膜內(nèi)每周給藥3次時(shí)，平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的平均抑制百分比為32.8％。而rsTGF-βRII-Ig顯示在2mg/kg時(shí)平均抑制13.2％(表14.1)。
表14.1.來自多項(xiàng)研究關(guān)于mu3G9和rsTGF-βRII-Ig組合數(shù)據(jù)的α平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的平均抑制百分比。
腹膜內(nèi)給藥3次/周，共10天 關(guān)于每個(gè)劑量時(shí)的個(gè)別小鼠參見表14.8 表14.2.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-4平均抑制百分比。

表14.3.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-6平均抑制百分比
表14.4A.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-7平均抑制百分比
表14.4B.Masson三色染色的UUO-7平均抑制百分比
表14.5.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-8平均抑制百分比
表14.6.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-9平均抑制百分比
表14.7.平滑肌肌動(dòng)蛋白染色的UUO-14平均抑制百分比
表14.8.在用mu3G9或rsTGF-βRII-Ig處理的個(gè)別動(dòng)物中平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫染色的抑制百分比


參考文獻(xiàn) 1.Miyajima A，Chen J，Lawrence C，Ledbetter S，Soslow RA，Stem J，Jha S，Pigato J，Lemer ML，Poppas DP，Darracott VaughanJr.E，F(xiàn)elson DAntibody to transforming growth factor-βameliorates tubular apoptosis in unilateral ureteral obstruction.Kid Int 2000，582310-2313. 2.Okada H，Kalluri RCellular and molecular pathways thatlead to progression and regression of renal fibrogenesis.Curr MolMed 2005，5467-474. 3.Wang W，Koka V，Lan HYTransforming growth factor-beta andSmad signalling in kidney diseases.Nephrology 2005，1048-56. 4.Leask A，Abraham DJTGF-beta signaling and the fibroticresponse.FASEB J 2004，18816-827. 5.Chapman HADisorders of lung matrix remodeling.J ClinInvest 2004，113148-157. 6.Sheppard DFunctions of pulmonary epithelial integrinsfrom development to disease.Physiol Rev 2003，83673-686. 7.Ihn HPathogenesis of fibrosisrole of TGF-beta and CTGF.Curr Opin Rheumatol 2002，14681-685. 8.Norman JT，F(xiàn)ine LGProgressive renal diseasefibroblasts，extracellular matrix，and integrins.Exp Nephrol 1999，7167-177. 9.Border WA，Noble NAInteractions of transforming growthfactor-beta and angiotensin II in renal fibrosis.Hypertension1998，31181-188. 10.Sampson NS，Ryan ST，Enlce DA，Cosgrove D，Koteliansky V，Gotwals PGlobal Gene Expression Analysis Reveals a Role for thealpha 1Integrin in Renal Pathogenesis.J Biol Chem 2001，27634182-34188. 11.Cosgrove D，RodgersK，Meehan D，Miller C，Bovard K，GilroyA，Gardner H，Kotelianski V，Gotwals P，AmattucciA，Kalluri RIntegrin α1β1and transforming growth factor-β1playdistinct roles in alport glomerular pathogenesis and serve as dualtargets for metabolic therapy.Amer J of Pathol 2000，1571649-1659. 12.Prols F，Hartner A，Schocklmann HO，Sterzel RBMesangialcells and their adhesive properties.Exp Nephrol 1999，7137-146. 13.Hamerski DA，Santoro SAIntegrins and the kidneybiologyand pathobiology.Curr Opin Nephrol Hypertens 1999，89-14. 14.Zambruno G，Marchisio PC，Marconi A，Vaschieri C，MelchioriA，GiannettiA，De Luca MTransforming growth factor-β1modulatesB1and B5integrin receptors and induces the de novo expressionof the αvB6 heterodimer in normal human keratinocytesimplications for wound healing.J Cell Biol 1995，129853-865. 15.Trevillian P，Paul H，Millar E，Hibberd A，Agrez MValpha(v)beta(6)Integrin expression in diseased and transplantedkidneys.Kidney Int 2004，661423-1433. 16.Breuss JM，Gallo J，DeLisser HM，Klimans kaya IV，F(xiàn)olkessonHG，Pittet JF，Nishimura S，Aldape K，Landers DV，Carpenter W，Gillett N，Sheppard D，Matthay MA，Albelda SM，Kramer RH，PytellaRExpression of the B6subunit in development，neoplasia and tissuerepair suggests a role in epithelial remodeling.J Cell Sci 1995，1082241-2251. 17.Breuss JM，Gillett N，Lu L，Sheppard D，Pytella RRestricteddistribution of integrin B6mRNA in primate epithelial tissues.J Histochem and Cytochem 1993，411521-1527. 18.Hakkinen L，Hildebrand HC，Berndt A，Kosmehl H，LarjavaHImmunolocalization of tenascin-C，α9integrin subunit，andαvB6 integrin during wound healing in human oral mucosa.J ofHistochem and Cytochem 2000，48985-998. 19.Arend LJ，Smart AM，Br iggs JPMouse R6integrin sequence，pattern of expression，and rolein kidney development.J Amer SocNephrol 2000，112297-2305. 20.Hakkinen L，Koivisto L，Gardner H，Saarialho-Kere U，CarrollJM，Lakso M，Rauvala H，Laato M，Heino J，Larjava HIncreasedexpression of B6-mtegrin in skin leads to spontaneous developmentof chronic wounds.Am J Pathol 2004，164229-242. 21.Huang XZ，J.W，Spong S，Sheppard DThe integrin αvB6is critical for keratinocyte migration on both its known ligand，fibronectin，and on vitronectin.J Cell Sci 1998，1112189-2195. 22.Munger JS，Huang X，Kawakatsu H，Griffiths MJD，Dalton SL，Wu J，Pittet JF，Kaminski N，GaratC，Matthay MA，RifkinDB，SheppardDThe integrin αvB6binds and activates latent TGFB1a mechanismfor regulating pulmonary inflammation and fibrosis.Cell 1999，96319-328. 23.Busk M，Pytella R，Sheppard DCharacterization of theintegrin alpha v beta 6as a fibronectin-binding protein.J BiolChem 1992，2675790-5796. 24.Yokosaki Y，Monis H，Chen A，Sheppard DDifferential effectsof the integrins alpha9betal，alphavbeta3，and alphavbeta6on cellproliferative responses to tenascin.Roles of the beta subunitextracellular and cytoplasmic domains.J Biol Chem 1996，27124144-24150. 25.Annes JP，Rifkin DB，Munger JSThe integrin αvB6bindsand activates latent TGFB3.FEBS lett 2002，51165-68. 26.Munger JS，Harpel JG，Gleizes PE，Mazzieri R，Nunes I，Rifkin DBLatent transforming growth factor-βstructuralfeature and mechanisms of activation.Kid Int 1997，511376-1382. 27.Gleizes PE，Munger JS，Nunes I，Harpel JG，Mazzieri R，Noguera I，Rifkin DBTGF-beta latencybiological significanceand mechanisms of activation.Stem Cells 1997，15190-197. 28.Khalil NTGF-betafrom latent to active.Microbes Infect1999，11255-1263. 29.Barcellos-Hoff MHLatency and activation in the controlof TGF-β.J Mamm Gland Biol 1996，1353-363. 30.Weinreb PH，Simon KJ，Rayhorn P，Yang WJ，Leone DR，DolinskiBM，Pearse BR，Yokota Y，Kawakatsu H，Atakilit A，Sheppard D，Violette SMFunction-blocking integrin alphavbeta βmonoclonalantibodies.J Biol Chem 2004，27917875-17887. 31.Ma J，Nichimura H，F(xiàn)ogo A，Kon V，Inagami T，Ichikawa IAccelerated fibrosis and collagen deposition develop in the renalinterstitium of angiotensin type 2 receptor null mutant miceduring ureteral obstruction.Kid Lit 1998，53937-944. 實(shí)施例15抑制性抗αvβ6在輻射誘導(dǎo)的肺纖維化鼠類模型中的用途 引言 當(dāng)紊亂的基質(zhì)重塑因肺損傷而起時(shí)發(fā)生肺纖維化(Chapman 2004)。在肺纖維化失調(diào)的許多信號(hào)因子中，細(xì)胞因子TGFβ其特別重要的作用。在動(dòng)物模型中，TGFβ信號(hào)抑制預(yù)防了肺、腎、肝和皮膚中的纖維化。
細(xì)胞內(nèi)處理后，TGFβ及其前結(jié)構(gòu)域作為非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物分泌(Annes，Munger等人2003)。與其前結(jié)構(gòu)域結(jié)合的TGFβ是潛伏的，即它不能與TGFβ受體結(jié)合；因此前結(jié)構(gòu)域被稱為潛伏相關(guān)肽(LAP)。除了充當(dāng)TGFβ抑制劑，LAP經(jīng)由二硫鍵與潛伏TGFβ結(jié)合蛋白(LTBP)家族的蛋白質(zhì)相互作用。LTBPs是基質(zhì)蛋白且使?jié)摲黅GFβ固定在ECM中。從LAP中釋放TGFβ，稱為潛伏TGFβ活化的過程，是TGFβ信號(hào)途徑中的必需步驟?；罨襟E是關(guān)于減少TGFβ信號(hào)策略的潛在靶。
整聯(lián)蛋白αvβ6和αvβ8通過與RGD氨基酸序列相互作用來激活潛伏TGFβ1和TGFβ3，所述RGD氨基酸位于分別的LAPs的C末端附近(Munger，Huang等人1999；Annes，Rifkin等人2002；Mu，Cambier等人2002)。(TGFβ2-最終的TGFβ同種型，沒有RGD序列且不能被這些整聯(lián)蛋白活化)。在肺內(nèi)，TGFβ經(jīng)由整聯(lián)蛋白αvβ6活化在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起非多余作用且響應(yīng)損傷。αvβ6在正常肺上皮中以少量表達(dá)但在損傷后快速上調(diào)。作為TGFβ信號(hào)減少的結(jié)果，缺乏β6基因(Itgb6-/-)的小鼠發(fā)展肺炎癥和肺氣腫。小鼠肺暴露于博來霉素引起急性肺損傷，伴隨αvβ6表達(dá)大量增加，隨后為TGFβ依賴性肺纖維化；Itgb6-/-小鼠在博來霉素處理后不發(fā)展肺纖維化。
電離輻射引起肺纖維化(Franko和Sharplin 1994；Movsas，Raffin等人1997；Martin，Lefaix等人2000；Abratt，Morgan等人2004)。與其中纖維化在肺損傷后數(shù)天內(nèi)開始的博來霉素肺纖維化模型形成對(duì)照，輻射誘導(dǎo)的肺纖維化(RILF)在損傷后數(shù)月開始。鼠類RILF是品系依賴性的；在這些實(shí)驗(yàn)中使用的C57BL/6品系是敏感性的。在鼠類RILF模型中，還存在大約在纖維化發(fā)展時(shí)發(fā)生的大量晚期死亡率；這種死亡率很可能是由于肺灌注喪失(Franko，Nguyen等人1996；Haston，Zhou等人2002)。抑制性抗αvβ6mAb(3G9)已被開發(fā)(Weinreb，Simon等人2004)。這些研究的目標(biāo)是(1)通過比較Itgb6+/+和Itgb6-/-對(duì)胸部輻射的應(yīng)答，在敏感性小鼠品系中建立αvβ6依賴性RILF，(2)通過用TGFβ拮抗劑(可溶性TGFβ受體)處理輻射小鼠證實(shí)TGFβ依賴性鼠類RILF模型，和(3)評(píng)估給予的各種劑量3G9對(duì)輻射小鼠的效應(yīng)。
材料和方法 1.動(dòng)物。使用的所有小鼠都是雌性的。Itgb6-/-小鼠是來自DeanSheppard，UCSF的贈(zèng)予，且在C57BL/6背景上飼養(yǎng)在我們實(shí)驗(yàn)室。野生型小鼠是購(gòu)自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的C57BL/6，在到達(dá)時(shí)7-9周大，且在輻射之前允許在我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)一周。所有動(dòng)物處理操作和實(shí)驗(yàn)得到紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)(New YorkUniversity School of Medicine animal care committee)的支持，且符合NIH關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南?；\限制于最多5只小鼠/籠/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室方案。每天監(jiān)控小鼠的發(fā)病率和死亡率。垂死小鼠被處死。
2.抗體。2種抗體從Biogen Idec(Cambridge，MA)獲得，且如本文其他地方所述進(jìn)行制備。測(cè)試的初級(jí)抗體3G9是阻斷αvβ6介導(dǎo)的TGFβ活化的抗αvβ6mAb。它是IgG1亞型且以陽(yáng)離子非依賴性方式結(jié)合αvβ6。對(duì)照Ab(1E6)是不與小鼠LFA-3相互作用的小鼠抗人LFA-3IgG1單克隆Ab。在正常小鼠中高達(dá)200mg/kg/周的這種對(duì)照Ab劑量4周已顯示沒有毒性(數(shù)據(jù)來自Biogen Idec)?？贵w等分試樣在無菌PBS中制備為稀釋物，以在200微升的總體積中達(dá)到0.3、1、3、6和10mg/kg的劑量。取決于實(shí)驗(yàn)，在右脅腹中的皮下注射或腹膜內(nèi)注射在照射后15周時(shí)開始。
3.輻射方案。小鼠在8-10周大時(shí)被照射。在照射前，使用阿佛丁(2，2，2-三溴乙醇；Acros Organics，NJ)用腹膜內(nèi)遞送的15μl/g2.5％溶液實(shí)現(xiàn)麻醉。小鼠隨后仰臥放置以膠帶粘緊在樹脂玻璃表面上。合適放置鉛遮板使輻射限制于胸部。從肺頂水平到劍突的領(lǐng)域是1.8cm。使用60Co來源遞送14-Gy輻射。源皮間距是65cm。使用這種來源的照射時(shí)間是～11分鐘。射線照射后，將小鼠送回籠中且面向上放置且在恢復(fù)期間進(jìn)行監(jiān)控。
4.來自被處死小鼠的樣品收集。照射后存活預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(對(duì)于抗體研究為26、28或32周)的小鼠被處死，且以下述方式進(jìn)行加工。用阿佛丁獲得深度麻醉后，在胸部和腹部皮膚上噴射70％的乙醇。通過橫膈膜打開胸腔。從心室中直接抽吸400-500μl血液。氣管被暴露且插入22-計(jì)量血管導(dǎo)管。肺用700-μl等分試樣的PBS灌洗2次。右主支氣管干在門處進(jìn)行結(jié)扎，且取出每個(gè)葉并置于分開管中，在液氮中快速冷凍，且貯藏于-80℃。用400μl 10％福爾馬林使左肺膨脹，置于10％福爾馬林中過夜，且包埋在石蠟中。在被處死時(shí)獲得的支氣管肺泡灌洗(BAL)流體分成2個(gè)等分試樣200μl和剩余部分。2個(gè)管在2000RPM下離心3分鐘。合并來自2個(gè)管的上清液，在液氮中冷凍且貯藏于-80℃。來自較大管的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行速凍(snap-frozen)且以相同方式貯藏。200-μl等分試樣的細(xì)胞團(tuán)塊用200μl RBC裂解緩沖液重懸浮且充分混合。50μl用于血球計(jì)中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。剩余150μl用于細(xì)胞離心涂片制備。通過心臟穿刺獲得的血液用于如下制備血清或血漿。在Capiject管或肝素化1.5cc微量離心管中最初混合后，樣品在14,000RPM下離心20分鐘。取出上清液且立即冷凍至-80℃。
5.來自被發(fā)現(xiàn)死亡或垂死小鼠的樣品收集。在達(dá)到處死日期前被發(fā)現(xiàn)死亡或垂死的小鼠被解剖以獲得肺樣品。垂死小鼠在解剖前用阿佛丁實(shí)施安樂死。通過橫膈膜打開胸腔。使用完全暴露進(jìn)行直至氣管的解剖。用22-計(jì)量血管導(dǎo)管插入氣管。用800-1000μl 10％福爾馬林使肺膨脹。胸腔內(nèi)容物被全部取出且在肺分離和石蠟包埋之前置于10％福爾馬林中至少24小時(shí)。
6.細(xì)胞分化。細(xì)胞離心涂片制劑通過DiffQuik方法(15秒順次浸入固定劑、1％曙紅Y、1％天藍(lán)A、和去離子水中)進(jìn)行染色。載玻片隨后進(jìn)行脫水和固定。在2個(gè)分開高倍(400x)視野中人工計(jì)數(shù)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目。
7.免疫組織化學(xué)。某些福爾馬林固定樣品用于β6的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。內(nèi)源性過氧化物酶活性用3％過氧化氫在甲醇中猝滅15分鐘，且抗原恢復(fù)通過應(yīng)用Digest-A113Pepsin(Zymed，South San Francisco)5-7分鐘來完成。根據(jù)制造商的說明書使用抗生物素蛋白/生物素阻斷溶液(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。用0.5％酪蛋白溶液阻斷15分鐘。由克隆到人IgG內(nèi)的小鼠抗β6mAb可變區(qū)組成的抗β6單克隆抗體ch2A1(Biogen Idec)，以在0.1％BSA中1∶500的稀釋度于室溫使用1小時(shí)。檢測(cè)使用Vectastain ABC試劑盒(VectorLaboratories)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)用抗人次級(jí)抗體來完成。色原體產(chǎn)生使用DAB試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)來完成，隨后為蘇木精復(fù)染。操作特異性通過在常規(guī)進(jìn)行的平行處理切片中省略初級(jí)抗體，和通過在來自Itgb6-/-小鼠的肺切片上、產(chǎn)生陰性結(jié)果的預(yù)測(cè)試來證實(shí)。
5.肺切片、三色染色、和纖維化百分比測(cè)定。福爾馬林固定、石蠟包埋的肺橫斷切開至5微米厚度。肺切片通過視覺估計(jì)在門處或附近獲得。載玻片進(jìn)行去石蠟化至去離子水(二甲苯浴x 2，各3分鐘，100％乙醇x 2，各3分鐘，95％乙醇x 2，各3分鐘，70％乙醇x 3，各3分鐘，去離子水x 3分鐘)。切片用Masson′s三色染色法(Bouin′s溶液過夜至媒染劑，Weigert′s鐵蘇木精5分鐘，Biebrich′s猩紅酸Fucshin5分鐘，磷鎢酸/磷鉬酸溶液5分鐘，苯胺藍(lán)溶液5分鐘，在中間去離子水漂洗，和1％乙酸2分鐘)進(jìn)行染色。玻片隨后進(jìn)行脫水(70％乙醇，95％乙醇，100％乙醇，和二甲苯)，且使用Permount進(jìn)行固定。
使用由Haston等人(Cancer Res 2002，62372-8)描述的纖維化百分比技術(shù)。獲得三色染色肺切片的低倍(2-3X)圖像且以數(shù)字形式保存。通過光顯微術(shù)進(jìn)行肺切片的高倍(100-200X)人工檢查，以鑒定纖維化區(qū)域(由膠原沉積增加和結(jié)構(gòu)喪失來定義)。使用NIH Image 1.62軟件在數(shù)碼圖像上描繪肺切片的纖維化橫斷面積連同橫斷總面積輪廓。纖維化面積總和除以肺總面積以確定纖維化百分比。當(dāng)與10個(gè)隨機(jī)切片比較時(shí)，肺的1個(gè)隨機(jī)橫切面已顯示反映整個(gè)肺中的纖維化百分比(Haston，Amos等人1996)。
9.羥脯氨酸測(cè)定法。羥脯氨酸含量測(cè)量由Reddy和Enwememka的方法修改。取出右肺并進(jìn)行稱重。肺組織(約20mg凈重)在400μl 2NNaOH溶液中溫育12小時(shí)(室溫)，隨后均質(zhì)化。組織勻漿和標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸溶液通過加熱至120℃30分鐘進(jìn)行水解。將氯胺T溶液(0.056M，450μl)加入50μl水解產(chǎn)物中，且允許氧化進(jìn)行25分鐘。加入Ehrlich′s試劑(1M，500μl)且允許顏色于65℃發(fā)展20分鐘。隨后測(cè)量550nm處的吸光度。終濃度表示為μg羥脯氨酸/mg凈肺組織。
10.RV/LV質(zhì)量比測(cè)量。用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)的小鼠在輻射后32周時(shí)被處死的股中；另外7只未受照射的C57BL/6小鼠用作對(duì)照。來自被照射小鼠的心臟來自在28-32周之間死亡的小鼠或存活至32周時(shí)被處死的小鼠。將心臟固定在福爾馬林中。在解剖顯微鏡下，取出心房，且解剖不含左心室和隔膜(LV)的右心室游離壁(RV)。對(duì)每片心室組織進(jìn)行稱重，且計(jì)算比率。7只未受照射的C57BL/6小鼠用作對(duì)照。
11.統(tǒng)計(jì)學(xué)。對(duì)于非參數(shù)數(shù)據(jù)使用曼-懷二氏檢驗(yàn)進(jìn)行組之間的纖維化百分比差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。記錄死亡日期且用于產(chǎn)生卡普蘭-邁耶曲線。個(gè)別組比較以及卡普蘭-邁耶曲線總比較使用時(shí)序(Mantel-Cox)檢驗(yàn)來進(jìn)行。報(bào)道測(cè)量平均值與相應(yīng)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤或標(biāo)準(zhǔn)差。為了比較RV/LV質(zhì)量比測(cè)量的平均值，使用斯氏t檢驗(yàn)(未配對(duì)，2尾)。使用弗氏精確檢驗(yàn)比較Itgb6-/-和Itgb6+/+小鼠中纖維化的存在或不存在。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為p＜0.05。
結(jié)果 1.鼠類RILF需要αvβ6表達(dá)在胸部輻射后比較Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠。這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為比較基線時(shí)和輻射后的αvβ6表達(dá)，且測(cè)定αvβ6缺乏是否預(yù)防纖維化。在28周之前的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上和在28周時(shí)照射Itgb6-/-和Itgb6+/+小鼠且將其處死。
(a)β6在照射后18-20周時(shí)上調(diào)。如通過免疫組織化學(xué)測(cè)量的，在照射后18周前被處死的小鼠具有正常、低αvβ6表達(dá)。然而，在18周時(shí)，可見遍及肺泡上皮廣泛增加表達(dá)的β6(圖42)。
(b)高αvβ6表達(dá)在纖維化區(qū)域中持續(xù)。與照射后的時(shí)間無關(guān)，在纖維化損害內(nèi)的上皮細(xì)胞中一貫地觀察到高水平的αvβ6表達(dá)(圖43)。
然而，在18周時(shí)注意到的廣泛增加表達(dá)的αvβ6在稍后時(shí)間點(diǎn)上通常更不明顯(圖43，比較24周和27周)。
(c)缺乏αvβ6的小鼠不發(fā)展RILF。在對(duì)照小鼠中，纖維化區(qū)域可以辨別的最早時(shí)間點(diǎn)是照射后20-22周(未顯示)。纖維化區(qū)域一般是良好區(qū)分和胸膜下的。在來自照射后27周被處死的Itgb6-/-小鼠的肺切片中沒有發(fā)現(xiàn)任何纖維化區(qū)域(N＝17)。相比之下，在來自21/23Itgb6+/+小鼠的切片中發(fā)現(xiàn)纖維化區(qū)域，這是統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(p＜0.001，雙尾費(fèi)氏精確檢驗(yàn))(圖44)。來自Itgb6+/+小鼠(照射后27周)切片的纖維化區(qū)域的平均百分比是17％+/-3％。通過測(cè)量來自照射后27周Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠的肺的羥脯氨酸含量證實(shí)組織學(xué)發(fā)現(xiàn)(圖45)。
(d)αvβ6缺乏不影響肺照射后的存活。14Gy胸部輻射后，死亡率直至照射后18周時(shí)是可以忽略的，且在照射后約25周時(shí)達(dá)到50％。在Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠的存活曲線之間沒有顯著差異(圖46)。
2.3G9(0.3、1和1，10mg/kg/周腹膜內(nèi)給藥)和可溶性TGFβR在鼠類RILF模型中的效應(yīng)。先前研究指出RILF依賴于αvβ6整聯(lián)蛋白的表達(dá)，和缺乏αvβ6不會(huì)使照射后的死亡率惡化。對(duì)于αvβ6的需求與其作為潛伏TGFβ1激活物的已知功能一致。這些結(jié)果還暗示αvβ6抑制作為抗纖維化策略的可行性。為了測(cè)試這個(gè)想法，和證實(shí)RILF鼠類模型是TGFβ依賴性的，用對(duì)照Ab-可溶性TGFβ受體，或3種3G9劑量之一處理被照射的小鼠(N＝27/組)。較少數(shù)目的小鼠(N＝15)單獨(dú)用PBS注射(200μl)進(jìn)行處理。3G9以0.3、1和10mg/kg的劑量使用，對(duì)照Ab以10mg/kg使用和可溶性TGFβ受體以5mg/kg使用。處理在照射后15周時(shí)(αvβ6上調(diào)前約3周)開始，且每周繼續(xù)1次直至照射后26周處死時(shí)(關(guān)于細(xì)節(jié)參見方法)。
(a)3G9和可溶性TGFβ受體減少纖維化。所有存活小鼠在照射后26周時(shí)被處死。盡管與對(duì)照比較0.3-mg/kg組沒有顯示纖維化％減少，但1-mg/kg組纖維化顯著減少。盡管可溶性TGFβ受體和10-mg/kg組同樣顯示比對(duì)照更少的纖維化，但在僅被處死的小鼠的分析中這個(gè)結(jié)果沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖47)。可能在計(jì)劃處死時(shí)間點(diǎn)之前死亡的小鼠在生物學(xué)上不同于存活小鼠。因此對(duì)在研究期間死亡或被處死的所有小鼠進(jìn)行類似分析。當(dāng)考慮所有小鼠(被處死和在處死前瀕死的小鼠)時(shí)，與對(duì)照比較在1-mg/kg、10-mg/kg和可溶性TGFβ受體組中存在明顯更少的纖維化。與對(duì)照比較0.3-mg/kg組再次沒有顯著差異(圖48)。
(b)10-mg/kg劑量的3G9引起嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞性肺泡炎。與對(duì)照比較，在10-mg/kg組中對(duì)所有被處死的小鼠進(jìn)行的BAL顯示嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比增加(圖49)。其他組沒有顯示類似增加。
(c)經(jīng)由較低劑量抗體的αvβ6阻斷不影響肺照射后的存活。當(dāng)比較所有組時(shí)，在存活中沒有顯著差異(p＝0.088；通過時(shí)序Mantel-Cox檢驗(yàn)比較所有組)。然而，在10-mg/kg組中朝向死亡率增加的趨勢(shì)很明顯(圖50)。如果只比較10-mg/kg/周和對(duì)照組(即，沒有關(guān)于多重比較的校正)，那么存活曲線之間的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的。
3.3G9(1、3、6和10mg/kg/周皮下給藥)在鼠類RILF模型中的效應(yīng)。先前研究指出鼠類模型中的RILF是TGFβ介導(dǎo)的，且經(jīng)由1mg/kg和10mg/kg劑量的3G9顯著減少。然而，在10-mg/kg劑量時(shí)存在增加的肺泡炎癥和朝向死亡率增加的趨勢(shì)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估了稍后時(shí)間點(diǎn)(高達(dá)照射后32周)上的纖維化，以測(cè)試3G9處理僅僅使RILF發(fā)作延遲數(shù)周而不是預(yù)防它的可能性。同樣，為了更好地限定1和10-mg/kg劑量之間肺泡炎癥和可能地存活中的差異，測(cè)試1-10mg/kg之間的另外劑量。照射了270只小鼠且將其分成相等的組以接受4種3G9劑量之一(1、3、6和10mg/kg)或?qū)φ誂b(10mg/kg)。處理在照射后15周時(shí)開始，且每周繼續(xù)1次至稍后的處死日期。該實(shí)驗(yàn)用間隔約1個(gè)月被照射的2組小鼠來進(jìn)行。在一個(gè)組中，在它們存活至照射后28周時(shí)(組1)，開始處理的小鼠被處死，和在另一個(gè)組中，在它們存活至32周時(shí)(組2)?？贵w皮下給予(不是與先前實(shí)驗(yàn)中一樣的腹膜內(nèi))。
(a)1、3、6和10mg/kg劑量的3G9減少纖維化。與對(duì)照比較，在接受3G9的所有組中觀察到纖維化水平顯著減少(p＜0.01)。這些差異對(duì)于被發(fā)現(xiàn)死亡或垂死的小鼠、在最后時(shí)間點(diǎn)上被處死的小鼠、和所有組合的小鼠是顯著的(圖51)。
(b)劑量較高的3G9引起嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞性肺泡炎。與對(duì)照比較，在3-mg/kg、6-mg/kg和10-mg/kg組中，對(duì)所有被處死的小鼠(N＝101)進(jìn)行的BALs顯示更高百分比的嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(圖52)(p＜0.02)。同樣，與1-mg/kg組比較，在10-mg/kg組中存在顯著更高的百分比(p＜0.001)。定性地，在更高劑量時(shí)可見“泡沫狀”巨噬細(xì)胞(與在Itgb6-/-小鼠中可見的那些相同)和細(xì)胞碎片數(shù)量增加(圖53)。
(c)劑量6mg/kg的3G9與存活減少相關(guān)。與1-mg/kg和3-mg/kg組比較，對(duì)照組之間在死亡率中沒有差異(圖54和55)。然而，與對(duì)照比較，在6-mg/kg組中死亡率明顯更高(p＜0.05)。與對(duì)照小鼠比較，10-mg/kg組沒有存活減少。6-mg/kg/周3G9組在28周處死(組1)和32周處死(組2)股中具有更差的存活，盡管差異在28周組中更顯著(圖54和55)。
(d)肺照射對(duì)RV/LV質(zhì)量比和肺灌注的影響。先前研究暗示在肺照射后纖維化期間的死亡是由于呼吸性窘迫，所述呼吸性窘迫起因于空隙梗阻(主要是由于纖維化)和肺泡灌流喪失的組合(Sharplin和Franko1989)。灌注喪失應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓過高和右心室肥大，和增加的RV質(zhì)量已在這種模型中被報(bào)道。測(cè)量了存活至32周的小鼠和相同股中在28-32周之間死亡的小鼠的RV/LV質(zhì)量比。與存活小鼠和未受照射的小鼠比較，死亡小鼠具有顯著增加的RV/LV比(圖56)。此外，在死亡的某些小鼠中，注意到肺泡壁中完全缺乏紅細(xì)胞的不同區(qū)域，這個(gè)發(fā)現(xiàn)指示肺泡灌流的完全喪失(圖57)。
討論 TGFβ已知為促纖維化介質(zhì)。先前工作顯示整聯(lián)蛋白αvβ6激活潛伏TGFβ1和TGFβ3，和Itgb6-/-小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。本文呈現(xiàn)的結(jié)果指出Itgb6-/-小鼠也被保護(hù)不受輻射誘導(dǎo)的肺纖維化。這些結(jié)果提供了靶向αvβ6整聯(lián)蛋白的抗纖維化治療原理。
在這些研究中發(fā)現(xiàn)以1mg/kg/周和更高劑量施用的3G9一貫地且有效減少RILF。更高的劑量，特別是6-10mg/kg/周的劑量與BAL流體中嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比增加相關(guān)。這些變化與Itgb6-/-小鼠的表型一致，且暗示這些3G9劑量抑制αvβ6介導(dǎo)的TGFβ活化至動(dòng)物表型模擬敲除的程度。
此外，更高的3G9劑量不定地與鼠類RI LF模型中的存活減少相關(guān)。在第一種試驗(yàn)中，使用10-mg/kg/周劑量存在死亡率增加的強(qiáng)烈趨勢(shì)，而在用1或0.3mg/kg/周處理的小鼠中則沒有。在第二種試驗(yàn)中，在6-mg/kg/周組中存在死亡率增加，而在其他組中則沒有(包括10mg/kg/周)。盡管劑量/應(yīng)答中的差異原因不明，但一般結(jié)果是在測(cè)試的最高劑量時(shí)存活減少的趨勢(shì)。
在RILF模型中發(fā)生的死亡看起來是由于呼吸性窘迫。死亡率是品系依賴性和性別依賴性的(Haston，Zhou等人2002)。鼠類RILF模型中的肺機(jī)能障礙和死亡率的原因已被廣泛研究(Sharplin和Franko 1989)。這個(gè)研究的作者得出結(jié)論肺灌注在輻射后減少，且這種缺乏可能促成死亡率。在輻射誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，對(duì)輻射誘導(dǎo)的肺纖維化有抵抗力的小鼠同樣具有減少的存活。這些小鼠中的肺灌注減少已發(fā)現(xiàn)是促成其在這種模型中死亡的主因。灌注缺乏模式取決于品系。在有纖維化趨向的小鼠中，灌注的完全喪失(如通過膠體碳的存在或不存在判斷的，所述膠體碳在處死前30秒靜脈內(nèi)注入)限制于纖維化區(qū)域和鄰近纖維化損害的偶然小區(qū)域。此外，與未受照射的對(duì)照比較，在被照射小鼠灌注區(qū)域的碳量中存在更大的區(qū)域至區(qū)域(region-to-region)變異性，暗示具有減少但并非缺乏灌注的大量區(qū)域。在多個(gè)小鼠品系中可見的肺灌注喪失的其他證據(jù)是無損害肺中的小血管數(shù)目減少，和如通過RV/LV厚度比評(píng)估的RV肥大。肺泡壁中的紅細(xì)胞數(shù)目(評(píng)估灌注的不同方法)在被照射的小鼠(A/J品系)中也是減少的。大多數(shù)C57BL/6小鼠沒有胸膜滲漏。除了C57BL/10J品系外，心肌損傷沒有由于照射而發(fā)生。
關(guān)于死亡率的觀察與Sharplin和的Franko更廣泛的觀察一致。在對(duì)照小鼠中，纖維化的量在死亡小鼠中大于存活至處死的那些(圖51)，暗示更大的肺機(jī)能障礙與死亡相關(guān)。死亡的小鼠具有右心室肥大(定義為RV/LV質(zhì)量指數(shù)增加)，而存活至處死的小鼠則沒有(圖56)，這個(gè)觀察暗示肺灌注喪失與死亡相關(guān)。在被發(fā)現(xiàn)死亡的某些小鼠中，肺泡壁中缺乏紅細(xì)胞的肺區(qū)域在組織學(xué)切片上是明顯的(圖57)，與那些區(qū)域中的灌注完全喪失一致，且與先前描述一致(Sharplin和Franko 1989)。沒有發(fā)現(xiàn)將是死亡原因的食道機(jī)能障礙(瘢痕化、穿孔)的證據(jù)，也沒有發(fā)現(xiàn)心肌壞死。依據(jù)先前工作解釋的，我們的證據(jù)暗示即使當(dāng)纖維化被阻止時(shí)，肺灌注喪失也在C57BL/6小鼠中發(fā)生，和肺灌注喪失而不是纖維化是造成死亡的原因。還注意到小鼠更可能在注射(對(duì)照Ab或3G9)后的2天期間死亡，暗示處理應(yīng)激和來自注射的可能額外流體量，促進(jìn)臨界小鼠死亡。
盡管通過遺傳除去喪失αvβ6不影響這種模型中的死亡率，但與用較低劑量的3G9或?qū)φ誂b處理的小鼠比較，高劑量的3G9(6-10mg/kg/周)與較早期的死亡相關(guān)。最明顯的解釋是較高劑量的3G9使死亡率惡化。然而，不能排除對(duì)照Ab和較低劑量的3G9實(shí)際上改善存活的可能性。關(guān)于3次實(shí)驗(yàn)至50％存活的時(shí)間比較看起來顯示了2個(gè)組。在腹膜內(nèi)實(shí)驗(yàn)中野生型和Itgb6-/-小鼠(圖46)、PBS處理和10-mg/kg/周3G9處理小鼠(圖50)，以及皮下實(shí)驗(yàn)中6-mg/kg/周3G9處理小鼠(圖54)的平均存活時(shí)間為～22.5-25周，而所有其他處理組的平均存活時(shí)間為～24.5-30周(圖50和54)。關(guān)于這點(diǎn)的確定結(jié)論是不可能的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件不同和其他條件可能已在實(shí)驗(yàn)之間改變，引起基線死亡率變化。在用6-10mg/kg/周的3G9處理的小鼠中，在解剖時(shí)肉眼檢查小鼠或在肺組織學(xué)上沒有發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致存活變化的新異常(除肺炎癥外)。RILF模型中較低和較高劑量3G9之間的存活差異原因仍不明了。
這些研究支持下述結(jié)論推測(cè)不會(huì)最大限度減少αvβ6介導(dǎo)的TGFβ活化的較低劑量3G9，安全地預(yù)防鼠類RILF模型中的肺纖維化。
參考文獻(xiàn) Abratt，R.P.，G.W.Morgan，等人(2004).″Pulmonarycomplications of radiation therapy.″Clin Chest Med 25(1)167-77.Annes，J.P.，J.S.Munger，等人(2003).″Making sense of latentTGF βactivation.″J Cell Sci 116(Pt 2)217-24. Annes，J.P.，D.B.Rifkin，等人(2002).″The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβ3.″FEBS Lett 511(1-3)65-8. Chapman，H.A.(2004).″Disorders of lung matrix remodeling.″J Clin Invest 113(2)148-57. Franlco，A.J.，G-K.Nguyen，等人(1996).″A comparison ofthe ultrastructure of perfusion-deficient and functional lungparenchyma in CBA mice during the late phase after irradiation.″Radiat Res 146(5)586-9. Franko，A.J.和J.Sharplin(1994).″Development of fibrosisafter lung irradiation in relation to inflammation and lungfunction in a mouse strain prone to fibrosis.″Radiat Res 140(3)347-55. Hasten，C.K.，C.I.Amos，等人(1996)″Inheritance ofsusceptibility to bleomycin-induced pulmonary fibrosis in thelung.″Cancer Res 56(11)2596-601. Haston，C.K.，X.Zhou，等人(2002).″Universal andradiation-specific loci influence murine susceptibility toradiation-induced pulmonary fibrosis.″Cancer Res 62(13)3782-8. Martin，M.，J.Lefaix，等人(2000).″TGF-β1and radiationfibrosisa master switch and a specific therapeutic target？″IntJ Radiat Oncol Biol Phys 47(2)277-90. Movsa s，B.，T.A.Raffm，等人(1997).″Pulmonary radiationinjury.″Chest 111(4)1061-76. Mu，D.，S.Cambier，等人(2002).″The integrin αv β8mediatesepithelial homeostasis through MT1-MMP-dependent activation ofTGF-betal.″J Cell Biol 157(3)493-507. Munger，J.S.，X.Huang，等人(1999).″The integrin αv β6binds and activates latent TGFβ1a mechanism for regulatingpulmonary inflammation and fibrosis.″Cell 96(3)319-28. Sharplin，J.and A.J.Franko(1989).″A quantitativehistological study of strain-dependent differences in the effectsof irradiation on mouse lung during the intermediate and latephases.″Radiat Res 119(1)15-31. Weinreb，P.H.，K.J.Simon，等人(2004).″Function-blockingintegrin αvβ6 monoclonal antibodiesdistinct ligand-mimeticand nonligand-mimetic classes.″J Biol Chem 279(17)17875-87. 實(shí)施例16抗αvβ6整聯(lián)蛋白單克隆抗體在肺纖維化博來霉素模型中的功效 概述 用于肺纖維化的目前治療在很大程度上是無效的且非常需要開發(fā)新型療法。由于TGF-β在驅(qū)動(dòng)特征為肺纖維化的許多病理過程中的關(guān)鍵作用，所以阻斷TGF-β途徑的試劑是特別感興趣的，所述病理過程包括成纖維細(xì)胞活化和增殖、和細(xì)胞外基質(zhì)分子表達(dá)。除了其促纖維化活性外，TGF-β是重要的抗炎細(xì)胞因子，且因此TGF-β的治療抑制應(yīng)當(dāng)理想地阻斷纖維化而不促進(jìn)過度炎癥。先前工作已顯示整聯(lián)蛋白αvβ6是體內(nèi)TGF-β活化的關(guān)鍵介質(zhì)，特別是在肺中。αvβ6與細(xì)胞外間隙中的潛伏TGF-β復(fù)合物直接結(jié)合，且在許多情況下這種結(jié)合是活性形式釋放所需的。由于肺中TGF-β信號(hào)受損，對(duì)于αvβ6缺陷的小鼠具有輕度肺部炎癥，且對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化有抵抗力。已開發(fā)了阻斷αvβ6與潛伏TGF-β結(jié)合且抑制TGF-β活化和后續(xù)信號(hào)的單克隆抗體。在本文中我們證實(shí)這些抗體在小鼠中減少博來霉素誘導(dǎo)纖維化中有效。如通過支氣管肺泡灌洗中的炎癥細(xì)胞數(shù)目測(cè)量的，進(jìn)一步顯示在減少肺膠原表達(dá)中接近最大的功效可以在不產(chǎn)生另外炎癥的劑量時(shí)達(dá)到。與αvβ6缺陷小鼠中可見的一致，同樣減少纖維化的更高劑量抗體可以減少炎癥。這些發(fā)現(xiàn)表明阻斷性αvβ6介導(dǎo)的TGF-β的促炎和抗纖維化效應(yīng)在這種模型中是可分離的，和纖維化抑制在比促炎效應(yīng)更低的劑量時(shí)發(fā)生。
引言 TGF-β1細(xì)胞因子對(duì)于纖維化起始和維持是關(guān)鍵的，所述纖維化是特征為用過量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)替換患病組織且最終導(dǎo)致器官瘢痕化和衰竭的病理過程。TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和成肌纖維細(xì)胞活化，這負(fù)責(zé)分泌ECM和維持纖維化過程進(jìn)展[1-6]。TGF-β1在組織重塑事件中起良好調(diào)節(jié)的作用，所述組織重塑事件在創(chuàng)傷愈合期間發(fā)生；然而，在許多疾病中這種組織重塑過程變得異常且特征在于TGF-β信號(hào)上調(diào)延長(zhǎng)、過量成纖維細(xì)胞積聚、ECM沉積、和瘢痕化。TGF-β1在體內(nèi)纖維化進(jìn)展中的重要性已通過功能獲得研究以及經(jīng)由阻斷來顯示[1，7-12]。在肺中腺病毒和轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)的各種細(xì)胞因子已顯示，在不存在顯著炎癥的情況下TGF-β1在其促進(jìn)纖維化的能力方面是獨(dú)特的。促進(jìn)纖維化的其他細(xì)胞因子通常通過上調(diào)組織中的TGF-β1表達(dá)來達(dá)到這點(diǎn)。此外，研究已顯示對(duì)SMAD3缺陷的敲除小鼠對(duì)肺纖維化發(fā)展有抵抗力，所述SMAD3是TGF-β信號(hào)的介質(zhì)[13]。使用抗TGF-β試劑的許多研究顯示在疾病模型中不受纖維化的顯著保護(hù)[8，9，11，14-17]。因此，TGF-β1已鑒定為用于治療與纖維化病理狀態(tài)相關(guān)疾病的潛在治療靶。
αvβ6整聯(lián)蛋白已鑒定為TGF-β1活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。TGF-β1合成為被切割的潛伏蛋白質(zhì)，且與N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP與鼠類活性C末端TGF-β細(xì)胞因子非共價(jià)結(jié)合。潛伏TGF-β1復(fù)合物不能與其同類受體結(jié)合且因此保持生物學(xué)無活性，直至通過幾種可替代機(jī)制之一轉(zhuǎn)變成活性形式，所述可替代機(jī)制包括通過蛋白酶切割、暴露于低pH或電離輻射、和潛伏復(fù)合物中的構(gòu)象變化允許其與其同類受體結(jié)合[18-21]。αvβ6整聯(lián)蛋白與潛伏TGF-β1復(fù)合物中的RGD基序結(jié)合，且使其轉(zhuǎn)變成活性形式[18，22-25]。盡管關(guān)于TGF-β活化的幾種其他機(jī)制已被鑒定，但在beta6整聯(lián)蛋白缺陷小鼠(β6無效小鼠)中的研究暗示αvβ6介導(dǎo)的TGF-β活化是肺和腎中纖維化發(fā)展所必需的[18，26]。αvβ6在正常成人組織中以低或無法檢測(cè)的水平表達(dá)，但在炎性/纖維化疾病中強(qiáng)烈上調(diào)，且一般限制于上皮細(xì)胞[27-30]。因此，在組織損傷期間上皮細(xì)胞中的αvβ6表達(dá)上調(diào)提供了用于增加TGF-β局部活化和在旁觀者細(xì)胞中的后續(xù)TGF-β依賴性事件的機(jī)制。阻斷αvβ6[31]配體結(jié)合提供了用于使TGF-β活化特異性局部限制在其中αvβ6表達(dá)上調(diào)的組織中的方法。這種方法提供了減少與TGF-β途徑總體抑制相關(guān)的臨床安全風(fēng)險(xiǎn)的可能性。
在本文描述的研究中，顯示αvβ6在與炎癥和纖維化病理狀態(tài)，包括特發(fā)性肺纖維化(IPF)相關(guān)的人肺病中是顯著上調(diào)的。先前研究已表明缺乏αvβ6功能的β6無效小鼠被保護(hù)不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[18]。在本文中顯示在各種小鼠品系中且通過纖維化的許多不同測(cè)量，阻斷配體結(jié)合和αvβ6的TGF-β活化功能的單克隆抗體有效抑制博來霉素誘導(dǎo)的纖維化。進(jìn)一步表明肺泡細(xì)胞群體在博來霉素?fù)p傷的肺中在低有效劑量時(shí)不改變，且因此如預(yù)期的，抗纖維化作用的機(jī)制不通過抑制炎癥來介導(dǎo)。只有使用高的頻繁給藥具有在這種模型中已注意到的另外炎癥，與β6無效小鼠中另外炎癥的發(fā)現(xiàn)一致。
材料和方法 1.試劑。αvβ6mAbs如本文其他地方所述和先前所述[31]產(chǎn)生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分別的親本雜交瘤總RNAs產(chǎn)生，其中恒定區(qū)引物CDL-739用于重鏈和CDL-738用于輕鏈，使用First StrandcDNA合成試劑盒(Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ)。重和輕鏈可變區(qū)基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用用于cDNA合成的相同3′引物、和對(duì)大多數(shù)鼠類抗體基因信號(hào)序列(在檢索后可獲得的序列)特異的簡(jiǎn)并引物庫(kù)、以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)。將克隆的重和輕鏈可變區(qū)連接到具有人IgG1恒定區(qū)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。重組可溶性鼠類TGF-β受體II型-Ig融合蛋白(sTGF-bRII-Ig)如先前所述[32]產(chǎn)生。在所有實(shí)驗(yàn)中使用研究級(jí)mu3G9、1E6和sTGF-bRII-Ig(在磷酸鹽緩沖鹽水中的純化蛋白質(zhì))。
2.動(dòng)物。
小鼠。對(duì)于使用肺羥脯氨酸作為終末點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)使用SV129小鼠(Sheppard Laboratory，UCSF)。對(duì)于使用組織形態(tài)測(cè)定術(shù)或BAL收集和分析作為終末點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)使用C57B16小鼠(Biogen Idec)。對(duì)于膠原基因表達(dá)作為終末點(diǎn)的定量分析，使用轉(zhuǎn)基因報(bào)道小鼠(Biogen Idec)。攜帶在colIα2基因啟動(dòng)子的17kb區(qū)域控制下的螢光素酶報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因小鼠先前已被描述[33]。通過使轉(zhuǎn)基因雄性與C57B1/6X DBA/2F1雜種雌性(Jackson Laboratories)交配來維持這些小鼠。選擇對(duì)于轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性(如通過尾螢光素酶表達(dá)所評(píng)估的)的后代用于下文概述的博來霉素攻擊實(shí)驗(yàn)。
倉(cāng)鼠(Giri Laboratory)。重量為90-100g的雄性金黃色敘利亞倉(cāng)鼠購(gòu)自Simonsens，Inc.(Gilroy，CA)。倉(cāng)鼠以4只的組飼養(yǎng)在具有濾過空氣以及恒溫和恒濕的實(shí)驗(yàn)室中。所有管理依照國(guó)立衛(wèi)生研究院動(dòng)物福利活動(dòng)健康指南(National Institutes of Health Guide forAnimal Welfare Act)。在任何處理前允許倉(cāng)鼠在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)1周。維持12小時(shí)光/暗循環(huán)。
3.免疫組織化學(xué)。將小鼠肺收集到10％緩沖的福爾馬林中且依照通常實(shí)踐進(jìn)行加工用于石蠟組織學(xué)。來自具有纖維化病理狀態(tài)的肺病患者肺的石蠟組織切片得自G.Davis(U.Vermont)、R.Lafyatis(BostonUniversity)、Ardais Corp.(Lexington，MA)和Asterand Inc.(Detroit，MI)。將組織切片在二甲苯和乙醇中去石蠟化、在蒸餾水中再水合、且隨后浸入包含0.45％H2O的甲醇中。組織與胃蛋白酶(00-3009，Zymed，San Francisco，CA)一起溫育，且用抗生物素蛋白和生物素(SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封閉。初級(jí)抗體在包含0.1％BSA的PBS中稀釋，且使組織于4℃溫育過夜。對(duì)于小鼠組織，切片與人/小鼠嵌合型抗αvβ6mAb-2A1[31]，和抗人生物素化次級(jí)抗體(PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起溫育。
對(duì)于人組織，切片與鼠類2A1[31]和抗小鼠-生物素化次級(jí)抗體(PK-6102，Vector Laboratories)一起溫育。將抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物-辣根過氧化物酶(Vector Kit，PK-6102)應(yīng)用于切片、在室溫下溫育30分鐘，且如示的(SK-4100，Vector Laboratories)制備3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，且于室溫應(yīng)用于切片5分鐘。組織切片用Mayer′s Hematoxylin染色1分鐘且在水和PBS中漂洗。所有人組織樣品在地方檢查機(jī)構(gòu)同意和患者同意下獲得。
3.1在小鼠中的博來霉素滴注。
SV129品系(D.Sheppard，UCSF)。如先前所述[18]，小鼠用博來霉素或鹽水滴注到氣管內(nèi)。簡(jiǎn)言之，將年齡和性別相配的8-12周大的129/ter SVEMS品系小鼠維持在無特異病原體的環(huán)境中。將博來霉素(Mead Johnson，Princeton，NJ)溶解于無菌鹽水中(在60ml中0.03或0.05單位)。博來霉素或鹽水通過直接切斷在甲氧氟烷麻醉下經(jīng)氣管施用。
C57B1/6品系和膠原報(bào)道小鼠(Biogen IDEC)。通過用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪腹膜內(nèi)注射來麻醉小鼠。使用無菌#15解剖刀在頸部進(jìn)行0.5-1.0cm中線切口以暴露氣管用于目測(cè)。氣管暴露和通過口腔在氣管中放置噴霧尖端后，用Penn Century微噴射裝置滴注博來霉素。在對(duì)照動(dòng)物中滴注鹽水。滴注后，手術(shù)位點(diǎn)用無菌閉合夾來關(guān)閉。對(duì)于術(shù)后痛皮下施用丁丙諾啡0.05mg/kg。
多種處理方案在這些小鼠博來霉素研究中用于評(píng)估測(cè)試物品且因此將在結(jié)果部分描述。
3.2在倉(cāng)鼠中的博來霉素滴注。在戊巴比妥麻醉下，在第0、7和14天時(shí)倉(cāng)鼠用鹽水(SA；4ml/kg)或博來霉素(BL；6.5U/4ml/kg)進(jìn)行IT滴注。動(dòng)物隨機(jī)分成6個(gè)實(shí)驗(yàn)組SA-滴注，用PBS處理(SA+PBS)；BL-滴注，用PBS處理(BL+PBS)；BL-滴注，在第0天時(shí)開始用mu3G9處理(BL+Ab1)；BL-滴注，在第7天時(shí)開始用mu3G9處理(BL+Ab2)；BL-滴注，在第14天時(shí)開始用mu3G9處理(BL+Ab3)；和BL-滴注，在第0天時(shí)開始用1E6處理(BL+1E6)。動(dòng)物在第28天時(shí)被處死，且取出其肺并加工用于羥脯氨酸和脂質(zhì)過氧化測(cè)定法。
4.關(guān)于膠原含量的羥脯氨酸測(cè)定法。肺在玻璃管(Fisher#14961)的1ml dH2O中進(jìn)行均質(zhì)化。將125μl 50％三氯乙酸(TCA)加入組織勻漿中且在冰上溫育20分鐘。樣品在1000rpm和4℃下離心5分鐘。棄去上清液，且將1ml 12N HCL加入玻璃管的團(tuán)塊中。樣品隨后于110℃烘焙24小時(shí)(在玻璃燒杯中)。干燥團(tuán)塊用2ml dH2O復(fù)原。制備從0.25mg/ml開始的6個(gè)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(Sigma-H6002)。在包含500μl氯胺T(在0.5M乙酸鈉和10％異丙醇中的1.4％氯胺T)的1.5mlEppendorf管中，加入200μl樣品且在室溫下溫育20分鐘。隨后，加入500μl Ehrlich′s/pDMBA(在70％異丙醇和30％高氯酸中的1Mp-DMBA(p-二甲氨基苯甲醛))，且于65℃溫育15分鐘。將100μl最終反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至96孔板，對(duì)于每個(gè)樣品進(jìn)行一式三份測(cè)量，且在2小時(shí)后于550nm處閱讀樣品。
5.組織學(xué)指數(shù)。對(duì)于使用組織形態(tài)測(cè)定術(shù)作為終末點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)，在處死時(shí)在組織學(xué)上評(píng)估每只小鼠的整個(gè)肺。橫切面被切割且通過標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)用Masson′s Trichrome進(jìn)行染色。選擇橫切面以包括來自每只小鼠肺的多個(gè)葉。進(jìn)行包含完整三色染色切片的高倍(100X)視野攝像(每只小鼠平均約30張)。通過Metamorph 6.0.5軟件評(píng)估每張照片的膠原含量(這在三色染色的組織學(xué)切片中呈現(xiàn)藍(lán)色)。通過顏色閾值選擇藍(lán)色面積，且表示為組織總面積百分比。
6.螢光素酶測(cè)定法。收集肺并在1ml裂解緩沖液(0.1MKH2PO4-ph7.8和1mM DL-二硫蘇糖醇)中進(jìn)行均質(zhì)化。隨后將樣品置于冰上10分鐘，在12,000rpm和4℃下離心10分鐘，且隨后將100μl的每種樣品轉(zhuǎn)移至Wallac Isoplatter。在加入100μl Luclite底物(Perkin Elmer#601911)前，將樣品再次置于冰上15分鐘。隨后在光度計(jì)上閱讀螢光素酶活性。
7.支氣管肺泡(BAL)收集和BAL細(xì)胞差異染色。小鼠用過度劑量的Inactin(Sigma)腹膜內(nèi)注射(IP)實(shí)施安樂死。主要使用鈍器解剖法暴露氣管。隨后用剪刀在2個(gè)軟骨環(huán)之間打開氣管，且將23-計(jì)量鈍頭針插入氣管內(nèi)。通過用Schwartz臨時(shí)夾(Roboz)輕輕夾住使針保持在原位。通過將不含Ca2+或Mg2+的0.8ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)注入肺內(nèi)來進(jìn)行BAL。隨后不應(yīng)用太多壓力將流體收回注射器內(nèi)，且轉(zhuǎn)移到在冰上的15ml聚丙烯Falcon管內(nèi)。隨后重復(fù)該操作，不施加過度負(fù)壓將BAL流體回吸到注射器內(nèi)。將樣品貯藏在冰上且加工用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、分化，且收集BAL團(tuán)塊和流體且貯藏于-80℃。
1.BAL隨后在180g，1000rpm(Beckman GPR)和4℃下在臺(tái)式離心機(jī)上旋轉(zhuǎn)10分鐘。隨后取出上清液(BAL流體)且冷凍于-80℃。將1.0ml RBC裂解溶液(Sigma)加入團(tuán)塊中且渦旋20秒。隨后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞離心涂片。
2.將樣品貯藏于冰上且使用血球計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞施加于血球計(jì)之后和讀數(shù)之前允許1分鐘以允許細(xì)胞沉降。
3.將100μ1細(xì)胞懸浮液在500RPM和室溫下細(xì)胞離心涂片(ThermoShandon)5分鐘。細(xì)胞離心涂片制劑通過將細(xì)胞溶液放置到細(xì)胞離心涂片裝置內(nèi)且在500rpm下旋轉(zhuǎn)5分鐘來制備。檢查細(xì)胞濃度以確保在載玻片上的濃度不是太高。允許載玻片干燥過夜且隨后用DiffQuik(Fisher)染色。根據(jù)制造商的(DiffQuik)方案來進(jìn)行染色。載玻片被干燥且用Permount(Fisher)蓋上蓋玻片后，細(xì)胞通過類型進(jìn)行分類，使用實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Fisher)計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇的100個(gè)細(xì)胞。
8.統(tǒng)計(jì)分析。使用方差分析(ANOVA)在媒介物對(duì)照和/或同種型對(duì)照、和測(cè)試物品之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。當(dāng)使用ANOVA在p＜0.05的概率上確定統(tǒng)計(jì)上顯著的差異時(shí)，通過Dunnet′s多重比較檢驗(yàn)來評(píng)估組間的顯著差異。
結(jié)果 1.αvβ6在人肺病和博來霉素模型中的表達(dá)。在各種人肺病包括纖維化或炎性病理狀態(tài)中上調(diào)的TGF-β表達(dá)和信號(hào)已得到描述[20，34]。然而，αvβ6表達(dá)僅在纖維-炎性肺病的少量樣品中得到描述[28]。已評(píng)估來自具有肺病患者的41個(gè)肺組織樣品中的αvβ6表達(dá)，所述肺病的特征為具有纖維化和/或炎性變化(表16-1)。另外，染色來自癌癥患者肺活檢的表面上正常區(qū)域的肺組織陣列(Imgenex)。αvβ6在正常肺中的表達(dá)通過免疫組織化學(xué)幾乎無法檢測(cè)。在“正?！狈谓M織陣列上的某些組織切片顯示陽(yáng)性αvβ6染色，但那些切片各自同樣具有附近的炎性病理狀態(tài)。在所有41個(gè)患病肺樣品中，具有纖維化和/或炎性變化的肺區(qū)域顯示αvβ6表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)(圖58)。αvβ6局限于覆蓋明顯纖維化的區(qū)域，或鄰近于炎性浸潤(rùn)的區(qū)域中的上皮細(xì)胞。在一系列纖維-炎性疾病中可見上調(diào)的αvβ6的存在，所述纖維-炎性疾病包括特發(fā)性肺纖維化、硬皮病肺病、和慢性阻塞性肺病。
為了使表達(dá)與特異性病理學(xué)變化更好地關(guān)聯(lián)，將染色的組織樣品送給外部受過訓(xùn)練的肺病理學(xué)家。盡管他不能證實(shí)許多商購(gòu)可得樣品(Ardais和Asterand)的病理診斷，但他一貫地指出與非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)比較，“對(duì)于常見間質(zhì)性肺炎可見高得多的αvβ6染色強(qiáng)度”，所述NSIP是與更少的纖維化和更好的預(yù)后相關(guān)的病理狀態(tài)，所述常見間質(zhì)性肺炎是與纖維化和進(jìn)行性疾病相關(guān)的病理狀態(tài)。在來自具有UIP患者的所有活檢中，在內(nèi)襯肺泡管和肺泡的II型和I型肺細(xì)胞內(nèi)可見強(qiáng)烈染色，而大的氣道在很大程度上是陰性的和肺泡內(nèi)的巨噬細(xì)胞是陰性的?？傊?，“高水平的染色與纖維化區(qū)域和UIP相關(guān)”，和在其他纖維化包括NS IP的情況下可見染色強(qiáng)度較低的類似模式。因?yàn)閁IP是具有特發(fā)性肺纖維化(IPF)的患者中占優(yōu)勢(shì)的病理狀態(tài)，所以在具有這種病理狀態(tài)的患者中強(qiáng)烈過度表達(dá)的αvβ6暗示它可能在驅(qū)動(dòng)纖維化進(jìn)展中具有功能作用，所述αvβ6是促纖維化細(xì)胞因子TGF-β的激活物。
2.αvβ6在小鼠博來霉素模型中的表達(dá)。為了證實(shí)αvβ6在肺纖維化博來霉素小鼠模型中也是上調(diào)的，對(duì)于在博來霉素滴注后1、5和15天獲取的組織切片上αvβ6蛋白質(zhì)的存在進(jìn)行免疫染色。在第5天時(shí)，在受博來霉素攻擊損害的肺區(qū)域各處的肺泡上皮上，αvβ6表達(dá)是上調(diào)的(圖59)。在第15天時(shí)，當(dāng)顯著纖維化的區(qū)域明顯時(shí)，αvβ6在這些纖維化區(qū)域的肺泡上皮中更強(qiáng)烈地上調(diào)。
3.在SV129小鼠中通過羥脯氨酸評(píng)估纖維化。在遺傳上對(duì)于αvβ6缺陷(β6無效)的小鼠先前已顯示在SV129小鼠品系中不受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的保護(hù)[18]。嘗試評(píng)估抗αvβ6單克隆抗體mu3G9在這個(gè)相同品系中減少博來霉素誘導(dǎo)的纖維化的功效。在我們合作者UCSF的Dean Sheppard的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行一系列4次實(shí)驗(yàn)(表16-2)。在第0天時(shí)用博來霉素滴注到SV129小鼠氣管內(nèi)，在博來霉素滴注后第0、15或30天時(shí)開始腹膜內(nèi)注射4mg/kg的mu3G9，每周3次。對(duì)照小鼠用PBS或陰性對(duì)照抗體1E6進(jìn)行注射。1E6是針對(duì)人LFA-3的鼠類IgG1抗體，且不與任何小鼠抗原結(jié)合。小鼠在第30或60天時(shí)被處死，且通過羥脯氨酸含量評(píng)估纖維化，所述羥脯氨酸含量是組織總膠原測(cè)量。在4次實(shí)驗(yàn)的3次中，mu3G9處理小鼠中的羥脯氨酸存在統(tǒng)計(jì)上顯著的減少，指示在減少博來霉素誘導(dǎo)的纖維化方面的功效(圖60)。只有當(dāng)處理延遲直至博來霉素滴注后30天時(shí)(圖60C)，與PBS處理或同種型對(duì)照處理小鼠比較，mu 3G9處理小鼠肺中的羥脯氨酸含量沒有顯著減少。
4.在處理46天、博來霉素攻擊小鼠中的存活評(píng)估。在博來霉素模型中的抗纖維化功效一般與存活改善無關(guān)，且因此并未預(yù)期存活在mu3G9處理小鼠中得到改善。然而，因?yàn)閺牡?5天到60天每周3次用4mg/kg mu3G9處理的這些小鼠(圖60D)代表已測(cè)試直至那個(gè)點(diǎn)的最長(zhǎng)處理期(46天)，所以分析以察看在那個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的組的存活中是否存在任何差異。當(dāng)比較用mu 3G9處理的小鼠與用PBS和4B4非阻斷性對(duì)照抗體處理的那些時(shí)，在總體存活中沒有顯著差異(表16-2)。
5.在C57B16小鼠中纖維化的組織形態(tài)測(cè)定術(shù)分析。為了證實(shí)mu3G9在不同小鼠品系和不同實(shí)驗(yàn)室中的抗纖維化功效，在Biogen Idec的一系列實(shí)驗(yàn)中使用C57B16小鼠品系評(píng)估m(xù)u3G9。這種品系經(jīng)常在博來霉素模型中使用，且產(chǎn)生可以在滴注后14天測(cè)量的快速纖維化。在前3次實(shí)驗(yàn)中，小鼠在第0天時(shí)用博來霉素滴注到氣管內(nèi)，在博來霉素攻擊前1天(第-1天)開始用mu3G9每周處理3次，且在第14天時(shí)實(shí)施安樂死用于肺收集。在第4次實(shí)驗(yàn)中，處理延遲直至第14天，且在第28天時(shí)收集肺。在這些實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)中(圖61)，相對(duì)于PBS處理的對(duì)照，mu3G9一貫地減少了纖維化肺組織百分比，所述纖維化肺組織在組織形態(tài)測(cè)定術(shù)上測(cè)量為Masson′s三色染色的組織切片中的藍(lán)色染色區(qū)域。在其中1E6mAb用作陰性IgG對(duì)照的2次實(shí)驗(yàn)之一中，1E6mAb同樣顯著減少纖維化組織百分比(圖61A)。1E6mAb的這種效應(yīng)在使用羥脯氨酸作為終末點(diǎn)的較早期實(shí)驗(yàn)(圖60)和延遲處理(第14-28天)實(shí)驗(yàn)(圖61D)中都沒有觀察到。總之，多次實(shí)驗(yàn)顯示mu3G9mAb在C57B16小鼠中減少由博來霉素誘導(dǎo)的纖維化組織百分比方面的功效。然而，由于組織形態(tài)測(cè)定術(shù)終末點(diǎn)的勞動(dòng)密集性質(zhì)，所以尋找用于測(cè)量纖維化的更快速和定量方法。
6.膠原-螢光素酶報(bào)道轉(zhuǎn)基因作為定量終末點(diǎn)的用途。攜帶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠先前已用于在纖維化模型中提供膠原表達(dá)的定量讀出，在所述轉(zhuǎn)基因中螢光素酶報(bào)道基因在膠原Iα2啟動(dòng)子的控制下表達(dá)[33]；[35]。在14天時(shí)，相對(duì)于鹽水對(duì)照，博來霉素攻擊小鼠中肺螢光素酶水平的增加為約10倍，使得它成為比羥脯氨酸測(cè)量敏感得多的終末點(diǎn)。使用這種系統(tǒng)，進(jìn)行使用每周一次給藥的3G9抗體劑量逐步增加，但包括用4mg/kg處理的小鼠組-在用羥脯氨酸和三色組織形態(tài)測(cè)定術(shù)作為終末點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)中使用每周3次的給藥方案。劑量逐步增加在3次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，其中每次實(shí)驗(yàn)具有PBS處理的對(duì)照組(n＝6、5和6，總共為n＝17)。為了校正螢光素酶測(cè)量中實(shí)驗(yàn)至實(shí)驗(yàn)的變化，關(guān)于每次實(shí)驗(yàn)中所有組的螢光素酶值對(duì)PBS對(duì)照的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。博來霉素攻擊報(bào)道小鼠的mu3G9處理產(chǎn)生膠原螢光素酶報(bào)道分子中的劑量依賴性減少(圖62)，其中在0.3mg/kg的周劑量時(shí)可見顯著功效和在1-3mg/kg時(shí)可見最大功效。
7.支氣管肺泡灌洗細(xì)胞組成分析。分析在第2、5、8和11天時(shí)博來霉素模型的支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞群體，以確定纖維化抑制是由于炎癥減少還是由于肺中炎癥細(xì)胞主要亞群中的改變。如預(yù)期的，當(dāng)與鹽水滴注小鼠比較時(shí)，由于博來霉素的氣管內(nèi)施用存在BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)升高。然而，與用同種型對(duì)照抗體1E6處理的小鼠比較，時(shí)程自始至終在用有效劑量0.3、1.0、和3mg/kg的3G9處理的小鼠中沒有看到BAL細(xì)胞總數(shù)目，以及巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞數(shù)目或百分比中的顯著差異。隨后使用每周3次的處理測(cè)試高得多的劑量，所述高得多的劑量起初已用于顯示用羥脯氨酸和組織形態(tài)測(cè)定術(shù)終末點(diǎn)的功效。在相對(duì)于博來霉素攻擊的-1、+1和+3天時(shí)，小鼠給予4、20和40mg/kg的3種劑量m3G9。小鼠在第5天時(shí)實(shí)施安樂死且分析BAL細(xì)胞含量。在4mg/kg的劑量(12mg/kg總劑量)時(shí)，再一次在BAL細(xì)胞總數(shù)目和巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞數(shù)目或百分比中都沒有顯著變化。在20和40mg/kg劑量(總共60和120mg/kg)時(shí)，相對(duì)于PBS對(duì)照，但不是相對(duì)于IgG1對(duì)照，在巨噬細(xì)胞數(shù)目中存在顯著增加(圖62)。在40mg/kg劑量時(shí)，與PBS和IgG對(duì)照比較時(shí)，BAL中嗜中性粒細(xì)胞百分比存在顯著增加，盡管嗜中性粒細(xì)胞總數(shù)目變化沒有達(dá)到顯著性。在非常高劑量(總共120mg/kg)時(shí)發(fā)生的這種嗜中性粒細(xì)胞增加類似于在輻射纖維化模型中使用高劑量、較長(zhǎng)期處理(6和10mg/kg處理，3-4個(gè)月)可見的那種(參見實(shí)施例15)?？傊?，抗αvβ6抗體在低至0.3mg/kg的周劑量時(shí)能夠減少博來霉素誘導(dǎo)的膠原表達(dá)，而總共高達(dá)12mg/kg的劑量在這種模型中不產(chǎn)生BAL細(xì)胞群體的顯著改變。更高的劑量可以產(chǎn)生巨噬細(xì)胞總數(shù)目和嗜中性粒細(xì)胞百分比增加。
8.在多重博來霉素劑量倉(cāng)鼠模型中的評(píng)估。在倉(cāng)鼠肺纖維化模型中檢查mu3G9的功效，其中在第0、7和14天時(shí)氣管內(nèi)給予連續(xù)3次博來霉素劑量。3組倉(cāng)鼠用5mg/kg mu3G9進(jìn)行處理，每周3次(總共15mg/kg/周)，在第0、7或14天時(shí)開始。動(dòng)物在第28天時(shí)被處死，且通過羥脯氨酸(圖65A)和脂質(zhì)過氧化測(cè)定法(圖65B)評(píng)估纖維化(在U.California-Davis，Davis，CA進(jìn)行)。出乎意料地，在這種模型中沒有看到纖維化減少方面的功效。在組之一中，倉(cāng)鼠在第7和14天時(shí)開始用mu3G9進(jìn)行處理，相對(duì)于PBS和IgG對(duì)照組，小鼠顯示在肺羥脯氨酸中統(tǒng)計(jì)上顯著的增加。與IgG對(duì)照組比較，脂質(zhì)過氧化值沒有顯著升高。分析各種處理組的存活曲線以察看這種外觀惡化是否對(duì)倉(cāng)鼠存活具有影響。在第0天開始處理的mu3G9小鼠(在圖65C中的BL+AB(b)1組)比PBS和IgG對(duì)照略微更早地開始死亡；然而，當(dāng)分別針對(duì)PBS和IgG對(duì)照比較B1(L)+Ab1存活曲線時(shí)，差異沒有顯著性(時(shí)序檢驗(yàn)p＝0.15對(duì)PBS和p＝0.25對(duì)IgG對(duì)照mAb)。mu3G9單克隆抗體是否與倉(cāng)鼠交叉反應(yīng)是未知的，且可能倉(cāng)鼠可能已產(chǎn)生針對(duì)這種模型中使用的鼠類抗體的抗體應(yīng)答。由于這種模型中解釋結(jié)果方面的困難，沒有繼續(xù)不同劑量關(guān)于功效的評(píng)估，因?yàn)樵?種不同鼠類肺纖維化模型(博來霉素和輻射誘導(dǎo)的)中可見一致功效。
表 表16-1關(guān)于αvβ6表達(dá)免疫染色的人肺病樣品
表16-2用mu3G9處理46天的博來霉素攻擊小鼠的存活 結(jié)論 mu3G9是纖維化博來霉素模型中的疾病嚴(yán)重度的有效抑制劑。這一系列實(shí)驗(yàn)顯示 (a)αvβ6表達(dá)在具有纖維化和/或炎性病理狀態(tài)的廣泛范圍的人肺病中的上皮細(xì)胞上是上調(diào)的。它在小鼠博來霉素纖維化模型中類似地上調(diào)。
(b)mu3G9在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯著減少博來霉素誘導(dǎo)的纖維化，對(duì)于分析使用多個(gè)終末點(diǎn)。功效在測(cè)試的所有小鼠品系SV129、C57B16、和C57B16X DBA雜種中可見。抑制膠原表達(dá)方面的功效在低至0.3mg/kg/的周劑量時(shí)可見。
(c)mu 3G9的作用機(jī)理是經(jīng)由TGF-β抑制，所述TGF-β是具有抗炎特性的促纖維化細(xì)胞因子。如預(yù)期的，纖維化抑制發(fā)生而不減少炎癥。相對(duì)于PBS但不是IgG對(duì)照，在第5天時(shí)在博來霉素攻擊小鼠的支氣管肺泡灌洗的BAL總細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中，頻繁高劑量的mu3G9(每隔一天給予20和40mg/kg)可以誘導(dǎo)最適度的增加。
(d)mu3G9在倉(cāng)鼠多重劑量博來霉素模型中無效。一個(gè)mu3G9處理組中明顯惡化的纖維化是否是測(cè)試物品相關(guān)的仍不清楚。
(e)4mg/kg劑量、每周3次共46天的mu 3G9處理不影響博來霉素模型中的存活。
參考文獻(xiàn) 1.Roberts，A.B.，等人，Transforming growth factor type BRapid induction of fibrosis and angiogenesis in vivo andstimulation of collagen formation in vitro.Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1986.83第4167-4171頁(yè)。
2.Roberts，A.B.and M.B.Sporn，Regulation of endothelial cellgrowth，architecture，and matrix synthesis by TGF-beta.Am.Rev.Respir.Dis.，1989.140第1126-1128頁(yè)。
3.Varga，J.，J.Rosenbloom，and S.A.Jimenez，Transforminggrowth factor beta(TGF beta)causes a persistent increase insteady-state amounts of type I and type III collagen andfibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts.Biochem.J.，1987.247(3)第597-604頁(yè)。
4.Grande，J.P.，D.C.Melder，and A.R.Zinsmeister，Modulationof collagen gene expression by cytokinesstimulatory effect oftransforming growth factor-betal，with divergent effects ofepidermal growth factor and tumor necrosis factor-alpha oncollagen type I and collagen type IV.J.Lab Clin.Med.，1997.130(5)第476-486頁(yè)。
5.Walker，G.A.，等人，Valvular myofibroblastsactivation bytransforming growth factor-betaimplications for pathologicalextracellular matrix remodeling in heart valve disease.Circ.Res.，2004.95(3)第253-260頁(yè)。
6.Eickelberg，O.，等人，Extracellular matrix deposition byprimary human lung fibroblasts in response to TGF-betal andTGF-beta3.Am.J.Physiol.，1999.276(5)第L814-L824頁(yè)。
7.Sime，PJ.，等人，Adenovector-mediated gene transfer ofactive transforming growth factor-β1induces prolonged severefibrosis in rat lung.J.clin.Invest.，1997.100第768-776. 8.Bonniaud，P.，等人，Progressive TGF-(beta)1-induced lungfibrosisis blocked by an orally active ALK5kinase inhibitor.Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2004.171第889-898頁(yè)。
9.Laping，NJ.，ALK5Inhibitionin renaldisease.Curr.Opin.Pharmacol.，2003.3(2)第204-208頁(yè)。
10.Miyajima，A.，等人，Antibody to transforming growth factor-βameliorates tubular apoptosis in unilateral ureteralobstruction.Kid.hit，2000.58第2310-2313頁(yè)。
11.Sharma，K.，等人，Neutralization of TGF-beta by ananti-TGF-beta antibody attenuates kidney hypertrophy and theenhanced extracellular matrix gene expresssion in STZ-induceddiabetic mice.Diabetes，1996.45(4)第522-530頁(yè)。
12.Wang，Q.，等人，Reduction of bleomycin induced lung fibrosisby transforming growth factor βsoluble receptor in hams ters.Thorax，1999.54第805-812頁(yè)。
13.Bonniaud，P.，等人，Smad 3null mice develop airspaceenlargement and are resistant to TGF-beta-mediated pulmonaryfibrosis.J.Immunol，2004.173(3)第2099-2108頁(yè)。
14.George，J.，等人，In vivo inhibition of rat stellate cellactivation by soluble transforming growth factor type IIreceptorA potential new therapy for hepatic fibrosis.Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1999.96(22)第12719-12724頁(yè)。
15.Zheng，H.，等人，Recombinant soluble transforming growthfactorβtype II receptor ameliorates radiation enterophay inmice.Gastroenterology，2000.119第1286-1296頁(yè)。
16.Kasuga，H.，等人，Effects of anti-TGF-βtype II receptorantibody on exper imental glomerulonephritis.Kid.hit.，2001.60第1745-1755頁(yè)。
17.Ziyadeh，F(xiàn).N.，等人，Long-term prevention of renalinsufficiency，excess matrix gene expression，and glomerularmesangial matrix expansion by treatment with monoclonalantitransforming growth factor-βant ibody in db/db diabeticmice.Proc.Natl.Acad.Sci，USA，2000.97(14)第8015-8020頁(yè)。
18.Munger，J.S.，等人，The integrin αv β6binds and activateslatent TGF β1a mechanism for regulating pulmonary inflammationand fibrosis.Cell，1999.96第319-328頁(yè)。
19.Gleizes，P.E.，等人，TGF-beta latencybiologicalsignificance and mechanisms of activation.Stem Cells，1997.15(3)第190-197頁(yè)。
20.Khalil，N.，TGF-hetafrom latent to active.MicrobesInfect，1999.1(15)第1255-1263頁(yè)。
21.Barcellos-Hoff，M.H.，Latency and activation in the controlof TGF-β.J.Mamm.Gland Biol.，1996.1(4)第353-363頁(yè)。
22.Huang，X.Z.，等人，The integrin αvB6 is critical forkerat inocyte migration on both its known ligand，fibronect in，and on vitronectin.J.Cell Sci.，1998.I11第2189-2195頁(yè)。
23.Busk，M.，R.Pytella，and D.Sheppard，Characterizationof the integrin alpha v beta 6as a fibronectin-binding protein.J.Biol.Chem.，1992.267(9)第5790-5796頁(yè)。
24.Yokosaki，Y.，等人，Differential effects of the integrinsalpha9betal，alphavbeta3，and alphavbeta6 on cell proliferativeresponses to tenascin.Roles of the beta subunit extracellular andcytoplasmic doma ins.J.Biol.Chem.，1996.271(39)第24144-24150頁(yè)。
25.Annes，J.P.，D.B.Rifkin，and J.S.Munger，The integrinαvβ6binds and activates latent TGFβ3.FEBSlett，2002.511第65-68頁(yè)。
26.Ma，LJ.，等人，Transforming growth factor-β-dependentand independent pathways of induction of tubulointerstitialfibrosis in β6-/-mice.Am.J.Pathol.，2003.163第1261-1273頁(yè)。
27.Breuss，J.M.，等人，Restricted distribution of integrinβ6mRNA in primate epithelial tissues.J.Histochem.andCytochem.，1993.41(10)第1521-1527頁(yè)。
28.Breuss，J.M.，等人，Expression of the R6subunit indevelopment，neoplasia and tissue repair suggests a role inepithelial remodeling.J.Cell Sci.，1995.108第2241-2251頁(yè)。
29.Zambruno，G.，等人，Transforming growth factor-β1modulates β1and β5 integr in receptors and induces the de novoexpression of the αvB6heterodimer in normal humankeratinocytesimplications for wound healing.J.Cell Biol，1995.129(3)第853-865頁(yè)。
30.Hakkinen，L.，等人，Increased expression of β6-integrinin skin leads to spontaneous development of chronic wounds.Am.J.Pathol.，2004.164第229-242頁(yè)。
31.Weinreb，P.H.，等人，F(xiàn)unction-blocking integrinalphavbeta6monoclonal antibodies.J.Biol.Chem.，2004.279(17)第17875-17887頁(yè)。
32.Cosgrove，D.，等人，Integrin α1β1 and transforming growthfactor-β1play distinct roles in alport glomerular pathogenesisand serve as dual targets for metabolic therapy.Amer.J.ofPathol，2000.157(5)第1649-1659頁(yè)。
33.Inagaki，Y.，等人，Activation of Proalpha2(I)collagenpromoter during hepatic fibrogenesis in transgenic mice.BiochemBiophys Res Commun，1998.250(3)第606-11頁(yè)。
34.Broekelmann，T.J.，等人，Transforming growth factor β1is present at sites of extracellular matrix gene expression inhuman pulmonary fibrosis.Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1991.88第6642-6646頁(yè)。
35.Denton，C.P.，等人，Activation of a fibroblast-specificenhancer of the proalpha2(I)collagen gene in tight-skin mice.Arthritis Rheum，2001.44(3)第712-22頁(yè)。
詞匯表
附錄Amu3G9劑量變化(羥脯氨酸) 附錄Bmu3G9劑量變化(組織形態(tài)測(cè)定術(shù)) 附錄Cmu3G9劑量變化(膠原報(bào)道小鼠)
附錄D在博來霉素中的BAL組成周劑量
附錄EBAL細(xì)胞組成每周給藥3次
實(shí)施例17抗αvβ6整聯(lián)蛋白單克隆抗體在正常和患病小鼠肺中的效應(yīng)的分子分析 概述 關(guān)于肺纖維化的動(dòng)物模型在模擬人特發(fā)性肺纖維化(IPF)的纖維化病理狀態(tài)的某些方面中是有效的；然而，沒有動(dòng)物模型精確模擬IPF的精確病理狀態(tài)。此外，因?yàn)镮PF中的疾病起始和進(jìn)展機(jī)制未完全了解，所以重要的是在多種疾病模型中測(cè)試潛在治療劑，并且不僅在改善纖維化病理狀態(tài)方面，還在干預(yù)被認(rèn)為在人疾病中相關(guān)的分子途徑方面評(píng)估其功效。TGF-β途徑已暗示為IPF中的關(guān)鍵途徑。人IPF肺的總體轉(zhuǎn)錄特征已顯示這種疾病中的顯著標(biāo)記是激活TGF-β途徑之一，這與TGF-β在驅(qū)動(dòng)許多特征為肺纖維化的病理過程中的已知作用一致，所述病理過程包括成纖維細(xì)胞活化和增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)分子表達(dá)。除了其促纖維化活性外，TGF-β是重要的抗炎細(xì)胞因子，且因此TGF-β的治療抑制應(yīng)當(dāng)理想地阻斷纖維化而不促進(jìn)過度炎癥。整聯(lián)蛋白αvβ6與潛伏TGF-β復(fù)合物直接結(jié)合且是TGF-β轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài)所需的。然而，因?yàn)棣羦β6介導(dǎo)的TGF-β活化只在某些組織中是關(guān)鍵的，所以對(duì)于αvβ6功能完全缺陷的小鼠只在肺中顯示病理狀態(tài)，而TGF-β缺陷小鼠在多個(gè)器官系統(tǒng)中顯示炎癥。因此本文所述的治療策略是阻斷αvβ6功能以避免TGF-β途徑的總體抑制，且顯示阻斷與TGF-β信號(hào)增加相關(guān)的纖維化病理狀態(tài)中的功效可以在不會(huì)誘導(dǎo)與TGF-β完全喪失相關(guān)的炎癥劑量時(shí)達(dá)到。在本文中表征了與纖維化和炎性病理狀態(tài)相關(guān)的mRNA和蛋白質(zhì)水平上的分子變化。表明高劑量的抗αvβ6單克隆抗體mu 3G9，臨床候選物BG 00011的鼠類親本，引起與αvβ6缺陷小鼠一致的肺炎性標(biāo)記中的mRNA和蛋白質(zhì)變化。進(jìn)一步表明在減少纖維化方面有效的低劑量mu 3G9在小鼠中不引起這些炎性變化。
引言 TGF-β1細(xì)胞因子是已知刺激成纖維細(xì)胞以產(chǎn)生過量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，最終導(dǎo)致器官瘢痕化和衰竭的促纖維化細(xì)胞因子(Roberts1986)。在肺中腺病毒和轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)的各種細(xì)胞因子已顯示，在不存在顯著炎癥的情況下TGF-β1在其促進(jìn)纖維化的能力方面是獨(dú)特的。TGF-β途徑中基因敲除小鼠模型(Bonniaud 2004，Munger 1999)和使用抗TGF-β試劑的許多研究已顯示，抑制TGF-β功效作為減少纖維化的方法(Geor ge，J.1999；Sharma，K.1996；Bonnidaud，P.2004；Zheng，H.2000；Kasuga，H.2001；Ziyadeh，F(xiàn).N.2000；Laping，N.J.2003)。由2個(gè)亞單位αv和β6整聯(lián)蛋白構(gòu)成的αv和β6整聯(lián)蛋白，是TGF-β1活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，特別是在肺中。它在損傷、炎癥和纖維化期間在上皮細(xì)胞上是上調(diào)的，且與潛伏TGF-β1復(fù)合物結(jié)合，使其轉(zhuǎn)變成活性形式。[Huang 1998；Munger 1999；Busk 1992；Yokoaski 1996；Annes 2002]。阻斷αvβ6與潛伏TGF-β1結(jié)合提供了使TGF-β活化抑制局限在αvβ6表達(dá)上調(diào)的位點(diǎn)處的方法，從而避免了所有組織中TGF-β途徑總體抑制的潛在臨床安全風(fēng)險(xiǎn)。
在上文實(shí)施例中，在2種鼠類肺纖維化模型博來霉素誘導(dǎo)的纖維化(實(shí)施例16)、輻射誘導(dǎo)的纖維化(實(shí)施例15)中表征了鼠類抗αvβ6單克隆抗體mu3G9的功效。此外，mu3G9處理在正常小鼠中的效應(yīng)在毒理學(xué)報(bào)告中詳細(xì)描述。在這個(gè)實(shí)施例中，表征了mu3G9處理在正常小鼠和肺纖維化疾病模型中對(duì)肺mRNA和蛋白質(zhì)水平的影響。
肺組織轉(zhuǎn)錄特征表明αvβ6阻斷減少改變TGF-β靶基因，所述TGF-β靶基因與博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化相關(guān)。這些數(shù)據(jù)暗示αvβ6涉及肺纖維化調(diào)節(jié)，且可以提供關(guān)于其治療調(diào)節(jié)的新型分子靶。
材料和方法 1.試劑。αvβ6mAbs如本文其他地方所述和先前所述(29)產(chǎn)生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分別的親本雜交瘤總RNAs產(chǎn)生，其中恒定區(qū)引物CDL-739用于重鏈和CDL-738用于輕鏈，使用FirstStrand cDNA合成試劑盒(Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ)。重和輕鏈可變區(qū)基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用用于cDNA合成的相同3′引物、和對(duì)大多數(shù)鼠類抗體基因信號(hào)序列(在檢索后可獲得的序列)特異的簡(jiǎn)并引物庫(kù)、以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)。將克隆的重和輕鏈可變區(qū)連接到具有人IgG1恒定區(qū)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。重組可溶性鼠類TGF-β受體II型-Ig融合蛋白(sTGF-βRII-Ig)如先前所述(10)產(chǎn)生。在所有實(shí)驗(yàn)中使用研究級(jí)mu 3G9、1E6和sTGF-bRII-Ig(在磷酸鹽緩沖鹽水中的純化蛋白質(zhì))。
2.動(dòng)物。
(a)在用于RNA分析的正常小鼠中的mu3G9處理正常C57B16小鼠用5mg/kg可溶性TGFbRII-Ig、PBS、或下述劑量的mu3G90.3、1、3、10和30mg/kg每周處理1次，共4周(在第1、8、15和22天時(shí))。一股處理小鼠在第29天時(shí)(最后1次劑量后1周＝無恢復(fù))收集，而另一股在第78天時(shí)(最后1次劑量后8周＝7-周恢復(fù))收集。這些實(shí)驗(yàn)不依賴于mu3G9小鼠毒理學(xué)報(bào)告中所述工作來進(jìn)行，在所述毒理學(xué)報(bào)告中測(cè)試CD-1小鼠品系且使用8周恢復(fù)期。
(b)在用于BAL蛋白質(zhì)多重分析物特征的正常小鼠中的mu3G9處理正常C57B16小鼠用PBS或下述劑量的mu 3G90.1、0.3、1、3和10mg/kg每周處理1次，共4周(在第1、8、15和22天時(shí))。小鼠在第29天時(shí)(最后1次劑量后1周)收集用于支氣管肺泡灌洗(BAL)收集。這些實(shí)驗(yàn)再次不依賴于mu3G9小鼠毒理學(xué)報(bào)告中所述工作來進(jìn)行，在所述毒理學(xué)報(bào)告中測(cè)試CD-1小鼠品系。
(c)在輻射纖維化模型中的mu3G9處理在評(píng)估輻射誘導(dǎo)的纖維化減少功效中使用的處理組和終末點(diǎn)細(xì)節(jié)包含在BIIB Report#Rsch-2006-007中。簡(jiǎn)言之，在New York School of Medicine的John Munger實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行3項(xiàng)研究，其中小鼠接受胸部照射且在照射后15周開始用0.3-10mg/kg/周的不同mu 3G9劑量進(jìn)行處理。如果在研究期間被發(fā)現(xiàn)死亡，那么收集小鼠肺用于組織學(xué)/纖維化測(cè)量。存活小鼠在照射后第26、28和32周時(shí)進(jìn)行收集。收集來自一個(gè)肺葉的BAL流體且送至Biogen IDEC，而其他葉進(jìn)行加工用于組織學(xué)/纖維化測(cè)量。BAL流體蛋白質(zhì)分析包含在這個(gè)報(bào)道中，以允許在Biogen IDEC與來自用mu 3G9處理的正常小鼠的BAL流體分析比較。
3.支氣管肺泡灌洗收集。小鼠用過度劑量的Inactin(Sigma)腹膜內(nèi)注射(IP)實(shí)施安樂死。主要使用鈍器解剖法暴露氣管。隨后用剪刀在2個(gè)軟骨環(huán)之間打開氣管，且將23-計(jì)量鈍頭針插入氣管內(nèi)。通過用Schwartz臨時(shí)夾(Roboz)輕輕夾住使針保持在原位。通過將不含Ca2+或Mg2+的0.8ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)注入肺內(nèi)來進(jìn)行BAL。隨后不應(yīng)用太多壓力將流體收回注射器內(nèi)，且轉(zhuǎn)移到在冰上的15ml聚丙烯Falcon管內(nèi)。隨后重復(fù)該操作，不施加過度負(fù)壓將BAL流體回吸到注射器內(nèi)。將樣品貯藏在冰上且加工用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、分化，且收集BAL團(tuán)塊和流體且貯藏于-80℃。
1.BAL隨后在180g(1000rpm)(Beckman GPR)和4℃下在臺(tái)式離心機(jī)上旋轉(zhuǎn)10分鐘。隨后取出上清液(BAL流體)且冷凍于-80℃。將1.0ml RBC裂解溶液(Sigma)加入團(tuán)塊中且渦旋20秒。隨后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞離心涂片。
2.將樣品貯藏于冰上且使用血球計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞施加于血球計(jì)之后和讀數(shù)之前允許1分鐘以允許細(xì)胞沉降。
3.將100μl細(xì)胞懸浮液在500RPM和室溫下細(xì)胞離心涂片(ThermoShandon)5分鐘。細(xì)胞離心涂片制劑通過將細(xì)胞溶液放置到細(xì)胞離心涂片裝置內(nèi)且在500rpm下旋轉(zhuǎn)5分鐘來制備。檢查細(xì)胞濃度以確保在載玻片上的濃度不是太高；如果濃度太高，那么使樣品再次旋轉(zhuǎn)。允許載玻片干燥過夜且隨后用DiffQuik(Fisher)染色。根據(jù)制造商的(DiffQuik)方案來進(jìn)行染色。載玻片被干燥且用Permount(Fisher)蓋上蓋玻片后，細(xì)胞通過類型進(jìn)行分類，使用實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Fisher)計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇的100個(gè)細(xì)胞。
4.用于RNA的肺收集。小鼠用過度劑量的Inactin(Sigma)腹膜內(nèi)注射(IP)實(shí)施安樂死。動(dòng)物用70％ETOH向下噴射，使用一對(duì)無菌剪刀將皮膚剪去，從胸骨開始且朝向頭部進(jìn)行。皮膚被清除后，剪去胸骨和肋骨以暴露心臟和肺。取出肺且置于一塊無菌紗布上以去除任何血液產(chǎn)物，并快速放置到14ml聚丙烯圓底管17×100mm(Fisher)內(nèi)。將液氮加入包含肺的聚丙烯管中且置于干冰上。隨后將肺貯藏于-80℃。
5.RNA制備。使用Qiazol試劑(Qiagen)根據(jù)制造商的方案從速凍的組織樣品中純化總RNA。RNA質(zhì)量通過在Bioanalyzer 2000(Agilent)上的毛細(xì)管電泳來驗(yàn)證。
6.關(guān)于轉(zhuǎn)錄特征的探針標(biāo)記、雜交和掃描。樣品標(biāo)記、雜交和染色根據(jù)Affymetrix Technical Manual(701021rev1)中的EukaryoticTarget Preparation方案來進(jìn)行用于Genechip

ExpressionAnalysis(Affymetrix，Santa Clara，CA)?？傊?，在20μL第一條鏈反應(yīng)中使用5μg純化總RNA，以及200U SuperScript II(目錄#，18064-022，Invitrogen)和0.5ug(dT)-T7引物[5′-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24]于42℃1小時(shí)。第二條鏈合成通過下述進(jìn)行添加40U大腸桿菌DNA Polymerase(目錄#18010-025，Invitrogen)、2U大腸桿菌RNase H(目錄#18021-071，Invitrogen)和10U大腸桿菌DNA Ligase(目錄#18052-019，Invitrogen)，隨后于16℃溫育2小時(shí)。第二條鏈合成使用Genechip

Sample Cleanup Module根據(jù)制造商的方案(目錄#900371，Affymetrix，Santa Clara，CA)進(jìn)行純化。純化cDNA使用BioArray高產(chǎn)量RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒(目錄#42655-40，Enzo Life Sciences，Inc.，Parmingdale，NY)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生70-120μg生物素標(biāo)記的cRNA(互補(bǔ)RNA)。小鼠MgU74Av2、MgU74Bv2和MgU74Cv2GeneChip

探針陣列在GeneChip

Hybridization Oven640(Affymetrix，Santa Clara，CA)中根據(jù)制造商的方案進(jìn)行預(yù)雜交。將片段化的標(biāo)記cRNA重懸浮于300μL 1X雜交緩沖液中，所述雜交緩沖液包含100mM 2-嗎啉乙磺酸，1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％Tween 20，0.5mg/mL乙?；疊SA，0.1mg/mL鯡魚精DNA，對(duì)照oligo B2，和對(duì)照bioB 1.5pM、bioC 5pM、bioD 25pM以及cre 100pM，且根據(jù)制造商的方案(Affymetrix，Santa Clara，CA)與Genechip

探針陣列雜交。雜交的Genechip

探針陣列進(jìn)行洗滌，且使用鏈霉親和素-藻紅蛋白(目錄#S866，Molecular Probes，Eugene，OR)進(jìn)行染色，且使用GeneChip

Fluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，CA)與生物素化的抗鏈霉親和素(BA-0500，VectorLaboratories，Burlingame，CA)一起擴(kuò)增。Genechip

探針陣列使用GeneArray Scanner(Hewlett Packard，Corvallis，OR)進(jìn)行掃描。
7.轉(zhuǎn)錄特征數(shù)據(jù)分析。將陣列掃描轉(zhuǎn)換成Affymetrix.CEL文件，且所得到的數(shù)據(jù)集(.CEL文件組表示完全實(shí)驗(yàn))使用RobustMicroarray Average(RMA)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。統(tǒng)計(jì)和聚類分析使用BRBArray Tools v.3.4.0-Beta 2(NCI)、GeneSpring(Agilent)和Spotfire(Spotfire)數(shù)據(jù)采集工具來完成。使用微陣列顯著性分析(SAM)鑒定與PBS處理組比較，信號(hào)強(qiáng)度通過任何實(shí)驗(yàn)處理改變的探針組，其中在0.95的置信限度(CL)時(shí)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)閾值設(shè)定不超過0.01。當(dāng)通過選擇顯示信號(hào)強(qiáng)度至少2倍變化的顯著影響(FDR＜0.01，CL 0.95)探針組必需時(shí)，進(jìn)行進(jìn)一步過濾。所得到的基因組特征和實(shí)驗(yàn)條件分組通過層級(jí)聚類進(jìn)行分析和顯示。虛擬途徑分析使用Ingenuity Pathway Analysis數(shù)據(jù)庫(kù)(Ingenuity Systems)來進(jìn)行。
8.BAL流體蛋白質(zhì)水平的多元分析。測(cè)量用的200ul等分試樣從如上所述收集的BAL流體中直接獲取。將這些等分試樣送至RulesBased Medicine，Inc.(Austin，TX)，在那里它們使用基于Luminex的技術(shù)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)小鼠蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象組進(jìn)行分析。
9.統(tǒng)計(jì)分析。關(guān)于轉(zhuǎn)錄特征分析的統(tǒng)計(jì)分析在上文描述。使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行媒介物對(duì)照和/或同種型對(duì)照、和各種劑量測(cè)試物品之間BAL流體中的蛋白質(zhì)水平分析的統(tǒng)計(jì)比較。當(dāng)使用ANOVA在p＜0.05的概率上確定統(tǒng)計(jì)上顯著的差異時(shí)，通過Dunnet′s多重比較檢驗(yàn)來評(píng)估組間的顯著差異。
結(jié)果 1.用mu3G9處理正常小鼠的效應(yīng)肺轉(zhuǎn)錄分析。在CD-1小鼠中的毒理學(xué)研究結(jié)果鑒定肺為關(guān)于mu3G9的毒性靶器官。如那些研究中詳細(xì)描述的，在用mu3G9處理的小鼠中可見與整聯(lián)蛋白β6無效小鼠(它對(duì)于αvβ6整聯(lián)蛋白是缺陷的)中的發(fā)現(xiàn)一致的肺炎癥。如通過組織病理學(xué)評(píng)估的，這種炎癥在1mg/kg劑量時(shí)很少觀察到，但在10mg/kg/周的劑量時(shí)始終可見。為了在C57B16品系(該品系在上文實(shí)施例15和16中所述的功效研究中使用)中評(píng)估這種炎癥，小鼠用劑量為0.3-30mg/kg/周的mu3G9處理，且加工肺用于RNA和微陣列分析。
使用FDR閾值0.01和CL 0.95的微陣列顯著性分析(SAM)，以在PBS處理的對(duì)照組和每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組之間的一系列配對(duì)比較中搜索差異表達(dá)的基因，包括用3G9處理的組和sTGFbRII-Ig組。使用其分別的PBS對(duì)照，此類配對(duì)SAM分析對(duì)于處理和恢復(fù)組分開進(jìn)行。對(duì)所得到的基因列表實(shí)施另外的過濾步驟，以鑒定在PBS對(duì)照和任何處理組之間信號(hào)強(qiáng)度變化超過2倍的顯著影響探針組。結(jié)果概括于表17-1到17-6中。在處理組的10mg/kg和30mg/kg亞組中觀察到滿足上述選擇標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)中的顯著變化(表17-1和17-2)。關(guān)于所選探針組的基因表達(dá)特征已顯示在10mg/kg和30mg/kg 3G9處理組中相應(yīng)基因表達(dá)水平的強(qiáng)烈雙向改變(圖66)。
在任何其他處理亞組或恢復(fù)組中沒有檢測(cè)到基因表達(dá)的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化(表17-1和17-2)。然而，對(duì)于其表達(dá)特征比MMP12的那種大0.95皮爾遜(Pearson)相關(guān)選擇的MMP12和25種其他基因，在3mg/kg 3G9處理組中已顯示可檢測(cè)的向上趨勢(shì)(圖67；表17-7)。
受3G9顯著影響的基因的功能注釋使用Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)數(shù)據(jù)庫(kù)來進(jìn)行，且已顯示這些基因與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子信號(hào)的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)(圖68)。類似地，虛擬調(diào)節(jié)途徑分析已暗示在基因表達(dá)中3G9誘導(dǎo)的變化與細(xì)胞因子TGF-β和干擾素信號(hào)改變的關(guān)聯(lián)。這些關(guān)聯(lián)根據(jù)2個(gè)最高評(píng)分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)型得出(圖69A，69B)。
2.MMP-12轉(zhuǎn)錄物的定量PCR分析。MMP-12顯示來自mu3G9處理小鼠肺中上調(diào)倍數(shù)最高的任何轉(zhuǎn)錄物(表17-3)。MMP-12先前已報(bào)道為來自β6無效小鼠肺中最高上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。為了進(jìn)一步闡明MMP-12表達(dá)和mu 3G9處理之間的關(guān)系，通過定量PCR分析MMP-12轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)水平，包括由β6無效小鼠肺制備的RNA。mu3G9處理在MMP-12轉(zhuǎn)錄物中產(chǎn)生劑量依賴性增加，所述劑量依賴性增加在10和30mg/kg時(shí)顯著。MMP-12表達(dá)中的倍數(shù)變化在那些劑量時(shí)與β6無效小鼠中可見的那種可比較。與上文對(duì)于微陣列分析所述的結(jié)果類似，通過qPCR的MMP-12水平在3mg/kg劑量時(shí)趨于向上，但在0.3和1mg/kg劑量時(shí)未改變。
3.來自用mu3G9處理的正常小鼠肺的BAL蛋白質(zhì)分析。為了進(jìn)一步表征可歸于mu3G9處理的肺中分子變化，分析來自另一股小鼠的BAL流體中的60種蛋白質(zhì)水平(表17-8)，所述另一股小鼠用劑量為0.1-10mg/kg的mu3G9處理4周。蛋白質(zhì)分析在Rules Based Medicine，Inc.(Austin，TX)通過luminex(多元蛋白質(zhì)分析)測(cè)定法來進(jìn)行。與轉(zhuǎn)錄水平上的發(fā)現(xiàn)一致，與肺炎癥相關(guān)的多種蛋白質(zhì)在用10mg/kg劑量處理小鼠的BAL流體中升高(表17-9)。此外，這些變化中的一些通過ANOVA在3mg/kg劑量時(shí)同樣顯著；然而，通過1mg/kg劑量在實(shí)驗(yàn)對(duì)象組上沒有蛋白質(zhì)升高。
4.來自輻射誘導(dǎo)的纖維化模型的BAL流體蛋白質(zhì)分析。mu3G9在減少輻射誘導(dǎo)的肺纖維化中的功效在上文實(shí)施例15中描述。在那些研究中收集的BAL流體(BALF)樣品通過多分析物蛋白質(zhì)特征進(jìn)行分析，使用的小鼠實(shí)驗(yàn)對(duì)象組與來自用mu 3G9處理的正常小鼠的BALF中使用的一樣。在本文中分析了第28周(處理13周)和第32周(處理17周)時(shí)間點(diǎn)的BALF分析。如通過ANOVA測(cè)定的顯著改變的蛋白質(zhì)概括于表17-11中。如同正常小鼠中的轉(zhuǎn)錄特征和蛋白質(zhì)結(jié)果一樣，在輻射纖維化模型中改變的大多數(shù)蛋白質(zhì)僅在10mg/kg劑量時(shí)達(dá)到顯著性，-盡管一些在3mg/kg時(shí)顯著且所有在3mg/kg時(shí)都顯示趨勢(shì)。大多數(shù)這些蛋白質(zhì)是已知與肺纖維化關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子或趨化因子。用10mg/kg mu3G9處理的正常小鼠中上調(diào)2倍或更多的20種蛋白質(zhì)中的14種(表17-10)在輻射模型中同樣一致上調(diào)。盡管在mu3G9處理期和損傷/炎癥狀態(tài)中存在差異，但在正常和被照射小鼠中的發(fā)現(xiàn)之間的一致性是驚人的。許多蛋白質(zhì)顯示的適當(dāng)更高的倍數(shù)上調(diào)與輻射模型中更長(zhǎng)期的處理期一致(表17-12)，但總的來說這2種非常不同的背景中的發(fā)現(xiàn)是一致的。此外，盡管在正常和被照射的小鼠中的基線水平不同(輻射損傷使大多數(shù)這些蛋白質(zhì)上調(diào))，但包括這些炎性標(biāo)記上調(diào)的劑量范圍在正常和被照射的小鼠中是相同的。具體地，在正常和患病小鼠中，它們?cè)?和10mg/kg劑量時(shí)是上調(diào)的，但在1mg/kg劑量時(shí)則不是(在圖70中用第28周時(shí)最高上調(diào)的4種蛋白質(zhì)舉例說明)。因此，盡管在輻射模型中藥物靶的表達(dá)高得多(參見上文實(shí)施例15)，但產(chǎn)生對(duì)mu3G9處理特異的BAL蛋白質(zhì)變化的劑量在2種背景中是相同的。應(yīng)當(dāng)指出并非所有由mu3G9誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)都被認(rèn)為具有促炎和/或促纖維化效應(yīng)。例如，CXCL細(xì)胞因子IP-10/CXCL10已在小鼠模型中顯示有效的抗纖維化功效，和對(duì)IP-10或其受體CXCR3缺陷的小鼠顯示對(duì)博來霉素過大的纖維化應(yīng)答。然而，在接近最大有效劑量的1mg/kg劑量時(shí)，在這種或其他細(xì)胞因子中未觀察到一致變化，因此肺細(xì)胞因子環(huán)境中的任何這些改變不太可能是mu3G9處理功效所需的。
在正常小鼠上調(diào)但在輻射模型中未上調(diào)的蛋白質(zhì)中有ApoA1、纖維蛋白原、和TIMP-1。與正常小鼠比較，這些蛋白質(zhì)和第4種蛋白質(zhì)觸珠蛋白的水平在被照射的小鼠的BAL流體中增加，但經(jīng)由mu 3G9處理減少(圖71)。因此，在有效劑量時(shí)這些蛋白質(zhì)水平的標(biāo)準(zhǔn)化暗示它們可能充當(dāng)28周時(shí)間點(diǎn)時(shí)的代理功效標(biāo)記(圖72)。在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組上在較低劑量時(shí)顯著改變的僅有蛋白質(zhì)是經(jīng)由處理減少的那些TIMP-1和觸珠蛋白。TIMP-1是已知的TGF-β靶且在纖維化疾病中常常是升高的。它的下調(diào)與mu3G9作用機(jī)理，即抑制αvβ6介導(dǎo)的TGF-β活化一致。
表 表17-1mu3G9體內(nèi)劑量按比例上升的肺轉(zhuǎn)錄物變化分析。受實(shí)驗(yàn)處理顯著(FDR＜0.01，CL 0.95)影響的探針組數(shù)目。

表17-2具有大于2倍變化的肺轉(zhuǎn)錄物分析。顯示響應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理的信號(hào)強(qiáng)度大于2倍顯著變化的探針組數(shù)目。

表17-3轉(zhuǎn)錄物列表 表17-4在處理組中受30mg/kg 3G9顯著影響的基因。
表17-5在處理組中相應(yīng)探針組的信號(hào)強(qiáng)度受10mg/kg 3G9顯著影響且顯示＞2倍變化的基因。
表17-6在30mg/kg組中變化＞2倍的轉(zhuǎn)錄物。在處理組中相應(yīng)探針組的信號(hào)強(qiáng)度受30mg/kg 3G9顯著影響且顯示＞2倍變化的基因。
表17-7在3mg/kg組中顯示向上趨勢(shì)的轉(zhuǎn)錄物 表17-8通過多分析物蛋白質(zhì)特征分析總蛋白 表17-9在不同劑量的mu3G9處理時(shí)改變的蛋白質(zhì) 表17-10在正常小鼠中具有大于2倍變化的BALF蛋白質(zhì)。


表17-12在正常和被照射的小鼠中BAL蛋白質(zhì)的倍數(shù)變化比較
結(jié)論 mu3G9處理的功效已在正常小鼠中通過轉(zhuǎn)錄物特征和多元分析物蛋白質(zhì)特征進(jìn)行表征 (a)來自高劑量mu3G9處理小鼠的轉(zhuǎn)錄物特征分析誘導(dǎo)與肺炎癥相關(guān)的許多轉(zhuǎn)錄物中的顯著變化。這些變化與來自整聯(lián)蛋白β6無效小鼠(αvβ6缺陷)的轉(zhuǎn)錄特征結(jié)果一致。誤調(diào)節(jié)的這些特定靶與由于mu 3G9的作用機(jī)理肺中的TGF-β信號(hào)減少一致。
(b)蛋白質(zhì)特征結(jié)果同樣顯示與mu3G9作用機(jī)理相關(guān)的相同細(xì)胞因子和趨化因子中的一致增加。
(c)轉(zhuǎn)錄物中的變化僅在10mg/kg劑量時(shí)達(dá)到顯著性，盡管許多轉(zhuǎn)錄物在3mg/kg劑量時(shí)趨于向上。某些蛋白質(zhì)變化在3mg/kg劑量時(shí)顯著，但大多數(shù)在10mg/kg劑量時(shí)達(dá)到顯著性。在1mg/kg劑量時(shí)蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物中的變化都不顯著。
mu3G9處理的效應(yīng)已在輻射纖維化模型中通過多重分析物蛋白質(zhì)特征進(jìn)行表征 (a)在正常中由高劑量mu 3G9誘導(dǎo)的許多相同細(xì)胞因子和趨化因子在輻射纖維化模型中同樣由高劑量mu3G9升高。
(b)盡管mu3G9的靶-整聯(lián)蛋白αvβ6的表達(dá)高得多，但這些炎性標(biāo)記的升高在輻射模型和正常小鼠中相同劑量時(shí)可見，即在3和10mg/kg時(shí)升高，但在1mg/kg時(shí)則不是，所述1mg/kg是這個(gè)模型中接近最大的有效劑量(參見實(shí)施例15)。
與纖維化有關(guān)的某些蛋白質(zhì)，特別是TIMP-1和觸珠蛋白，在有效劑量時(shí)在28周時(shí)間點(diǎn)時(shí)經(jīng)由mu3G9處理正?；?。
參考文獻(xiàn) Annes JP，Rifkin DB，Munger JS.The integrin αvB6 bindsand activates latent TGFB 3.FEBS lett 2002；51165-68. Bonniaud P，KoIb M，GaitT，Robertson J，Robbins C，StampfiiM，Lavery C，MargettsPJ，Roberts AB，Gauldie J.Smad3nullmicedevelop airspace enlargement and are resistant toTGF-beta-mediated pulmonary fibrosis.J Immunol.2004；173(3)2099-108. Bonniaud P，Margetts PJ，Schroeder JA，Kapoun AM，Damm D，Murphy A，ChakravartyS，DugarS，Higgins L，Protter AA and others.Progressive TGF-(beta)1-induced lung fibrosis is blocked byan orally active ALK 5kinase inhibitor.Am JRespir Crit CareMed.2004. Breuss JM，Gallo J，DeLisser HM，Klimanskaya IV，F(xiàn)olkessonHG，PittetJF，Nishimura S，Aldape K，Landers DV，Carpenter W等人Expression of the R6 subunit in development，neoplasia andtissue repair suggests a role in epithelial remodeling.J CellSci 1995；1082241-2251. Chevalier RL，Goyal S，Kim A，Landau D，LeRoith D.Renaltubulointerstitial injury from ureteral obstruction in theneonatal rat is attenuated by IGF-I.Kidney Int 2000；57882-890. Collard HR，Ryu JH，Douglas WW，Schwarz MI，Curran-EverettD，King TE，Brown KK.Combined Corticosteroid andCyclophosphamide Therapy does not alter survival in IdiopathicPulmonary Fibrosis.Chest 2004；1252169-2174. Coultas DB，Zumwalt RE，Black WC Sobonya RE.The Epidemiologyof Interstitial Lung Disease.Am J Respir Crit Care Med 1994；150967-972. Cosgrove D，Meehan D，Grunkemeyer JA，Kornak JM，Sayers R，Hunter WJ，Samuelson GC.Collagen COL4A 3knockouta mouse modelfor autosomal Alport syndrome.Genes Dev 1996；102981-2992. Douglas WW，Ryu JH，Swensen SJ，Offord KP，Schroeder DR，Caron GM，Remee RA.Colchicine versus Prednisone in theTreatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosisa randomizedprospective study.Am J Respir Crit Care Med 1998；158220-225. Eickel berg O，Kohler E，Reichenberger F，Bertschin S，WoodtliT，Erne P，Perruchoud AP，Roth M.Extracellular matrix depositionby primary human lung fibroblasts in response to TGF-betal andTGF-beta3.Am J Physiol 1999 276(5)L814-L824. Flaherty KR，Toesw GB，Lynch JP，Kazerooni EA，Gross BH，Strawderman RL，Hariharan K，F(xiàn)lint A，Martinez FJ.Steroids inIdiopathic Pulmonary FibrosisA prospective assessment ofadverse reactions，response to therapy，and survival.Am J Med2001；110278-282. George J，Roulot D，Koteliansky VE，Bissell DM.In vivoinhibition of rat stellate cell activation by solubletransforming growth factor type II receptorA potential newtherapy for hepatic fibrosis.Proc Natl Acad Sci，USA 1999；96(22)12719-12724. Gleizes PE，Munger JS，Nunes I，Harpel JG，Mazzieri R，Noguera I，Rifkin DB.TGF-beta latencybiological significanceand mechanisms of activation.Stem Cells 1997；15190-197. Hakkinen L，Hildebrand HC，Berndt A，Kosmehl H，Larjava H.Immunolocalization of tenascin-C，alpha 9integrin subunit，and alphavbeta6 integrin during wound healing in human oralmucosa.J Histochem Cytochem.2000 48(7)985-98. Hakkinen L，Koivisto L，Gardner H，Saarialho-Kre U，CarrollJM，Lakso M，Rauvala H，Laato M，Heino J，Larjava H.Increasedexpression of beta6-integrin in skin leads to spontaneousdevelopment of chronic wounds.Am J Pathol 2004 164(1)229-42. Huang XZ，Wu JF，Cass D，Erie DJ，Corry D，Young SG，F(xiàn)areseRV Jr，Sheppard D.Inactivation of the integrins inregulatinginflammation in the lung and skin.J Cell Biol.1996 May；133(4)921-8. Huang X，Wu J，Spong S，Sheppard D.The integrinalphavbeta6is critical for keratinocyte migration on bothits known ligand，fibronectin，and on vitronectin.J Cell Sci 1998；1112189-95. Kaminski N，Belperio JA，Bitterman PB，Chen L，Chensue SW，and others.Idiopathic Pulmonary Fibrosis.Proceedings of the1st Annual Pittsburgh International Lung Conference.October2002.Am J Respir Cell MoI Biol.2003 Sep；29(3Suppl)S1-105. Kasuga H，Ito Y，Sakamoto S，Kawachi H，Shimizu F，YuzawaY，S.M.Effects of anti-TGF-βtype II receptor antibody onexperimental glomerulonephritis.Kid Lit 2001；601745-1755. Laping NJ. ALK5 Inhibition in renal disease.Curr OpinPharmacol 2003；3(2)204-208. Ma LJ，Yang H，Gaspert A，Carlesso G，Barty MM，DavidsonJM，Sheppard D，F(xiàn)ogo AB.Transforming growth factor-β-dependentand independent pathways of induction of tubulointerstitialfibrosis in B6-/-mice.Am J Pathol 2003；1631261-1273. Miner JH，Sanes JR.Molecular and functional defects inkidneys of mice lacking collagen α3(IV)implicat ions foralport syndrome.J Cell Biol 1996；1351403-1413. Miyajima A，Chen J，Lawrence C，Ledbet ter S，Soslow RA，Stern J，Jha S，Pigato J，Lemer ML，Poppas DP，Vaughan ED，F(xiàn)elsen D.Antibody to transforming growth factor-betaameliorates tubular apoptosis in unilateral ureteralobstruction.Kidney Int 2000；58(6)2301-13. Morris DG，Huang X，Kaminski N，Wang Y，Shapiro SD，DolganovG，Glick A，Sheppard D.Loss of integrin alpha(v)beta6-mediatedTGF-beta activation causes Mmp12-dependent emphysema.Nature.2003Mar 13；422(6928)130-1. Munger JS，Harpel JG，Gleizes PE，MazzieriR，NunesI5RifkinDB.Latent transforming growth factor-betastructural featuresand mechanisms of activation.Kidney Int 1997；511376-1382. Munger JS，Huang X，Kawakatsu H，Griffiths MJD，Dalton SL，Wu J，Pittet JF，Kaminski N，Garat C，Matthay MA and others.The integrin αv β6binds and activates latent TGF β1amechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis.Cell 1999；96319-328. Pittet J.F.，Griffiths M.J.，Geiser T.，Kaminski N.，Dalton S.L.，Huang X.，Brown L.A.，Gotwals P.J.，KotelianskyV.E.，Matthay M.A.and others.TGF-beta is acritical mediatorof acute lung injury.J Clin Invest 2001；107(12)1537-1544. Roberts AB，Sporn MB.Regulation of endothelial cell growth，architecture，and matrix synthesis by TGF-beta.Am Rev RespirDis 1989；1401126-1128. Roberts AB，Sporn MB，Assoian RK，Smith JM，Roche NS，WakefiledLM，Heine UI，Liotta LA，F(xiàn)alanga V，Kehrl JH and others.Transforming growth factor type BRapid induction of fibrosisand angiogenesis in vivo and stimulation of collagen formationin vitro.Proc Natl Acad Sci，USA 1986；834167-4171. Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis challenges for thefuture.Chest 2001；120(1)8-10. Sleijfer-S.Bleomycin-induced pneumonitis.Chest 2001；120(2)617-24. Sharma K，Jin Y，Guo J，Ziyadeh FN.Neutralization of TGF-βantibody attenuates kidney hypertrophy and the enhancedextracellular matrix gene expresssion in STZ-induced diabeticmice.Diabetes 1996；45522-530. Sime PJ，Xing Z，Graham FL，Csalcy KG，Gauldie J.Adenovector-mediated gene transfer of active transforming growthfactor-β1induces prolonged severe fibrosisinrat lung.JClinInvest 1997；100768-776. Turner-Warwick M，Burrows B，Johnson A.Cryptogenic fibrosinalveolitisresponse to corticosteroid treatment and its effecton survival.Thorax 1980；35593-599. Varga J，Rosenbloom J，Jimenez SA.Transforming growthfactor beta(TGF beta)causes a persistent increase insteady-state amounts of type I and type III collagen andfibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts.BiochemJ 1987；247(3)597-604. Wang Q，Hyde DM，Gotwals PJ，Gin SN.Effects of delayedtreatment with soluble transforming growth factor-betareceptor in a three-dose bleomycin model of lung fibrosis inhamsters.Exp Lung Res 2002；28(6)405-17. Weinreb PH，Simon KJ，Rayhorn P，Yang WJ，Leone DR，DolinskiBM，Pearse BR，Yokota Y，Kawakatsu H，Atakilit A and others.Function-blocking integrin αvβ6 monoclonal antibodies.JBiol Chem 2004；279(17)17875-17887. Zheng H，Wang J，Koteliansky V，J.GP，Hauer-Jensen M.Recombinant soluble transforming growth factor βtype IIreceptor ameliorates radiation enterophay in mice.Gastroenterology 2000；1191286-1296. Zisman DA，Lynch JP，Toews GB，Kazerooni EA，F(xiàn)lint A，MartinezFJ.Cyclophosphamide in the Treatment of Idiopathic PulmonaryFibrosis.Chest 2000；1171619-1626. Ziyadeh FN，Hoffman BB，Han DC，Iglesias-de Ia Cruz MC，Hong SW，Isono M，Chen S，McGowan TA，Sharma K.Long-termprevention of renal insufficiency，excess matrix geneexpression，and glomerular mesangial matrix expansion bytreatment with monoclonal antitransforming growth factor-βantibody in db/db diabetic mice.Proc Natl Acad Sci，USA 2000；97(14)8015-8020. 為了清楚理解的目的通過舉例說明和實(shí)施例已相當(dāng)詳細(xì)地充分描述本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，無需改變本發(fā)明的范圍或其任何具體實(shí)施方案，通過在廣泛和等價(jià)系列條件、制劑和其他參數(shù)內(nèi)修改或改變本發(fā)明可以同樣進(jìn)行，和此類修改或變化希望包含在附加權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，且引入本文作為參考，其程度與每個(gè)單個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e并個(gè)別指出引入作為參考相同。
序列表
<110>Violette，Shelia M
Koopman，Louisa A.
Simon，Kenneth J.
Weinreb，Paul H.
van Vlijmen，Herman W.T.
Saldanha，Jose W.
Lugovskoy，Alexey A.
<120>抗-αvβ6抗體及其用途
<130>2159.0840002
<140>US11/483,190
<141>2006-07-10
<150>US 60/773,310
<151>2005-07-08
<150>US 60/697,442
<151>2005-07-08
<160>152
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化3G9重鏈
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210>2
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化3G9輕鏈
<400>2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
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<220>
<223>人源化8G6重鏈
<400>3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Tyr Ala
20 25 30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<210>4
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化8G6輕鏈
<400>4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
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Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<223>pKJS195載體-3G9形式5輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(711)
<400>5
atg gac ttc cag gtg cag atc ttc agc ttc ctg ctg atc agc gtg agc48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser
1 5 10 15
gtg atc atg agc cgc ggc gag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc96
Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
ctg agc ctg agc ccc ggc gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc144
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser
35 40 45
agc agc gtg agc agc agc tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc192
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
cag gcc ccc agg ctg ctg atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc240
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
atc ccc gcc cgc ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg288
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
acc atc agc agc ctg gag ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cac336
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His
100 105 110
cag tgg agc acc tac ccc ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag384
Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
atc aag cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct432
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat480
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc528
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag576
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac624
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg672
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt711
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>6
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pKJS189載體-3G9載體3重鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
<400>6
atg gac ttc ggc ctg agc tgg gtg ttc ctg gtg ctg gtg ctg aag ggc48
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtg cag tgc gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc ctg gtg cag96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
ccc ggc ggc agc ctg agg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc acc ttc144
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agc cgc tac gtg atg agc tgg gtg cgc cag gcc ccc ggc aag ggc ctg192
Ser Arg Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
gag tgg gtg gcc agc atc agc agc gga ggc cgc atg tac tac ccc gac240
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp
65 70 75 80
acc gtg aag ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac aac gcc aag aac agc288
Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
ctg tac ctg cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac acc gcc gtg tac336
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
tac tgc gcc cgc ggc agc atc tac gac ggc tac tac gtg ttc ccc tac384
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr
115 120 125
tgg ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc gcc agc acc aag ggc432
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
ccc agc gtg ttc ccc ctg gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc480
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
acc gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtg aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg528
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc576
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg624
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg672
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa720
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
tct tgt gac aag act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc768
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc816
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg864
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg912
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc960
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg1008
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc1056
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca1104
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag1152
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc1200
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg1248
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
cct ccc gtg ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc1296
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc1344
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc1392
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
ctg tct ccc ggt1404
Leu Ser Pro Gly
465
<210>7
<211>1404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pKJS196載體-去糖化-3G9形式3重鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
<400>7
atg gac ttc ggc ctg agc tgg gtg ttc ctg gtg ctg gtg ctg aag ggc48
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtg cag tgc gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc ctg gtg cag96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
ccc ggc ggc agc ctg agg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc acc ttc144
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agc cgc tac gtg atg agc tgg gtg cgc cag gcc ccc ggc aag ggc ctg192
Ser Arg Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
gag tgg gtg gcc agc atc agc agc gga ggc cgc atg tac tac ccc gac240
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp
65 70 75 80
acc gtg aag ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac aac gcc aag aac agc288
Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
ctg tac ctg cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac acc gcc gtg tac336
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
tac tgc gcc cgc ggc agc atc tac gac ggc tac tac gtg ttc ccc tac384
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr
115 120 125
tgg ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc gcc agc acc aag ggc432
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
ccc agc gtg ttc ccc ctg gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc480
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
acc gccgcc ctg ggc tgc ctg gtg aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg528
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc576
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg 624
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg 672
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa 720
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
tct tgt gac aag act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc 768
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 816
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 864
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 912
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac cag agc 960
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
305 310 315 320
acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg1008
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc1056
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca1104
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag1152
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc1200
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg1248
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
cct ccc gtg ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc1296
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc1344
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc1392
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
ctg tct ccc ggt1404
Leu Ser Pro Gly
465
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于鼠類3G9重鏈可變結(jié)構(gòu)域的PCR引物
<400>8
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<210>9
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于鼠類3G9重鏈可變結(jié)構(gòu)域的PCR引物
<400>9
ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt39
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于鼠類3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的PCR引物
<400>10
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<210>11
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于鼠類3G9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的PCR引物
<400>11
ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag39
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<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建重鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>12
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<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建重鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>13
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<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>14
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<210>15
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>15
gcagcatcag cccgttagat ctccagcttg gtgcc35
<210>16
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>16
ggaacttaca cttgagctgg cactgcatgt caagg35
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<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈嵌合3G9的PCR引物
<400>17
ccttgacatg cagtgccagc tcaagtgtaa gttcc35
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建重鏈hu3G9形式1&2的PCR引物
<400>18
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建重鏈hu3G9形式1&2的PCR引物
<400>19
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<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈hu3G9形式1，2&3的PCR引物
<400>20
gctgacagcg gccgcgggat ccac 24
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于構(gòu)建輕鏈hu3G9形式1，2&3的PCR引物
<400>21
ggaagatgaa cacactgggt gcgg 24
<210>22
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>22
gctgacagcg gccgcgggat ccaccatgga cttcggcctg agctgggtgt tcctggtgct60
ggtgctgaag ggcgtgcagt gcgaggtgat gctggtggag agcggcggc 109
<210>23
<211>122
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>23
ggcctggtgc agcccggcgg cagcctgagg ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 60
agccgctacg tgatgagctg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc120
ag 122
<210>24
<211>118
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>24
catcagcagc ggaggccgca tgtactaccc cgacaccgtg aagggccgct tcaccatcag60
ccgcgacagc gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac agcctgcgcg ccgaggac 118
<210>25
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>25
accgccgtgt actactgcgc ccgcggcagc atctacgacg gctactacgt gttcccctac60
tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc tccgccagca cc 102
<210>26
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>26
aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcaccgcc60
gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgaaccgg tgaccgtgag c111
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>27
gctgcaccag gccgccgccg ctctcc26
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>28
ccgctgctga tgctggccac ccac 24
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>29
gcagtagtac acggcggtgt cctcggcgcg30
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>30
gctggggccc ttggtgctgg cgg 23
<210>31
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>31
gctgacagcg gccgcgggat ccaccatgga cttcggcctg agctgggtgt tcctggtgct60
ggtgctgaag ggcgtgcagt gcgaggtgca gctggtggag agcggcggc 109
<210>32
<211>122
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>32
ggcctggtgc agcccggcgg cagcctgagg ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc60
agccgctacg tgatgagctg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 120
ag 122
<210>33
<211>118
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>33
catcagcagc ggaggccgca tgtactaccc cgacaccgtg aagggccgct tcaccatcag60
ccgcgacagc gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac agcctgcgcg ccgaggac 118
<210>34
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>34
accgccgtgt actactgcgc ccgcggcagc atctacgacg gctactacgt gttcccctac60
tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc tccgccagca cc 102
<210>35
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>35
aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcaccgcc60
gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgaaccgg tgaccgtgag c111
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>36
gctgcaccag gccgccgccg ctctcc26
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>37
ccgctgctga tgctggccac ccac 24
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>38
gcagtagtac acggcggtgt cctcggcgcg 30
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>39
gctggggccc ttggtgctgg cgg 23
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的PCR引物
<400>40
ccatcagccg cgacaacgcc aagaacagcc tg32
<210>41
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9重鏈的PCR引物
<400>41
caggctgttc ttggcgttgt cgcggctgat gg32
<210>42
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>42
gctgacagcg gccgcgggat ccaccatgga cttccaggtg cagatcttca gcttcctgct60
gatcagcgtg agcgtgatca tgagccgcgg cgagatcgtg ctgacc 106
<210>43
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>43
cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagaggg ccaccctgag ctgcagcgcc60
agcagcagcg tgagcagcag ctacctgtac tggtaccagc agaagcccgg ccaggcc 117
<210>44
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>44
cccaggctgt ggatctacag caccagcaac ctggccagcg gcgtgcccgt gcgcttcagc60
ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctggagcc cgaggac 117
<210>45
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>45
ttcgccgtgt acttctgcca ccagtggagc acctaccccc ccaccttcgg cggcggcacc60
aaggtggaga tcaagcgtac ggtggccgca cccagtgtgt tcatcttcc 109
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>46
gcggggctct gggtcagcac gatc24
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>47
ccacagcctg ggggcctggc cg 22
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>48
gtacacggcg aagtcctcgg gctc24
<210>49
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>49
gctgacagcg gccgcgggat ccaccatgga cttccaggtg cagatcttca gcttcctgct60
gatcagcgtg agcgtgatca tgagccgcgg cgagatcgtg ctgacc 106
<210>50
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>50
cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagaggg ccaccctgag ctgcagcgcc60
agcagcagcg tgagcagcag ctacctgtac tggtaccagc agaagcccgg ccaggcc 117
<210>51
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>51
cccaggctgt ggatctacag caccagcaac ctggccagcg gcgtgcccgc ccgcttcagc60
ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctggagcc cgaggac 117
<210>52
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>52
ttcgccgtgt actactgcca ccagtggagc acctaccccc ccaccttcgg cggcggcacc60
aaggtggaga tcaagcgtac ggtggccgca cccagtgtgt tcatcttcc 109
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>53
gcggggctct gggtcagcac gatc24
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>54
ccacagcctg ggggcctggc cg 22
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>55
gtacacggcg aagtcctcgg gctc24
<210>56
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>56
gctgacagcg gccgcgggat ccaccatgga cttccaggtg cagatcttca gcttcctgct60
gatcagcgtg agcgtgatca tgagccgcgg cgagatcgtg ctgacc 106
<210>57
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>57
cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagaggg ccaccctgag ctgcagcgcc60
agcagcagcg tgagcagcag ctacctgtac tggtaccagc agaagcccgg ccaggcc117
<210>58
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>58
cccaggctgt ggatctacag caccagcaac ctggccagcg gcatccccgc ccgcttcagc60
ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcagca gcctggagcc cgaggac 117
<210>59
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的5’磷酸化頂端鏈寡核苷酸
<400>59
ttcgccgtgt actactgcca ccagtggagc acctaccccc ccaccttcgg cggcggcacc60
aaggtggaga tcaagcgtac ggtggccgca cccagtgtgt tcatcttcc 109
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>60
gcggggctct gggtcagcac gatc24
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>61
ccacagcctg ggggcctggc cg22
<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9輕鏈的底部鏈寡核苷酸
<400>62
gtacacggcg aagtcctcgg gctc 24
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生成3G9輕鏈的PCR引物
<400>63
gtcagcacga tctggccgcg gctcatgatc30
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生成3G9輕鏈的PCR引物
<400>64
gatcatgagc cgcggccaga tcgtgctgac30
<210>65
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生成3G9輕鏈的PCR引物
<400>65
cccaggctgc tgatctacag cacc 24
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生成3G9輕鏈的PCR引物
<400>66
ggtgctgtag atcagcagcc tggg 24
<210>67
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式1輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>67
gag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc ctg agc ctg agc ccc ggc48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc agc agc gtg agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc cag gcc ccc agg ctg tgg144
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc gtg cgc ttc agc192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
ccc gag gac ttc gcc gtg tac ttc tgc cac cag tgg agc acc tac ccc288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag324
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>68
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式2輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>68
gag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc ctg agc ctg agc ccc ggc48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc agc agc gtg agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc cag gcc ccc agg ctg tgg144
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc gcc cgc ttc agc192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cac cag tgg agc acc tac ccc288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag324
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>69
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式3輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>69
gag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc ctg agc ctg agc ccc ggc48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc agc agc gtg agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc cag gcc ccc agg ctg tgg144
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc atc ccc gcc cgc ttc agc192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cac cag tgg agc acc tac ccc288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag324
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>70
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式4輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>70
cag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc ctg agc ctg agc ccc ggc48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc agc agc gtg agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc cag gcc ccc agg ctg tgg144
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc atc ccc gcc cgc ttc agc192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cac cag tgg agc acc tac ccc288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag324
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>71
<211>324
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式5輕鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>71
gag atc gtg ctg acc cag agc ccc gcc acc ctg agc ctg agc ccc ggc48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc ctg agc tgc agc gcc agc agc agc gtg agc agc agc96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac ctg tac tgg tac cag cag aag ccc ggc cag gcc ccc agg ctg ctg144
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tac agc acc agc aac ctg gcc agc ggc atc ccc gcc cgc ttc agc192
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc agc ctg gag240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cac cag tgg agc acc tac ccc288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
ccc acc ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag324
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>72
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式1重鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>72
gag gtg atg ctg gtg gag agc ggc ggc ggc ctg gtg cag ccc ggc ggc48
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
agc ctg agg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc acc ttc agc cgc tac96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
gtg atg agc tgg gtg cgc cag gcc ccc ggc aag ggc ctg gag tgg gtg144
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc agc atc agc agc gga ggc cgc atg tac tac ccc gac acc gtg aag192
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac agc gcc aag aac agc ctg tac ctg240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
cgc ggc agc atc tac gac ggc tac tac gtg ttc ccc tac tgg ggc cag336
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>73
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式2重鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>73
gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc ctg gtg cag ccc ggc ggc48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
agc ctg agg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc acc ttc agc cgc tac96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
gtg atg agc tgg gtg cgc cag gcc cccggc aag ggc ctg gag tgg gtg144
ValMet Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc agc atc agc agc gga ggc cgc atg tac tac ccc gac acc gtg aag192
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac agc gcc aag aac agc ctg tac ctg240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
cgc ggc agc atc tac gac ggc tac tac gtg ttc ccc tac tgg ggc cag336
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>74
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式3和5重鏈
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>74
gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc ctg gtg cag ccc ggc ggc48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
agc ctg agg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc acc ttc agc cgc tac96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
gtg atg agc tgg gtg cgc cag gcc ccc ggc aag ggc ctg gag tgg gtg144
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc agc atc agc agc gga ggc cgc atg tac tac ccc gac acc gtg aag192
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac aac gcc aag aac agc ctg tac ctg240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc288
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
cgc ggc agc atc tac gac ggc tac tac gtg ttc ccc tac tgg ggc cag336
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>75
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式1輕鏈
<400>75
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>76
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式2輕鏈
<400>76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>77
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式3輕鏈
<400>77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>78
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式1重鏈
<400>78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>79
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式2重鏈
<400>79
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>80
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu8G6形式3重鏈
<400>80
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>81
<211>97
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的鼠類重鏈序列
<400>81
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210>82
<211>97
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9HV1重鏈序列
<400>82
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210>83
<211>97
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9HV2重鏈序列
<400>83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210>84
<211>97
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9HV3重鏈序列
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210>85
<211>76
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的VH3-7重鏈序列
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Phe Thr Ile
35 40 45
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
50 55 60
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75
<210>86
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的鼠類輕鏈序列
<400>86
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>87
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9LV1輕鏈序列
<400>87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>88
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9LV2輕鏈序列
<400>88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>89
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9LV3輕鏈序列
<400>89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>90
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9LV4輕鏈序列
<400>90
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>91
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的3G9LV5輕鏈序列
<400>91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr
<210>92
<211>71
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu3G9的L6輕鏈序列
<400>92
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
20 25 30
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
50 55 60
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
65 70
<210>93
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的鼠類重鏈
<400>93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Leu Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>94
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6HV1重鏈序列
<400>94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>95
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6HV2重鏈序列
<400>95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>96
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6VH3重鏈序列
<400>96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>97
<211>76
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的VH1-2重鏈序列
<400>97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Thr Met
35 40 45
Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu
50 55 60
Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75
<210>98
<211>99
<212>PRT
<212>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的鼠類輕鏈序列
<400>98
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro
<210>99
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6LV1輕鏈序列
<400>99
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro
<210>100
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6LV2輕鏈序列
<400>100
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Phe Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>8G6抗體的重鏈CDR1序列
<400>101
Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His
1 5 10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于1A8抗體的重鏈CDR1序列
<400>102
Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met His
1 5 10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1和3G9抗體的重鏈CDR1序列
<400>103
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Val Met Ser
1 5 10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的重鏈CDR1序列
<400>104
Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Asp Leu Ile Glu
1 5 10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的重鏈CDR1序列
<400>105
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5 10
<210>106
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于8G6抗體的重鏈CDR2序列
<400>106
Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>107
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于1A8抗體的重鏈CDR2序列
<400>107
Val Ile Asp Thr Tyr Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210>108
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1抗體的重鏈CDR2序列
<400>108
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210>109
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9抗體的重鏈CDR2序列
<400>109
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly
1 5 10 15
<210>110
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的重鏈CDR2序列
<400>110
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>111
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的重鏈CDR2序列
<400>111
Val Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>112
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于8G6抗體的重鏈CDR3序列
<400>112
Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15
Tyr
<210>113
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于1A8抗體的重鏈CDR3序列
<400>113
Gly Gly Phe Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15
Ser
<210>114
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1抗體的重鏈CDR3序列
<400>114
Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr
1 5 10
<210>115
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9抗體的重鏈CDR3序列
<400>115
Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr
1 5 10
<210>116
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的重鏈CDR3序列
<400>116
Ile Tyr Tyr Gly Pro His Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>117
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的重鏈CDR3序列
<400>117
Ile Asp Tyr Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asp Asp
1 5 10
<210>118
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于8G6抗體的輕鏈CDR1序列
<400>118
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr
1 5 10 15
<210>119
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于1A8抗體的輕鏈CDR1序列
<400>119
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Thr Tyr Ser Tyr Ile His
1 5 10 15
<210>120
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1抗體的輕鏈CDR1序列
<400>120
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210>121
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9抗體的輕鏈CDR1序列
<400>121
Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210>122
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的輕鏈CDR1序列
<400>122
Lys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210>123
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的輕鏈CDR1序列
<400>123
Lys Ala Ser Gln Ala Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210>124
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于8G6抗體和1A8抗體的輕鏈CDR2序列
<400>124
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>125
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1抗體和3G9抗體的輕鏈CDR1序列
<400>125
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210>126
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的輕鏈CDR2序列
<400>126
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210>127
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的輕鏈CDR2序列
<400>127
Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr
1 5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于8G6抗體的輕鏈CDR3序列
<400>128
Gln His Asn Trp Glu Ile Pro Phe Thr
1 5
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于1A8抗體的輕鏈CDR3序列
<400>129
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2B1抗體的輕鏈CDR3序列
<400>130
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于3G9抗體的輕鏈CDR3序列
<400>131
His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2A1抗體的輕鏈CDR3序列
<400>132
Gln Gln His Tyr Gly Ile Pro Trp Thr
1 5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于2G2抗體的輕鏈CDR3序列
<400>133
Gln His His Tyr Gly Val Pro Trp Thr
1 5
<210>134
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的8G6LV3輕鏈序列
<400>134
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Ile Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro
<210>135
<211>70
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于hu8G6的L6輕鏈序列
<400>135
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
20 25 30
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
50 55 60
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
65 70
<210>136
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pKJS195載體-3G9形式5輕鏈
<400>136
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>137
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pKJS189載體-3G9載體3重鏈
<400>137
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Arg Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His GluAla Leu HisAsn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly
465
<210>138
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pKJS196載體-去糖化-3G9形式3重鏈
<400>138
Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Arg Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly
465
<210>139
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式1輕鏈
<400>139
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>140
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式2輕鏈
<400>140
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>141
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式3輕鏈
<400>141
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>142
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式4輕鏈
<400>142
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>143
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式5輕鏈
<400>143
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>144
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式1重鏈
<400>144
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>145
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式2重鏈
<400>145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>146
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hu3G9形式3和5重鏈
<400>146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>147
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于擴(kuò)增寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)模板的寡核苷酸引物
<400>147
catggccttc cgtgttccta20
<210>148
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于擴(kuò)增寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)模板的寡核苷酸引物
<400>148
gcggcacgtc agatcc16
<210>149
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>識(shí)別GADPH的探針
<400>149
ccccaatgtg tccgtc16
<210>150
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于擴(kuò)增RNA第一鏈的PCR引物
<400>150
ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt 40
<210>151
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>源自一致性框架序列的人FR4
<400>151
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>152
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>源自一致性框架序列的人FR4
<400>152
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
表1關(guān)于hu3G9的重和輕鏈序列
表1a 重鏈序列
FR1 CDR1FR2
鼠類 (1)EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYVMSWVRQTPEKRLEWVA
3G9HV1(1)EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYVMSWVRQAPGKGLEWVA
3G9HV2(1)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYVMSWVRQAPGKGLEWVA
3G9HV3(1)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYVMSWVRQAPGKGLEWVA
VH3-7 (1)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS WVRQAPGKGLEWVA
CDR2 FR3
鼠類 (50)SISS-GGRMYYPDTVKG RFTISRDSARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAR
3G9HV1(50)SISS-GGRMYYPDTVKG RFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
3G9HV2(50)SISS-GGRMYYPDTVKG RFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
3G9HV3(50)SISS-GGRMYYPDTVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VH3-7 (50)--------- RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
表1b-輕鏈序列
FR1 CDR1 FR2
鼠類 (1)QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSANSSVSSSYLYWYQQKSGSSPKLWIY
3G9LV1(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLWIY
3G9LV2(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLWIY
3G9LV3(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLWIY
3G9LV4(1)QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLWIY
3G9LV5(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY
L6(1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIY
CDR2FR3CDR3
鼠類 (51)STSNLASGVPVRFSGSGSGTSFSLTISSMEAEDAASYFC HQWSTYPPT
3G9LV1(51)STSNLASGVPVRFSGSGSGTDFTLTISSLEPΞDFAVYFC HQWSTYPPT
3G9LV2(51)STSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSTYPPT
權(quán)利要求
1.一種與αvβ6特異性結(jié)合的人源化抗體，其包含SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO1的氨基酸殘基31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和98-109(CDR3)限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
3.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO2的氨基酸殘基24-35(CDR1)、51-57(CDR2)和90-98(CDR3)限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
4.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO1的氨基酸殘基1-30(FR1)、36-49(FR2)、66-97(FR3)和110-120(FR4)限定的框架區(qū)(FR)。
5.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-23(FR1)、36-50(FR2)、58-89(FR 3)和99-108(FR4)限定的框架區(qū)(FR)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的人源化抗體，其中所述抗體在所述重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列、CDR2序列、CDR3序列中或框架序列中包含至少一個(gè)氨基酸置換。
7.權(quán)利要求6的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)下述氨基酸的置換Q3M和N74S。
8.權(quán)利要求7的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV1)中包含下述氨基酸中的置換Q3M和N74S。
9.權(quán)利要求7的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV2)中包含下述氨基酸置換N74S。
10.權(quán)利要求7的人源化抗體，其中所述抗體包含在所述序列SEQID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV3)。
11.權(quán)利要求6的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含選自E1Q、L47W、I58V、A60V和Y87F的至少一個(gè)氨基酸置換。
12.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV1)中包含氨基酸置換L47W、I58V、A60V和Y87F。
13.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV2)中包含氨基酸置換L47W和I58V。
14.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV3)中包含氨基酸置換L47W。
15.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV4)中包含氨基酸置換E1Q和L47W。
16.權(quán)利要求11的人源化抗體，其中所述抗體包含在SEQ ID NO2的所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV5)序列。
17.一種與αvβ6特異性結(jié)合的人源化抗體，其包含SEQ ID NO1的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(HV3)和SEQ ID NO2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV5)。
18.權(quán)利要求1或權(quán)利要求17的人源化抗體，其中所述互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來源于所述鼠類3G9抗體。
19.權(quán)利要求1或權(quán)利要求17的人源化抗體，其中所述抗體可以與鼠類3G9抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合αvβ6。
20.權(quán)利要求1或權(quán)利要求17的人源化抗體，其中所述抗體通過重組載體產(chǎn)生，所述重組載體包含編碼所述抗體的核酸。
21.權(quán)利要求20的人源化抗體，其中所述重組載體是選自pKJS195、pKJS189和pKJS196的質(zhì)粒。
22.權(quán)利要求21的人源化抗體，其中所述質(zhì)粒pKJS195包含SEQID NO5。
23.權(quán)利要求21的人源化抗體，其中所述質(zhì)粒pKJS189包含SEQID NO6。
24.權(quán)利要求21的人源化抗體，其中所述質(zhì)粒pKJS196包含SEQID NO7。
25.一種人源化抗體，其具有對(duì)于由權(quán)利要求1和17中任何一項(xiàng)的抗體識(shí)別的所述表位的特異性。
26.一種特異性結(jié)合αvβ6的人源化抗體，其包含
(a)包含來自所述鼠類3G9抗體的3個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、和來自人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)框架(FR)序列的人源化輕鏈；和
(b)包含來自所述鼠類3G9抗體的3個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、和來自人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)框架(FR)序列的人源化重鏈。
27.一種分離核酸分子，其包含關(guān)于SEQ ID NO1-5中任何一個(gè)的編碼序列。
28.一種分離多肽，其包含SEQ ID NO1-5中任何一個(gè)的氨基酸序列。
29.一種重組載體，其包含權(quán)利要求27的核酸分子。
30.權(quán)利要求29的重組載體，其進(jìn)一步包含編碼人源化免疫球蛋白輕鏈的融合基因，所述基因包含的核苷酸序列編碼對(duì)于αvβ6具有結(jié)合特異性的、來源于非人抗體輕鏈的CDR、和來源于人起源的輕鏈的框架區(qū)。
31.權(quán)利要求30的重組載體，其中所述非人抗體是鼠類3G9抗體。
32.權(quán)利要求30的重組載體，其中所述載體是質(zhì)粒pKJS195。
33.權(quán)利要求29的重組載體，其進(jìn)一步包含編碼人源化免疫球蛋白重鏈的融合基因，所述基因包含的核苷酸序列編碼對(duì)于αvβ6具有結(jié)合特異性的、來源于非人抗體重鏈的CDR、和來源于人起源的重鏈的框架區(qū)。
34.權(quán)利要求33的重組載體，其中所述非人抗體是鼠類3G9抗體。
35.權(quán)利要求33的重組載體，其中所述載體是質(zhì)粒pKJS189。
36.權(quán)利要求33的重組載體，其中所述載體是質(zhì)粒pKJS196。
37.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求29-36中任何一項(xiàng)的重組載體。
38.一種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由αvβ6介導(dǎo)的疾病的組合物，其包含權(quán)利要求1、17和26中任何一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)可接受的載體。
39.權(quán)利要求38的組合物，其中所述抗體與細(xì)胞毒素劑綴合。
40.一種制備人源化抗體的方法，其包括在適合于人源化抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求37的宿主細(xì)胞，其中使人源化抗體鏈表達(dá)和產(chǎn)生人源化抗體。
41.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括分離所述人源化抗體。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
43.一種治療具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病、或處于具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病危險(xiǎn)中的受試者的方法，其包括給所述受試者施用權(quán)利要求38的組合物，從而減輕或延緩所述疾病的發(fā)作。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述受試者是人。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病是纖維化。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述纖維化是硬皮病、瘢痕化、肝纖維化、腎纖維化、或肺纖維化。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病是牛皮癬。
48.權(quán)利要求43的方法，其中所述疾病是癌癥。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述癌癥是上皮癌。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述癌癥是口腔、皮膚、子宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、腎或結(jié)腸直腸癌。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述疾病是阿爾波特氏綜合征。
52.一種與αvβ6特異性結(jié)合的人源化抗體，其包含SEQ ID NO3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
53.權(quán)利要求52的人源化抗體，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO3的氨基酸殘基31-35(CDR1)、50-66(CDR2)和99-115(CDR3)限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
54.權(quán)利要求52的人源化抗體，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO4的氨基酸殘基24-38(CDR1)、54-60(CDR2)和93-101(CDR3)限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
55.權(quán)利要求52的人源化抗體，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO3的氨基酸殘基1-30(FR1)、36-49(FR2)、67-98(FR3)和116-126(FR4)限定的人框架區(qū)(FR)。
56.權(quán)利要求52的人源化抗體，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含由SEQ ID NO4的氨基酸殘基1-23(FR1)、39-53(FR2)、61-92(FR3)和102-111(FR4)限定的人框架區(qū)(FR)。
57.根據(jù)權(quán)利要求52-56中任何一項(xiàng)的人源化抗體，其中所述抗體在所述重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列、CDR2序列、CDR3序列或框架序列中包含至少一個(gè)氨基酸置換。
58.權(quán)利要求57的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)下述氨基酸的置換A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K。
59.權(quán)利要求58的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV1′)中包含氨基酸置換A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K。
60.權(quán)利要求58的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV2′)中包含氨基酸置換M48I、V68A、R72V和T74K。
61.權(quán)利要求58的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(HV3′)中包含氨基酸置換V68A、R72V和T74K。
62.權(quán)利要求57的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含選自至少一個(gè)下述氨基酸置換E1D、L46F和Y49K。
63.權(quán)利要求62的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV1′)中包含氨基酸置換E1D、L46F和Y49K。
64.權(quán)利要求62的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV2′)中包含氨基酸置換L46F和Y49K。
65.權(quán)利要求62的人源化抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(LV3′)中包含氨基酸置換Y49K。
66.權(quán)利要求52-56中任何一項(xiàng)的人源化抗體，其中所述互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來源于鼠類8G6抗體。
67.權(quán)利要求52-56中任何一項(xiàng)的人源化抗體，其中所述抗體可以與鼠類8G6抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合αvβ6。
68.一種分離核酸分子，其包含SEQ ID NO3-4中任何一項(xiàng)的編碼序列。
69.一種分離多肽，其包含SEQ ID NO3-4中任何一項(xiàng)的氨基酸序列。
70.一種重組載體，其包含權(quán)利要求68的核酸分子。
71.權(quán)利要求70的重組載體，其進(jìn)一步包含編碼人源化免疫球蛋白輕鏈的融合基因，所述基因包含的核苷酸序列編碼對(duì)于αvβ6具有結(jié)合特異性的、來源于非人抗體輕鏈的CDR、和來源于人起源的輕鏈的框架區(qū)。
72.權(quán)利要求71的重組載體，其中所述非人抗體是鼠類8G6抗體。
73.權(quán)利要求70的重組載體，其進(jìn)一步包含編碼人源化免疫球蛋白重鏈的融合基因，所述基因包含的核苷酸序列編碼對(duì)于αvβ6具有結(jié)合特異性的、來源于非人抗體重鏈的CDR、和來源于人起源重鏈的框架區(qū)。
74.權(quán)利要求73的重組載體，其中所述非人抗體是鼠類8G6抗體。
75.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求70-74中任何一項(xiàng)的重組載體。
76.一種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由αvβ6介導(dǎo)的疾病的組合物，其包含權(quán)利要求52-56中任何一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)可接受的載體。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中所述抗體與細(xì)胞毒素劑綴合。
78.一種制備人源化抗體的方法，其包括在適合于人源化抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求75的宿主細(xì)胞，其中使人源化抗體鏈表達(dá)和產(chǎn)生人源化抗體。
79.權(quán)利要求78的方法，其進(jìn)一步包括分離所述人源化抗體。
80.權(quán)利要求78的方法，其中所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
81.一種治療具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病、或處于具有由αvβ6介導(dǎo)的疾病危險(xiǎn)中的受試者的方法，其包括給所述受試者施用權(quán)利要求76的組合物，從而減輕或延緩所述疾病的發(fā)作。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述受試者是人。
83.權(quán)利要求81的方法，其中所述疾病是纖維化。
84.權(quán)利要求81的方法，其中所述疾病是癌癥。
85.權(quán)利要求81的方法，其中所述疾病是阿爾波特氏綜合征。
86.一種人源化抗體，其包含由包含質(zhì)粒pKJS189(SEQ ID NO6)的重組載體產(chǎn)生的重鏈可變結(jié)構(gòu)域形式3(HV3)、和由包含質(zhì)粒pKJS195(SEQ ID NO5)的重組載體產(chǎn)生的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形式5(LV5)。
87.一種人源化抗體，其包含由包含質(zhì)粒pKJS196(SEQ ID NO7)的重組載體產(chǎn)生的去糖基重鏈可變結(jié)構(gòu)域形式3(a-HV3)、和由包含質(zhì)粒pKJS195(SEQ ID NO5)的重組載體產(chǎn)生的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形式5(LV5)。
88.一種減少或預(yù)防患者中的原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移至次級(jí)部位的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與所述原發(fā)性腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中所述配體與所述整聯(lián)蛋白的所述結(jié)合導(dǎo)致所述腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏感性或侵襲力減少。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述腫瘤是癌。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是腺癌。
91.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭頸癌、胃癌和脾臟癌。
92.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是乳腺癌。
93.權(quán)利要求92的方法，其中所述乳腺癌是原位乳腺癌。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述原位乳腺癌選自原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS)。
95.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是子宮內(nèi)膜癌。
96.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是胰腺癌。
97.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌。
98.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是子宮頸癌。
99.權(quán)利要求89的方法，其中所述癌是肺癌。
100.權(quán)利要求88的方法，其中與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的所述配體是抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化單克隆抗體。
103.權(quán)利要求101的方法，其中所述單克隆抗體選自2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5和CSβ6。
104.權(quán)利要求101的方法，其中所述單克隆抗體是3G9。
105.權(quán)利要求101的方法，其中所述單克隆抗體是8G6。
106.權(quán)利要求101的方法，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
107.權(quán)利要求106的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu3G9(BG00011)。
108.權(quán)利要求106的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu8G6。
109.權(quán)利要求88的方法，其中所述配體與至少一種細(xì)胞毒素化合物綴合。
110.權(quán)利要求88的方法，其中給所述患者施用所述配體，連同給所述患者施用至少一種細(xì)胞毒素化合物。
111.權(quán)利要求109或權(quán)利要求110的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、卡里奇霉素、美登素、trichothene、CC1065、白喉A鏈、銅綠假單胞菌外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸蛋白質(zhì)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。
112.權(quán)利要求109或權(quán)利要求110的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自放射性同位素和前體藥物活化酶。
113.權(quán)利要求112的方法，其中所述放射性同位素選自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。
114.權(quán)利要求112的方法，其中所述前體藥物活化酶選自堿性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脫氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶。
115.權(quán)利要求88的方法，其中所述配體以藥物組合物的形式施用于所述患者，所述藥物組合物包含所述配體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
116.權(quán)利要求88或權(quán)利要求115的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的途徑施用于所述患者口部施用、腸胃外施用、顱內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和鼻內(nèi)施用。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的腸胃外途徑施用于所述患者肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用和皮下施用。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述腸胃外途徑包含經(jīng)由注射給所述患者施用所述配體或組合物。
119.一種診斷更可能進(jìn)展至侵襲癌的癌的方法，其包括
(a)從患者獲得包含腫瘤或其部分的癌性上皮組織樣品，和非癌性上皮組織樣品；
(b)使所述組織樣品與一種或多種配體接觸，所述配體與一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合；和
(c)測(cè)定所述組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，
其中相對(duì)于所述非癌性組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平，所述癌性組織樣品中的整聯(lián)蛋白αvβ6表達(dá)水平增加指示在所述患者中存在更可能進(jìn)展至侵襲癌的癌。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述腫瘤是癌。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌是腺癌。
122.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌和脾臟癌。
123.權(quán)利要求122的方法，其中所述癌是乳腺癌。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述乳腺癌是原位乳腺癌。
125.權(quán)利要求124的方法，其中所述原位乳腺癌選自原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS)。
126.權(quán)利要求124的方法，其中所述癌是子宮內(nèi)膜癌。
127.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌是胰腺癌。
128.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌。
129.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌是子宮頸癌。
130.權(quán)利要求120的方法，其中所述癌是肺癌。
131.權(quán)利要求119的方法，其中與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的所述配體是抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
133.權(quán)利要求132的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化單克隆抗體。
134.權(quán)利要求132的方法，其中所述單克隆抗體選自2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5和CSβ6。
135.權(quán)利要求132的方法，其中所述單克隆抗體是3G9。
136.權(quán)利要求132的方法，其中所述單克隆抗體是8G6。
137.權(quán)利要求132的方法，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
138.權(quán)利要求137的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu3G9(BG00011)。
139.權(quán)利要求137的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu8G6。
140.權(quán)利要求119的方法，其中所述配體與至少一種可檢測(cè)標(biāo)記綴合。
141.權(quán)利要求140的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自生色標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、非放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、毒素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、X-放射照相標(biāo)記、自旋標(biāo)記和核磁共振對(duì)比劑標(biāo)記。
142.權(quán)利要求141的方法，其中所述生色標(biāo)記選自二氨基聯(lián)苯胺和4-羥基偶氮-苯-2-羧酸。
143.權(quán)利要求141的方法，其中所述酶標(biāo)記選自蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
144.權(quán)利要求141的方法，其中所述放射性同位素標(biāo)記選自3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc和109Pd。
145.權(quán)利要求141的方法，其中所述非放射性同位素標(biāo)記選自157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc和112In。
146.權(quán)利要求141的方法，其中所述熒光標(biāo)記選自152Eu標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、異硫氰酸酯標(biāo)記、羅丹明標(biāo)記、藻紅蛋白標(biāo)記、藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記、鄰苯二醛標(biāo)記和熒光胺標(biāo)記。
147.權(quán)利要求141的方法，其中所述毒素標(biāo)記選自白喉毒素標(biāo)記、蓖麻毒素標(biāo)記和霍亂毒素標(biāo)記。
148.權(quán)利要求141的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記選自魯米諾標(biāo)記、異魯米諾標(biāo)記、芳香族吖啶酯標(biāo)記、咪唑標(biāo)記、吖啶鎓鹽標(biāo)記、草酸酯標(biāo)記、螢光素標(biāo)記、螢光素酶標(biāo)記和水母素標(biāo)記。
149.權(quán)利要求141的方法，其中所述X-放射照相標(biāo)記是鋇或銫。
150.權(quán)利要求141的方法，其中所述自旋標(biāo)記是氘。
151.權(quán)利要求141的方法，其中所述核磁共振對(duì)比劑標(biāo)記選自Gd、Mn和鐵。
152.一種清除患者中的αvβ6陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與一種或多種αvβ6陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中所述配體與所述整聯(lián)蛋白的所述結(jié)合導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏感性或侵襲力減少。
153.權(quán)利要求152的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞來自轉(zhuǎn)移癌。
154.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是腺癌。
155.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌和脾臟癌。
156.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是乳腺癌。
157.權(quán)利要求156的方法，其中所述乳腺癌是原位乳腺癌。
158.權(quán)利要求157的方法，其中所述原位乳腺癌選自原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS)。
159.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是子宮內(nèi)膜癌。
160.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是胰腺癌。
161.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌。
162.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是子宮頸癌。
163.權(quán)利要求153的方法，其中所述癌是肺癌。
164.權(quán)利要求152的方法，其中與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的所述配體是抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。
165.權(quán)利要求164的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
166.權(quán)利要求165的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化單克隆抗體。
167.權(quán)利要求165的方法，其中所述單克隆抗體選自2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5和CSβ6。
168.權(quán)利要求165的方法，其中所述單克隆抗體是3G9。
169.權(quán)利要求165的方法，其中所述單克隆抗體是8G6。
170.權(quán)利要求165的方法，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
171.權(quán)利要求170的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu3G9(BG00011)。
172.權(quán)利要求170的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu8G6。
173.權(quán)利要求152的方法，其中所述配體與至少一種細(xì)胞毒素化合物綴合。
174.權(quán)利要求152的方法，其中給所述患者施用所述配體，連同給所述患者施用至少一種細(xì)胞毒素化合物。
175.權(quán)利要求173或權(quán)利要求174的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、卡里奇霉素、美登素、trichothene、CC1065、白喉A鏈、銅綠假單胞菌外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸蛋白質(zhì)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。
176.權(quán)利要求173或權(quán)利要求174的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自放射性同位素和前體藥物活化酶。
177.權(quán)利要求176的方法，其中所述放射性同位素選自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。
178.權(quán)利要求176的方法，其中所述前體藥物活化酶選自堿性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脫氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶。
179.權(quán)利要求152的方法，其中所述配體以藥物組合物的形式施用于所述患者，所述藥物組合物包含所述配體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
180.權(quán)利要求152或權(quán)利要求179的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的途徑施用于所述患者口部施用、腸胃外施用、顱內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和鼻內(nèi)施用。
181.權(quán)利要求180的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的腸胃外途徑施用于所述患者肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用和皮下施用。
182.權(quán)利要求181的方法，其中所述腸胃外途徑包含經(jīng)由注射給所述患者施用所述配體或組合物。
183.一種手術(shù)摘除來自所述患者組織或器官的腫瘤后清除來自所述患者的殘留αvβ6陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與所述組織或器官中的一種或多種殘留腫瘤細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中所述配體與所述整聯(lián)蛋白的所述結(jié)合導(dǎo)致所述腫瘤細(xì)胞死亡、化學(xué)敏感性或侵襲力減少。
184.權(quán)利要求183的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞來自轉(zhuǎn)移癌。
185.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是腺癌。
186.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌和脾臟癌。
187.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是乳腺癌。
188.權(quán)利要求187的方法，其中所述乳腺癌是原位乳腺癌。
189.權(quán)利要求188的方法，其中所述原位乳腺癌選自原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS)。
190.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是子宮內(nèi)膜癌。
191.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是胰腺癌。
192.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌。
193.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是子宮頸癌。
194.權(quán)利要求184的方法，其中所述癌是肺癌。
195.權(quán)利要求183的方法，其中與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的所述配體是抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。
196.權(quán)利要求195的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
197.權(quán)利要求196的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化單克隆抗體。
198.權(quán)利要求196的方法，其中所述單克隆抗體選自2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5和CSβ6。
199.權(quán)利要求196的方法，其中所述單克隆抗體是3G9。
200.權(quán)利要求196的方法，其中所述單克隆抗體是8G6。
201.權(quán)利要求196的方法，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
202.權(quán)利要求201的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu3G9(BG00011)。
203.權(quán)利要求201的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu8G6。
204.權(quán)利要求183的方法，其中所述配體與至少一種細(xì)胞毒素化合物綴合。
205.權(quán)利要求183的方法，其中給所述患者施用所述配體，連同給所述患者施用至少一種細(xì)胞毒素化合物。
206.權(quán)利要求204或權(quán)利要求205的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、卡里奇霉素、美登素、trichothene、CC 1065、白喉A鏈、銅綠假單胞菌外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸蛋白質(zhì)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。
207.權(quán)利要求204或權(quán)利要求205的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自放射性同位素和前體藥物活化酶。
208.權(quán)利要求207的方法，其中所述放射性同位素選自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。
209.權(quán)利要求207的方法，其中所述前體藥物活化酶選自堿性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脫氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶。
210.權(quán)利要求183的方法，其中所述配體以藥物組合物的形式施用于所述患者，所述藥物組合物包含所述配體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
211.權(quán)利要求183或權(quán)利要求210的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的途徑施用于所述患者口部施用、腸胃外施用、顱內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和鼻內(nèi)施用。
212.權(quán)利要求211的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的腸胃外途徑施用于所述患者肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用和皮下施用。
213.權(quán)利要求212的方法，其中所述腸胃外途徑包含經(jīng)由注射給所述患者施用所述配體或組合物。
214.一種減少或預(yù)防患者中的原發(fā)性轉(zhuǎn)移前或侵襲前腫瘤進(jìn)展至轉(zhuǎn)移性或侵襲性腫瘤的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的一種或多種配體，所述配體與所述轉(zhuǎn)移前或侵襲前腫瘤中的一種或多種細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白αvβ6亞單位結(jié)合，其中所述配體與所述整聯(lián)蛋白的所述結(jié)合導(dǎo)致減少或預(yù)防所述轉(zhuǎn)移前或侵襲前癌癥細(xì)胞侵入所述患者中的所述原發(fā)性腫瘤周圍的組織區(qū)域內(nèi)。
215.權(quán)利要求214的方法，其中所述轉(zhuǎn)移前或侵襲前腫瘤是癌。
216.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是腺癌。
217.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌選自乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、頭與頸癌、胃癌和脾臟癌。
218.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是乳腺癌。
219.權(quán)利要求218的方法，其中所述乳腺癌是原位乳腺癌。
220.權(quán)利要求219的方法，其中所述原位乳腺癌選自原位導(dǎo)管癌(DCIS)和原位小葉癌(LCIS)。
221.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是子宮內(nèi)膜癌。
222.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是胰腺癌。
223.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌。
224.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是子宮頸癌。
225.權(quán)利要求215的方法，其中所述癌是肺癌。
226.權(quán)利要求214的方法，其中與αvβ6整聯(lián)蛋白結(jié)合的所述配體是抗體或其αvβ6表位結(jié)合片段。
227.權(quán)利要求226的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
228.權(quán)利要求227的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合、靈長(zhǎng)類化或人源化單克隆抗體。
229.權(quán)利要求227的方法，其中所述單克隆抗體選自2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5和CSβ6。
230.權(quán)利要求227的方法，其中所述單克隆抗體是3G9。
231.權(quán)利要求227的方法，其中所述單克隆抗體是8G6。
232.權(quán)利要求227的方法，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
233.權(quán)利要求232的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu3G9(BG00011)。
234.權(quán)利要求232的方法，其中所述人源化單克隆抗體是hu8G6。
235.權(quán)利要求214的方法，其中所述配體與至少一種細(xì)胞毒素化合物綴合。
236.權(quán)利要求214的方法，其中給所述患者施用所述配體，連同給所述患者施用至少一種細(xì)胞毒素化合物。
237.權(quán)利要求235或權(quán)利要求236的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、美法侖、阿霉素、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、卡里奇霉素、美登素、trichothene、CC 1065、白喉A鏈、銅綠假單胞菌外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白質(zhì)、美洲商陸蛋白質(zhì)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。
238.權(quán)利要求235或權(quán)利要求236的方法，其中所述細(xì)胞毒素化合物選自放射性同位素和前體藥物活化酶。
239.權(quán)利要求238的方法，其中所述放射性同位素選自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。
240.權(quán)利要求238的方法，其中所述前體藥物活化酶選自堿性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脫氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶。
241.權(quán)利要求214的方法，其中所述配體以藥物組合物的形式施用于所述患者，所述藥物組合物包含所述配體和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
242.權(quán)利要求214或權(quán)利要求241的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的途徑施用于所述患者口部施用、腸胃外施用、顱內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和鼻內(nèi)施用。
243.權(quán)利要求242的方法，其中所述配體或組合物經(jīng)由選自下列的腸胃外途徑施用于所述患者肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用和皮下施用。
244.權(quán)利要求243的方法，其中所述腸胃外途徑包含經(jīng)由注射給所述患者施用所述配體或組合物。
全文摘要
本發(fā)明在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域中。具體而言，本發(fā)明涉及識(shí)別v6整聯(lián)蛋白的人源化抗體，所述人源化抗體包含非人起源的可變區(qū)和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本發(fā)明還涉及用于其制備、包含其的藥物組合物的方法，以及通過施用人源化抗v6抗體治療各種疾病的方法。本發(fā)明還涉及在腫瘤細(xì)胞和組織表面上差異表達(dá)的整聯(lián)蛋白αvβ6的鑒定，這種差異表達(dá)在確定腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能中的用途，以及使用與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合的配體特別是抗體，診斷和治療/預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和用于清除殘留轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101287841SQ200680032957
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2006年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者S·維奧莉特, L·A·庫(kù)珀曼, K·J·西蒙, P·H·溫萊博, H·范維利吉曼, J·薩爾丹哈, A·A·魯格夫斯科 申請(qǐng)人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司