專利名稱：：日本血吸蟲紫外線(uv)-照射致弱尾蚴的單鏈抗體庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程抗體領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲uv-致弱尾蚴單鏈抗體庫的構(gòu)建及鑒定方法。背景資料血吸蟲病仍然在許多是一種嚴(yán)重危害人類身體健康和生命安全、阻礙疫區(qū)經(jīng)濟發(fā)展和社會進步的人獸共患病。Chitsulo等報道，全世界74個國家，6億人受感染威脅，2億人被感染，其中1.2億人出現(xiàn)了癥狀，2000萬人被嚴(yán)重感染。血吸蟲病病情的控制至今仍然是世界上急待解決的一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。血吸蟲疫苗的開發(fā)研制是血吸蟲病防治研究的重點，照射致弱尾拗是目前能有效抗日本血吸蟲感染的一種免疫原，經(jīng)紫外線照射致弱的血吸蟲尾蚴免疫宿主可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強的免疫保護力，有的減蟲率高達90%，保護力持續(xù)時間長達6個月之久。實驗證明，紫外線照射致弱尾蚴多次免疫動物后，其免疫保護機制轉(zhuǎn)為抗體依賴性的體液免疫為主。隨后又證實了IgG為其主要的效應(yīng)抗體，尤其是提取純化的亞型IgGl抗體可誘導(dǎo)更高的保護力。因此抗體在日本血吸蟲紫外線照射尾蚴多次免疫免誘導(dǎo)的免疫保護機制中起著重要作用。但是由于照射致弱疫苗會造成宿主病理損害、其抗原材料來源有限、制備、保存等問題，限制了其在人體中的應(yīng)用。噬菌體抗體庫技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的基因工程抗體技術(shù)，隨著蛋白組學(xué)時代的到來，大量新發(fā)現(xiàn)基因的表達和功能的研究需要眾多高親和力、高特異性抗體。該技術(shù)可很好地解決此問題，并被認為是抗體工程領(lǐng)域的革命性進展。此技術(shù)用PCR將免疫球蛋白全套可變區(qū)基因擴增出來，克隆到表達載體中，通過與單鏈絲狀噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白表達在噬菌體的表面，使之成為噬菌體抗體。由于此技術(shù)繞過細胞雜交，避免了雜交瘤細胞系不穩(wěn)定的缺點，且操作簡便，庫容量大，成本低，還可不經(jīng)免疫制備人源或鼠源性抗體，故被認為是繼雜交瘤抗體之后的第3代抗體。單鏈抗體是具有與抗原特異性結(jié)合的最小功能單位，它以體積小、滲透性強等特點，可以很方便地導(dǎo)入細胞內(nèi)，產(chǎn)生細胞內(nèi)抗體，結(jié)合、封閉特定抗原，造成細胞的表型剔除，用以研究蛋白質(zhì)功能，探索致病機制。它亦可作為人源性抗體，且其分子小、免疫原性低、用于人體不易產(chǎn)生抗異種蛋白反應(yīng)，易于進行基因操作等特點，因而可開發(fā)出更加理想的分子疫苗。本發(fā)明利用紫外照射致弱尾蚴的體液免疫高保護力的特點和噬菌體抗體庫諸多的優(yōu)點，成功構(gòu)建了紫外照射日本血吸蟲致弱尾呦單鏈抗體庫單鏈抗體(ScFv)表達文庫。近幾年來，構(gòu)建噬菌體抗體庫制備日本血吸蟲特異性單鏈抗體技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)為制備抗血吸蟲感染基因工程全分子抗體奠定了扎實可靠的理論和實驗基礎(chǔ)2001年俞小淙等(俞小淙，蔣欣,等.抗日本血吸蟲膜蛋白特異性單鏈抗體的構(gòu)建及表達，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2001，(3):9-14)成功地構(gòu)建和表達了抗日本血吸蟲膜蛋白特異性單鏈抗體。2003年，陳代雄等(陳代雄，詹希美，何藹,等.抗日本血吸蟲噬菌體抗體庫的構(gòu)建和初步應(yīng)用，熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2003，3(4):391-395.)以FNO-PQ為靶抗原，從構(gòu)建的抗日本血吸蟲噬菌體抗體庫中篩選、富集目的抗體克隆，成功地構(gòu)建了抗日本血吸蟲噬菌體單鏈抗體庫，并從中篩選到抗日本血吸蟲循環(huán)抗原的單鏈抗體。同年，徐勁等(徐勁,吳忠道,等.抗日本血吸蟲卵單抗33F5可變區(qū)輕、重鏈基因的串聯(lián)及克隆，中國血吸蟲病防治雜志，2002，14(3):173-175.)制備了抗日本血吸蟲蟲卵尿素溶性抗原單克隆抗體22F5的基因工程單鏈抗體，宋曉彤等(宋曉彤,馮振卿，等.日本血吸蟲單克隆抗獨特型抗體NP30單鏈抗體基因的構(gòu)建和表達，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2002，(3):26-28)構(gòu)建了日本血吸蟲單克隆抗獨特型抗體NP30單鏈抗體(ScFv)基因。此后，朱毅等(朱毅,等.日本血吸蟲單克隆抗抗獨特型抗體NP48單特異性雙鏈抗體的構(gòu)建表達與初步鑒定，中國血吸蟲病防治雜志，2005,(4):241-245)2005年構(gòu)建和表達日本血吸蟲單克隆抗抗獨特型抗體NP48單特異性雙鏈抗體，并初步鑒定表達產(chǎn)物活性。2006年，岳國峰(岳國峰，等.人源日本血吸蟲Fab抗體庫的構(gòu)建及抗獨特型抗體的篩選、鑒定，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，36(11):997-1000.)等成功構(gòu)建了人源日本血吸蟲Fab抗體庫，并從中獲得人源日本血吸蟲抗獨特型抗體B6，為研制用于人體血吸蟲病免疫預(yù)防的抗獨特型抗體疫苗奠定了基礎(chǔ)。2007年，雷黎等(雷黎，趙志榮等.人源性抗日本血吸蟲噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定，中國人獸共患病學(xué)報，2007，23(4):386-389).從對血吸蟲感染有一定抗性成年人外周血淋巴細胞中擴增出人IgG輕鏈和重鏈Fd段基因片段，成功地構(gòu)建了人源性抗日本血吸蟲Fab段噬菌體抗體庫。何卓等(本課題組)構(gòu)建日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)單鏈抗體(ScFv)表達文庫，并對文庫進行篩選獲得針對日本血吸蟲病疫苗候選分子S正A26-28kDa的特異性單鏈抗體。單鏈抗體庫及其特異性的單鏈抗體應(yīng)用于血吸蟲病研究領(lǐng)域具有重要的意義，它為曰本血吸蟲病的診斷、預(yù)防及治療提供了更經(jīng)濟的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有血吸蟲輻射致弱疫苗的不足，結(jié)合單鏈抗體的諸多優(yōu)點，提供一種富含高效日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體的庫源，可進一步篩選用于血吸蟲病診斷和治療的特異性單鏈抗體，并研究這些抗體的免疫學(xué)特性、生物學(xué)活性和功能。所述日本血吸蟲單鏈抗體庫是采用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建的抗日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴的全套單鏈抗體庫，其庫容量達到1.9乂108，.重組效率為100%。本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種高效的構(gòu)建日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體的庫的方法，包括以下步驟1)紫外照射致弱尾拗動物模型的建立；2)UV致弱尾蚴血清中IgG的測定及其無菌血清的制備；3)總RNA的抽提和mRNA的分離；4)cDNA第一鏈的合成及全套VH和VL基因的PCR擴增；5)全套單鏈抗體ScFv基因的拼接和PCR擴增；6)全套單鏈抗體ScFv基因的噬菌體展示；7)庫容量及重組率的檢測；8)多樣性的鑒定及保護性的鑒定。其中1)步驟中紫外照射條件為紫外燈與待照尾蚴玻片距離14cm，波長254nm，400uw照射1分鐘立即貼腹感染。7)步驟中檢測結(jié)果為庫容量達到1.9X108，重組效率為100%。8)步驟中保護性鑒定方法為選用經(jīng)紫外照射致弱血清被動轉(zhuǎn)移試驗，通過用100條紫外照射致弱尾蚴感染Balb/c雌性小鼠共五次，每次間隔兩周。保護性鑒定結(jié)果為小鼠可獲得42.5%的減蟲率，21.6%的肝減卵率。。本發(fā)明的紫外照射致弱日本血吸蟲尾蚴單鏈抗體庫具有以下優(yōu)勢1、利用了噬菌體抗體庫技術(shù)及單鏈抗體的眾多優(yōu)點，構(gòu)建的日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體庫可以彌補輻射致弱疫苗應(yīng)用的局限性，為開拓新的疫苗發(fā)展策略和新疫苗的設(shè)計提供借鑒。2、為進一步篩選用于血吸蟲病診斷和治療的特異性單鏈抗體、進行抗原表位分析和疫苗研制提供了庫源；同時也為研究這些抗體的免疫學(xué)特性、生物學(xué)活性和功能奠定了基礎(chǔ)。3、可以從紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體庫中獲得的高特異性的單鏈抗體作為探針來篩選cDNA文庫，以獲得保護性抗原的編碼基因序列，加快血吸蟲基因疫苗生產(chǎn)的步伐。4、可用紫外照射致弱尾坳單鏈抗體作為載體制備各種免疫毒素或介導(dǎo)效應(yīng)細胞的雙特異性抗體，為血吸蟲的免疫治療提供新的方法。圖1是本發(fā)明UV致弱尾蚴感染BALB/C小鼠脾臟RNA瓊脂糖凝膠電泳分析RNA凝膠電泳圖顯示，RNA有完整的三條帶，由上往下依次為rRNA28S，rRNA18S，扁A5S。圖2是本發(fā)明VH和VL基因的PCR擴增凝膠電泳圖顯示，VH片段大約為420bp,VL片段大約為360bp。結(jié)果與理論值相符，顯示成功擴增出VH和VL基因片段。圖3是本發(fā)明ScFv基因的拼接凝膠電泳圖顯示，ScFv片段長約780bp，與理論值相符，證實ScFv基因拼接成功。圖4是本發(fā)明重組噬菌體載體的PCR鑒定結(jié)果凝膠電泳圖顯示，隨機挑選的10個菌落，提取質(zhì)粒后，以VH(back)和VL(for)為引物，1-10號菌均擴增出長約為780bp的片段，證實紫外線照射致弱尾蚴單鏈抗體庫的重組率為100%。圖5是本發(fā)明構(gòu)建的UV-致弱尾蚴ScFv庫的多樣性鑒定凝膠電泳圖顯示，用BstNI酶切質(zhì)粒，1-10號質(zhì)粒的酶切圖譜具有多樣性，說明紫外線照射致弱尾蚴單鏈抗體庫的多樣性好，因此從庫中篩選到目的ScFv的機率也越大。圖6是本發(fā)明是UV-致弱尾呦血清被動轉(zhuǎn)移試驗不同組別肝臟蟲卵結(jié)節(jié)的情況其中圖A,正常鼠肝臟陰性對照；B，NS陽性對照組肝臟；C，UV-致弱尾呦鼠血清轉(zhuǎn)移組肝臟；D,正常尾呦感染鼠血清轉(zhuǎn)移組肝臟。結(jié)果顯示，C和D組與生理鹽水對照組小鼠肝臟比較，蟲卵結(jié)節(jié)較少，肝臟顏色較淺，較鮮艷。實驗證實，紫外照射致弱尾呦動物模型有效好的保護力，其單鏈抗體庫中含高效和一定保護力的單鏈抗體。圖7是本發(fā)明UV-致弱尾蚴血清中IgG與血吸蟲不同階段抗原反應(yīng)的變化趨勢圖UV致弱尾蚴血清中IgG的變化趨勢:用間接ELISA檢測UV-致弱尾蚴感染的血清中IgG對血吸蟲不同階段抗原(A為尾蚴抗原、B/C分別為童蟲和成蟲抗原、D為蟲卵抗原)的反應(yīng)性。如圖顯示，小鼠經(jīng)UV致弱尾蚴5次感染以后，血清中針對血吸蟲不同階段抗原的IgG水平的總趨勢隨著免疫次數(shù)的增加而增加；除蟲卵抗原以外，針對其它抗原的特異IgG在第十周的效價均達到1:12800。針對成蟲和童蟲抗原的IgG效價變化趨勢一至，均在第4周開始升高，第8周達高峰，第10周與第8周持平；針對尾蚴抗原的IgG第6周開始升高，第10周達到高峰；針對蟲卵抗原的IgG前6周無顯著性變化，第8周升高，第10周IgG到峰值，效價為1:3200，遠低于針對其它抗原成分的效價。從圖中可以看出，UV致弱尾呦多次感染小鼠后能誘導(dǎo)高滴度的IgG水平，其中以成蟲、童蟲最為明顯，尾蚴、蟲卵次之。圖8是不同感染劑量組的UV致弱尾呦血清中IgG的動態(tài)變化圖用伺接ELISA檢測不同劑量組(A組-100條，B組-200條，C組-300條)的UV-致弱尾蚴感染血清針對尾呦抗原的特異性IgG抗體變化，檢測稀釋度為1:100。如圖所示不同感染劑量組中以A組感染100條UV致弱尾蚴劑量最佳。具體實施方式下面對本發(fā)明日本血吸蟲uv-致弱尾蚴單鏈抗體庫的實施例進行詳細說明實施例一日本血吸蟲uv-致弱尾蚴單鏈抗體庫的構(gòu)建1、紫外照射致弱尾蚴動物模型的建立將Babl/c雌性小鼠42只，按感染劑量不同分三組，每組14只。(A組-100條，B組-200條，C組-300條)共感染五次，每次間隔兩周。紫外燈的測試條件紫外燈管長15cm，將探測頭固定在紫外燈中心點7.5cm處，暗室下測試不同距離下的照射強度，每個距離測試三次，取平均值。感染條件紫外燈與待照尾蚴玻片距離14cm，波長254nm，400uw照射1分鐘立即貼腹感染。每次感染后3天，取小鼠尾靜脈血ELISA法測定效價。紫外燈的照射強度測定紫外燈管長15cm，將探測頭固定在紫外燈中心點7.5cm處，暗室下測試不同距離下的照射強度，每個距離測試三次，取平均值。數(shù)據(jù)見表1。由表可見，紫外線的強度與距離成反比；照射最佳條件為待照尾蚴玻片放在紫外燈7.5cm處的中心位置，二者垂直距離14cm,波長254nm，400uw1分鐘。表l不同距離下紫外線強度測試表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、UV致弱尾蚴血清中IgG的測定及其無菌血清的制備間接ELISA測定血清效價用包被稀釋液將H本血吸蟲不同階段的抗原稀釋到50ug/ml，包被100ul/孔4。C過夜；5%脫脂牛奶封閉，37°C2h。洗滌，加入1:100-12800倍比稀釋鼠血清，37'C2h;洗滌，加入HRP標(biāo)記抗鼠IgG(工作濃度1:5t)00)100ul/孔，37。C2h;洗滌，加入底物顯色10min;2M硫酸終止.E960酶標(biāo)儀波長450nm測定吸光值。待測樣本OD450值與陰性對照OD45o值的比值P/N〉2.l判為陽性；抗體的效價達到l:12800后，將小鼠眼球放血，用50mlEP管收集，置37。C水浴2h，4500rpm常溫離心，分離血清，0.45濾膜過濾除菌和RBC碎片，分裝成0.4毫升/管，-2(TC保存。3、總RNA的抽提和raRNA的分離取效價達l:12800以上的小鼠脾臟混合，Trizol試劑提取脾臟總RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。紫外分光光度計測定A260/A28()比值，鑒定RNA的質(zhì)量。小鼠脾細胞RNA質(zhì)和量的鑒定RNA凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA有完整的三條帶，rRNA28S，rRNA18S，rRNA5S。紫外分光光度計檢測A260/A28()的比值為1.851,濃度為9069.3ug/ml。證明總RNA純度好，RNA的質(zhì)和量均達到實驗要求。4、cDNA第一鏈的合成及全套VH和VL基因片段的擴增按照MBI公司RT試劑盒說明書以小鼠脾臟RNA為模板，oligo(dt)18為引物，M-mulv反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。然后再以cDNA為模板，分別用VH和VL上下游引物，擴增全套VH和VL基因。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94°C，30sec，65°C，45see，72°C，45sec;共30個循環(huán)。然后72°C延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用Takara膠回收試劑盒回收VH和VL目的片段。全套VH和VL基因的擴增兩步法RT-PCR，擴增得到VH和VL片段。凝膠電泳結(jié)果顯示，VH片段大約為420bp，VL片段大約為360bp。結(jié)果與理論值相符，顯示成功擴增出VH和VL基因片段。5、全套單鏈抗體ScFv基因的拼接和PCR擴增以等量(50ng)的VH和VL膠回收產(chǎn)物互為模板和引物，重疊PCR法擴增將VH和VL片段隨機拼接成ScFv，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94°C，30sec,65°C，45sec,72°C，45sec;共7個循環(huán)，然后72°C,3min。反應(yīng)完畢后，50ul反應(yīng)體系中補加VH(back)和VL(for)各lul，lOXbuffer0.5ul，在ddH20為2.5ul，使整個反應(yīng)體系為55ul,PCR擴增，條件為94。C預(yù)變性3min:94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec:共30個循環(huán)。然后72°C延伸7min。凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用Takara膠回收試劑盒回收ScFv目的片段。.ScFv基因的拼接將純化的等量VH和VL基因互為模板和引物，經(jīng)重疊PCR法拼接并擴增得到ScFv基因片段。凝膠電泳結(jié)果顯示，ScFv片段長約780bp，與理論值相符，證實ScFv基因拼接成功。6、全套單鏈抗體ScFv基因的噬菌體展示將純化的ScFv片段用SfiI，Notl雙酶切后的產(chǎn)物(約150ng)與經(jīng)同種雙酶切預(yù)切的pCANTAB5E噬菌體載體(約250ng)按l:3摩爾比混合后，16。C連接過夜。用20ulddH20溶解乙醇純化的連接產(chǎn)物，取10ul純化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至50ul感受態(tài)TGl細胞，電轉(zhuǎn)化杯寬O.lcm，電轉(zhuǎn)化條件1.8KV,4.7ms，電轉(zhuǎn)化后立即加入lml預(yù)溫的2xYT-G培養(yǎng)液，于37°C250rpm培養(yǎng)lh，取少量菌液，用2xYT培養(yǎng)液以10倍梯度Mfi，分別取100ul涂布SOBAG平板，30。C培養(yǎng)過夜，計算菌落數(shù)，測定庫容。剩下的菌液以100ul每板涂布SOBAG平板，30。C培養(yǎng)過夜，2xYT洗下菌落后，加入甘油使終濃度為20%，混勻后于-70。C低溫冰箱保存。留取一部分菌液(約5ml)，用2xYT培養(yǎng)液將菌液稀釋至OD60(r0.3，記下終體積。加入氨芐青霉素使終濃度為100ug/ml，加入葡萄糖使終濃度為2%。37°C250rpm培養(yǎng)lh。加M13K07(加入量為5xl0、5x0.5x終體積)，37°C,250rpm培養(yǎng)lh。1000gxlOmin離心沉淀，小心去掉上清，用10ml2xYT-AK重懸沉淀，37°C，250卬m培養(yǎng)過夜。1000gx20min離心沉淀細菌。取上清到聚丙烯離心管中，即為重組的初級噬菌體表面展示抗體庫，將上清用O.45um孔徑的過濾器過濾。4'C保存。實施例二日本血吸蟲uv-致弱尾蚴單鏈抗體庫的鑒定1、庫容量及重組率的檢測將ScFv-pCANTAB5E連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌TG1,10倍梯度稀釋后涂布SOBAG平板，過夜培養(yǎng)后，按SOBAG平板的菌落數(shù)計算庫容量。隨機挑取SOBAG平板上的菌落10個，分別加入5ml的2xYT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，以VH(back)和VL(for)為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)模式為94CC預(yù)變性3min;94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec，共30個循環(huán)；72°C延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。檢測是否含有插入子，算出實際庫容量。結(jié)果為W稀釋的SOBAG平板上，菌落數(shù)為19，故庫容為1.9X108。隨機挑選的10個菌落，提取質(zhì)粒后，以VH(back)和VL(for)為引物，均擴增出長約為780bp的片段，證實紫外線照射致弱尾蚴單鏈抗體庫的重組率為100%，實際庫容為1.9X108。2、多樣性的鑒定將上述挑選的10個菌落的質(zhì)粒，用BstNI酶切，凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，觀察每個質(zhì)粒酶切片段的差異來確定單鏈抗體庫的多樣性。結(jié)果顯示用BstM酶切質(zhì)粒，酶切圖譜具有多樣性，說明紫外線照射致弱尾蚴單鏈抗體庫的多樣性好，因此從庫中篩選到目的ScFv的機率也越大。3、保護性的鑒定一一被動轉(zhuǎn)移試驗將6周左右，雌性BALB/C鼠共21只分三組，UV-血清組，感染血清組，NS對照組，每組7只；將己收集的無菌紫外致弱尾蚴血清、45天正常尾蚴感染血清及無菌生理鹽水，按組別注射至小鼠尾靜脈，每組分三次，感染前兩小時注射一次，感染后1周和3周再各注射一次，每次注射0.4毫升。正常尾蚴攻擊，尾蚴數(shù)為40士2條。攻擊感染45天后處死小鼠，與NS對照組比較，分別計算減蟲率和減卵率。免疫保護效果評價指標(biāo)如下-.1)經(jīng)左心室一肝門靜脈灌注收集血吸蟲成蟲計算減蟲率。減蟲率(％)=(1-免疫組檢獲成蟲數(shù)/對照組檢獲成蟲數(shù))X100%2)每只肝臟稱重、研磨，加入10n/。NaOH于37'C消化過夜。取50ul涂片兩張，鏡檢全部蟲卵數(shù)，計算每克肝蟲卵數(shù)。減卵率(％)=(1-免疫組每克肝組織蟲卵數(shù)/對照組每克肝組織蟲卵數(shù))X100%被動轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果將建庫時收集的無菌UV-致弱尾拗血清在攻擊感染前以及感染后一周,三周，共三次轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，得到42.5%減蟲率，顯著高于感染組的減蟲率22.PA;肝減卵率為21.6%,與感染組的26.6%相比兩組別之間無顯著性差異(P>0.05)。但兩組和生理鹽水對照組小鼠肝臟比較，蟲卵結(jié)節(jié)較少，肝臟顏色較淺，較鮮艷。實驗證實，紫外照射致弱尾蚴動物模型有效好的保護力，其單鏈抗體庫中含高效和一定保護力的單鏈抗體。表4血清被動轉(zhuǎn)移小鼠的減蟲效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>VMS,vaccinatedmiceserumUV致弱尾呦鼠血清；IMS,Infectedmiceserum45天感染鼠血清；NS為生理鹽;*小鼠死1只P!P"分別為1，2組與3組的比較ps為1，2組間的比較。表5血清被動轉(zhuǎn)移小鼠的減卵效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>VMS,vaccinatedmiceserumUV致弱尾呦鼠血清；IM&Infectedmiceserum45天感染鼠血清NS為生理鹽水；*小鼠死1只；P'P2分別為1，2組與3組的比較13為1,2組間的比較。權(quán)利要求1、建立的一種日本血吸蟲單鏈抗體的庫，其特征在于是采用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建的抗日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴的全套單鏈抗體庫，其庫容量達到1.9×108，重組效率為100％。2、一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述日本血吸蟲單鏈抗體的庫的方法，其特征在于包括以下步驟1)紫外照射致弱尾蚴動物模型的建立；2)UV致弱尾蚴血清中IgG的測定及其無菌血清的制備；3)總RNA的抽提和mRNA的分離；4)cDNA第一鏈的合成及全套VH和VL基因的PCR擴增；5)全套單鏈抗體ScFv基因的拼接和PCR擴增；6)全套單鏈抗體ScFv基因的噬菌體展示；7)庫容量及重組率的檢測；8)多樣性的鑒定及保護性的鑒定。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種日本血吸蟲單鏈抗體的庫的構(gòu)建方法，其特征在于l)步驟中紫外照射條件為暗室條件下，待照尾蚴玻片放在紫外燈7.5cm處的中心位置，二者垂直距離14cm，波長254nm，400uw照射1分鐘立即貼腹感染。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種日本血吸蟲單鏈抗體的庫的構(gòu)建方法，其特征在于7)步驟中檢測結(jié)果為庫容量達到1.9X108，重組效率為100%。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種日本血吸蟲單鏈抗體的庫的構(gòu)建方法，其特征在于8)步驟中保護性鑒定方法為選用經(jīng)紫外照射致弱血清被動轉(zhuǎn)移試驗，通過用IOO條紫外照射致弱尾蚴感染Balb/c雌性小鼠共五次，每次間隔兩周。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種日本血吸蟲單鏈抗體的庫的構(gòu)建方法，其特征在于8)步驟中保護性鑒定結(jié)果為小鼠可獲得42.5%的減蟲率，21.6%的肝減卵。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴的全套單鏈抗體。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程抗體領(lǐng)域，利用紫外照射致弱尾蚴的體液免疫高保護力的特點和噬菌體抗體庫的優(yōu)點，首次成功的構(gòu)建了日本血吸蟲UV-致弱尾蚴單鏈抗體(ScFv)表達文庫。日本血吸蟲UV-弱尾蚴單鏈抗體庫的庫容量為1.9*10⁸，重組率100％，多樣性100％，建庫時的UV-致弱尾蚴血清被動轉(zhuǎn)移試驗得到42.5％減蟲率和21.6％的肝減卵率，證實了此庫中含高效和一定保護力的單鏈抗體。構(gòu)建日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體庫，提供了一個富含高效日本血吸蟲紫外照射致弱尾蚴單鏈抗體的庫源，彌補了輻射致弱疫苗應(yīng)用的局限性，為開拓新的疫苗發(fā)展策略和新疫苗的設(shè)計提供借鑒。文檔編號C40B40/02GK101240452SQ20081003065公開日2008年8月13日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日發(fā)明者周帥鋒,汪世平申請人:汪世平;周帥鋒