專利名稱：一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境可疑內(nèi)分泌干擾物生物活性的判別預(yù)測(cè)方法，具體說(shuō)是基于
雌激素受體(estrogen rec印tor， ER) H12螺旋構(gòu)象的變化來(lái)識(shí)別有機(jī)物雌激 素受體激動(dòng)和拮抗作用的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，多種天然的和人工合成的化學(xué)物質(zhì)因?yàn)槟軌蚰M或抑制體內(nèi)激素的 作用對(duì)人類及其他物種產(chǎn)生嚴(yán)重危害而受到廣泛關(guān)注。1960s，雷切爾.卡遜在《寂
靜的春天》 一書中提到一些環(huán)境化學(xué)物質(zhì)能夠干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)；三十年后，有研
究發(fā)現(xiàn)，歐美國(guó)家成年男子的精子數(shù)和精液量大約減少了一半，生殖系統(tǒng)發(fā)育異 常和生殖力降低等現(xiàn)象相應(yīng)增加，經(jīng)過(guò)分析得出造成這主要是由環(huán)境內(nèi)分泌干擾 物特別是環(huán)境雌激素等外源性物質(zhì)影響并損害生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的結(jié)果
(Carlsen E， Giwercman A， Keiding N, et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J， 1992, 305: 609-613.)。目前，環(huán)境污染 物質(zhì)對(duì)生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響和損害己經(jīng)成為科學(xué)家們新的研究熱點(diǎn)。環(huán)境雌激 素(environmental estrogens,或environmental hormones)是內(nèi)分泌干f尤物 中較為重要的一種，它們是通過(guò)與雌激素受體結(jié)合或影響細(xì)胞信號(hào)途徑等其它方 式模擬或部分模仿雌激素，發(fā)揮類似雌激素效應(yīng)的化合物。其中，環(huán)境污染物以 與內(nèi)源性雌激素類似的形式與雌激素受體結(jié)合，使受體的構(gòu)象發(fā)生改變，形成配 體-受體復(fù)合物，復(fù)合物再結(jié)合到細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合域的雌激素響應(yīng)元素(ERE) 上，誘導(dǎo)或抑制有關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)一系列雌激素 依賴性生理生化過(guò)程造成影響，產(chǎn)生各種環(huán)境擬/抗激素效應(yīng)的受體介導(dǎo)模式尤 其受到關(guān)注。
ER受體與配體結(jié)合后，自身構(gòu)型會(huì)受配體的影響發(fā)生變化而產(chǎn)生改變。配 體與ER結(jié)合，可以表現(xiàn)為雌激素激動(dòng)劑和(或)拮抗劑的作用。通過(guò)受體介導(dǎo) 途徑產(chǎn)生效應(yīng)的環(huán)境雌激素雖均能與雌激素受體結(jié)合，但是在不同生物體組織和 器官內(nèi)表現(xiàn)出不同的激動(dòng)或拮抗的作用，不同污染物所表現(xiàn)的ER激動(dòng)劑效應(yīng)或 (和)拮抗劑作用都與ER高親和力的相互作用有關(guān)，但其表現(xiàn)出的生物效應(yīng)卻 完全不同。環(huán)境中具有擬/抗雌激素效應(yīng)的有機(jī)污染物種類繁多，數(shù)目龐大，許 多在結(jié)構(gòu)上與體內(nèi)天然雌激素沒(méi)有相似性，而且每年都有大量新化學(xué)物產(chǎn)生。因 此，首先面對(duì)的挑戰(zhàn)是如何快速有效地判斷環(huán)境污染物是ER激動(dòng)劑還是拮抗
劑，亦或是選擇性的激動(dòng)劑(拮抗劑)，以識(shí)別其內(nèi)分泌干擾作用的類型，以便 進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，為風(fēng)險(xiǎn)管理工作提供科學(xué)依據(jù)。由于環(huán)境中污染物結(jié)構(gòu)
各異且數(shù)目與日俱增，因財(cái)力、人力和時(shí)間所限，單純依賴實(shí)驗(yàn)室工作來(lái)進(jìn)行
ER激動(dòng)劑/拮抗劑篩選顯然是不現(xiàn)實(shí)的，目前迫切需要發(fā)展非實(shí)驗(yàn)性的環(huán)境雌激 素篩選評(píng)價(jià)方法，對(duì)于環(huán)境污染物的擬/抗雌激素效應(yīng)首先進(jìn)行快速甄別，在此 基礎(chǔ)上再進(jìn)行精細(xì)測(cè)試和研究?；诜肿幽M方法的結(jié)構(gòu)活性相關(guān)(Structure Activity Relationship, SAR)技術(shù)可在環(huán)境雌激素結(jié)構(gòu)與其ER激動(dòng)/拮抗性之間 架起橋梁，使得解決這一難題成為可能(王連生，韓朔睽.有機(jī)污染物的定量結(jié) 構(gòu)-活性相關(guān).1993，北京中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社)。這一方法不受實(shí)驗(yàn)條件和測(cè) 試儀器的限制，采用各種分子力學(xué)和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)來(lái)研究和預(yù)測(cè)化合物的生物活 性，因而在面對(duì)大批量化合物時(shí)具有尤為明顯的優(yōu)勢(shì)。
隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)步，在利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)中，目前SAR 方法也從傳統(tǒng)的二維模型預(yù)測(cè)發(fā)展為可以根據(jù)化合物三維空間構(gòu)象信息參數(shù)和 活性指標(biāo)建立合適的三維SAR模型(3D-SAR)， P. SCHMIEDER等人(P. SCHMIEDER et al., A reactivity pattern for discrimination of ER agonism and antagonism based on 3-D molecular attributes, SAR and QSAR in Environmental Research, 2002 Vol. 13 (2)， pp. 353-364)通過(guò)構(gòu)建化合物的三 維模型，考慮了化合物柔性的影響，用于區(qū)分ER可能的激動(dòng)劑與拮抗劑，研究 表明與分子體積相關(guān)的參數(shù)，包括可接近表面和范德華表面的大小對(duì)區(qū)分ER激 動(dòng)劑和拮抗劑具有明顯的效用。Minutolo等人(F. Minutolo， R. Bellini, et al.， Monoaryl-Substituted Salicylaldoximes as Ligands for Estrogen Receptor |3.丄 Med. Chem., 2008. 51(5): p. 1344-1351.)使用分子對(duì)接方法研究了單芳香基取 代的水楊醛肟類化合物與ERP的結(jié)合模式。表明中間苯環(huán)上的取代物會(huì)影響此 類化合物與ER(3的結(jié)合能力，其中含氯取代物同ERP具有較好的結(jié)合，并在體 內(nèi)以激動(dòng)相態(tài)存在。但是，這些方法均存在如下先驗(yàn)的理論假設(shè)，即化合物的激 動(dòng)/拮抗性僅取決于其與受體配體結(jié)合區(qū)(Ligand Binding Domain, LBD)活性 口袋的結(jié)合模式，若一批化合物激動(dòng)/拮抗選擇性不僅受控于其與靶標(biāo)點(diǎn)作用方
式，而且還取決于受體LBD構(gòu)象改變，則所得SAR模型的穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)能力都 會(huì)受到較大影響。最初的研究(Katzenellenbogen, B.S.， Montano, M.M.， etal.， Antiestrogens: mechanisms and actions in target cells,丄Steroid Biochem. Mol. Biol. 1995,53,387-393.)表明，具有抗雌激素效應(yīng)的化合物一般都具有較長(zhǎng)的 尾鏈，這一尾鏈的存在會(huì)改變這些分子與雌激素受體活性口袋的結(jié)合方式。但是 Nettles等人(Nettles KW， Sun丄et al. ， Allosteric control of ligand selectivity between estrogen receptors a and p: implications for other nuclear receptors. Molecular Cell, 2004 13:317-327)的研究表明較小的分子也可能使得結(jié)構(gòu)LBD 區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其變?yōu)檗卓剐螒B(tài)?？梢?jiàn)，單純從活性口袋出發(fā)難以 區(qū)分有機(jī)物的激動(dòng)/拮抗效應(yīng)。
雌激素配體結(jié)合區(qū)中由12個(gè)a螺旋和一個(gè)連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的三層螺旋 形成了結(jié)合配體小分子的疏水口袋?；衔镞M(jìn)入疏水口袋與受體結(jié)合后可誘導(dǎo)受 體構(gòu)象變化，使受體C端的a螺旋(Helix12螺旋，H12) /AF2像一個(gè)蓋子折疊 在口袋的上方，關(guān)閉配體進(jìn)出口袋的通道，穩(wěn)定受體與配體的結(jié)合，同時(shí)在受體 中形成了一個(gè)新的能與蛋白質(zhì)(如共激活因子或共抑制因子)相互作用的表面。以 前認(rèn)為激動(dòng)劑可以充滿活性口袋并誘導(dǎo)了單一的活性構(gòu)象，但近來(lái)晶體結(jié)構(gòu)研究 發(fā)現(xiàn)受體活性口袋存在多種活性構(gòu)象，能夠以不同方式適應(yīng)各種配體。核受體的 活性口袋結(jié)構(gòu)會(huì)根據(jù)結(jié)合配體性質(zhì)的不同而發(fā)生重排，引起口袋不同區(qū)域的尺寸 變化，配體結(jié)合區(qū)晶體結(jié)構(gòu)顯示活性口袋可以擴(kuò)張和縮小，如Skafar等的研究 表明雌激素受體F功能區(qū)能夠調(diào)節(jié)hERa配體轉(zhuǎn)錄激活活性，F(xiàn)區(qū)與H12連接， 具有高度的延展性，容易環(huán)繞在LBD表面，不同激動(dòng)劑或拮抗劑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致F 區(qū)及整個(gè)LBD區(qū)的構(gòu)象變化(Skafar D.F.， Koide S,. Understanding the human estrogen receptor-alpha using targeted mutagenesis. Molecular 3nd Cellular Endocrinology, 2006, 246: 83-90.)。 H12決定著內(nèi)部所結(jié)合配體的疏水表面尺
寸，對(duì)配體結(jié)合區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活功能發(fā)揮具有非常重要的作用。大量的晶體結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)表明，碳端的H12構(gòu)象的變化與配體-雌激素受體復(fù)合物可能產(chǎn)生的激動(dòng)或拮 抗效應(yīng)相關(guān)。H12螺旋的位置對(duì)污染物的激動(dòng)劑/拮抗劑活性具有重要的識(shí)別作 用，污染物結(jié)合后引發(fā)H12構(gòu)象變化的不同會(huì)導(dǎo)致不同的輔因子結(jié)合區(qū)暴露在 受體表面，從而與不同的輔因子結(jié)合，發(fā)揮其激動(dòng)劑/拮抗劑活性，共激活因子 和共抑制因子在受體表面的結(jié)合區(qū)域有顯著交迭，這可能是部分選擇性激動(dòng)劑/
拮抗劑既能與共激活因子結(jié)合又可以與共抑制因子結(jié)合的根本原因。已有的
SAR研究方法多是基于分子力學(xué)的分子對(duì)接，只能模擬EDs與激素受體口袋的 結(jié)合，因此無(wú)法判斷LBD 口袋以外H12螺旋位置對(duì)于污染物激動(dòng)劑/拮抗劑活性 的識(shí)別作用。
另外，有機(jī)污染物與雌激素受體的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，結(jié)合中伴隨著 污染物和受體大分子體系構(gòu)象的改變(van Lipzig MMH, Ter Laak AM， et al., Prediction of ligand binding affinity and orientation of xenoestrogens to the estrogen receptor by molecular dynamics simulations and the linear interaction energy method. J Med Chem， 2004， 47:1018—1030)。同源模建和晶體衍射得到
的受體結(jié)構(gòu)是靜態(tài)的，只能顯示某一瞬時(shí)的分子構(gòu)象。而激素受體分子又有一定 的柔性，其構(gòu)象會(huì)隨結(jié)合污染物的不同發(fā)生一定程度的變化，因此對(duì)相關(guān)結(jié)構(gòu)的 分子動(dòng)力學(xué)模擬在闡明伴隨配體結(jié)合的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)變化，區(qū)分污染物是具 有擬雌激素效應(yīng)(即激動(dòng)劑)、抗雌激素效應(yīng)(即拮抗劑)將非常重要。通過(guò)比 較經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與ER結(jié)合后H12螺旋位置 與典型的ER激動(dòng)/拮抗劑H12螺旋位置，可以定性判別該污染物的激動(dòng)/拮抗作 用。
文獻(xiàn)檢索結(jié)果表明，在本發(fā)明完成之前，還未發(fā)現(xiàn)基于分子動(dòng)力學(xué)方法分析 ER的LBD結(jié)構(gòu)中H12螺旋位置的變化對(duì)污染物擬/抗雌激素效應(yīng)影響進(jìn)行識(shí)別 的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
1. 發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題。
針對(duì)環(huán)境有機(jī)污染物擬/抗雌激素效應(yīng)的快速確定對(duì)每一種化合物進(jìn)行生物 化學(xué)和毒理實(shí)驗(yàn)需要巨大的人力、物力、財(cái)力，目前已有的雌激素激動(dòng)/拮抗劑 篩選和預(yù)測(cè)方法受限于對(duì)于雌激素受體本身構(gòu)象動(dòng)態(tài)信息的獲取和描述，對(duì)污染 物激動(dòng)/拮抗效應(yīng)的識(shí)別預(yù)測(cè)能力有限。本發(fā)明的目的是提供一種有機(jī)物雌激素 受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方法，基于分子動(dòng)力學(xué)方法分析ER的LBD結(jié)構(gòu)中 H12螺旋位置的變化，快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地識(shí)別污染物擬/抗雌激素效應(yīng)。
2. 技術(shù)方案
本發(fā)明的原理是利用分子動(dòng)力學(xué)手段，計(jì)算與分析有機(jī)物與雌激素受體結(jié)合
過(guò)程，基于配體結(jié)合方式和雌激素配體結(jié)合區(qū)構(gòu)象的變化，特別是ER的LBD 結(jié)構(gòu)中H12螺旋位置的變化，識(shí)別有機(jī)物是ER激動(dòng)劑還是拮抗劑的一種方法。
采用的技術(shù)方案如下 一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方法，其步驟包括-
(1) 根據(jù)已有雌激素受體與配體結(jié)合方式和其在體內(nèi)發(fā)揮作用區(qū)別，從
蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)庫(kù)中選擇包含與受測(cè)化合物結(jié)構(gòu)類似的雌 激素受體晶體結(jié)構(gòu)，作用位點(diǎn)的選擇采用SitelD (SYBYL7.3, Tripos Inc.)等分子模擬方法尋找受體大分子的活性口袋，并結(jié)合 晶體結(jié)構(gòu)中配體分子的結(jié)合方式確定結(jié)合的活性口袋，選擇活性 殘基周圍一定范圍的殘基組成底物的結(jié)合口袋。在目前結(jié)晶的諸 多ER配體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)中，許多結(jié)構(gòu)由多條肽鏈組成，即部分氨 基酸殘基無(wú)法結(jié)晶出來(lái)，這些氨基酸殘基多處于二級(jí)結(jié)構(gòu)銜接的 環(huán)區(qū)。但在隨后進(jìn)行的研究中，要求整個(gè)受體結(jié)構(gòu)由一條鏈組成， 不能存在斷裂，因而當(dāng)選擇的受體晶體結(jié)構(gòu)不完整，缺少部分氨
基酸信息時(shí)，使用同源模建等方法將這些區(qū)域補(bǔ)齊。
(2) 構(gòu)建有機(jī)污染物分子的空間結(jié)構(gòu)并進(jìn)行構(gòu)型和能量?jī)?yōu)化，采用分子
對(duì)接計(jì)算可疑環(huán)境內(nèi)分泌污染物與雌激素受體活性口袋結(jié)合的作 用模式。具體地說(shuō)構(gòu)建有機(jī)物結(jié)構(gòu)，使用Tripos力場(chǎng)對(duì)化合物 進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，選擇電荷選擇為Gasteiger-H(jckel電荷，能量收 斂標(biāo)準(zhǔn)為0.0"lkcal/mol，最大迭代次數(shù)設(shè)置為1000次。使用 Surflex分子對(duì)接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進(jìn)行分子 對(duì)接，參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)；
(3) 對(duì)構(gòu)建好的雌激素受體-配體復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化模擬。具體
地說(shuō)，分子動(dòng)力學(xué)模擬是在常溫常壓(NPT)下由AMBER程序 包完成的。使用AMBER的ff03力場(chǎng)參數(shù)描述體系的蛋白質(zhì)分子， 使用GAFF力場(chǎng)描述配體分子。保留晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，并將 整個(gè)系統(tǒng)放入充滿TIP3P水分子模型的立方體的周期性盒子中， 蛋白質(zhì)或復(fù)合物距離盒子的最短具體為10A，并根據(jù)需要加入必 要的Na+或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個(gè)別水分子被 Na+或Cr離子所替換。使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,
控制碰撞頻率為1.0PS—1，同時(shí)維持體系壓力為1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，
對(duì)于所有涉及氫原子的鍵長(zhǎng)使用SHAKE算法控制含氫鍵的運(yùn) 動(dòng)，截?cái)喟霃皆O(shè)定為10A，動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)間步長(zhǎng)為2.0fs，每1ps 保存一個(gè)構(gòu)象。具體的模擬過(guò)程如下1.結(jié)構(gòu)優(yōu)化，運(yùn)行500步 的最陡下降法(ste印est descent),然后使用共軛梯度法 (conjugate gradient)使得體系的能量收斂；2.升溫，在50ps 內(nèi)，對(duì)受體蛋白的空間位置進(jìn)行束縛，使得體系溫度上升到300K;
3. 溶劑體系平衡；同樣對(duì)受體蛋白的空間位置進(jìn)行約束,進(jìn)行50ps
的分子動(dòng)力學(xué)模擬，使得模擬體系通過(guò)釋放過(guò)高能量而得到放松；
4. 分子動(dòng)力學(xué)模擬不再進(jìn)行位置約束，對(duì)體系進(jìn)行2.0ns的分
子動(dòng)力學(xué)模擬。對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行分析，根據(jù)勢(shì)能、動(dòng)能、
總能量、溫度、壓力、體積、密度、RMSD等隨時(shí)間變化的曲線， 判斷整體結(jié)構(gòu)是否達(dá)到平衡，平衡的標(biāo)志是構(gòu)象差異RMSD隨時(shí) 間變化不顯著。
(4)污染物擬/抗雌激素作用識(shí)別。分析動(dòng)力學(xué)模擬獲得的蛋白質(zhì)構(gòu)象與 初始構(gòu)象的區(qū)別，計(jì)算雌激素受體配體結(jié)合區(qū)H12螺旋附近的氨 基酸在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的RMSD值隨時(shí)間的變化，來(lái)獲得真實(shí) 環(huán)境中配體與雌激素配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合模式。計(jì)算分子動(dòng)力學(xué)模 擬前后的ER構(gòu)象差異的RMSD值，比較經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到 可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與ER結(jié)合后H12螺旋位置與典型的 ER激動(dòng)/拮抗劑H12螺旋位置，可以識(shí)別該污染物的激動(dòng)/拮抗作 用。H12螺旋蓋在口袋上方，則識(shí)別為激動(dòng)作用為主，H12的這 一精確位置在已知結(jié)構(gòu)的LBD結(jié)合中高度保守，是轉(zhuǎn)錄激活的必 備條件。而在拮抗劑與ER的結(jié)合中，H12的這一位置被污染物 阻止，迫使H12移動(dòng)，形成可阻止有轉(zhuǎn)錄能力的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)2 (Activation Function 2， AF隱2)構(gòu)象所致。 上述受體種類包括能夠介導(dǎo)生物體內(nèi)雌激素響應(yīng)的各種物種和亞型的雌激 素受體。根據(jù)已有雌激素受體實(shí)驗(yàn)測(cè)定所使用受體的物種和亞型，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫(kù)(PDB)中選擇與不同類型激動(dòng)劑和拮抗劑結(jié)合的雌激素受體晶體結(jié)構(gòu)建立 ER模型，作用位點(diǎn)的選擇是采用SitelD (SYBYL7.3， Tripos Inc.)等分子模擬
方法尋找受體大分子的活性口袋，選擇活性殘基周圍一定范圍內(nèi)的殘基組成底物
結(jié)合口袋。在目前結(jié)晶的諸多ER配體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)中，許多結(jié)構(gòu)由多條肽鏈組成，
即部分氨基酸殘基無(wú)法結(jié)晶出來(lái)，這些氨基酸殘基多處于二級(jí)結(jié)構(gòu)銜接的環(huán)區(qū)。 但在隨后進(jìn)行的研究中，要求整個(gè)受體結(jié)構(gòu)由一條鏈組成，不能存在斷裂，因而 當(dāng)選擇的受體晶體結(jié)構(gòu)不完整，缺少部分氨基酸信息時(shí)，使用同源模建等方法將 這些區(qū)域補(bǔ)齊。
上述有機(jī)物的能量?jī)?yōu)化使用Tripos力場(chǎng)，電荷選擇為Gasteiger-HGckel電 荷，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.05kcal/mol，最大迭代次數(shù)設(shè)置為1000次。使用Surflex
分子對(duì)接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進(jìn)行分子對(duì)接，參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn) 參數(shù)。
上述分子動(dòng)力學(xué)模擬是在常溫常壓(NPT)下由AMBER程序包完成的。使 用AMBER的ff03力場(chǎng)參數(shù)描述體系的蛋白質(zhì)分子，使用GAFF力場(chǎng)描述配體 分子。保留晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，并將整個(gè)系統(tǒng)放入充滿TIP3P水分子模型的 立方體的周期性盒子中，蛋白質(zhì)或復(fù)合物距離盒子的最短具體為10A，并根據(jù)需 要加入必要的Na+或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個(gè)別水分子被Na+或 Cr離子所替換。使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,控制碰撞頻率為1.0ps人 同時(shí)維持體系壓力為1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，對(duì)于所有涉及氫原子的鍵長(zhǎng)使用SHAKE 算法控制含氫鍵的運(yùn)動(dòng)，截?cái)喟霃皆O(shè)定為10A，動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)間步長(zhǎng)為2.0fs， 每1ps保存一個(gè)構(gòu)象。具體的模擬過(guò)程如下1.結(jié)構(gòu)優(yōu)化，運(yùn)行500步的最陡下 降法(steepest descent),然后使用共軛梯度法(conjugate gradient)使得體 系的能量收斂；2.升溫，在50ps內(nèi)，對(duì)受體蛋白的空間位置進(jìn)行約束，使得體 系溫度上升到300K; 3.溶劑體系平衡；同樣對(duì)受體蛋白的空間位置進(jìn)行約束，
進(jìn)行50PS的分子動(dòng)力學(xué)模擬，使得模擬體系放松；4.分子動(dòng)力學(xué)模擬不再進(jìn)
行位置束縛，對(duì)體系進(jìn)行2.0ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行分析， 根據(jù)勢(shì)能、動(dòng)能、總能量、溫度、壓力、體積、密度、RMSD等隨時(shí)間變化的 曲線，判斷整體結(jié)構(gòu)是否達(dá)到平衡，平衡的標(biāo)志是構(gòu)象差異RMSD隨時(shí)間變化 不顯著。
上述污染物擬/抗雌激素作用識(shí)別方法特征是分析動(dòng)力學(xué)模擬獲得的蛋白 質(zhì)構(gòu)象與初始構(gòu)象的區(qū)別，計(jì)算雌激素受體配體結(jié)合區(qū)H12螺旋附近的氨基酸 在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的RMSD值隨時(shí)間的變化，來(lái)獲得真實(shí)環(huán)境中配體與雌激
素配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合模式。計(jì)算分子動(dòng)力學(xué)模擬前后的ER構(gòu)象差異的RMSD 值，比較經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與ER結(jié)合后H12螺 旋位置與典型的ER激動(dòng)/拮抗劑H12螺旋位置。H12螺旋蓋在口袋上方，則識(shí) 別為激動(dòng)作用為主，H12的這一精確位置在己知結(jié)構(gòu)的LBD結(jié)合中高度保守， 是轉(zhuǎn)錄激活的必備條件。而在拮抗劑與ER的結(jié)合中，H12的這一位置被污染物 阻止，迫使H12移動(dòng)，形成可阻止有轉(zhuǎn)錄能力的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)2構(gòu)象所致。 3.有益成果
采用本發(fā)明方法可以真實(shí)的再現(xiàn)環(huán)境污染物與雌激素受體結(jié)合過(guò)程，基于分 子動(dòng)力學(xué)模擬H12螺旋位置變化，從而有效識(shí)別有機(jī)物的擬/抗雌激素作用，方 法成本低廉簡(jiǎn)便，能夠節(jié)省大量的人力物力財(cái)力，為大規(guī)模開(kāi)展毒害化學(xué)品環(huán)境 安全性評(píng)價(jià)(REACH)進(jìn)行提供相應(yīng)的基礎(chǔ)工具與快捷途徑。


圖1為1ERE中具有晶體結(jié)構(gòu)的序列同完整序列的比對(duì)；
圖2為來(lái)自與PDB庫(kù)的1ERE (左)與補(bǔ)齊后的1ERE結(jié)構(gòu)(右)； 圖3為化合物17卩雌二醇(17p-Estradiol)分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程的勢(shì)能圖4為己烯雌酚(Diethystilbestrol)，4-羥基他莫昔芬(4-OH-Tamoxifene，4-OHT)
經(jīng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后與ER的結(jié)合方式作用圖5為雌二醇，己烯雌酚，4-羥基他莫昔芬與染料木素間RMSD值在分子動(dòng)力 學(xué)模擬過(guò)程中的變化示意具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明
實(shí)施例1:
采用本發(fā)明方法處理雌激素受體缺失結(jié)構(gòu)補(bǔ)齊問(wèn)題。在分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中，
需要保持整個(gè)蛋白質(zhì)為一條單鏈，不能由多個(gè)肽段組成。但是實(shí)際中在PDB庫(kù)
中所能得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，常常會(huì)出現(xiàn)部分氨基酸殘缺，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鏈的斷裂， 采用同源模建差的方法補(bǔ)齊缺失結(jié)構(gòu)。
采用人雌激素受體a亞型晶體結(jié)構(gòu)(PDBID: 1ERE)作為初始結(jié)構(gòu)。1ERE 的結(jié)構(gòu)在H1-H2螺旋間的Loop區(qū)以及H9-H10螺旋間的Loop區(qū)均存在缺失，使得整個(gè)1ERE結(jié)構(gòu)由三條不相連肽段組成。從PDB庫(kù)中獲得1ERE的晶體結(jié) 構(gòu)及完整的一級(jí)序列，將具有晶體結(jié)構(gòu)的序列同完整序列進(jìn)行比對(duì)(圖1)，缺 失部分按loop區(qū)處理，利用同源模建法構(gòu)建了 1ERE的完整序列(圖2)。
實(shí)施例2:
采用本發(fā)明方法處理復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬。AMBER無(wú)法自動(dòng)識(shí)別非標(biāo) 準(zhǔn)的氨基酸/核酸及配體分子，在對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬前，需要設(shè)定復(fù) 合物中配體分子的力場(chǎng)。采用AMBER的Antechamber模塊給配體分子加力場(chǎng) 參數(shù)，力場(chǎng)采用標(biāo)準(zhǔn)AMBER力場(chǎng)(general AMBER force field, GAFF)，電荷 采用半經(jīng)驗(yàn)的AM1-BCC算法得到。通過(guò)Antechamber,可以使得系統(tǒng)識(shí)別配 體的原子鍵和原子類型的信息，并加入系統(tǒng)缺失的力場(chǎng)參數(shù)。
在tLeap中使用ff03力場(chǎng)和GAFF力場(chǎng)，并將小分子力場(chǎng)信息載入tLeap， 這時(shí)tLeap可以讀入并正確識(shí)別復(fù)合物。在體系中增加必要的用于平衡電荷的 Na+原子或Cr原子，加入TIP3P類型的水分子，保存整個(gè)體系(包括復(fù)合物和 水分子)的拓?fù)湮募妥鴺?biāo)文件。
利用sander模塊進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。包括結(jié)構(gòu)優(yōu)化，升溫，體系平衡和 分子動(dòng)力學(xué)模擬等過(guò)程。結(jié)構(gòu)優(yōu)化過(guò)程共1000步，前500步采用最陡下降法， 后500步采用共軛梯度法使得體系能量收斂；升溫過(guò)程為50ps，使得體系溫度 升至300k，期間對(duì)蛋白質(zhì)空間位置進(jìn)行約束；體系平衡過(guò)程同樣對(duì)蛋白質(zhì)空間 位置進(jìn)行約束，共50ps,使得整個(gè)體系放松；分子動(dòng)力學(xué)模擬中不再對(duì)蛋白質(zhì) 進(jìn)行約束，共計(jì)進(jìn)行2.0ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。在全部過(guò)程中，使用Langevin 恒溫器維持溫度，控制碰撞頻率為1.0ps"，維持體系1atm,對(duì)于涉及氫原子的 運(yùn)動(dòng)使用SHAKE算法控制氫鍵的運(yùn)動(dòng)，截?cái)喟霃皆O(shè)為10A，動(dòng)力學(xué)模擬步長(zhǎng)為 2.0fs，每1ps保存一個(gè)構(gòu)象。
實(shí)施例3:
采用本發(fā)明方法識(shí)別典型雌激素激動(dòng)型配體17p雌二醇(17p-Estradiol) H12
螺旋的位置。
雌二醇與雌激素受體配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合模式已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段得到測(cè)定。選 擇雌激素與人類雌激素受體a亞型晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼為1ERE)，使用同源模
建的手法補(bǔ)齊缺失的氨基酸殘基。
利用這一結(jié)構(gòu)作為初始模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。通過(guò)圖3可以看出，在
2ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，復(fù)合物分子構(gòu)型在較短時(shí)間內(nèi)已經(jīng)處于平衡狀 態(tài)，在全部分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，復(fù)合物的構(gòu)象變化不大，RMSD值一直穩(wěn) 定在3.4A。同時(shí)可以看到，經(jīng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后，氨基酸殘基與配體形成氫鍵網(wǎng)絡(luò) 并未消失，說(shuō)明這一氫鍵網(wǎng)絡(luò)有助于整個(gè)體系的穩(wěn)定(圖3)。
本例中雌激素H12螺旋的RMSD值在整個(gè)動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中變化較小，在 最初短時(shí)間震蕩后，系統(tǒng)穩(wěn)定在3.2A左右振動(dòng)，這說(shuō)明在本例模擬的天然環(huán)境 中，雌二醇在同雌激素結(jié)合后，復(fù)合物，尤其是雌激素配體結(jié)合區(qū)的H12螺旋 處的構(gòu)象基本沒(méi)有變化，說(shuō)明這此化合物在與雌激素結(jié)合時(shí)均起到激動(dòng)劑的作 用，復(fù)合物以激活型態(tài)存在，能夠激活雌激素效應(yīng)。
實(shí)施例4:
采用本發(fā)明方法識(shí)別3種有機(jī)物的擬/抗雌激素效應(yīng)。有機(jī)物包括己烯雌酚 (Diethystilbestrol)， 4-羥基他莫昔芬(4-OH-Tamoxifene， 4-OHT)和染料木 素Genistein(GEN)。
其中己烯雌酚雖然擁有通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段測(cè)定的結(jié)構(gòu)(PDB編碼為1S9P)，但 是此三維結(jié)構(gòu)中缺少H12螺旋部分的信息，本發(fā)明中利用對(duì)接手法解決此類三 級(jí)結(jié)構(gòu)殘缺的問(wèn)題。4-羥基他莫昔芬與染料木素均擁有合適的三維結(jié)構(gòu)(PDB 編碼分別為3ERT與1X7R)。但與三種配體結(jié)合的雌激素配體結(jié)合區(qū)構(gòu)象并不 一致，尤其是H12螺旋區(qū)域的構(gòu)象間存在較大差異。
為了比較這三種化合物進(jìn)入雌激素配體結(jié)合區(qū)后H12螺旋的變化，本例中 將三種配體對(duì)接入實(shí)施例1獲得的受體LBD活性口袋內(nèi)，并利用分子動(dòng)力學(xué)模 擬復(fù)合物構(gòu)象的變化趨勢(shì)。選用雌激素受體與實(shí)施例3相同。
構(gòu)建了這幾種化合物的結(jié)構(gòu)，并使用Tripos力場(chǎng)對(duì)化合物進(jìn)行能量?jī)?yōu)化， 電荷選擇為Gasteiger-H(ickel電荷，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.05kcal/mol，最大迭代次 數(shù)設(shè)置為1000次。使用Surflex將化合物與受體活性口袋對(duì)接，選擇其中結(jié)合 模式與實(shí)驗(yàn)得到的晶體結(jié)構(gòu)最為相似的作為初始構(gòu)象。
利用分子對(duì)接得到的結(jié)構(gòu)作為初始模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。經(jīng)過(guò)2ns的分子動(dòng) 力學(xué)模擬，得到上述幾個(gè)分子在ER配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合方式及其引起的構(gòu)象變
化。通過(guò)對(duì)整個(gè)體系的平衡分析可以看出，在整個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程中，己烯雌酚和染 料木素達(dá)到平衡所用的時(shí)間較短，而4-羥基他莫昔芬所達(dá)到平衡所需的時(shí)間較
長(zhǎng)。并且，通過(guò)對(duì)LBD的RMSD值統(tǒng)計(jì)可以看出，在4-羥基他莫昔芬的動(dòng)力學(xué) 模擬過(guò)程時(shí)，0.6ns左右RMSD值明顯增大，說(shuō)明此時(shí)間配體結(jié)合區(qū)發(fā)生了構(gòu) 象變化，從分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化上看，H12螺旋發(fā)生了旋轉(zhuǎn)。并 且，這一變化是在極短的時(shí)間內(nèi)完成，表明H12螺旋構(gòu)象的變化并非緩慢進(jìn)行 而是發(fā)生了一次突變。在此突變之后，整個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)象又重新回歸穩(wěn)定，說(shuō)明整 個(gè)蛋白質(zhì)重新得到一個(gè)新的平衡構(gòu)象。通過(guò)計(jì)算得到，H12螺旋在平衡前后的 RMSD差值在0.5A左右。從整個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程中抽樣得到H12螺旋平衡前后的蛋 白質(zhì)構(gòu)型，從圖4中可以看出，ER的LBD結(jié)構(gòu)，尤其是H12螺旋的構(gòu)象發(fā)生 了重要的變化。在分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后，4-羥基他莫昔芬的RMSD值與 其他三者有較大差異，差值約在0.5A，而四者中，僅4-羥基他莫昔芬由于尾鏈 的存在，使得H12螺旋遠(yuǎn)離活性口袋，表現(xiàn)出拮抗作用，其他三者H12螺旋均 位于覆蓋于口袋上方，都是激動(dòng)劑(圖5)。
權(quán)利要求
1. 一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方法，包括以下步驟:(1)根據(jù)已有雌激素受體與配體結(jié)合方式和其在體內(nèi)發(fā)揮作用，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)中選擇包含與受測(cè)化合物結(jié)構(gòu)類似的雌激素受體晶體結(jié)構(gòu)；(2)構(gòu)建有機(jī)污染物分子的空間結(jié)構(gòu)并進(jìn)行構(gòu)型和能量?jī)?yōu)化，采用分子對(duì)接計(jì)算可疑環(huán)境內(nèi)分泌污染物與雌激素受體活性口袋結(jié)合的作用模式；(3)對(duì)構(gòu)建好的雌激素受體-配體復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化模擬；(4)有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別，分析動(dòng)力學(xué)模擬獲得的蛋白質(zhì)構(gòu)象與初始構(gòu)象的區(qū)別，計(jì)算雌激素受體配體結(jié)合區(qū)H12螺旋附近的氨基酸在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的RMSD值隨時(shí)間的變化，來(lái)獲得真實(shí)環(huán)境中配體與雌激素配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合模式；計(jì)算分子動(dòng)力學(xué)模擬前后的ER構(gòu)象差異的RMSD值，比較經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與ER結(jié)合后H12螺旋位置與典型的ER激動(dòng)和拮抗劑H12螺旋位置，可以識(shí)別該污染物的激動(dòng)和拮抗作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l中所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方 法，其特征在于利用分子動(dòng)力學(xué)手段，計(jì)算與分析有機(jī)物與雌激素受體結(jié) 合過(guò)程，根據(jù)配體結(jié)合方式和雌激素配體結(jié)合區(qū)構(gòu)象的變化，特別是ER 的LBD結(jié)構(gòu)中H12螺旋位置的變化，識(shí)別有機(jī)物是ER激動(dòng)劑還是拮抗劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的識(shí)別方 法，其特征在于步驟(l)中根據(jù)已有雌激素受體與配體結(jié)合方式和其在 體內(nèi)發(fā)揮的作用，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)中選擇包含與受測(cè)化合物結(jié)構(gòu)類似的 雌激素受體晶體結(jié)構(gòu)，作用位點(diǎn)的選擇采用SiteID分子模擬方法尋找受 體大分子的活性口袋，并結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)中配體分子的結(jié)合方式確定結(jié)合的 活性口袋，選擇活性殘基周圍一定范圍的殘基組成底物的結(jié)合口袋。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作 用的識(shí)別方法，其特征在于步驟(2)中化合物結(jié)構(gòu)與能量?jī)?yōu)化使用Tripos 力場(chǎng)，電荷選擇為Gasteiger-H ii ckel電荷，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為 0. 05kcal/raol,最大迭代次數(shù)設(shè)置為1000次；使用Surf lex分子對(duì)接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進(jìn)行分子對(duì)接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的 識(shí)別方法，其特征在于步驟(3)中所述的雌激素受體-配體復(fù)合物的分子 動(dòng)力學(xué)優(yōu)化模擬，模擬是在常溫常壓下由AMBER程序包完成的，使用AMBER 的ff03力場(chǎng)參數(shù)描述體系的蛋白質(zhì)分子，使用GAFF力場(chǎng)描述配體分子， 保留晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，并將整個(gè)系統(tǒng)放入充滿TIP3P水分子模型的立 方體的周期性盒子中，蛋白質(zhì)或復(fù)合物距離盒子的最短具體為10A,并根 據(jù)需要加入必要的Na'或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個(gè)別水分子 被Na+或Cr離子所替換，使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,控制碰 撞頻率為l.Ops—',同時(shí)維持體系壓力為l個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，對(duì)于所有涉及氫 原子的鍵長(zhǎng)使用SHAKE算法控制含氫鍵的運(yùn)動(dòng)，截?cái)喟霃皆O(shè)定為10A，動(dòng) 力學(xué)模擬時(shí)間步長(zhǎng)為2.0fs,每0.2ps保存一個(gè)構(gòu)象，具體的模擬過(guò)程如 下l.結(jié)構(gòu)優(yōu)化，運(yùn)行500步的最陡下降法，然后使用共軛梯度法使得體 系的能量收斂；2.升溫，在50ps內(nèi)，對(duì)受體蛋白的空間位置進(jìn)行束縛， 使得體系溫度上升到300K; 3.溶劑化動(dòng)力學(xué)；同樣對(duì)受體蛋白的空間位置 進(jìn)行東縛，進(jìn)行50ps的分子動(dòng)力學(xué)模擬，使得模擬體系放松；4.分子動(dòng) 力學(xué)模擬不再進(jìn)行位置東縛，對(duì)體系進(jìn)行2.0ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的 識(shí)別方法，其特征在于步驟(3)中所述的對(duì)于復(fù)合物構(gòu)象處于平衡的判 定是建立在對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)勢(shì)能、動(dòng)能、 總能量、溫度、壓力、體積、密度和RMSD隨時(shí)間變化的曲線，判斷整體 結(jié)構(gòu)是否達(dá)到平衡，平衡的標(biāo)志是構(gòu)象差異RMSD隨時(shí)間變化不顯著。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的 識(shí)別方法，其特征在于步驟(3)中通過(guò)控制分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中各步 參數(shù)的設(shè)定，能夠在最終的模擬過(guò)程中得到接近自然條件的"真實(shí)"環(huán)境。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作用的 識(shí)別方法，其特征在于由于采用的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件Amber與分子對(duì)接 軟件SYBYL所支持力場(chǎng)的不同，特征步驟(2)中小分子選用Tripos力場(chǎng)， 而在特征步驟(3)中小分子改用GAFF力場(chǎng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗作 用的識(shí)別方法，其特征在于步驟U)中通過(guò)比較經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到 可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與ER結(jié)合后H12螺旋位置與典型的ER激動(dòng)和拮 抗劑的H12螺旋位置，識(shí)別有機(jī)物的雌激素激動(dòng)和拮抗作用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的一種有機(jī)物雌激素受體激動(dòng)和拮抗 作用的識(shí)別方法，其特征在于步驟(3)和(4)中所述的的RMSD值通過(guò) 分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算得到，且RMSD計(jì)算的參考構(gòu)象為分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算前的初 始構(gòu)象。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種有機(jī)物雌激素受激動(dòng)和拮抗體作用的識(shí)別方法。利用分子動(dòng)力學(xué)手段，計(jì)算與分析有機(jī)物與雌激素受體結(jié)合過(guò)程，基于配體結(jié)合方式和雌激素配體結(jié)合區(qū)構(gòu)象的變化，特別是ER的LBD結(jié)構(gòu)中H12螺旋位置的變化，識(shí)別有機(jī)物是ER激動(dòng)劑還是拮抗劑。本發(fā)明可以有效識(shí)別有機(jī)物的擬/抗雌激素作用，方法成本低廉簡(jiǎn)便，能夠節(jié)省大量的人力物力財(cái)力，為大規(guī)模開(kāi)展毒害化學(xué)品環(huán)境安全性評(píng)價(jià)(REACH)進(jìn)行提供相應(yīng)的基礎(chǔ)工具與快捷途徑。
文檔編號(hào)C40B30/02GK101381894SQ20081012372
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者磊 劉, 張愛(ài)茜, 彭素芬, 遠(yuǎn) 藺, 韓朔睽, 高常安 申請(qǐng)人:南京大學(xué)