一種從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種從火水母刺細(xì)胞毒液中提取 的多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 北部灣火水母（Tamoya alata Uchida)是僅分布在我國(guó)北部灣海域的一種大型 劇毒水母，觸腕長(zhǎng)且具有大量的刺絲囊細(xì)胞，內(nèi)含主要活性成分為蛋白質(zhì)/多肽的毒液，與 人或動(dòng)物接觸時(shí)該刺細(xì)胞會(huì)扎入皮膚，可深入到真皮部位，并釋放細(xì)胞內(nèi)貯存的毒素，造成 蟄傷。根據(jù)受傷嚴(yán)重程度不同，受害者被蟄處即時(shí)出現(xiàn)皮膚紅腫、刺痛、流血、皮膚潰爛等現(xiàn) 象，嚴(yán)重者虛弱，發(fā)熱，嘔吐，甚至死亡。宄其原因，水母觸腕的刺細(xì)胞內(nèi)含有大量的水母毒 素，主要是結(jié)構(gòu)新穎的蛋白類物質(zhì)。
[0003] 水母種類不同，其生理結(jié)構(gòu)以及體內(nèi)所含的毒素成分和活性也存在較大差異，這 就致使不同種類水母的毒素的分離純化工作難以效仿，只能通過(guò)繁雜的試驗(yàn)摸索得到。所 以水母毒素的分離純化工作具有很大的難度。發(fā)明人對(duì)火水母毒液進(jìn)一步研宄，從該毒液 中可以分離出一種具有顯著抗腫瘤活性的多肽，該毒液具有顯著的抗腫瘤活性，相應(yīng)活性 成分是一種蛋白質(zhì)。
[0004] 鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤。是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病 率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。鼻咽癌大多對(duì)放射治療具有中度敏感性，放射治療是鼻咽癌 的首選治療方法。但是對(duì)較高分化癌，病程較晚以及放療后復(fù)發(fā)的病例，手術(shù)切除和化學(xué)藥 物治療亦屬于不可缺少的手段。因此，亟需一種保守的治療方法是亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題和/或缺陷，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu) 點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽，其能夠抑制 鼻咽癌腫瘤細(xì)胞株CNE-1，CNE-2生長(zhǎng)，誘導(dǎo)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞株CNE-2凋亡。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種所述多肽的提取方法，操作簡(jiǎn)單，分離步驟少，適 宜于快速分離；分離條件溫和，能最大程度地保存所得蛋白質(zhì)的抗腫瘤活性。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種所述多肽的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種從火水母刺細(xì)胞毒液中 提取的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0010] 一種從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽的提取方法，從火水母刺細(xì)胞毒液中提取 毒液蛋白，之后依次使用Histrap SP強(qiáng)陽(yáng)尚子交換柱和Histrap Q強(qiáng)陰尚子交換柱從毒液 蛋白中分離如權(quán)利要求1所述的多肽。
[0011] 優(yōu)選的是，所述的從火水母刺細(xì)胞毒液中提取多肽的提取方法，還包括以下步 驟：
[0012] 步驟一、從活的火水母取觸腕，與0-4°C的去離子水按照體積比為I : 1-1. 5混合， 攪拌、靜置后，取沉淀重復(fù)2-4次，第一次離心，收集沉淀物；
[0013] 步驟二、將步驟一得到的沉淀物與總磷酸鹽濃度為0. 025mol/L，pH為5. 5-6. 5的 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液按照質(zhì)量體積比Ig : 40-60mL混合，超聲波破碎，第二 次離心，收集上清液，得到毒液蛋白；
[0014] 步驟三、取步驟二得到毒液蛋白，用總磷酸鹽濃度0. 025mol/L，pH為5. 5-6. 5的磷 酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液稀釋3-5倍，使之緩慢流經(jīng)Histrap SP強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱， 按照4-6倍柱體積加入氯化鈉濃度為0. 035-0. 045mol/L、pH為5. 5-6. 5的第一磷酸鹽緩沖 溶液進(jìn)行第一次淋洗，然后按照4-6倍柱體積加入氯化鈉濃度為0. 045-0. 060mol/L、pH為 5. 5-6. 5的第二磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0015] 步驟四、取步驟三得到第二淋洗液進(jìn)行緩沖溶液置換，變更緩沖溶液為總磷酸鹽 濃度為〇. 〇25mol/L，pH為7. 5-8. 5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，使之緩慢流經(jīng) Histrap Q強(qiáng)陰離子交換柱，按照4-6倍柱體積加入氯化鈉濃度為0· 020-0. 040mol/L、pH 為7. 5-8. 5的第三磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行第三次淋洗，然后按照4-6倍柱體積加入氯化鈉濃 度為0. 040-0. 050mol/L、pH為7. 5-8. 5的第四磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行第四次淋洗，收集淋洗 液得到第四淋洗液；
[0016] 步驟五、取步驟四得到的第四淋洗液進(jìn)行第三次離心超濾濃縮，收集上清液，減壓 冷凍干燥，即得所述多肽。
[0017] 優(yōu)選的是，所述的從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽的提取方法，還包括以下步 驟：
[0018] 步驟一、從活的火水母取觸腕，與2°C的去離子水按照體積比為1 : 1.3混合，攪 拌、靜置后，取沉淀重復(fù)3次，第一次離心，收集沉淀物；
[0019] 步驟二、將步驟一得到的沉淀物與總磷酸鹽濃度為0. 025mol/L、pH為6. 0的磷酸 氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液按照質(zhì)量體積比Ig : 50mL混合，超聲波破碎，第二次離心， 收集上清液，得到毒液蛋白；
[0020] 步驟三、取步驟二得到毒液蛋白，用總磷酸鹽濃度0· 025mol/L、pH為6. 0的磷酸氫 二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液稀釋4倍，使之緩慢流經(jīng)Histrap SP強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，按照5 倍柱體積加入氯化鈉濃度為〇. 040mol/L、pH為6. 0的第一磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行一次淋洗， 然后按照5倍柱體積加入氯化鈉濃度為0. 055mol/L、pH為6. 0的第二磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行 第二次淋洗，收集淋洗液得到第二淋洗液；
[0021] 步驟四、取步驟三得到第二淋洗液進(jìn)行緩沖溶液置換，變更緩沖溶液為總磷酸鹽 濃度為0. 〇25mol/L、pH為8. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，使之緩慢流經(jīng)經(jīng)過(guò) Histrap Q強(qiáng)陰離子交換柱，按照5倍柱體積加入氯化鈉濃度為0· 030mol/L、pH為8. 0的 第三磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行第三次淋洗，然后按照5倍柱體積加入氯化鈉濃度為0. 045mol/ L、pH為8. 0的第四磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行第四次淋洗，收集淋洗液得到第四淋洗液；
[0022] 步驟五、取步驟四得到的第四淋洗液進(jìn)行第三次離心超濾濃縮，收集上清液，減壓 冷凍干燥，即得所述多肽。
[0023] 優(yōu)選的是，所述的從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述步驟五超 濾所使用的超濾管的截留分子量為30K。
[0024] 優(yōu)選的是，所述的從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述一次離心 的操作條件為：離心力l〇〇〇G，4°C，15min ;所述二次離心的操作條件為：離心力13000G， 4°C，2h ;所述三次離心的操作條件為：離心力5000G，4°C，lh。
[0025] 優(yōu)選的是，所述的從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽的提取方法，所述的第一磷 酸鹽緩沖溶液和第二磷酸鹽緩沖溶液均為總磷酸鹽濃度為0. 〇25mol/L的磷酸氫二鈉-磷 酸二氫鈉緩沖溶液；第三磷酸鹽緩沖溶液和第四磷酸鹽緩沖溶液均為總磷酸鹽濃度為 0. 025mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液。
[0026] -種從火水母刺細(xì)胞毒液中提取的多肽在制備抗鼻咽癌的藥物的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0028] 第一、本發(fā)明從火水母刺細(xì)胞毒液中提取一種新的多肽，是依次經(jīng)過(guò)Histrap SP 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和Histrap Q強(qiáng)陰離子交換柱，從毒液蛋白中分離得到的，是具有抗鼻咽癌 腫瘤活性的新蛋白，屬于開(kāi)創(chuàng)性發(fā)明；
[0029] 第二、將觸腕以1 : 1-1. 5體積比浸泡在0_4°C的去離子水中，防止溫度高導(dǎo)致 觸腕蛋白變性以及便于低溫下觸腕自解，攪拌靜置多次破壞和分解觸腕的膠原蛋白和保護(hù) 層；
[0030] 第三、一次離心在1000G，4°C，15min下進(jìn)行，需要將觸腕完全溶解為觸細(xì)胞；二次 離心在13000G，4°C，2h下進(jìn)行，需要將觸細(xì)胞破碎后毒液蛋白全部溶出，超聲波破碎細(xì)胞 殘片粒徑越小需要的離心力越大；三次離心在5000G，4°C，Ih下進(jìn)行，需要將經(jīng)過(guò)層層分離 后得到蛋白進(jìn)行濃縮；
[0031] 第四、將毒液蛋白經(jīng)過(guò)Histrap SP強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，弱酸性的緩沖溶液使得大部 分毒液蛋白與H+結(jié)合然后帶正電荷，強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱吸附帶正電荷的毒液蛋白，依次用氯 化鈉濃度為〇· 035-0. 045mol/L的第一磷酸鹽緩沖溶液和氯化鈉濃度為0· 045-0. 060mol/ L的第二磷酸鹽緩沖溶液淋洗，摒棄一部分不需要的蛋白，然后交換緩沖溶液為0. 025mol/ L，pH為7. 5-8. 5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，弱堿性的緩沖溶液使得大部分 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，再經(jīng)過(guò)Histrap Q強(qiáng)陰離子交換柱，強(qiáng)陰離子交換柱吸附帶負(fù)電荷的 蛋白，依次用氯化鈉濃度為0. 020-0. 040mol/L的第三磷酸鹽緩沖溶液和氯化鈉濃度為 0. 040-0. 050mol/L的第四磷酸鹽緩沖溶液淋洗，獲得目標(biāo)蛋白；
[0032] 第五、本發(fā)明得到的多肽經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明具有抗鼻咽癌活性，抑制鼻咽癌腫瘤細(xì)胞 株CNE-I，CNE-2生長(zhǎng)，誘導(dǎo)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞株CNE-2凋亡，采用本發(fā)明的方法可以大批量處 理火水母刺細(xì)胞毒液，分離出其中含有的抗腫瘤活性蛋白。操作簡(jiǎn)單，分離步驟少，適宜于 快速分離；分離條件溫和，能最大