專利名稱：修飾的可變域分子及其生產(chǎn)和使用方法
修飾的可變域分子及其生產(chǎn)和使用方法
通過引用進(jìn)行結(jié)合本申請要求于 2009年10月23日提交的名稱為“修飾的可變域分子及其生產(chǎn)和使用方法”的USSN61/254，460、以及于2010年9月7日提交的名稱為“修飾的可變域分子及其生產(chǎn)和使用方法2”的澳大利亞臨時(shí)專利申請?zhí)?010904025的優(yōu)先權(quán)，通過引用將它們的全部內(nèi)容結(jié)合在此。
領(lǐng)域本披露涉及包括抗聚集抗體可變域的蛋白質(zhì)及其用途。
進(jìn)旦 冃月^目前包括抗原結(jié)合域的抗體和蛋白質(zhì)廣泛地用作研究試劑、診斷/預(yù)測試劑、工業(yè)試劑以及治療劑。這種寬范圍的可應(yīng)用性是由于包括其抗原結(jié)合域的抗體和蛋白質(zhì)以高度特異性和親和力結(jié)合到抗原上的能力。因此，包括其抗原結(jié)合域的抗體和蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到樣品中的抗原上并且允許檢測、定量或殺死表達(dá)該抗原的細(xì)胞或遞送治療的有效載荷。然而，盡管它們具有通用性，僅一個(gè)小組的抗體具有適合診斷/預(yù)測/工業(yè)的/治療性應(yīng)用的生物物理特性。例如，治療性或體內(nèi)診斷抗體/蛋白質(zhì)需要受試者體內(nèi)較長的血清半衰期以便累積到所希望的靶上，并且因此它們必須是抗聚集的(Willuda等人，1999)。工業(yè)應(yīng)用通常需要具有較長半衰期或在暴露于苛刻條件(例如高溫，無聚集)之后能夠起作用的抗體/蛋白質(zhì)(Harris, 1999)。包括抗體可變域的蛋白質(zhì)的聚集可能導(dǎo)致在表達(dá)和/或純化、免疫原性、毒性、降解、親和力受損、或儲(chǔ)存之后失去活性方面的困難。蛋白質(zhì)聚集是與折疊途徑競爭的一個(gè)過程或可以起于折疊途徑中的中間體，并且通常涉及未折疊蛋白或部分折疊蛋白的結(jié)合。通過穩(wěn)定天然狀態(tài)(即，抗去折疊)或通過降低蛋白質(zhì)的未折疊或部分折疊狀態(tài)聚集的傾向可以實(shí)現(xiàn)對于聚集的抗性。穩(wěn)定天然狀態(tài)的一個(gè)缺點(diǎn)是這些蛋白質(zhì)將有可能暴露于它們將去折疊的一個(gè)環(huán)境中。通常，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性或去折疊時(shí)，在蛋白質(zhì)內(nèi)部通常介導(dǎo)分子內(nèi)接觸的氨基酸殘基被暴露出來。這種暴露通常使蛋白易于形成分子間接觸并且聚集。與抗去折疊的蛋白質(zhì)相反，在暴露于這樣的環(huán)境之后，當(dāng)去折疊時(shí)具有降低聚集傾向的蛋白質(zhì)將簡單地重新折疊成生物活性的非聚集狀態(tài)。包括其抗原結(jié)合域的抗體或蛋白質(zhì)的聚集抗性或聚集傾向通常受其中包含的一個(gè)或多個(gè)最大聚集傾向結(jié)構(gòu)域限制并且受它與周圍結(jié)構(gòu)域(如果存在的話)的相互作用的強(qiáng)度的限制。這是因?yàn)橐坏┰摻Y(jié)構(gòu)域去折疊，如果它不能再折疊，它可以與同一種蛋白質(zhì)中或其他蛋白質(zhì)中的其他結(jié)構(gòu)域相互作用并且形成聚集體?？贵w的恒定域通常不聚集并且在序列上并不顯著改變(如通過它們的名字表明)。因此，抗體的最弱結(jié)構(gòu)域通常被認(rèn)為是從一種抗體改變到下一種抗體的那些區(qū)域，即可變區(qū)(例如，重鏈可變區(qū)(Vh)和/或輕鏈可變區(qū)(VJ) (Ewert等人，2003)。在這個(gè)方面，將易于聚集的scFv分子結(jié)合到其他穩(wěn)定的重組抗體產(chǎn)物中經(jīng)常將這些通常所不希望的性狀賦予該新的重組體設(shè)計(jì)中。如Ewert等人，2008說明的，為了通過合理的工程化改進(jìn)任何次優(yōu)的抗體構(gòu)建體，必須鑒定和改善“最弱的連接”。Ewert等人還強(qiáng)調(diào)了可變域通常是抗體或抗體相關(guān)分子中的“最弱連接”。因此，使可變域具有聚集抗性的工程化最可能致使包括該可變域的整個(gè)蛋白質(zhì)具有聚集抗性。Hoyer等人，2002還確立了 Vh結(jié)構(gòu)域?qū)Π贵w可變域的蛋白質(zhì)的再折疊具有顯著影響。諸位作者得出結(jié)論，這些Vh可以是進(jìn)行修飾以改善蛋白的一個(gè)主要目標(biāo)。為了降低可變域的聚集，已經(jīng)提出了不同的策略，例如合理設(shè)計(jì)聚集抗性蛋白、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)接枝、或?qū)⒍蜴I引入到一個(gè)可變域中。合理設(shè)計(jì)聚集抗性蛋白通常涉及使用計(jì)算機(jī)分析來預(yù)測點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)的聚集傾向的影響。然而，對于這種方法存在許多困難。例如，僅鑒定可能減少去折疊蛋白的聚集的突變是不夠的。而是，該突變還必須不增加折疊蛋白的聚集或影響折疊蛋白的功能。此夕卜，合理設(shè)計(jì)需要所改善特異性蛋白質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析并且因此難以與尚未徹底表征的蛋白質(zhì)一起使用并且不易應(yīng)用于多種不同蛋白質(zhì)。⑶R接枝涉及將來自一個(gè)可變域的⑶R移植到另一個(gè)可變域的框架區(qū)(FRs)上。這個(gè)策略顯示在穩(wěn)定抗-EGP-2scFv中是有用的(Willuda等人，1999)。然而，這個(gè)策略通常用于產(chǎn)生抗去折疊的可變域，如上面討論的，這不是最令人希望的蛋白質(zhì)形式。這種方法的缺點(diǎn)包括在CDR接枝之后可能發(fā)生親和力降低?？梢酝ㄟ^將突變引入到這些FR中來克服這種親和力損失，然而這類突變可能在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生免疫原性表位，由此制造從治療觀·點(diǎn)來看所不希望的蛋白質(zhì)。此外，CDR接枝通常需要晶體結(jié)構(gòu)的分析或供體和受體可變區(qū)的同源性建模，用于評定接枝的適合性。清楚地，這樣一種方法是費(fèi)力的并且需要專門的知識。此外，因?yàn)槊糠N可變區(qū)具有不同結(jié)構(gòu)，這種方法不易貫穿多種分子進(jìn)行應(yīng)用。對于涉及將二硫鍵引入可變區(qū)的多種方法，當(dāng)該鍵可以幫助蛋白質(zhì)正確地再折疊時(shí)，它還將剛性引入到該可變域中。這種剛性可以降低抗體對抗原的親和力。此外，不是所有可變域都能夠支持引入必要的半胱氨酸殘基用于二硫鍵形成而不損失親和力或不引入免疫原性表位。此外，在高蛋白濃度下形成二硫鍵可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，因此抵消了該鍵的任何潛在的正效應(yīng)。如從上述可以清楚的，本領(lǐng)域中對于包含聚集抗性可變域的蛋白質(zhì)以及它們的生產(chǎn)方法存在著一種需要。優(yōu)選地，這些方法易于應(yīng)用于多種不同的可變區(qū)中。
概述在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，諸位發(fā)明人尋求鑒定在賦予聚集(例如在暴露于熱之后)抗性的抗體的可變區(qū)中的氨基酸殘基。這類聚集抗性蛋白用于多種應(yīng)用，例如治療和/或診斷/預(yù)測。諸位發(fā)明人將包括Vh的聚集抗性單域抗體序列與具有相同框架序列但是不具有聚集抗性的種系Vh進(jìn)行比較。最初，諸位發(fā)明人在聚集抗性Vh的互補(bǔ)決定區(qū)中鑒定了大量氨基酸差異(如圖I中所示)。雖然鑒定了大量的差異，諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)單個(gè)氨基酸改變賦予Vh聚集抗性并且僅少量改變的組合賦予大多數(shù)觀察到的聚集抗性。這些發(fā)現(xiàn)促使諸位發(fā)明人進(jìn)一步研究這些改變在互補(bǔ)決定區(qū)中的作用。諸位發(fā)明人確定根據(jù)Kabat標(biāo)號系統(tǒng)位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的帶負(fù)電荷的氨基酸足以對Vh或包括它的蛋白質(zhì)賦予相當(dāng)?shù)木奂剐?。諸位發(fā)明人另外地發(fā)現(xiàn)，與缺乏帶負(fù)電荷的殘基或僅包括一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基的蛋白質(zhì)相比較，在上面討論的位置處包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸顯著地改善了包括Vh的蛋白質(zhì)的聚集抗性。如在此舉例說明的，在于此說明的位置處包括多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸對蛋白質(zhì)(例如，在溶液中或展示在噬菌體表面上)賦予聚集抗性。這種作用在可溶性蛋白中是顯著的(與噬菌體表面上展示的相對)。因此，諸位發(fā)明人不但已經(jīng)確定賦予聚集抗性的單個(gè)氨基酸殘基，他們還另外地確定了它們可以顯著地通過結(jié)合這些殘基來改善該耐受性。在此方面，諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒定了與用單個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸所觀察到的相比較賦予更大程度的聚集抗性的帶帶負(fù)電荷的氨基酸的多種組合。諸位發(fā)明人未料想到的是，在Vh中這樣幾個(gè)氨基酸殘基的取代可能賦予這種程度的聚集抗性。除了在上述位置處的取代之外，諸位發(fā)明人還鑒定了在互補(bǔ)決定區(qū)中的其他變化，這些變化對Vh上(例如根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在位置26和/或30和/或50和/或52和/或52a和/或53上的負(fù)電荷的氨基酸)賦予了可檢出的聚集抗性。 因?yàn)橹T位發(fā)明人所鑒定的突變是在抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)中，它們可以容易地在不同抗體之間轉(zhuǎn)移(例如，包括不同框架區(qū)的不同類別或亞類的抗體)。這是因?yàn)橐呀?jīng)選擇了抗體可變域來適應(yīng)CDR中的序列變化，而框架區(qū)通常不顯著地改變，因?yàn)樗鼈兲峁┮环N用于呈遞⑶R環(huán)的支架。除了在互補(bǔ)決定區(qū)中的取代(該取代賦予了聚集抗性)之外，諸位發(fā)明人還鑒定了對Vh (例如根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在位置39和/或40上的帶負(fù)電荷的氨基酸)賦予可檢出的聚集抗性的鄰近框架區(qū)中的改變。這些發(fā)現(xiàn)允許諸位發(fā)明人生產(chǎn)數(shù)種包括一個(gè)Vh的聚集抗性蛋白，該Vh能夠特異性地結(jié)合到除了用于篩選的這類蛋白質(zhì)的文庫之外的抗原，以鑒定包括Vh結(jié)構(gòu)域的新蛋白質(zhì)(例如用作治療和/或診斷試劑)。與缺乏一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，諸位發(fā)明人生產(chǎn)的蛋白質(zhì)還以較高的水平表達(dá)于重組系統(tǒng)中。此外，與缺乏多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸或包含一個(gè)單個(gè)的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)相比較，通過結(jié)合多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，諸位發(fā)明人能夠獲得更高水平的可溶性蛋白表達(dá)。諸位發(fā)明人生產(chǎn)的蛋白質(zhì)還顯示了在純化過程中降低的被色譜樹脂截留的傾向，由此增加了產(chǎn)量。在此方面，諸位發(fā)明人再次顯示與缺乏如在此鑒定的一個(gè)單個(gè)殘基的蛋白質(zhì)相比較，包括這種殘基賦予了顯著的優(yōu)點(diǎn)，并且顯示包括多個(gè)帶負(fù)電荷的殘基進(jìn)一步改善了這個(gè)作用。諸位發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)與缺乏如上討論的一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)相比較，包括這類氨基酸的蛋白質(zhì)能夠更高程度地濃縮而不聚集，從而為儲(chǔ)存以及為產(chǎn)生高濃度組合物(例如藥物組合物)提供了明確的優(yōu)點(diǎn)。由諸位發(fā)明人生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的聚集抗性還提供了一個(gè)在純化過程中的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@些蛋白能夠被加熱以減少二聚體/三聚體的存在量并且然后進(jìn)行純化。這不僅降低了該蛋白的所不希望的形式的存在量而且潛在地增加了產(chǎn)量。諸位發(fā)明人另外生產(chǎn)了聚集抗性蛋白文庫并且顯示他們可以從中分離出特異性結(jié)合到抗原上和/或高親和力地結(jié)合到抗原上的蛋白質(zhì)。從這些文庫中分離的蛋白質(zhì)還顯示具有聚集抗性。因此，本披露提供了包括根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)在位置32和/或位置33處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體Vh的一種分離蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、^半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及任選地，該蛋白質(zhì)在選自下組的一個(gè)位置上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或35。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。在一個(gè)另外的或替代的實(shí)例中，該蛋白包括一種聚集抗性VH。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)不是HEL4(即，不包括SEQ ID NO : I中列出的序列)。本披露還提供了包括根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)在位置28、33和/或35處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體Vh的一種分離蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、^半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸.本披露還提供了一種分離蛋白質(zhì)，包括在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含帶負(fù)電荷的氨基酸的一個(gè)抗體VH，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、P _半乳糖苷酶、a -淀粉酶、B5R之外的抗原上或其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置 28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸.在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)包括一個(gè)聚集抗性VH。本披露還提供了包括根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)在位置28、33和/或35處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體Vh的一種分離蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠以大于IOiiM或5iiM或liiM，優(yōu)選地大于IOOnM的親和力特異性地結(jié)合到抗原上，其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸.在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)包括一個(gè)聚集抗性VH。本披露還提供了一種分離蛋白質(zhì)，包括在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含帶負(fù)電荷的氨基酸的一個(gè)抗體Vh,該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)28和/或31和/或32和/或33和/或35，該蛋白質(zhì)能夠以大于IOiiM或5iiM或liiM，優(yōu)選地大于IOOnM的親和力特異性地結(jié)合到抗原上，其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸.
在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)不結(jié)合到P半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R、人VEGF或人腫瘤壞死因子a上。本披露還提供了包括能夠特異性結(jié)合到抗原上的一種抗體蛋白質(zhì)，其中該Vh包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的連續(xù)氨基酸的一個(gè)序列，其中X1相應(yīng)于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28，其中XpHX6以及X8中至少兩項(xiàng)是帶負(fù)電荷的氨基酸并且剩余的在X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸，并且其中該蛋白質(zhì)不結(jié)合到雞蛋溶菌酶或3半乳糖苷酶或B5R上，并且其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置X5和X6處包括天冬氨酸，則它在位置X2與X8之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及 (ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置X4和X5處包括天冬氨酸，則它在位置X1與X8之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。在一個(gè)實(shí)例中，與無上面討論的帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，該蛋白質(zhì)具有降低的聚集傾向。例如，與沒有帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，在加熱到至少打約600C或700C或優(yōu)選地800C之后該蛋白質(zhì)具有降低的聚集傾向。在一個(gè)實(shí)例中，在加熱到至少大約60°C或70°C或優(yōu)選地80°C之后該蛋白質(zhì)保持特異性結(jié)合到抗原上的能力。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到(優(yōu)選地特異性地結(jié)合到)一種人蛋白上(在適當(dāng)情況下，除了人VEGF或人腫瘤壞死因子a之外)。在另一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到(優(yōu)選地特異性地結(jié)合到)一種與人類病癥相關(guān)或是其成因的蛋白質(zhì)上(在適當(dāng)情況下，除了 VEGF或人腫瘤壞死因子a之外)。這樣的蛋白質(zhì)可以是一種人蛋白質(zhì)、或來自例如傳染性生物的一種蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)是一種人蛋白質(zhì)(在適當(dāng)情況下，除了 VEGF或人腫瘤壞死因子a之外)。示例性的蛋白質(zhì)是可溶的和/或分泌的蛋白質(zhì)或受體(例如，受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)或膜結(jié)合蛋白(例如膜結(jié)合蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)例中，該帶負(fù)電荷的氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)實(shí)例中，該帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。在一個(gè)實(shí)例中，在位置28和/或31和/或33和/或35上的帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。在一個(gè)實(shí)例中，在位置32上的帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在一個(gè)示例性形式中，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32和33上包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。在另一個(gè)示例性的形式中，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31和32和33上包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)在單獨(dú)地或共同地選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置26、30、39、40、50、52、52a以及53。優(yōu)選地，該帶負(fù)電荷的氨基酸是在位置30處，例如這個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。優(yōu)選地，該帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。在此所述的一種示例性的蛋白質(zhì)包括下面各項(xiàng)
(i)在單獨(dú)地或共同地選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)殘基上的一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28、31、32、33、以及35 ;以及
(ii)任選地，在單獨(dú)地或共同地選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基上的一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置26、30、39、40、50、52、52a以及53。在此所述的另一種示例性的蛋白質(zhì)包括下面各項(xiàng)
⑴在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置32和33處的一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)任選地，在單獨(dú)地或共同地選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基上的一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置26、28、30、31、35、39、40、50、52、52a以及53。在本披露的一個(gè)示例性的形式中，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31和32和33上包括帶負(fù)電荷的氨基酸。例如，該蛋白質(zhì)包括
(i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸；以及
(ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置33處的一個(gè)天冬氨酸。例如，該蛋白包括
(i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31處的一個(gè)天冬氨酸；
(ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸；以及
(iii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置33處的一個(gè)天冬氨酸。任選地，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或35上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸(例如天冬氨酸)。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)在位置28、32和33或位置28、31、32和33或位置32、33和35或位置31、32、33和35或位置28、31、32、33和25處包括帶負(fù)電荷的氨基酸。本披露還用于生產(chǎn)具有改進(jìn)的聚集抗性的現(xiàn)有蛋白質(zhì)的修飾形式。因此，本披露另外地提供了包括能夠特異性地結(jié)合到抗原上的一個(gè)修飾的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)，其中Vh在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31和/或位置33上包括帶負(fù)電荷的氨基酸，并且其中Vh的未修飾形式不包括帶負(fù)電荷的氨基酸。本披露另外地提供了包括能夠特異性地結(jié)合到抗原上的一個(gè)修飾的抗體Vh的蛋白質(zhì)，其中Vh在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28、31、33和/或35上包括帶負(fù)電荷的氨基酸，并且其中Vh的未修飾形式不包括一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。優(yōu)選地，Vh的未修飾形式結(jié)合到與該修飾的Vh相同抗原上(例如，相同表位)。本披露另外地提供了包括能夠特異性地結(jié)合到抗原上的修飾Vh的蛋白質(zhì)，其中Vh包括選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修飾的蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35上不包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。優(yōu)選地，Vh的未修飾形式結(jié)合到與該修飾的Vh相同的抗原上(例如，相同表位)。本披露還提供了包括能夠特異性結(jié)合到抗原上的一種修飾的Vh的蛋白質(zhì)，其中該Vh包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的連續(xù)氨基酸的一個(gè)序列，其中X1相應(yīng)于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28，其中Xp X4, X5, X6以及X8中至少兩項(xiàng)是帶負(fù)電荷的氨基酸并且剩余的在X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸，其中該未修飾的蛋白質(zhì)在位置Xp X4、X5、X6和X8上不包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白包括一個(gè)修飾的聚集抗性VH。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)包括
(i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31處的一個(gè)天冬氨酸；和/或
(ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸；和/或
(iii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置33處的一個(gè)天冬氨酸。任選地，該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或35上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸(例如天冬氨酸)。這類蛋白質(zhì)的示例性特征(例如，針對帶負(fù)電荷的氨基酸和/或特異性帶負(fù)電荷的氨基酸的另外的位點(diǎn))在此進(jìn)行了說明并且將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于本披露的形式。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)是一種抗體。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)或抗體不結(jié)合到雞蛋溶菌酶、P半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R(例如，來自痘苗病毒)上或其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外帶負(fù)電荷的氨基酸.優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)結(jié)合到一種人蛋白質(zhì)(例如，與疾病相關(guān)或是其成因的人蛋白質(zhì))上。在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)任何一個(gè)實(shí)例的如在此所述的蛋白質(zhì)在CDR(例如CDR3)中不包括二硫鍵。在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)任何一個(gè)實(shí)例在此所述的蛋白質(zhì)內(nèi)的可變區(qū)不具有總酸性等電點(diǎn)。本披露的示例性的蛋白質(zhì)是在除了根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的氨基酸位置處人化、人源化或去免疫化的，并且融合到一種人蛋白質(zhì)或其區(qū)域上(例如，是嵌合抗體)。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)是處于單域抗體(dAb)或融合到另一種蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)e區(qū)域)上的dAb的形式。 在一個(gè)替代實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)另外地包括一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VJ，其中
Vl相結(jié)合從而形成一個(gè)Fv (例如,包括一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))。在一個(gè)實(shí)例中，該Fv能夠特異性地結(jié)合到一種抗原上。在一個(gè)實(shí)例中，％和Vlj是處于不同多肽鏈中。例如,該蛋白質(zhì)是處于抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體或Fv的形式。在另一個(gè)實(shí)例中，是處于相同多肽鏈中。例如,該蛋白質(zhì)是處于一種(scFv)n或包括(scFv)n的一種融合蛋白的形式,其中n是I至10之間的一個(gè)數(shù)字。在一個(gè)替代的或另外的實(shí)例中，除了上面討論的具有特異性親和力的那些蛋白質(zhì)之外，蛋白質(zhì)以小于5 u M、優(yōu)選地小于I ii M、優(yōu)選地小于500nM、優(yōu)選地小于200nM、并且更優(yōu)選地小于10nM，例如小于InM的親和力特異性地結(jié)合到靶抗原或表位上。在一個(gè)替代的或另外的實(shí)例中，在此討論的任何蛋白質(zhì)以大于100pM、優(yōu)選地大于10pM、優(yōu)選地大于IpM的親和力特異性地結(jié)合到靶抗原或表位上。在一個(gè)另外的或替代的實(shí)例中，本披露的任何蛋白質(zhì)以300nM或更小、300nM至5pM、優(yōu)選地50nM至20pM、或5nM至200pM或InM至IOOpM的Kd與它的一個(gè)或多個(gè)靶抗原解離。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)包括包含與被修飾成在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35 (和/或在此所述的任何另外的位點(diǎn))處包括一個(gè)(或兩個(gè)或更多個(gè))帶負(fù)電荷的氨基酸的SEQ ID NO :2中列出的序列具有至少大約80% (或90%或95%或99%或100%) —致性的序列的蛋白質(zhì)的一個(gè)⑶R1。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)包括與SEQ IDNO :5、6、7中列出的一個(gè)序列具有至少大約80% (或90%或95%或99%或100% ) 一致性的一個(gè)序列或包括所述蛋白質(zhì)的一個(gè)⑶R3 (優(yōu)選地，一個(gè)重鏈⑶R3)。在本披露的一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)包括與被修飾成包括根據(jù)任一實(shí)例在此所述的帶負(fù)電 荷的氨基酸的SEQ ID NO :10-13的任一項(xiàng)列出的一個(gè)序列具有至少大約80% (或90%或95%或99%或100% ) 一致性的一個(gè)序列。在本披露的一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)包括與被修飾成在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35 (和/或在此所述的任何另外位點(diǎn))處包括一個(gè)(或兩個(gè)或更多個(gè))帶負(fù)電荷的氨基酸的SEQ ID NO 10-13的任一項(xiàng)中列出的一個(gè)序列具有至少大約80% (或90%或95%或99%或100% ) —致性的一個(gè)序列。本披露還提供了結(jié)合到一種化合物上的本披露的蛋白質(zhì)。例如，該化合物是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成放射性同位素、可檢測標(biāo)記、治療化合物、膠體、毒素、核酸、肽、蛋白質(zhì)、增加該蛋白質(zhì)在受試者體內(nèi)的半衰期的化合物以及它們的混合物。本披露還提供了包括本披露的一種蛋白質(zhì)和一種藥學(xué)上可接受載體的組合物。本披露另外地提供了編碼本披露的蛋白質(zhì)的核酸。在一個(gè)實(shí)例中，該核酸是處于表達(dá)構(gòu)建體中并且可操作地連接到一個(gè)啟動(dòng)子上。例如，該表達(dá)構(gòu)建體是一種表達(dá)載體。本披露還提供了表達(dá)本披露的蛋白質(zhì)的一種細(xì)胞。例如，該細(xì)胞包括本披露的一種核酸或表達(dá)構(gòu)建體。示例性的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞以及原核細(xì)胞。本披露還提供了一種用于生產(chǎn)本披露蛋白質(zhì)的方法,該方法包括維持本披露的表達(dá)構(gòu)建體持續(xù)一段時(shí)間并且在足以(或使得)產(chǎn)生編碼蛋白的條件下。例如，該方法包括培養(yǎng)本披露的細(xì)胞持續(xù)一段時(shí)間并且在足以(或使得)產(chǎn)生本披露蛋白的條件下。在一個(gè)實(shí)例中，該方法另外地包括分離本披露的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，該方法另外地包括在分離蛋白之前、期間或之后，將該蛋白質(zhì)加熱至例如至少大約50°C或60°C或70°C或80°C。例如，將蛋白質(zhì)加熱以便由此降低在表達(dá)和純化過程中天然發(fā)生的二聚體和/或三聚體的量。這樣一種方法可以促進(jìn)回收增加水平的本披露的蛋白質(zhì)。任選地，該方法另外地包括將蛋白質(zhì)結(jié)合到一種化合物上或?qū)⒃摶衔锱渲瞥梢环N藥物組合物。本披露另外地提供了包括本披露的多種蛋白質(zhì)的一個(gè)文庫。本披露還提供了包括含有抗體￥11的蛋白質(zhì)的一個(gè)文庫，其中至少30% (或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%或98%或99% )的Vh在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包括帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35。本披露還提供了包括含有抗體Vh的蛋白質(zhì)的一個(gè)文庫，其中至少30% (或40 %或50 %或60 %或70 %或80 %或90 %或95 %或98 %或99 % )的Vh包括包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8的連續(xù)氨基酸的一個(gè)序列，其中X1相應(yīng)于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28，其中Xp X4, X5, X6以及X8的至少兩項(xiàng)是帶負(fù)電荷的氨基酸并且在剩余的X1-X8上的氨基酸是任何氨基酸。在一個(gè)實(shí)例中，包含帶負(fù)電荷的氨基酸的Vh在位置32和33、或31和32和33上包括這些殘基。用于帶負(fù)電荷的氨基酸或可以包括的特定帶負(fù)電荷的氨基酸的另外位點(diǎn)在此進(jìn)行了說明并且并且將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于本實(shí)例中。在一個(gè)實(shí)例中，這些蛋白質(zhì)展示在顆粒(例如，噬菌體或核糖體)或細(xì)胞的表面 上。在一個(gè)實(shí)例中，除了在位置32和/或33處(以及，任選地31)的那些之外的Vh結(jié)構(gòu)域的⑶R中(例如⑶R3中或⑶R2和3中或⑶Rl、2和3中)的氨基酸是隨機(jī)地或半隨機(jī)地或是從人抗體衍生的。在另一個(gè)實(shí)例中，除了在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的那些之外Vh結(jié)構(gòu)域的⑶R中(例如⑶R3中或⑶R2和3中或⑶Rl、2和3中)的氨基酸是隨機(jī)地或半隨機(jī)地或是從人抗體衍生的。清楚地是，本披露還提供了編碼所述文庫的核酸文庫。本披露另外地提供了一種用于分離本披露的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括使本披露的文庫與一種抗原相接觸持續(xù)一段時(shí)間并且在足夠(或使得)蛋白質(zhì)結(jié)合到該抗原上的條件下，并且分離該蛋白質(zhì)。本披露另外地提供了一種用于生產(chǎn)包括多種本披露蛋白質(zhì)的文庫的方法，該方法包括
(i)獲得或產(chǎn)生編碼多種包括Vh結(jié)構(gòu)域的蛋白的核酸，其中這些Vh結(jié)構(gòu)域在上面討論的位置處包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸；
(ii)產(chǎn)生包括以下可操作地連接核酸的表達(dá)構(gòu)建體的一個(gè)文庫
a)一種啟動(dòng)子；
b)在(i)獲得或產(chǎn)生的一種核酸；以及
c)編碼促進(jìn)這些細(xì)胞或顆粒中/上展示包含Vh的蛋白質(zhì)的多肽的一種核酸；以及
(iii)表達(dá)由這些表達(dá)構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)使得它們展示在這些細(xì)胞或顆粒中/上。在一個(gè)實(shí)例中，除了在位置32和/或33處(以及，任選地31)的那些之外Vh結(jié)構(gòu)域的⑶R中(例如⑶R3中或⑶R2和3中或⑶Rl、2和3中)的氨基酸是隨機(jī)地或半隨機(jī)地或是從人抗體衍生的。在另一個(gè)實(shí)例中，除了在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的那些之外Vh結(jié)構(gòu)域的⑶R中(例如⑶R3中或⑶R2和3中或⑶Rl、2和3中)的氨基酸是隨機(jī)地或半隨機(jī)地或是從人抗體衍生的。在一個(gè)實(shí)例中，該方法另外地包括分離編碼該蛋白質(zhì)的核酸。可以將這樣的核酸引入到表達(dá)構(gòu)建體中。任選地，可以表達(dá)該蛋白質(zhì)。
本披露還考慮了對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，例如親和力成熟和/或人源化和/或去免疫化。這樣一種分離的蛋白質(zhì)可以用于生產(chǎn)例如一種抗體。本披露還用于降低現(xiàn)有抗體或包括其Vh蛋白質(zhì)的聚集傾向或增加其聚集抗性。例如，本披露提供了一種用于增加包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的聚集抗性的方法，該方法包括對該Vh進(jìn)行修飾使得它在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包括帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修飾的蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處不包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。另外的修飾位點(diǎn)和可以取代的特異性氨基酸殘基在此進(jìn)行了說明并且將被考慮 為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于本實(shí)例中。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括從該蛋白質(zhì)中分離一種Vh，根據(jù)本披露的方法修飾該Vh,并且生產(chǎn)包含該Vh的蛋白質(zhì)。例如，該方法包括從抗體中分離Vh，根據(jù)本披露的方法修飾該VH，并且生產(chǎn)包括該修飾的Vh的抗體。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的方法另外地包括在根據(jù)本披露修飾之后使Vh或包括它的蛋白質(zhì)的親和力成熟和/或?qū)⒃摰鞍踪|(zhì)去免疫化和/或?qū)⒃摰鞍踪|(zhì)人源化和/或?qū)⒃摰鞍踪|(zhì)嵌合化。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的方法不涉及將任何另外的氨基酸殘基插入(與取代相對)到Vh中。上述方法將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于增加蛋白質(zhì)表達(dá)和/或用于生產(chǎn)能夠在高濃度下在不顯著的聚集下儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)和/或用于用于增加從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)或用于降低從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)所需溶液的體積的方法中。例如，本披露提供了一種用于增加包含抗體Vh的可溶蛋白生產(chǎn)水平的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置28和/或31和/或33和/或35處的一個(gè)氨基酸來修飾該Vh并且生產(chǎn)該蛋白，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸蛋白的生產(chǎn)水平相比較，所生產(chǎn)的可溶蛋白的水平增加了。本披露還提供了一種用于增加包含抗體Vh的可溶蛋白的生產(chǎn)水平的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代位于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸來修飾該Vh并且使該蛋白質(zhì)與一種層析樹脂相接觸，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平相比較，所生產(chǎn)的可溶蛋白的水平增加了。本披露還提供了一種用于增加從一種層析樹脂中回收包含抗體重鏈蛋白質(zhì)的水平或用于降低從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)所需的溶液的體積的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位于位置28、31、33和/或35處的氨基酸來修WVh，并且使該蛋白質(zhì)與層析樹脂接觸，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，從層析樹脂回收蛋白質(zhì)的回收水平增加了或者從層析樹脂回收蛋白質(zhì)所需的溶液的體積降低了。本披露還提供了一種用于增加從一種層析樹脂中回收包含抗體Vh的蛋白質(zhì)的水平或用于降低從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)所需的溶液的體積的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位于位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸來修飾Vh，并且使該蛋白與層析樹脂接觸，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，從層析樹脂回收蛋白質(zhì)的回收水平增加了并且從層析樹脂回收蛋白質(zhì)所需的溶液的體積降低了。本披露還提供了本披露的蛋白質(zhì)或本披露的組合物在醫(yī)藥中的用途。本披露還提供了一種治療或預(yù)防受試者體內(nèi)的病癥的方法，該方法包括將本披露的一種蛋白質(zhì)或組合物施用于對其有需要的受試者體內(nèi)。在一個(gè)實(shí)例中，受試者患有癌癥和/或炎性疾病和/或自身免疫疾病和/或神經(jīng)病癥。本披露還提供了本披露的蛋白質(zhì)在制造治療或預(yù)防一種病癥的藥物中的用途。本披露還提供了一種用于將化合物遞送到細(xì)胞中的方法，該方法包括使細(xì)胞與本披露的蛋白質(zhì)或組合物相接觸。 本披露還提供了用于診斷或預(yù)測受試者體內(nèi)的病癥的一種方法，該方法包括使來自受試者的樣品與本披露的蛋白質(zhì)或組合物相接觸使得該蛋白質(zhì)結(jié)合到抗原上并且形成一種復(fù)合物以及對該復(fù)合物進(jìn)行檢測，其中該復(fù)合物的檢測對于受試者體內(nèi)的病癥是診斷性的或預(yù)測性的。在一個(gè)實(shí)例中，本方法包括確定該復(fù)合物的水平，其中所述復(fù)合物的增強(qiáng)或降低的水平對于受試者體內(nèi)的病癥是診斷性的或預(yù)測性的。本披露另外提供了一種用于局部化或檢測受試者體內(nèi)的抗原的方法，所述方法包括
(i)將本披露的蛋白質(zhì)或組合物施用于受試者體內(nèi)使得該蛋白質(zhì)結(jié)合到抗原上，其中該蛋白質(zhì)結(jié)合到一種可檢測標(biāo)記上；以及
(ii)檢測或局部化該在體內(nèi)的可檢測標(biāo)記。本披露的每個(gè)實(shí)例將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于包括包含任選地與在此所述另一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸位置30的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)上，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、P半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R之外的抗原上或其中
(i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人腫瘤壞死因子a上并且在位置30和31處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及
(ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人腫瘤壞死因子a上并且在位置30處包括谷氨酸并且在位置32處包括天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。
附圖簡要說明圖I 是一個(gè)圖解表示，顯示了 HEL4(SEQ ID NO 1)和 DP47 (SEQ IDNO 2)的一個(gè)氨基酸序列比對。完全相同的氨基酸標(biāo)記有星號。還指出了在此提及的⑶R位置。圖2是一個(gè)圖形表示，顯示了在DP47/HEL4⑶R嵌合體上聚集抗性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將HEL4⑶Rl引入到DP47中賦予Vh結(jié)構(gòu)域聚集抗性，而引入⑶R2和⑶R3具有降低的作用。圖3是一個(gè)顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖形表示，這些實(shí)驗(yàn)用于鑒定賦予聚集抗性的HEL4Vh結(jié)構(gòu)域的⑶Rl中單個(gè)氨基酸、以及它們的組合。位于⑶Rl位置31、32或33處的帶負(fù)電荷的氨基酸導(dǎo)致Vh結(jié)構(gòu)域的顯著的聚集抗性，而其他突變具有有限的作用。在31-33處的三重的氨基酸改變(SYA31-33DED)顯著增加了聚集抗性。任何取代的定位都指示在X軸上。
圖4是一個(gè)圖形表示，顯示包括具有單個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸改變、以及它們組合的Vh結(jié)構(gòu)域的scFv的聚集抗性。在CDRl位置31、32或33處的帶負(fù)電荷的氨基酸導(dǎo)致scFv結(jié)構(gòu)域顯著的聚集抗性，而其他突變具有有限的作用。在31-33處的三重氨基酸改變(SYA31-33DED)顯著增加了 scFv的聚集抗性。任何取代的定位都指示在X軸上。圖5A是一個(gè)圖形表示，顯示了當(dāng)進(jìn)行在此舉例說明的“熱/冷”測定時(shí)包括HEL4的⑶RU并且因此包括在位置31、32以及33處的帶負(fù)電荷的氨基酸)并且其中將多樣性引入到HEL4的⑶R3中的來自Garvan-IA Vh文庫的大多數(shù)測試的初試(未選擇的)克隆顯示顯著水平的聚集抗性。圖5B是一個(gè)圖形表示，顯示了當(dāng)進(jìn)行在此舉例說明的熱/冷測定時(shí)包括HEL4的⑶RU并且因此包括在位置31、32以及33處的帶負(fù)電荷的氨基酸)并且其中將多樣性引入到HEL4的⑶R3中的來自Garvan-IB Vh文庫的大多數(shù)測試的初試(未選擇的)克隆顯示顯著水平的聚集抗性。圖6顯示了克隆G07抗-hTNF結(jié)構(gòu)域抗體和克隆Gll抗_mIL_21結(jié)構(gòu)域抗體的 抗原結(jié)合特異性。使用ELISA來確定每個(gè)克隆結(jié)合到多種抗原上的能力(如圖中顯示的)。“hTNF”，人腫瘤壞死因子a ;“mTNF”，小鼠腫瘤壞死因子a ;“hIL21“，人白細(xì)胞介素21 ； ”mIL21，小鼠白細(xì)胞介素21 ^ gal", ^半乳糖苷酶；“hPRLR”，人催乳激素受體。圖7是一個(gè)圖形表不,顯不了在位置26至40之間暴露的殘基的表面上包括帶負(fù)電荷的氨基酸的DP47的不同突變體的聚集抗性。提供的結(jié)果顯示了在經(jīng)受在此舉例說明的“熱/冷”測定之后在噬菌體上展示的DP47單突變體的聚集抗性。突變位點(diǎn)指示在X軸上。圖8是一個(gè)圖形表示，顯示了在⑶R2中包含帶負(fù)電荷的氨基酸的DP47的不同突變體的聚集抗性。提供的結(jié)果顯示了在經(jīng)受在此舉例說明的“熱/冷”測定之后在噬菌體上展示的DP47單突變體的聚集抗性。突變位點(diǎn)指示在X軸上。圖9是一個(gè)圖形表示，顯示了在⑶Rl中包含多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的DP47的不同突變體的聚集抗性。提供的結(jié)果顯示了在經(jīng)受在此舉例說明的“熱/冷”測定之后在噬菌體上展示的DP47單突變體的聚集抗性。突變位點(diǎn)指示在X軸上。
圖10是一個(gè)圖形表示，顯示了任選地與CDRl中帶負(fù)電荷的氨基酸相結(jié)合的在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或35處包含帶負(fù)電荷的氨基酸的DP47的不同突變體的聚集抗性。提供的結(jié)果顯示了在經(jīng)受在此舉例說明的“熱/冷”測定之后在噬菌體上展示的DP47單突變體的聚集抗性。突變位點(diǎn)指示在X軸上。圖11是一個(gè)圖形表示，顯示了在⑶Rl中包含單個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的可溶性DP47突變體的表達(dá)水平。結(jié)果呈現(xiàn)了如使用蛋白A酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)所確定的顯示蛋白水平(mg/升培養(yǎng)物)。突變位點(diǎn)指示在X軸上。圖12是一個(gè)圖形表示，顯示了在尺寸排阻層析之后Vh結(jié)構(gòu)域的回收百分比。將DP47的不同突變體加熱到80°C持續(xù)10分鐘緊接著在4°C下冷卻10分鐘或不進(jìn)行處理然后暴露于尺寸排阻層析。結(jié)果表示為加熱樣品曲線下的面積，表示為在未加熱樣品曲線下的面積百分比。突變位點(diǎn)指示在X軸上。圖13A和13B是一系列圖形表示，顯示了 DP47突變體的熱去折疊的圓二色性(CD)分析結(jié)果。通過將樣品加熱到80°C并且以1°C /min將加熱的蛋白質(zhì)從80°C冷卻到4°C對每種樣品的聚集抗性進(jìn)行測試。指出了所測試的Vh結(jié)構(gòu)域的個(gè)性特征。
序列表檢索表SEQ ID NO 1-HEL4 氨基酸序列。SEQ ID NO 2-DP47 Vh 的氨基酸序列。SEQ ID NO :3_Vl區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID勵(lì)4-￥11與￥1區(qū)之間的接頭序列的氨基酸序列。SEQ ID NO :5-VHhTNF_G07(抗-hTNF Vh)的氨基酸序列。SEQ ID NO :6-VHmIL21_Gll (抗-mIL-21VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO :7-VHPRLR_C02(抗-hPRLR Vh)的氨基酸序列。SEQ ID NO :8-VhHEL_H04(抗-HEL Vh)的氨基酸序列。SEQ ID NO :9-VhHEL_H08(抗-HEL Vh)的氨基酸序列。SEQ ID NO :10-阿達(dá)木單抗(以Humira⑧形式銷售)Vh區(qū)的氨基酸序列。seq id NO :11-利妥昔單抗(以Rituxan( 成Mabthera 形式銷售)Vh區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO 12~曲妥珠單抗(以Herceptin 形式銷售)Vh區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO :13-貝伐單抗(以Avastin 形式銷售)Vh區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO :14_編碼HEL4 Vh的核苷酸序列。SEQ ID NO :15_編碼DP47 Vh區(qū)的核苷酸序列。SEQ ID NO 16-用于擴(kuò)增Vh的寡核苷酸的核苷酸序列。SEQ ID NO :17_用于擴(kuò)增Vh的寡核苷酸的核苷酸序列。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明
概述本說明書包含使用PatentIn Version 3. 5制備的核苷酸和氨基酸序列信息，并且在權(quán)利要求書之后提供在此。貫穿本說明書，除非另外明確地說明或上下文另有要求，否則提及單個(gè)步驟、物質(zhì)構(gòu)成、步驟的組或物質(zhì)構(gòu)成的組應(yīng)當(dāng)被理解成包括這些步驟、物質(zhì)構(gòu)成、步驟的組或物質(zhì)構(gòu)成的組的一個(gè)或多個(gè)(即一個(gè)或更多個(gè))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本披露是容易進(jìn)行改變和變更的，除外確切地說明的那些。應(yīng)當(dāng)理解的是本披露包括所有此類改變和變更。本披露還包括在本說明書中逐個(gè)地或共同地提及或指出的所有這些步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有的組合或其中的任何兩種或多種。本披露并非局限于在此說明的特定實(shí)施方案的范圍內(nèi)，這些實(shí)施方案僅旨在舉例說明的目的。功能上等效的產(chǎn)物、組合物和方法清楚地在本披露的范圍內(nèi)，如在此所說明。在此所述的任何實(shí)施方案以便將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于任何其他實(shí)施方案中，除非另外明確說明。針對包含抗體Vh的蛋白的在此所述的任何實(shí)施方案或?qū)嵗蛩鼈兊挠猛緦⒈豢紤]為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于包含免疫球蛋白Vh的蛋白或它的用途上。除非另外明確地定義，在此使用的所有技術(shù)的和科學(xué)的術(shù)語應(yīng)當(dāng)認(rèn)為具有與本領(lǐng)域(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、以及生物化學(xué)中)中一個(gè)普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。除非另外說明，本披露中使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)物、以及免疫技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)操作。貫穿文獻(xiàn)這類技術(shù)在以下來源中進(jìn)行了說明和解釋，例如，J. Perbal,《分子克隆實(shí)用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning), JohnWiley and Sons (1984) ;J. Sambrook 等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecular Cloning ALaboratory Manual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989) ;T. A. Brown (編輯)，《基本 分子生物學(xué)實(shí)用方法》(Essential Molecular Biology APractical Approach),第 I 和 2 卷(Volumes I and 2), IRL 出版社(1991) ;D. M. Glover 和B. D. Hames (編輯)，《DNA 克隆實(shí)用方法》(DNA Cloning A Practical Approach),第 1-4 卷(Volumes 1-4)，IRL出版社(1995和1996);和F. M. Ausubel等人(編輯)，《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Pub. Associates andWiley-Interscience (1988,包括至今的所有更新)；Ed Harlow 和 David Lane (編輯)《抗體實(shí)驗(yàn)手冊》(Antibodies A Laboratory Manual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarbourLaboratory)，(1988)，以及J. E. Coligan等人(編輯)《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocols in Immunology), John Wiley & Sons (包括至今的所有更新)。通過Kabat (1987 和 / 或 1991)、Bork 等人(1994)和 / 或 Chothia 和 Lesk (1987和1989)或Al-Lazikani等人(1997)中的討論可以進(jìn)一步闡明在此所述的可變區(qū)及其部分、免疫球蛋白、抗體及其片段的說明和定義。術(shù)語“和/或”，例如“X和/或Y”應(yīng)當(dāng)理解為是指“X和Y”或“X或Y”并且應(yīng)當(dāng)理解成為兩種含義或?yàn)槿我缓x提供明顯支持。貫穿本說明書，詞語“包括”(“comprise”)或變化如“包括”(“comprises”)或“包括”(“comprising”)應(yīng)當(dāng)被理解成是暗指包含了一個(gè)提及的要素、整體或步驟或者多個(gè)要素、整體或步驟的組，但不排除任何其他要素、整體或步驟，或者多個(gè)要素、整體或步驟的組。如在此所使用的，術(shù)語“衍生自”應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是指一個(gè)特定的整體可以是從一個(gè)特定來源獲得，盡管不需要直接地從該來源獲得。
選擇的定義如在此使用的，術(shù)語“聚集”是指在不用將蛋白質(zhì)再折疊成天然或未聚集狀態(tài)的試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行處理下是不可逆的蛋白質(zhì)之間的締合或結(jié)合。這類聚集可以導(dǎo)致功能的喪失，天然折疊的喪失，和/或細(xì)胞毒性或免疫原性的獲得。這個(gè)定義包括體內(nèi)形成的有害的和無功能蛋白組裝以及在生物醫(yī)藥研究以及生物技術(shù)中體外形成的無功能蛋白組裝兩者。然而，它不包括等電的或“鹽析的”沉淀(其中當(dāng)轉(zhuǎn)移到類似天然緩沖劑條件時(shí)，組成性蛋白立即返回到它們可溶的天然形式)。對于“聚集抗性”，是指在暴露于使蛋白或其結(jié)構(gòu)域變性的條件之后(例如，力口熱)，本披露的蛋白質(zhì)能夠再折疊并且以構(gòu)象特異方式結(jié)合到結(jié)合配偶體上，例如，該蛋白質(zhì)能夠再折疊成允許特異性結(jié)合到抗原和/或超級抗原(例如，蛋白A)上的構(gòu)象。優(yōu)選地，在部分地或完全變性(或去折疊)之后該蛋白質(zhì)能夠再折疊成允許特異性結(jié)合到抗原或超級抗原上的構(gòu)象。在暴露于通常使蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域變性的條件(例如加熱)之后，優(yōu)選的蛋白質(zhì)并不顯著地聚集。例如，包含多種所述蛋白質(zhì)的組合物中大于約10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%的本披露的蛋白質(zhì)在暴露于熱之后(例如，60°C或70°C或80°C)不聚集。因此，優(yōu)選的蛋白質(zhì)還可以被考慮為可熱再折置的。如在此使用的，術(shù)語“抗體”應(yīng)當(dāng)理解成表示包括由多個(gè)多肽鏈組成的可變區(qū)(例如輕鏈可變區(qū)(')和重鏈可變區(qū)(Vh))的一種蛋白質(zhì)。抗體還通常包括恒定域，這些恒定域可以安排到一個(gè)恒定區(qū)或恒定片段或可結(jié)晶片段(Fe)中。這些抗體可以特異性地結(jié)合到一種或少數(shù)的緊密相關(guān)的抗原上。通常，這些抗體包括一個(gè)四鏈結(jié)構(gòu)作為它們的基礎(chǔ)單元。全長抗體包括共價(jià)連接的兩個(gè)重鏈(大約50-70kD)和兩個(gè)輕鏈(每個(gè)大約23kD)。輕鏈通常包括一個(gè)可變區(qū)以及一個(gè)恒定域并且在哺乳動(dòng)物中是一個(gè)K輕鏈或一個(gè)X 輕鏈。重鏈通常包括一個(gè)可變區(qū)和通過鉸鏈區(qū)連接到一個(gè)或多個(gè)另外的恒定域上的一個(gè)或兩個(gè)恒定域。哺乳動(dòng)物的重鏈?zhǔn)且韵骂愋椭?a、S、e、Y、或ii。每個(gè)輕鏈還共價(jià)地連接到這些重鏈之一上。例如，通過鏈間二硫鍵并且通過非共價(jià)相互作用將兩個(gè)重鏈以及重鏈和輕鏈保持在一起。在不同類型抗體中的鏈間二硫鍵的數(shù)量可以改變。每個(gè)鏈具有一個(gè)N端可變區(qū)(％或'，其中它們各自具有大約110個(gè)氨基酸長度)并且在C端具有一個(gè)或多個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域(Q，它具有大約110個(gè)氨基酸長度)與重鏈的第一恒定域(Ch，它具有大約330-440個(gè)氨基酸長度)對齊并且二硫鍵鍵連到其上。該輕鏈可變區(qū)與該重鏈可變區(qū)對齊?？贵w重鏈可以包括2個(gè)或更多個(gè)另外的Ch結(jié)構(gòu)域(例如，Ch2、Ch3等)并且可以包括可以在ChI與Cm恒定域之間進(jìn)行鑒定的一個(gè)鉸鏈區(qū)。抗體可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及 IgY)、類別(例如，IgG1'IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 以及 IgA2)或亞類。優(yōu)選地，該抗體是IgG，例如IgG3。優(yōu)選地，該抗體是一種鼠類(小鼠或大鼠)抗體或一種靈長類(優(yōu)選人類)抗體。術(shù)語“抗體”還包括人源化抗體、靈長類化抗體、去免疫化抗體、人類抗體以及嵌合抗體。這個(gè)術(shù)語不包括抗體樣分子，例如T細(xì)胞受體，這類分子由術(shù)語“免疫球蛋白”涵蓋。如在此使用的，“可變區(qū)”是指包括⑶R(即⑶R1、⑶R2、和⑶R3、以及FR)的氨基酸序列的如在此定義的抗體或免疫球蛋白(它)的輕鏈和重鏈的部分。Vh是指重鏈的可變區(qū)。'是指輕鏈的可變區(qū)。根據(jù)本披露中使用的方法，分配到CDR和FR上的氨基酸位置是根據(jù)Kabat (1987和1991)或Chothia (1989)定義的并且根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行編號。熟練的業(yè)內(nèi)人士將能夠容易地將其他編號系統(tǒng)用于本披露的性能中，例如Clothia和Lesk (1987)和/或Chothia (1989)和/或Al-Lazikani等人(1997)的高變區(qū)環(huán)編號系統(tǒng)(hypervariable loop numbering system)。如在此使用的，術(shù)語“重鏈可變區(qū)”或“VH ”應(yīng)當(dāng)理解成表示能夠結(jié)合到一種或多種抗原上，優(yōu)選地特異性地結(jié)合到一種或多種抗原上，并且至少包含⑶Rl的一種蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，該重鏈連同三個(gè)⑶R—起包括三個(gè)或四個(gè)FR(例如，F(xiàn)R1、FR2、FR3以及任選地FR4)。在一個(gè)實(shí)例中，重鏈包括根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的以下殘基1_25或1_30 (FRl)，26-35 或 31-35 (或 35b)(CDRl)，36-49(FR2)，50-65(CDR2)，66-94(FR3)，95-102(CDR3)和103-113 (FR4)定位的FR和⑶R。在一個(gè)實(shí)例中，該重鏈?zhǔn)菑陌ㄋ鲋劓満投鄠€(gè)(優(yōu)選地3個(gè)或4個(gè))恒定域的免疫球蛋白衍生的或連接到恒定片段(Fe)上。如在此使用的，術(shù)語“輕鏈可變區(qū)”或應(yīng)當(dāng)理解成表示能夠結(jié)合到一種或多種抗原上，優(yōu)選地特異性地結(jié)合到一種或多種抗原上，并且至少包含⑶Rl的一種蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，該輕鏈連同三個(gè)⑶R —起包括三個(gè)或四個(gè)FR(例如，F(xiàn)RU FR2、FR3以及任選地FR4)。優(yōu)選地，輕鏈包括根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的以下殘基1_23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)以及 98-107 (FR4)定位的 FR 以及⑶R。在一個(gè)實(shí)例中，該輕鏈?zhǔn)菑陌ㄟB接到恒定域上和/或不連接到恒定片段(Fe)上的所述輕鏈的免疫球蛋白衍生的。在本披露的一些實(shí)例中，術(shù)語“框架區(qū)”應(yīng)當(dāng)理解為表示除了⑶R殘基之外的那些可變區(qū)殘基。天然發(fā)生抗體的每個(gè)可變區(qū)典型地具有鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4的4個(gè)FR。如果⑶R是根據(jù)Kabat來定義的，示例性的輕鏈FR(LCFR)殘基定位在殘基1_23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)、以及 98-107 (LCFR4)的附近。注意的是入 LCFRl 不包括殘基10 (該殘基包括在K LCFRl中)。示例性的重鏈FR(HCFR)殘基定位在殘基1_25或1-30 (HCFRl)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)、以及 103-113 (HCFR4)的附近。如在此使用的，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(同義詞⑶R ;即⑶R1XDR2、和⑶R3或高變區(qū))是指其存在對于抗原結(jié)合是必需的抗體可變區(qū)的氨基酸殘基。每個(gè)可變區(qū)典型地具有鑒定為⑶R1XDR2和⑶R3的三個(gè)區(qū)域。每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)可以包括來自如Kabat (1987或1991或1992)或Chotia(1989)定義的“互補(bǔ)決定區(qū)”的氨基酸殘基。在本披露的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，·在重鏈可變區(qū)中，⑶RHl是在殘基26至35 (或35b)之間，⑶RH2是在殘基50至65之間，并且⑶RH3是在殘基95至102之間(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行編號)。在輕鏈中，⑶RLl是在殘基24至34之間，⑶RL2是在殘基50至56之間并且⑶RL3是在殘基89至97之間(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行編號)。這些⑶R還可以包括多個(gè)插入，例如在如Kabat (1987和/或1991和/或1992)中說明的。如在此使用的，術(shù)語“Fv”應(yīng)當(dāng)理解為表示任何蛋白質(zhì)，無論包括多個(gè)多肽或一個(gè)單個(gè)多肽，其中 '和Vh結(jié)合并且形成具有抗原結(jié)合位點(diǎn)(即能夠特異性地結(jié)合到抗原上)的一種復(fù)合物。形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的Vh和\抗原是在一個(gè)單個(gè)多肽鏈中或在不同多肽鏈中。此外，本披露的Fv(以及本披露的任何蛋白)抗原具有可以或不可以結(jié)合相同抗原的多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解成包括從抗體直接衍生的片段以及相應(yīng)于使用重組手段生產(chǎn)的這種片段的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)例中，Vh不連接到重鏈恒定域(Ch) I上和/或\不連接到輕鏈恒定域(Q)上。示例性的包含F(xiàn)v的多肽或蛋白質(zhì)包括一種Fab片段、一種Fab’片段、一種F(ab’ )片段、一種scFv、一種雙鏈抗體、一種三鏈抗體、一種四鏈抗體、或更高等級的復(fù)合物、一種結(jié)構(gòu)域抗體(例如，一種Vh)或連接到一個(gè)恒定區(qū)或其結(jié)構(gòu)域上的上述中的任何一項(xiàng)，例如，Ch2或Ch3結(jié)構(gòu)域?！癋ab片段”由抗體的單價(jià)抗原結(jié)合片段組成，并且可以通過用木瓜酶消化整個(gè)免疫球蛋白來生產(chǎn)，從而產(chǎn)生由完整的輕鏈和重鏈的一部分組成的一個(gè)片段或可以使用重組手段生產(chǎn)。通過用胃蛋白酶處理全抗體可以獲得抗體的“Fab’片段”，緊接著還原，從而產(chǎn)生由一個(gè)完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分組成的分子。以這種方式處理的每個(gè)抗體得到兩個(gè)Fab’片段。還可以通過重組手段生產(chǎn)Fab’片段?？贵w的“F(ab’)2片段”由通過兩個(gè)二硫鍵保持在一起的兩個(gè)Fab’片段的二聚體組成，并且通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體而獲得，而沒有隨后的還原?！癋ab2”片段是包括使用例如亮氨酸拉鏈*Ch3結(jié)構(gòu)域連接的兩個(gè)Fab片段的一種重組片段?！皢捂淔v”或“scFv”是包含其中'和￥11是通過適當(dāng)?shù)娜嵝远嚯慕宇^共價(jià)連接的抗體的可變區(qū)片段(Fv)的重組分子。落在本術(shù)語范圍內(nèi)的示例性的包含F(xiàn)v的蛋白質(zhì)的詳細(xì)討論在此在下面進(jìn)行提供。
如在此使用的，術(shù)語“抗原結(jié)合位點(diǎn)”應(yīng)當(dāng)理解成表示由能夠特異性地結(jié)合到抗原上的蛋白質(zhì)形成的結(jié)構(gòu)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)不需要是一系列的連續(xù)氨基酸，或甚至是在一個(gè)單個(gè)多肽鏈中的氨基酸。例如，在從兩個(gè)不同多肽鏈產(chǎn)生的Fv中，抗原結(jié)合位點(diǎn)是由\和Vh的一系列區(qū)域組成的，這些區(qū)域與抗原相互作用并且然而它們通常不總是在每個(gè)可變區(qū)中一個(gè)或多個(gè)⑶R中。“恒定域”是抗體中的一種結(jié)構(gòu)域，其序列在相同類型的抗體(例如，IgG或IgM或IgE)中是高度類似的?？贵w的恒定區(qū)通常包括多個(gè)恒定域，例如Y、a和S重鏈的恒定區(qū)包括三個(gè)恒定域并且Y、a和S重鏈的Fe包括兩個(gè)恒定域。y和e重鏈的恒定區(qū)包括4個(gè)恒定域并且Fe區(qū)包括2個(gè)恒定域。如在此使用的術(shù)語“可結(jié)晶的片段”或“Fe”是指包括至少一個(gè)恒定域的抗體的一部分，并且它通常(盡管不是必然的)是糖基化的并且它結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)Fe受體和/或補(bǔ)體級聯(lián)的組分(例如，賦予效應(yīng)子功能)上?？梢詮奈宸N同種型(a、S、e、Y、或ii)的任何一項(xiàng)中選擇重鏈恒定區(qū)。此外，不同亞類的重鏈(例如重鏈的IgG亞類)負(fù)責(zé)不同效應(yīng)子功能并且因此通過選擇所希望的重鏈恒定區(qū)，可以生產(chǎn)具有所希望的效應(yīng)子功能的 蛋白質(zhì)。優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)是Y l(IgGl),2(IgG2)以及y3(IgG3)0對于“Kabat編號系統(tǒng)”，表示用于以與Kabat (1987和/或1991和/或1992)中提出的系統(tǒng)一致的形式對免疫球蛋白的可變區(qū)中的殘基進(jìn)行編號的系統(tǒng)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”應(yīng)當(dāng)理解成包括一種單個(gè)多肽，S卩，通過肽鍵連接的一系列連續(xù)氨基酸或共價(jià)地或非共價(jià)地連接到彼此上的一系列多肽(即，多肽復(fù)合物)。例如，該系列的多肽可以是使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或二硫鍵共價(jià)地連接的。非共價(jià)鍵的實(shí)例包括氫鍵、離子鍵、范德華力、以及疏水性相互作用。本披露考慮的非共價(jià)鍵是Vh與\之間的相互作用，例如處于雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體或抗體的一些形式。術(shù)語“多肽”應(yīng)當(dāng)理解成是指來自上述段落，表示通過肽鍵連接的一系列連續(xù)氨基酸。如在此使用的，術(shù)語“抗原”應(yīng)當(dāng)理解成表示可以針對它而產(chǎn)生免疫球蛋白反應(yīng)(例如，抗體反應(yīng))的物質(zhì)的任何組合物。示例性的抗原包括蛋白質(zhì)類、肽類、多肽類、碳水化合物類、磷酸鹽基團(tuán)類、磷酸肽類或多肽類、糖基化的肽類或肽類等。如在此使用的，術(shù)語“特異性的結(jié)合”或“以特異性方式結(jié)合”應(yīng)當(dāng)理解成表示與本披露的蛋白質(zhì)與替代的抗原或細(xì)胞反應(yīng)或結(jié)合相比較，它以更多的持續(xù)時(shí)間和/或以更大的親和力更頻繁地、更迅速地與一種特定抗原或多種抗原或表達(dá)它們的細(xì)胞反應(yīng)或結(jié)合。例如，與特異性地結(jié)合到抗原上的蛋白質(zhì)結(jié)合到其他抗原上相比較，它以更大的親和力、親和度、更容易地、和/或以更長的持續(xù)時(shí)間結(jié)合該抗原。通過閱讀本定義還理解的是例如特異性地結(jié)合到一種第一抗原上的蛋白質(zhì)可以或不可以特異性地結(jié)合到一種第二抗原上。這樣，“特異性結(jié)合”不必要求專一地結(jié)合或不可檢出地結(jié)合另一種抗原，這是通過術(shù)語“選擇性結(jié)合”來表示的。通常地，但不是必需地，提及結(jié)合表示特異性結(jié)合，并且每個(gè)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解成為其他術(shù)語提供明確支持。如在此使用的，在Vh的背景下術(shù)語“修飾的”表示與親本(或未修飾的)Vh相比較Vh的序列被改變。例如，在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處包括除了帶負(fù)電荷的氨基酸之外氨基酸的Vh被修飾成用帶負(fù)電荷的氨基酸取代這些氨基酸的一個(gè)或多個(gè)。例如，在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處對Vh進(jìn)行修飾用來增加在這些位置處的帶負(fù)電荷的氨基酸的數(shù)量，例如總計(jì)I或2或3或4或5或更多。在一個(gè)示例性的形式中，在列舉的位置處帶負(fù)電荷的氨基酸的數(shù)量增加為至少2個(gè)。對于“逐個(gè)地”表示本披露分開地涵蓋了所述的殘基或多個(gè)殘基的組，并且是指盡管單獨(dú)的一個(gè)或多個(gè)殘基或多個(gè)殘基的組可能并未在此分開地列出，隨附的權(quán)利要求可以分開地定義此類一種或多種殘基或多個(gè)殘基的組并且可以彼此分開。對于“共同地”，表示本披露涵蓋了任何數(shù)目或組合的所述的殘基或多個(gè)殘基的 組，并且是指盡管此類數(shù)目的或組合的一個(gè)或多個(gè)殘基或多個(gè)殘基的組未能在此確切地列出，隨附的權(quán)利要求可以分開地定義此類組合或亞組合，并且可以與一個(gè)或多個(gè)殘基或殘基的組的任何其他組合分開。
包含可變區(qū)的蛋白質(zhì)本披露考慮了包括特異性地或選擇性地結(jié)合到一種或多種抗原上并且如根據(jù)任何一個(gè)實(shí)施方案在此所述進(jìn)行修飾的免疫球蛋白重鏈變區(qū)的任何蛋白質(zhì)。熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“免疫球蛋白”包括符合Kabat編號系統(tǒng)的免疫球蛋白超家族的任何蛋白質(zhì)。免疫球蛋白超家族成員的實(shí)例包括T細(xì)胞受體。本披露優(yōu)選地考慮了包括特異性地或選擇性地結(jié)合到一種或多種抗原上(例如通過抗原結(jié)合位點(diǎn))并且如根據(jù)任何一個(gè)實(shí)施方案在此所述進(jìn)行修飾的抗體Vh的任何蛋白質(zhì)。
抗體可變區(qū)如熟練的業(yè)內(nèi)人士基于在此的說明應(yīng)當(dāng)清楚的，本披露的蛋白質(zhì)可以包括來自被修飾成在于此說明的位置處包括帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體的一個(gè)或多個(gè)VH。這樣的蛋白質(zhì)包括多種抗體(例如，整個(gè)抗體或全長抗體)?？梢酝ㄟ^首先生產(chǎn)針對感興趣抗原的一種抗體并且對該抗體進(jìn)行修飾(例如使用重組手段)或通過對前面生產(chǎn)的抗體進(jìn)行修飾來生產(chǎn)這類抗體?？商娲?，生產(chǎn)了包括本披露Vh的蛋白質(zhì)，并且然后將該蛋白質(zhì)被修飾或用來生產(chǎn)抗體。用于生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法(例如雜交瘤技術(shù))由Kohler和Milstein，(1975)進(jìn)行了說明。在雜交瘤方法中，典型地用免疫原或抗原或表達(dá)它們的細(xì)胞來免疫小鼠、倉鼠、或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，用于引發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生可以特異性地結(jié)合到該免疫原或抗原上的抗體。然后使用適當(dāng)?shù)娜诤蟿?例如聚乙二醇)使來自免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合從而形成一種雜交瘤細(xì)胞(Goding，1986)?？梢詫⒌玫降碾s交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生化細(xì)胞的生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本蛋白缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地可以包括次黃嘌呤、氨蝶呤、以及胸苷(“HAT培養(yǎng)基”)，這些物質(zhì)阻止了 HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長。本披露還考慮了用于生產(chǎn)抗體的其他方法，例如使用在Largaespada (1990)或Weissinger等人(1991)中以屬類方式詳細(xì)說明的ABL-MYC技術(shù)。可替代地，抗體、或其編碼序列是從前面生產(chǎn)的表達(dá)感興趣抗體的細(xì)胞產(chǎn)生的(例如雜交瘤或轉(zhuǎn)染瘤)。這類雜交瘤和/或轉(zhuǎn)染瘤的不同來源對于熟練的業(yè)內(nèi)人士而言應(yīng)當(dāng)是清楚的并且包括在例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和/或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保存中心(ECACC)中。用于分離和/或修飾編碼來自抗體的Vh的序列的方法對于熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)是清楚的和/或在此進(jìn)行說明。根據(jù)本披露可以修飾的示例性的抗體包括但不限于SYNAGIS (帕利珠單抗;MedImmune)，它是一種人源化的抗呼吸道合胞體病毒(RSV)單克隆抗體；HERCEPTIN (曲妥珠單抗；Genentech)，它是一種人源化的抗J1ER2單克隆抗體；REMICADE (英利昔單抗；CentOCOr)，它是一種嵌合的抗TNFa單克隆抗體；REOPRO (阿昔單抗；Centocor),它是一種抗糖蛋白Iib/IIIa 受體抗體；ZENAPAX (達(dá)利珠單抗；Roche Pharmaceuticals),它是一種人源化的抗CD25單克隆抗體；RITUXANtm/MABTHERAtm(利妥昔單抗)，它是一種嵌合的抗CD20 IgGl 抗體(IDEC Pharm/Genentech, Roche) ;STMULECTtm(巴利昔單抗；Novartis)，它是一種嵌合的抗IL-2Ra抗體；ERBITUX(西妥昔單抗；ImClone)，它是一種嵌合的抗EGFR抗體；MYL0TARG (吉姆單抗；Ce 11 tech/Wyeth)，它是一種人源化的抗CD33抗體)；Campath IH/LDP-O3 (阿侖單抗；ILEX/Schering/Millenium),它是一種人源化的抗 CD52IgGl 抗體；X0LAIR (奧馬佐單抗；Tanox/Genentech/Novartis)，一種人源化的抗 IgEFe抗體；AVASTIN (貝伐單抗；Genentech),人源化的抗VEGF抗體；RAPTIVA (依法珠單抗；Genentech/Merck Serono),它是一種人源化的抗OHla抗體；LUCENTIS(蘭尼單抗；Genentech/Novartis)，它是一種人源化的抗VEGF-A抗體；TYSABRI (那他珠單抗；Biogen Idec/EIan Pharmaceuticals),它是一種人源化的抗整聯(lián)蛋白a 4抗體；S0LIRIS (依庫珠單抗；Alexion Pharmaceuticals),它是一種人源化的抗補(bǔ)體蛋白C5抗體；VECTIBIX (帕尼單抗；Amgen)，全人的抗EGFR單克隆抗體^HUMIRA (阿達(dá)木單抗；Abbott/Medlmmune Cambridge)全人的抗TNF a。包括抗體Vh的其他抗體和蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域已知的并且不排除在外。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地獲得已知抗體Vh的序列。示例性的序列包括阿達(dá)木單抗ID NO 10)或利妥昔單抗IDNO 11)或曲妥珠單抗的VH(SEQ IDNO 12)或貝伐單抗的Vh(SEQ IDNO :13)。根據(jù)本披露可以容易地修飾這些序列。
在抗體生產(chǎn)和/或?qū)⑵渚幋a序列分離之后，將抗體或它的Vh修飾成在必要的位置中包括帶負(fù)電荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)用來賦予聚集抗性(例如，如根據(jù)任何一個(gè)實(shí)施方案在此說明的)。通常，這包括分離編碼Vh或抗體的核酸并且將它的序列修飾成在必要位點(diǎn)處包括編碼天冬氨酸(即，GAA或GAG)或谷氨酸(即GAT或GAC)的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
嵌合的人源化的以及人化抗體本披露的蛋白質(zhì)可以衍生自或可以是一種人源化的抗體或人化抗體或從中衍生的VH。術(shù)語“人源化的抗體”應(yīng)當(dāng)理解成是指一種嵌合分子，該嵌合分子通常是使用重組技術(shù)制備的，具有從來自非人類物種的抗體衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)并且該分子的剩余抗體結(jié)構(gòu)是基于人類抗體的結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選地包括接枝到人類抗體可變區(qū)中適當(dāng)?shù)腇R( S卩，Vh中除了 CDR之外的區(qū)域)上的來自非人類抗體的CDR并且剩余區(qū)域是來自人類抗體?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型或被一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代所修飾。在一些實(shí)例中，人類抗體的框架殘基被相應(yīng)的非人類殘基替換。人源化抗體還可以包括在受體抗體或輸入的CDR或框架序列中不能找到的殘基。通常，人源化的抗體可以包括基本上所有至少一個(gè)，并且典型地兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本上所有CDR區(qū)相應(yīng)于非人類抗體的那些并且所有或基本上所有FR區(qū)是人類抗體一致序列的那些。用于人源化非人類抗體的方法是本領(lǐng)域已知的?；旧峡梢园凑誙S5225539、US6054297或US5585089的方法來進(jìn)行人源化。不排除用于人源化抗體的其他方法。如結(jié)合抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)的在此使用的術(shù)語“人類抗體”是指具有可變的以及任選地恒定的衍生自或相應(yīng)于在人類中(例如在人種系或體細(xì)胞中)發(fā)現(xiàn)的序列的抗體區(qū)的抗體?！叭恕笨贵w可以包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基，例如，通過隨機(jī)或體外定點(diǎn)突變引入的突變(具體地是在抗體的少量殘基中涉及保守取代或突變的突變，例如在抗體的1、2、3、4或5個(gè)殘基中，優(yōu)選地例如在組成抗體的一個(gè)或多個(gè)⑶R的1、2、3、4或5個(gè)殘基中)和/或在此說明的位置處的帶負(fù)電荷的氨基酸。示例性的人類抗體或蛋白包括人框架區(qū)(例如，來自人種系)并且在除了帶負(fù)電荷的氨基酸包括于其上的一個(gè)或多個(gè)位置之外的CDR中的任意氨基酸。這些“人類抗體”實(shí)際上 并不必須由人來生產(chǎn)，而是它們可以使用重組手段來生產(chǎn)和/或從包含編碼人類抗體恒定和/或可變區(qū)的核酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中(例如小鼠)分離?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)(包括噬菌體展示文庫(例如，如在Hoogenboom和Winter 1991 ;US5, 885，793中說明的和/或在下面說明的)或使用表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，如W02002/066630 ;Lonberg等人(1994)或Jakobovits等人(2007)說明的)來生產(chǎn)人類抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括人Vh(即在除了根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的位置處)。例如，該蛋白質(zhì)包括全部人框架區(qū)。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)不包括人源化Vh或不包括從人源化抗體衍生的VH。例如，該蛋白質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)中不包括鼠類氨基酸。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)不包括從人源化的Fab4D5衍生的Vh(例如，如US6407213中說明的)。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)是一種嵌合抗體。術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與從具體物種(例如，鼠類，例如小鼠)中得到的抗體中相應(yīng)的序列完全相同或同源的抗體或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類，而該一個(gè)或多個(gè)鏈的剩余部分與從另一個(gè)物種(例如，靈長類，例如人類)得到的抗體中相應(yīng)序列完全相同或同源或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類，以及這類抗體的片段，只要它們顯示出所希望的生物活性即可(US4，816，567)。典型地，嵌合抗體使用嚙齒動(dòng)物或兔可變區(qū)以及人恒定區(qū)，以便生產(chǎn)主要具有人結(jié)構(gòu)域的抗體。例如，嵌合抗體包括來自根據(jù)本披露的任何實(shí)施方案修飾的融合到人恒定區(qū)上的小鼠抗體的可變區(qū)。這類嵌合抗體的生產(chǎn)是本領(lǐng)域已知的，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)手段實(shí)現(xiàn)(如，例如在US5, 807，715、US4，816，567以及US4, 816，397中說明的)。
包含Vh的蛋白質(zhì) 單域抗體在一些實(shí)施方案中，本披露的蛋白是一種單域抗體(它與術(shù)語“結(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”可互換地使用)。單域抗體是包括抗體的重鏈可變域的全部或一部分的一種單個(gè)多肽鏈。在某些實(shí)施方案中，單域抗體是一種人單域抗體(Domantis公司，沃爾瑟姆市，馬薩諸塞州；參見例如 US6, 248，516、W090/05144、W02003/002609 和 / 或 W02004/058820)。在一個(gè)實(shí)例中，單域抗體由能夠特異性地結(jié)合到抗原上以及能夠根據(jù)本披露進(jìn)行修飾的抗體重鏈可變域的全部或一部分組成。本披露還包括融合到另一種分子(例如，另一種結(jié)構(gòu)域抗體或Fe區(qū))上的結(jié)構(gòu)域抗體。
示例性的結(jié)構(gòu)域抗體包括在SEQ ID NO :5_9中的任一項(xiàng)中列出的序列。
雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體包括Vh的示例性的蛋白質(zhì)是雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及更高等級的蛋白復(fù)合物例如在W098/044001和W094/007921中說明的那些。如在此使用的，術(shù)語“雙鏈抗體”應(yīng)當(dāng)理解成表示包括兩個(gè)相關(guān)多肽鏈的一種蛋白質(zhì)，每個(gè)多肽鏈包括結(jié)構(gòu)'-X-Vh或VH-X-'，其中\(zhòng)是一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)，Vh是一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)，X是包括不足以允許一個(gè)單個(gè)多肽鏈中的V1^P'相結(jié)合(或形成Fv)的殘基的一個(gè)接頭或不存在，并且其中一個(gè)多肽鏈的Vh結(jié)合到另一個(gè)多肽鏈的'上以形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，即用來形成能夠特異性地結(jié)合到一種或多種抗原上的一個(gè)Fv分子。在每個(gè)多肽鏈中的\和Vh可以是相同的或在每個(gè)多肽鏈中\(zhòng)和Vh可以是不同的從而形成一種雙特異性雙鏈抗體(即，包括具有不同特異性的兩個(gè)Fv)。 如在此使用的，術(shù)語“三鏈抗體”應(yīng)當(dāng)理解成表示包括三個(gè)結(jié)合的多肽鏈的一種蛋白質(zhì)，每個(gè)多肽鏈包括如上關(guān)于雙鏈抗體所提出的結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)多肽鏈的Vh與另一個(gè)多肽鏈的\相結(jié)合從而由此形成一個(gè)三聚體蛋白(三鏈抗體)。如在此使用的，術(shù)語“四鏈抗體”應(yīng)當(dāng)理解成表示包括四個(gè)結(jié)合的多肽鏈的一種蛋白質(zhì)，每個(gè)多肽鏈包括如關(guān)于雙鏈抗體所提出的結(jié)構(gòu)，并且其中一個(gè)多肽鏈的Vh與另一個(gè)多肽鏈的'相結(jié)合從而由此形成一個(gè)四聚體蛋白(四鏈抗體)。熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)知道雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體以及它們的生產(chǎn)方法。Vh和\能夠以任何順序定位，即或VH-'。通常，這些蛋白質(zhì)包括一種多肽鏈，其中一個(gè)Vh和一個(gè)\直接地或使用接頭連接，該接頭具有不足以允許Vh和\結(jié)合的長度。包括Vh和\的蛋白質(zhì)相結(jié)合從而形成雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體，這取決于接頭(如果存在的話)的長度和/或Vh和\結(jié)構(gòu)域的順序。優(yōu)選地，該接頭包括12個(gè)或更少的氨基酸。例如，在多肽鏈具有以下以N到C順序Vh-X-'安排的結(jié)構(gòu)的情況下，當(dāng)X是一個(gè)接頭時(shí)，具有3-12個(gè)殘基的接頭通常導(dǎo)致形成雙鏈抗體，當(dāng)接頭具有I或2個(gè)殘基或當(dāng)接頭不存在時(shí)通常導(dǎo)致形成三鏈抗體。在多肽鏈具有以下以N到C順序'-X-Vh安排的結(jié)構(gòu)的情況下，當(dāng)X是一個(gè)接頭時(shí)，具有3-12個(gè)殘基的接頭通常導(dǎo)致形成雙鏈抗體，具有I或2個(gè)殘基的接頭通常導(dǎo)致形成雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體并且缺乏接頭的多肽通常形成三鏈抗體或四鏈抗體。說明雙鏈抗體、三鏈抗體和/或四鏈抗體的示例性出版物包括W094/07921、W098/44001、Holliger 等人(1993)、Hudson 和 Kortt (1999)、Hollinger 和 Hudson (2005)、以及其中引用的參考文件。
單鏈 Fv (scFv)熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)知道的是scFv包括在一個(gè)單個(gè)多肽鏈中的V1^P '區(qū)。優(yōu)選地，多肽鏈進(jìn)一步包括Vh與 '之間的一個(gè)多肽接頭，它使scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的所希望的結(jié)構(gòu)(即，用于單個(gè)多肽鏈的％和'彼此結(jié)合從而形成一個(gè)Fv)。這與雙鏈抗體或更高等級的多聚體不同，其中來自不同多肽鏈的可變區(qū)彼此締合或結(jié)合。例如，接頭包括超過12個(gè)氨基酸殘基,其中(Gly4Ser)3是針對scFv更偏愛的接頭之一。本披露還考慮了二硫鍵穩(wěn)定的Fv (或diFv或dsFv),其中一個(gè)單個(gè)半胱氨酸殘基被引入到Vh的FR以及\的FR中，并且這些半胱氨酸殘基通過二硫鍵連接從而產(chǎn)生一種穩(wěn)定的Fv (參見例如Brinkmann等人，1993)。可替代地，或另外地，本披露提供了一種二聚體scFv，即包括通過非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵連接的兩個(gè)scFv分子的一種蛋白質(zhì)。這類二聚體scFv的實(shí)例包括例如連接到亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域上的兩個(gè)scFv(例如,從Fos或Jun衍生的)，由此這些亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域相結(jié)合從而形成二聚體化合物(參見例如Kostelny 1992或Kruif■和Logtenberg, 1996)?？商娲?，通過具有允許兩個(gè)scFv形成并且允許結(jié)合到抗原上的足夠長度的肽接頭來連接兩個(gè)scFv(例如，如在US20060263367中說明的)。本披露還考慮了 scFv的修飾形式，例如包括修飾成允許糖基化的接頭的scFv (例如，如在US6，323，322中說明的)。熟練的業(yè)內(nèi)人士將能夠容易地生產(chǎn)scFv或其包括根據(jù)基于在此披露的本披露適當(dāng)修飾的Vh的修飾形式。關(guān)于scFv的綜述,參見Pliickthun(1994)。另外的scFv的說明可以在例如Bird等人，1988中找到。
微抗體熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)知道的是微抗體包括融合到抗體的G2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域上的抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域。任選地，微抗體包括Vh和\與Ch2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)，有時(shí)這種構(gòu)象稱為柔性微抗體(Flex Minibody) (Hu等人，1996)。微抗體不包括C0I或Q。優(yōu)選地，V1^P'結(jié)構(gòu)域融合到抗體的鉸鏈區(qū)以及G3結(jié)構(gòu)域上。每個(gè)區(qū)域可以是從同一個(gè)抗體衍生的?？商娲?，V1^P'結(jié)構(gòu)域可以是從一個(gè)抗體衍生的并且鉸鏈和Ch2/Ch3來自另一個(gè)抗體，或鉸鏈和Ch2/Ch3也可以是從不同抗體衍生的。本披露還考慮了包括來自一個(gè)抗體的Vh和\以及來自另一個(gè)抗體的Vh和\的多特異性微抗體。示例性的微抗體以及它們的生產(chǎn)方法在例如W094/09817中進(jìn)行了說明。
包含其他可變區(qū)的蛋白質(zhì)US5, 731，168說明了其中一對Fv的界面被工程化以便使異源二聚體的百分比最大化的分子，該異源二聚體是從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的，由此生產(chǎn)雙特異性蛋白。優(yōu)選的界面包括(^3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，來自第一蛋白的界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈被更大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或丙氨酸)替換較大氨基酸側(cè)鏈在第二蛋白的界面上產(chǎn)生了與一個(gè)或多個(gè)較大側(cè)鏈具有完全相同或類似尺寸的補(bǔ)償性“空腔”。包含可變區(qū)的雙特異性蛋白包括交聯(lián)的或“異共軛的”蛋白。例如，處于異共軛狀態(tài)的蛋白質(zhì)之一可以結(jié)合到抗生物素蛋白上并且另一個(gè)結(jié)合到生物素上。例如已經(jīng)提出這類蛋白將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向到不想要的細(xì)胞上(US4，676，980)?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的交聯(lián)方法制造包括可變區(qū)的異共軛蛋白。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑是本領(lǐng)域已知的，并且連同多種交聯(lián)技術(shù)一起披露于US4，676，980中。還可以使用化學(xué)鍵來制備包括可變區(qū)的雙特異性蛋白。Brennan(1985)說明了一個(gè)步驟，其中完整的抗體被蛋白質(zhì)裂解地切割從而產(chǎn)生F(ab’)2片段。在二硫醇絡(luò)合劑、亞砷酸鈉的存在下將這些片段還原，以穩(wěn)定鄰位二硫醇并且防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原將這些Fab’ -TNB衍生物中的一種再轉(zhuǎn)化成Fab’ -硫醇并且與等摩爾量的另一種Fab’ -TNB衍生物混合從而形成雙特異性蛋白。
包含另外可變區(qū)的蛋白包括例如單鏈Fab (例如，Hust等人，2007)或Fab3(例如，如在EP19930302894中說明的)。
恒定域融合本披露涵蓋了包括本披露的修飾的Vh以及一個(gè)恒定區(qū)(例如，F(xiàn)e)或其結(jié)構(gòu)域(例如(^2和/*CH3結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)。例如，本披露提供了微抗體(如上面討論的)或結(jié)構(gòu)域抗體-Fe融合物或scFv-Fc融合物或雙鏈抗體-Fe融合物或三鏈抗體-Fe融合物或四鏈抗體-Fe融合物或結(jié)構(gòu)域抗體_Ch2融合物、scFv-Ch2融合物或雙鏈抗體_Ch2融合物或三鏈抗體_Ch2融合物或四鏈抗體_Ch2融合物或結(jié)構(gòu)域抗體_Ch3融合物或scFv-Ch3融合物或雙鏈抗體_Ch3融合物或三鏈抗體_Ch3融合物或四鏈抗體_Ch3融合物。這些蛋白質(zhì)中的任何一種可以在可變區(qū)和恒定區(qū)或恒定域之間包括一個(gè)接頭，優(yōu)選地一個(gè)抗體鉸鏈區(qū)。優(yōu)選地，這類Fe融合蛋白具有效應(yīng)子功能。
如在此使用的，術(shù)語“CH2結(jié)構(gòu)域”包括重鏈抗體分子的部分，該部分例如從根據(jù)Kabat EU編號系統(tǒng)的(如在Kabat 1991或1992中披露的)位置231-340附近之間延伸。兩個(gè)N連接分支的碳水化合物鏈通常插入在一個(gè)完整的天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本披露的蛋白質(zhì)包括從IgGl分子(例如，人類IgGl分子)衍生的CH2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本披露的蛋白質(zhì)包括從IgG4分子(例如，人類IgG4分子)衍生的Ch2結(jié)構(gòu)域。如在此使用的，術(shù)語“Ch3結(jié)構(gòu)域”包括重鏈抗體分子的部分，該部分從Ch2結(jié)構(gòu)域的N端延伸大約110個(gè)殘基(例如從位置341-446b附近(Kabat EU編號系統(tǒng)))。CH3結(jié)構(gòu)域典型地形成IgG抗體的C-端部分。然而，在一些抗體中，另外的結(jié)構(gòu)域可以從(^3結(jié)構(gòu)域延伸從而形成該分子的C端部分(例如，IgM的ii鏈和IgE的e鏈中的Ch4結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白包質(zhì)括從IgGl分子(例如，人類IgGl分子)衍生的Ch3結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本披露的蛋白質(zhì)包括從IgG4分子(例如，人類IgG4分子)衍生的Ch3結(jié)構(gòu)域?？梢詮亩喾N不同來源獲得用于生產(chǎn)本披露的蛋白質(zhì)的恒定區(qū)序列。在優(yōu)選的實(shí)例中，該蛋白質(zhì)的恒定區(qū)或其部分是從人類抗體衍生的。然而應(yīng)當(dāng)理解的是恒定區(qū)或其部分可以是從另一種哺乳動(dòng)物種類的免疫球蛋白或抗體衍生的，包括例如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人靈長類(例如，黑猩猩、獼猴)種類。此外，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域或其部分可以是從任何抗體類別衍生的。如在此使用的，術(shù)語“效應(yīng)子功能”是指Fe區(qū)或其部分(例如G2結(jié)構(gòu)域)結(jié)合免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)和/細(xì)胞以及調(diào)節(jié)不同生物效應(yīng)的功能性能力。效應(yīng)子功能可以是抗原依賴性的或抗原非依賴性的?！翱乖蕾囆孕?yīng)子功能”是指這樣一種效應(yīng)子功能，該功能通常是在抗體結(jié)合到抗原上之后誘導(dǎo)的。典型的抗原依賴性效應(yīng)子功能包括結(jié)合補(bǔ)體蛋白(例如Clq)上的能力。例如，補(bǔ)體的Cl組分結(jié)合到Fe區(qū)上抗原活化經(jīng)典的補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致了調(diào)理作用和細(xì)胞病原體的溶解(稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC的一種過程)。補(bǔ)體的活化還刺激了炎性反應(yīng)并且還可以涉及自身免疫超敏反應(yīng)。其他抗原依賴性效應(yīng)子功能是通過抗體經(jīng)由它們的Fe區(qū)結(jié)合到細(xì)胞上某些Fe受體(“FcR s”)上來介導(dǎo)的。存在針對不同類別的抗體(包括IgG( Y受體，或IgX R)、IgE ( e受體，或Ig e R)、IgA( a受體，或Iga R)以及IgM(U受體，或IgyR)特異性的多種Fe受體?？贵w到細(xì)胞表面上的Fe受體上的結(jié)合觸發(fā)了許多重要的并且多樣化的生物學(xué)反應(yīng)包括免疫復(fù)合物的內(nèi)吞作用、抗體覆蓋的顆粒或微生物的吞食和破壞(也成為抗體依賴性吞噬作用，或ADCP)、免疫復(fù)合物的清除、通過殺傷細(xì)胞溶解抗體覆蓋的靶細(xì)胞(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或ADCC)、炎性介質(zhì)的釋放、免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、胎盤轉(zhuǎn)移以及抗體生產(chǎn)的控制。如在此使用的，術(shù)語“抗原非依賴性效應(yīng)子功能”是指抗原通過抗體誘導(dǎo)的一種效應(yīng)子功能，無論它是否結(jié)合它相應(yīng)的抗原。典型的抗原非依賴性效應(yīng)子功能包括抗體的細(xì)胞運(yùn)輸、循環(huán)半衰期和清除率、以及純化的促進(jìn)。結(jié)構(gòu)上獨(dú)特的Fe受體，“新生的Fe受體”或“FcRn”，也稱為挽救受體，在調(diào)節(jié)半衰期和細(xì)胞運(yùn)輸方面起重要作用。從微生物細(xì)胞純化的其他Fe受體(例如葡萄球菌蛋白A或G)能夠以高親和力結(jié)合到Fe區(qū)上并且能夠用來促進(jìn)純化包含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)。例如可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及被選擇用來擴(kuò)增感 興趣結(jié)構(gòu)域的引物來克隆恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?？贵w序列的克隆在例如US5，658，570中進(jìn)行了說明。本披露的蛋白質(zhì)可以包含任何數(shù)量的不同類型的恒定區(qū)/域。組成蛋白質(zhì)的恒定區(qū)的恒定域或它們的部分可以是從不同抗體分子衍生的。例如，蛋白質(zhì)可以包括從IgGl分子衍生的Ch2結(jié)構(gòu)域或其部分以及從IgG3分子衍生的Ch3區(qū)或其部分。在本披露的另一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)包括足以賦予FcRn結(jié)合的Fe的至少一個(gè)區(qū)域。例如，結(jié)合到FcRn上的Fe區(qū)的部分包括根據(jù)Kabat EU編號的從IgG的從大約氨基酸282至438。在一個(gè)實(shí)例中，本披露改變的蛋白質(zhì)包括修飾的恒定區(qū)，其中一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域是部分地或完全缺失的(“結(jié)構(gòu)域缺失的恒定區(qū)”)。本披露還包括修飾的Fe區(qū)或已經(jīng)改變的部分(例如，提高的或降低的效應(yīng)子功能)。許多這類修飾的Fe區(qū)是本領(lǐng)域已知的并且例如在 W02005/035586、W02005/063815 或 W02005/047327 中進(jìn)行了說明。
去免疫化的蛋白質(zhì)本披露還考慮了一種去免疫化的蛋白質(zhì)。去免疫化的蛋白質(zhì)將一個(gè)或多個(gè)表位例如B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位移開(即突變)，由此降低了受試者可能產(chǎn)生針對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的可能性。用于生產(chǎn)去免疫化的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并且例如在W000/34317.W02004/108158和W02004/064724中進(jìn)行 了說明。例如，該方法包括執(zhí)行一個(gè)計(jì)算機(jī)分析來預(yù)測蛋白質(zhì)中的表位并且使預(yù)測的表位中一個(gè)或多個(gè)殘基突變，由此降低它的免疫原性。然后對該蛋白質(zhì)進(jìn)行分析(例如，計(jì)算機(jī)方式或體外地或體內(nèi)地)用于確保它保持它的結(jié)合到抗原上的能力。優(yōu)選的出現(xiàn)在CDR內(nèi)的表位不被突變，除非該突變不可能降低抗原結(jié)合。用于預(yù)測表位的方法是本領(lǐng)域已知的并且例如在Saha(2004)中進(jìn)行了說明?；谠诖说恼f明用于引入適當(dāng)?shù)耐蛔円约氨磉_(dá)和分析得到蛋白質(zhì)的方法對于熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)是清楚的。
文庫和篩選的方法本披露還包括了包含多種根據(jù)本披露修飾的Vh的蛋白質(zhì)的一個(gè)文庫，例如該文庫包括具有不同結(jié)合特征的多種蛋白質(zhì)。本披露的實(shí)例包括天然文庫、免疫文庫或合成文庫。天然文庫是從適當(dāng)宿主的B淋巴細(xì)胞得到的，該宿主尚未用任何免疫原激發(fā)，它也未展示感染或炎癥的癥狀。免疫文庫是從由適當(dāng)?shù)亍懊庖叩摹彼拗黧w內(nèi)(即，已經(jīng)用免疫原激發(fā)的宿主)獲得的B細(xì)胞和漿細(xì)胞的混合物制造的。在一個(gè)實(shí)例中，使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，寡dT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶)將來自這些細(xì)胞的mRNA翻譯成cDNA。在一個(gè)替代實(shí)例中，用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^PCR擴(kuò)增編碼來自宿主細(xì)胞的抗體的核酸(mRNA或基因組DNA)。用于這類抗體基因擴(kuò)增的引物是本領(lǐng)域已知的(例如，US6，096, 551和W000/70023)。在一個(gè)另外的實(shí)例中，來自宿主細(xì)胞的mRNA被合成為cDNA并且然后在一個(gè)PCR反應(yīng)中用抗體特異性引物對這些cDNA進(jìn)行擴(kuò)增(例如，US6, 319，690)。可替代地，可以通過常規(guī)cDNA克隆技術(shù)(Sambrook和Russell，編輯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》(Molecular Cloning A Laboratory Manual),第三版(3rdEd),第 1-3 卷(vols. 1-3),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2001)來克隆所有組成部分，而不使用PCR。在克隆過程中或之后將DNA修飾成在必要位點(diǎn)處包括一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)例中，建立了公開的人源抗體序列數(shù)據(jù)庫，其中抗體序列彼此比對。該數(shù)據(jù)庫用來定義抗體序列的亞群，這些序列在CDR環(huán)的序列和經(jīng)典折疊兩個(gè)方面顯示高度的相似性(如通過抗體結(jié)構(gòu)分析而確定的)。對于每個(gè)亞群而言，推導(dǎo)出一個(gè)一致序列，該 序列代表該亞群的多個(gè)成員；因此一致序列的全部集合表示人類抗體的全部結(jié)構(gòu)清單。然后例如通過全基因分析或通過使用合成的遺傳亞基來構(gòu)建這些人工基因。這些遺傳亞基相應(yīng)于處于多肽水平的結(jié)構(gòu)亞元件。在DNA水平上，這些遺傳亞基是通過在這些亞元件的每一個(gè)的起點(diǎn)和終點(diǎn)處的切割位點(diǎn)來定義的，在該載體系統(tǒng)中這些切割位點(diǎn)是唯一的。作為一致序列集合的成員的所有基因是這樣構(gòu)建的，使得它們包含相應(yīng)的遺傳亞序列的類似模式。例如，所述多肽是或衍生于HuCAL —致基因VKI、VK2、VK3、VK4、VM、V入2、V 入 3、Vh1A、Vh1B、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6、CK、C 入、ChI 或所述 HuCAL —致基因的任何組合。然后可以使用DNA分子的這個(gè)集合來產(chǎn)生抗體的“合成文庫”，優(yōu)選地Fv、二硫鍵連接的Fv、單鏈Fv(scFv)、Fab片段、或Fab’片段,它們可以用作特異性地結(jié)合到抗原上的蛋白質(zhì)的來源。US6，300，064披露了用于制造合成文庫的方法。這類合成文庫被修飾成包括根據(jù)本披露的帶負(fù)電荷的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)例中，通過合成從定義的V基因元件制造合成的人類抗體。Winter (EP0368684)提供了一種用于擴(kuò)增(例如通過PCR)、克隆、以及表達(dá)抗體可變區(qū)基因的方法。用這些基因開始，他能夠通過對重鏈和/或輕鏈的CDR3進(jìn)行隨機(jī)化處理來產(chǎn)生功能性抗體片段的文庫。這個(gè)過程在功能上等效于在免疫系統(tǒng)中B細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)生的VJ和VDJ重組的天然過程。例如，可以在體外通過連接到5個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基的合成的“D片段”和一個(gè)J片段上來重排人種系Vh基因片段的所有組成部分，以產(chǎn)生具有八個(gè)殘基的一個(gè)合成的第三互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。US5，885，793披露了制造例如這些的這類抗體文庫的方法。如熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)清楚的，包括本披露蛋白質(zhì)的文庫是這樣生產(chǎn)的，使得擴(kuò)增的V區(qū)包括編碼在此所述的位置處的帶負(fù)電荷的氨基酸的密碼子。根據(jù)本披露的蛋白質(zhì)可以是可溶的分泌蛋白或能夠以融合蛋白形式遞呈在細(xì)胞或顆粒(例如，噬菌體或其他病毒、核糖體或孢子)的表面上。各種展示文庫形式是本領(lǐng)域已知的，并且綜述見于例如Levin和Weiss (2006)中。例如，該文庫是一種體外展示文庫(即，使用體外展示來展示蛋白質(zhì)，其中表達(dá)的結(jié)構(gòu)域連接到從中它被表達(dá)使得所述結(jié)構(gòu)域在缺乏宿主細(xì)胞下而呈現(xiàn)的核酸上)。因此，通過體外展示技術(shù)生產(chǎn)的文庫不限于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率。體外展示方法的實(shí)例包括核糖體展示、共價(jià)展示以及mRNA展示。在一個(gè)實(shí)例中，該體外展示文庫是一種核糖體展示文庫。熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)知道的是，核糖體展示文庫直接地將由表達(dá)文庫編碼的mRNA連接到它編碼的蛋白質(zhì)上。用于生產(chǎn)核糖體展示文庫的方法包括以可操作地與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列和核糖體結(jié)合序列相連接的方式布置編碼包括Vh的蛋白質(zhì)的核酸。優(yōu)選的啟動(dòng)子序列是噬菌體T3和T7啟動(dòng)子。優(yōu)選地，以可操作地與間隔區(qū)序列以及終止密碼子被去除的一個(gè)修飾的終止序列相連接的方式布置核酸。如本發(fā)明上下文中使用的，術(shù)語“間隔區(qū)序列”應(yīng)當(dāng)理解成表示編碼融合到一種肽上的該肽的一系列核酸。將間隔區(qū)序列結(jié)合到基因構(gòu)建體中，因?yàn)樵诜g之后由該間隔區(qū)序列編碼的肽保留在核糖體通道中，同時(shí)允許包括Vh的蛋白質(zhì)自由地折疊并且與另一種蛋白質(zhì)或一種核酸相互作用。一個(gè)優(yōu)選的間隔區(qū)序列是例如編碼絲狀噬菌體M13mpl9的基因III的氨基酸211-299的一種核酸。使用本領(lǐng)域已知的和/或例如在Ausubel等人(1987)以及Sambrook等人(2001)中說明的方法在體外將展示文庫轉(zhuǎn)錄和翻譯。用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的可商購系統(tǒng)的實(shí)例包括例如來自Promega的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中的TNT。在冰上將表達(dá)反應(yīng)冷卻通常使翻譯終止。通過添加多種試劑(像例如乙酸鎂或氯霉素)對抗與該肽和/或它的編碼mRNA解離來穩(wěn)定核糖體復(fù)合物。通過如在此說明的多種方法來篩選這類體外展示文庫。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的展示文庫是核糖體失活展示文庫。根據(jù)這個(gè)實(shí)例，將一個(gè)核酸可操作地連接到編碼一個(gè)第一間隔區(qū)序列的一個(gè)核酸上。優(yōu)選的是這種間隔區(qū)序列是一種富含甘氨酸/甘氨酸的序列，該序列允許含有由其編碼的Vh的蛋白質(zhì)自由地折疊并且與目標(biāo)抗原相互作用。該第一間隔區(qū)序列連接到編碼失活核糖體的一種毒素的核酸上。優(yōu)選的是該毒素包括蓖麻毒蛋白A鏈，該蓖麻毒蛋白A鏈?zhǔn)Щ钫婧撕颂求w并且使核糖體停滯在翻譯復(fù)合物上而不釋放mRNA或編碼的肽。將編碼該毒素的核酸連接到編碼一個(gè)第二間隔區(qū)序列的另一個(gè)核酸上。該第二間隔區(qū)是用于占據(jù)核糖體通道的一個(gè)錨，并且允許該蛋白質(zhì)和毒素兩者都正確地折疊并且變得有活性。這類間隔區(qū)序列的實(shí)例是從M13噬菌體的基因III衍生的序列。通常使用一種系統(tǒng)(例如可從Promega得到的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng))體外轉(zhuǎn)錄和翻譯核糖體失活展示文庫。當(dāng)翻譯編碼毒素的mRNA以及正確折疊這種蛋白質(zhì)時(shí)，核糖體被失活同時(shí)仍然結(jié)合到編碼的多肽和從中將它翻譯的mRNA兩者上。在另一個(gè)實(shí)例中，該展示文庫是一個(gè)mRNA展示文庫。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，一種核酸可操作地連接到編碼一種間隔區(qū)序列的一種核酸上，例如富含甘氨酸/絲氨酸的序列，該序列允許包括由本披露的表達(dá)文庫編碼的Vh的蛋白質(zhì)自由地折疊并且與靶抗原相互作用。將編碼間隔區(qū)序列的核酸可操作地連接到一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子上。通常使用本領(lǐng)域已知方法體外地轉(zhuǎn)錄mRNA展示文庫,像例如可從Promega得到的HeLaScrib核提取體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(HeLaScribe Nuclear Extract In Vitro Transcription System)。隨后使用本令頁域已知技術(shù)將編碼的mRNA共價(jià)連接到一種DNA寡核苷酸上，該DNA寡核苷酸共價(jià)連接到結(jié)合到核糖體上的一個(gè)分子上，像例如嘌呤霉素，并且在例如Roberts和Szostak (1997)中進(jìn)行了說明。優(yōu)選地，將該寡核苷酸共價(jià)連接到補(bǔ)骨脂素部分上，由此該寡核苷酸光交聯(lián)到由本披露的表達(dá)文庫編碼的mRNA上。然后使用本領(lǐng)域已知的方法翻譯從表達(dá)文庫轉(zhuǎn)錄的mRNA。當(dāng)核糖體到達(dá)該mRNA與該寡核苷酸的接點(diǎn)時(shí)，核糖體停滯并且嘌呤霉素部分進(jìn)入核糖體的磷酸轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)并且因此將編碼的多肽共價(jià)連接到它從中表達(dá)的mRNA上。仍然在另一個(gè)實(shí)例中，該展示文庫是一個(gè)共價(jià)展示文庫。根據(jù)這個(gè)實(shí)例，將編碼包括Vh的蛋白質(zhì)的核酸可操作地連接到一個(gè)第二核酸上，該第二核酸編碼與它從其編碼的DNA相互作用的一種蛋白質(zhì)。與它從其相互作用的DNA相互作用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于大腸桿菌噬菌體P2病毒A蛋白(P2A)以及從噬菌體186、HP1以及PSP3中分離的等效蛋白。使用一種系統(tǒng)(例如可從Promega得到的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng))體外地轉(zhuǎn)錄和翻譯共價(jià)展示基因構(gòu)建體。當(dāng)翻譯包括Vh的蛋白質(zhì)與P2A蛋白的融合物時(shí)，P2A蛋白切口它結(jié)合到其上的核酸并且與其形成一個(gè)共價(jià)鍵。因此，一個(gè)核酸片段共價(jià)地連接到它編碼的多肽上。仍然在另一個(gè)實(shí)例中，該展示文庫是一種噬菌體展示文庫，其中包括表達(dá)蛋白展示在噬菌體表面上(如例如US5, 821，047、US6, 248，516以及US6, 190，908中所述)。所述的基本原理涉及包括編碼包含Vh的蛋白質(zhì)的序列的一個(gè)第一核酸融合到包括編碼噬 菌體外殼蛋白的序列的一個(gè)第二核酸上，像例如選自下組的噬菌體外殼蛋白M13蛋白-3、M13蛋白-7、或M13蛋白-8。然后將這些序列插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，即能夠在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的載體。然后，用重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(像例如大腸桿菌)。還用編碼核酸片段可操作地連接到其上的衣殼蛋白的未修飾形式的輔助噬菌體顆粒來感染所述宿主細(xì)胞。在適合在顆粒表面上形成包括大于融合蛋白的一個(gè)拷貝的重組噬菌粒顆粒的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的、感染的宿主細(xì)胞。在產(chǎn)生病毒顆粒(例如，、噬菌體、T4噬菌體、M13噬菌體、17噬菌體以及桿狀病毒)方面這種系統(tǒng)顯示是有效的。然后對這類噬菌體展示顆粒進(jìn)行篩選用來鑒定具有足以結(jié)合到靶抗原上的構(gòu)象的展示結(jié)構(gòu)域。其他病毒展示文庫包括逆轉(zhuǎn)錄病毒展示文庫，其中表達(dá)的肽或蛋白結(jié)構(gòu)域展示在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的表面上(例如，如在US6，297，004中說明的)。本披露還考慮了細(xì)菌展示文庫(例如，如在US5，516，637中說明的)；酵母展示文庫(例如，如在US6，423，538中說明的)或哺乳動(dòng)物展示文庫(例如，如在Strenglin等人1988中說明的)。用于篩選展示文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)例中，使用親和純化來篩選本披露的展示文庫。親和純化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且在例如Scopes (1994)中進(jìn)行了說明。親和純化的方法典型地涉及使包括由該文庫展示的Vh的蛋白質(zhì)與已知靶抗原和/或已知超級抗原(例如，蛋白A)接觸，并且在洗滌之后，對仍然結(jié)合到抗原上的這些結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行洗脫?？乖瓋?yōu)選地結(jié)合到另一個(gè)分子上從而允許易于純化，像例如選自下組的一種分子，該組由以下各項(xiàng)組成蛋白G、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、生物素、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、以及FLAG表位。因此，通過離心或通過結(jié)合到另一種分子上(例如鏈霉親和素)或結(jié)合特異性抗體(例如抗-FLAG抗體，或抗-GST抗體)而簡單地分離靶蛋白或核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的展示文庫被表達(dá)從而允許使用FACS分析來鑒定結(jié)合的肽。使用FACS分析篩選文庫在US6，455，63中進(jìn)行了說明。優(yōu)選地，通過FACS分級來篩選體外展示文庫。體外展示蛋白共價(jià)連接到適合于FACS分選的顆?；蛑榱Ｉ?，像例如玻璃、聚合物類，像例如聚苯乙烯、膠乳或交聯(lián)葡聚糖例如瓊脂糖凝膠、纖維素、尼龍、特氟綸等。將結(jié)合到顆?；蛑榱Ｉ系恼故疚膸焯砑拥娇乖虺壙乖?，該抗原或超級抗原標(biāo)記有可檢測標(biāo)記，像例如熒光分子、或可通過一種第二熒光分子檢出的分子。然后這些珠粒被洗滌并且經(jīng)受FACS分選，這允許具有結(jié)合的熒光抗原或超級抗原的珠粒與未結(jié)合到熒光靶蛋白或核酸上的珠粒分離?？商娲兀褂没谏飩鞲衅鞯臏y定法來篩選文庫，像例如Biacore傳感器芯片技術(shù)(Biacore AB,英國)。Biacore傳感器芯片是涂覆有一個(gè)薄層的用羧甲基化葡聚糖修飾的金的一種玻璃表面，該靶蛋白或核酸共價(jià)附連到其上。然后使本披露的文庫暴露于包括該抗原的Biacore傳感器芯片。
蛋白質(zhì)生產(chǎn) 遊使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來分離編碼包括可變區(qū)的蛋白質(zhì)的DNA。例如，引物設(shè)計(jì)成退火到位于感興趣區(qū)域側(cè)翼的可變區(qū)內(nèi)的保守區(qū)上，并且然后使用這些引物來擴(kuò)增插入的核酸，例如通過PCR。適合的方法和/或引物是本領(lǐng)域已知的和/或例如在Borrebaeck (編輯)，1995和/或Froyen等人，1995中進(jìn)行了說明。用于這類擴(kuò)增方法的模板DNA的適當(dāng)來源是源于例如雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、和/或表達(dá)包括可變區(qū)蛋白的細(xì)胞(例如，如在此所述)。 在分離之后，將DNA修飾成包括通過本領(lǐng)域已知的多種方法中任何一種編碼必要位置處帶負(fù)電荷的氨基酸的密碼子。這些方法包括但不限于通過前面制備的編碼蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變、以及盒式誘變來制備。還可以通過限制性片段操作或通過用合成的寡核苷酸進(jìn)行重疊延伸PCR來構(gòu)建重組蛋白的變異體。誘變引物編碼這些帶負(fù)電荷的氨基酸，例如包括組成編碼帶負(fù)電荷的氨基酸(例如，天冬氨酸(即GAA或GAG)或谷氨酸(S卩，GAT或GAC))的密碼子的殘基?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)來產(chǎn)生對這種突變體DNA進(jìn)行編碼的DNA。一般指導(dǎo)可以在Sambrook等人1989 ;和/或Ausubel等人1993中找到。定點(diǎn)誘變是一種用于制備取代變異體(即，突變體蛋白)的方法。這種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Carter等人1985 ;或Ho等人1989)。簡言之，在進(jìn)行DNA的定點(diǎn)誘變中，通過首先將編碼所希望的突變的寡核苷酸(例如，插入一個(gè)或多個(gè)編碼帶負(fù)電荷的氨基酸的密碼子)雜交到這種起始DNA的單鏈上來改變起始DNA。在雜交之后，使用雜交的寡核苷酸作為引物，并且使用起始DNA的單鏈作為模板，使用DNA聚合酶來合成一個(gè)完整的第二鏈。因此，編碼所希望的突變的寡核苷酸被結(jié)合在得到的雙鏈DNA中。可以在表達(dá)該蛋白質(zhì)的基因內(nèi)進(jìn)行定點(diǎn)誘變從而在表達(dá)質(zhì)粒中進(jìn)行誘變并且可以對得到的質(zhì)粒測序，以證實(shí)所希望的帶負(fù)電荷的氨基酸置換突變的引入。定點(diǎn)實(shí)施方案和方式包括可商購的試劑盒，例如QuikChange 多位點(diǎn)定向誘變試劑盒(Multi Site-Directed MutagenesisKit) (Stratagene,拉荷雅,加利福尼亞州)。PCR誘變還適合于制造起始蛋白的氨基酸序列變異體。參見，Higuchi, 1990 ;Ito等人1991。簡言之，當(dāng)少量的模板DNA用作PCR中的起始材料時(shí)，可以使用在序列上與模板DNA中相應(yīng)區(qū)域略有不同的引物來產(chǎn)生相對大量的特異性DNA片段，該特異性DNA片段僅在引物與模板不同的位置處與模板序列不同。用于制備變異體、盒式誘變的另一種方法是基于Wells等人，1985所述的技術(shù)。起始材料是包括有待突變的起始蛋白DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。鑒定有待突變的起始DNA中的一種或多種密碼子。在所鑒定的一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的每一側(cè)上必須存在獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。如果不存在這類限制位點(diǎn)，可以使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法來產(chǎn)生它們用來將它們引入到起始DNA中的適當(dāng)位置。在這些位點(diǎn)處對質(zhì)粒DNA進(jìn)行切割從而將它線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟來合成編碼位于限制位點(diǎn)之間但是包含所希望的一個(gè)或多個(gè)突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸，其中分開地合成該寡核苷酸的兩個(gè)鏈并且然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)雜交到一起。這種雙鏈寡核苷酸稱為盒。這種盒被設(shè)計(jì)成具有與該線性化質(zhì)粒的末端相容的5’和3’末端，這樣使得它可以直接地連接到該質(zhì)粒上?，F(xiàn)在該質(zhì)粒包含突變的DNA序列?？梢酝ㄟ^DNA測序來證實(shí)包含編碼的帶負(fù)電荷的氨基酸置換的突變體DNA。 還通過基于PCR的誘變使用雙鏈質(zhì)粒DNA作為模板通過寡核苷酸定向誘變來產(chǎn)生單個(gè)突變(Sambrook等人，2001)。
重組體表達(dá)在重組蛋白的情況下，優(yōu)選地將編碼它的核酸置于表達(dá)載體中，然后將它們轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，優(yōu)選可以產(chǎn)生二硫橋或鍵的細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或另外地不產(chǎn)生免疫球蛋白 的骨髓瘤細(xì)胞，從而獲得在重組宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra等人，(1993)和Pliickthun, (1992)。用于實(shí)現(xiàn)這些目的的分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且例如在Ausubel等人(1987)和Sambrook等人(2001)中進(jìn)行了說明。廣泛多樣的克隆以及體外擴(kuò)增方法適合于構(gòu)建重組核酸。生產(chǎn)重組抗體的方法也是本領(lǐng)域已知的。參見US4，816，567。在分離之后，優(yōu)選地將編碼本披露的蛋白質(zhì)的核酸插入到表達(dá)構(gòu)建體或可復(fù)制載體中用于進(jìn)一步克隆(DNA的擴(kuò)增)或用于在無細(xì)胞系統(tǒng)中或在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選地，將該核酸可操作地連接到一個(gè)啟動(dòng)子上。如在此使用的，術(shù)語“啟動(dòng)子”應(yīng)當(dāng)在其最廣義的背景下理解并且包括基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括在具有或不具有另外的調(diào)節(jié)元件(例如，上游活化序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子、以及沉默子)下對于精確轉(zhuǎn)錄起始所需要的TATA盒或起始子元件，這些調(diào)節(jié)元件例如響應(yīng)于發(fā)育和/或外部刺激、或以組織特異性方式改變了核酸的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“啟動(dòng)子”還用來說明賦予、活化或增強(qiáng)它可操作地連接到其上的核酸的表達(dá)的重組核酸、合成核酸或融合核酸、或衍生物。優(yōu)選的啟動(dòng)子可以包含一個(gè)或多個(gè)特異性調(diào)節(jié)元件的另外拷貝，以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)和/或改變所述核酸的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。如在此使用的，術(shù)語“可操作地連接到”表示將一個(gè)啟動(dòng)子相對于一個(gè)核酸進(jìn)行定位這樣使得核酸的表達(dá)被該啟動(dòng)子控制。本披露還考慮了無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。例如,將編碼本披露的蛋白質(zhì)的核酸可操作地連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子上，例如一個(gè)17啟動(dòng)子，并且使得到的表達(dá)構(gòu)建體暴露于足以轉(zhuǎn)錄和翻譯的條件。用于體外表達(dá)或無細(xì)胞表達(dá)的典型的表達(dá)載體已經(jīng)進(jìn)行了說明并且包括但不限于TNT 17和 TNT T3系統(tǒng)(Promega)、pEXPl_DEST和pEXP2_DEST載體(Invitrogen)。用于在細(xì)胞中表達(dá)的許多載體是可供使用的。載體組分通常包括但不限于下面的一項(xiàng)或多項(xiàng)信號序列、編碼本披露的蛋白質(zhì)的序列(例如，從在此提供的信息中得到的)、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄終止序列。熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)知道適合的用于蛋白質(zhì)表達(dá)的序列。例如，示例性的信號序列包括原核分泌信號(例如，pelB、堿性磷脂酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定性腸毒素II)、酵母分泌信號(例如，轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列)或哺乳動(dòng)物分泌信號(例如，單純皰疹gD信號)。示例性的啟動(dòng)子包括在原核生物中有活性的那些(例如，phoA啟動(dòng)子、內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、以及雜合啟動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子)。這些啟動(dòng)子用于在原核生物中進(jìn)行表達(dá)，原核生物包括真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，腸細(xì)菌科，例如大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷白菌屬、變形桿菌屬、沙門菌屬，例如，鼠傷寒沙門菌，沙雷氏菌屬，例如，粘質(zhì)沙雷菌以及志賀菌屬，以及桿菌，例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，假單胞菌例如銅綠假單胞菌以及鏈霉菌屬。優(yōu)選地，該宿主是大腸桿菌。一個(gè)優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，雖然其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X 1776 (ATCC 31，537)、以及大腸桿菌W3110 (ATCC27，325)、DH5a 或 DHlOB 是適當(dāng)?shù)?。在哺乳?dòng)物細(xì)胞中具有活性的示例性啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV-IE)、人延長因子I-a啟動(dòng)子(EFl)、小核RNA啟動(dòng)子(Ula和Ul b)、a肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子、猿猴病毒40啟動(dòng)子(SV40)、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子(RSV)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、￠-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、包括CMV增強(qiáng)子/0肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合調(diào)節(jié)元件或免疫球蛋白啟動(dòng)子或其活性片段。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚腎系(被亞克隆用于懸浮培養(yǎng)中生長的293或293細(xì)胞；幼地鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10);或中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。適合在酵母細(xì)胞像例如選自下組的酵母細(xì)胞(該組由以下各項(xiàng)組成巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母以及稷酒裂殖酵母)中表達(dá)的典型啟動(dòng)子包括但不限于ADH1啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、GAL4啟動(dòng)子、CUPl啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、nmt啟動(dòng)子、RPRl啟動(dòng)子、或TEFl啟動(dòng)子。適合用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的典型啟動(dòng)子包括但不限于0PEI2啟動(dòng)子，從家蠶分離的昆蟲肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，果蠅Dsh啟動(dòng)子(Marsh等人2000)以及誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動(dòng)子。用于表達(dá)重組蛋白的優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞包括選自下組的昆蟲細(xì)胞，包括BT1-TN-5B1_4細(xì)胞、以及草地貪夜蛾細(xì)胞(例如，sfl9細(xì)胞、sf21細(xì)胞)。用于表達(dá)核酸片段的適當(dāng)昆蟲包括但不限于果蠅。還考慮了草地貪夜蛾的用途。用于將這種分離的核酸分子或包括以上物質(zhì)的一種基因構(gòu)建體引入到細(xì)胞中用于表達(dá)的手段對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。用于一種給定的細(xì)胞的技術(shù)取決于已知的成功的技術(shù)。用于將重組DNA引入到細(xì)胞中的手段除了其他之外還包括微注射、由DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、由脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如通過使用Lipofectamine (Gibco,MD,USA)和/或Cellfectin(Gibco, MD，USA))、PEG-介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔和微粒轟擊(例如通過使用DNA-包被的鶴或金顆粒(Agracetus Inc. , WI, USA))?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本披露的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，這取決于所使用的細(xì)胞類型。可商購的培養(yǎng)基例如Ham’ s FlO (Sigma)、最低必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma)、RPM1-1640 (Sigma)、以及Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適合用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于培養(yǎng)在此討論的其他細(xì)胞類型的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。
蛋白質(zhì)的分離本披露的蛋白質(zhì)優(yōu)選地被分離。對于“分離的”，表示該蛋白質(zhì)是基本上純的或從它的天然發(fā)生的環(huán)境中移出，例如處于異源環(huán)境中。對于“基本上純的”，表示該蛋白質(zhì)基本上不含有污染劑，例如至少大約70 %或75 %或80 %或85 %或90 %或95 %或96 %或97 %或98 %或99 %不含有污染劑。用于純化本披露的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的和/或在此說明的。例如，使該蛋白質(zhì)與能夠結(jié)合到其上的一種試劑相接觸持續(xù)一段時(shí)間并且在足以使結(jié)合發(fā)生的條件下。任選地，在洗滌以便去除未結(jié)合蛋白之后，本披露的蛋白質(zhì)被分離(例如，洗脫)。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，可以細(xì)胞內(nèi)地、在壁膜間隙中生產(chǎn)本披露的蛋白質(zhì)或直接地分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)該蛋白質(zhì)，作為一個(gè)第一步驟，例如通過離心或超濾將微粒碎片(宿主細(xì)胞或溶解片段)去除。Carter等人(1992)說明了用于分離被分泌到大腸桿菌壁膜間隙中的抗體的步驟。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA、以及苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下將細(xì)胞糊(cell paste)融化持續(xù)大約30分鐘?？梢酝ㄟ^離心去除細(xì)胞碎片。當(dāng)將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，通常首先使用可商購的蛋白濃縮過濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元將來自這類表達(dá)系統(tǒng)的上清液濃縮?？梢詫⒌鞍酌敢种苿├鏟MSF包括在上述步驟的任何一項(xiàng)中以抑制蛋白水解，并且可以包括多種抗生素以防止偶發(fā)污染物的生長。從這些細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)可以使用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、以及親和層析進(jìn)行純化，其中親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。作為親和配體的蛋白A的適應(yīng)性取決于蛋白質(zhì)中存在的任何抗體Fe結(jié)構(gòu)域的種類和同種型(如果確實(shí)存在的話)?？梢允褂玫鞍譇來純化基于人Y I、Y 2、或Y 4重鏈(Lindmark等人1983)的抗體。蛋白G被推薦用于所有小鼠同種型以及用于人Y 3 (Guss等人1986)。另外可以使用本披露的蛋白質(zhì)中可變區(qū)結(jié)合到其上或升高到其上的抗原或表位決定簇來進(jìn)行親和層析。親和配體附連到其上的基質(zhì)最通常地是瓊脂糖，但是其他基質(zhì)是可供使用的。與使用瓊脂糖可以實(shí)現(xiàn)的相比較，機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如可控多孔玻璃或聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物允許更快的流速和更短的加工時(shí)間。用于蛋白質(zhì)純化的其他技術(shù)例如在離子交換柱上進(jìn)行分級分離、乙醇沉淀法、反相高效液相層析法、在硅石上的層析法、在肝素上的層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂 上的SEPHAROSE 層析法(例如，聚天冬氨酸柱)、色譜聚集法、SDS-PAGE,以及硫酸銨沉淀也是可用的，這取決于有待回收的蛋白質(zhì)。熟練的業(yè)內(nèi)人士還應(yīng)當(dāng)知道的是本披露的蛋白質(zhì)可以修飾成包括一個(gè)標(biāo)簽以促進(jìn)純化或檢測，例如，聚組氨酸標(biāo)簽，例如，六組氨酸標(biāo)簽，或流感病毒血凝素(HA)標(biāo)簽、或猿猴病毒5(V5)標(biāo)簽、或FLAG標(biāo)簽、或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽。優(yōu)選地，該標(biāo)簽是一個(gè)六his標(biāo)簽。然后使用本領(lǐng)域已知的方法將得到的蛋白質(zhì)純化，例如親和純化。例如，通過使包含該蛋白質(zhì)的樣品與固定在固體或半固體載體上特異性地結(jié)合六his標(biāo)簽的鎳-氮川三乙酸(Ni-NTA)相接觸，將包含六his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)純化，將該樣品洗滌以便去除未結(jié)合蛋白，并且隨后將結(jié)合蛋白洗脫?？商娲兀蛄硗獾?，將結(jié)合到標(biāo)簽上的配體或抗體用于親和純化方法中。在任何一個(gè)或多個(gè)初步純化步驟之后,可以使包括本披露的蛋白質(zhì)和污染物的混合物經(jīng)受低PH疏水性相互作用色譜。
蛋白質(zhì)合成使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如使用BOC或FMOC化學(xué))從其確定的氨基酸序列易于合成本披露的蛋白質(zhì)。合成肽可以使用固相、液相、或肽縮合、或它們?nèi)魏谓M合的已知技術(shù)來制備，并且可以包括天然的和/或非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是具有Merrifield，1963的最初固相步驟的脫保護(hù)、中和、結(jié)合以及洗滌實(shí)驗(yàn)方案或由Carpino和Han，1972說明的堿不穩(wěn)定的Na氨基保護(hù)的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)Boc (Na -氨基保護(hù)的Na-叔-丁氧羰基)氨基酸樹脂。Fmoc和BocNa-氨基保護(hù)的氨基酸兩者可以從不同商業(yè)來源獲得，像例如 Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge ResearchBiochemical、Bachem、或 Peninsula Labs。
評估蛋白質(zhì)聚集抗性的方法可以使用本領(lǐng)域已知的方法來分析本披露的蛋白質(zhì)或組合物的聚集抗性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可接受的聚集抗性參數(shù)。示例性的參數(shù)更詳細(xì)地說明如下。在示例性的實(shí)施方案中，評估了熱再折疊能力(refoldability)。在一些實(shí)例中，評估了本披露的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(例如，如通過％產(chǎn)率測量的)。在其他實(shí)例中，評估了本披露的蛋白質(zhì)的聚集水平。在某些實(shí)例中，將一個(gè)披露的蛋白質(zhì)或組合物的聚集抗性與適當(dāng)對照進(jìn)行比較?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的許多非限制性生物物理或生物化學(xué)技術(shù)來分析本披露的 蛋白質(zhì)的聚集抗性。這類技術(shù)的一個(gè)實(shí)例是分析光譜學(xué)，例如圓二色性(CD)光譜學(xué)。CD光譜學(xué)測量蛋白質(zhì)的光學(xué)活性作為增加的溫度的一個(gè)函數(shù)。圓二色(CD)光譜學(xué)測量了由于結(jié)構(gòu)不對稱性產(chǎn)生的左手偏振光對比右手偏振光的吸收差異。無序或去折疊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致CD光譜與有序或折疊結(jié)構(gòu)非常不同。CD光譜反映蛋白質(zhì)對于增加溫度的變性作用的靈敏度并且因此指示蛋白質(zhì)的聚集抗性(參見van Mierlo和Steemsma, 2000)。用于測量聚集抗性的另一個(gè)示例性分析光譜學(xué)方法是熒光發(fā)射光譜學(xué)(參見vanMierlo和Steemsma，同上)。用于測量聚集抗性的又另一個(gè)示例性分析光譜學(xué)方法是核磁共振(NMR)光譜學(xué)(參見例如van Mierlo和Steemsma,同上)。在其他實(shí)施方案中，以生物化學(xué)方式測量了本披露的組合物或蛋白質(zhì)的聚集抗性。用于評定聚集抗性的示例性的生物化學(xué)方法是熱激發(fā)測定(thermal challengeassay)。在“熱激發(fā)測定”中，使本披露的蛋白質(zhì)經(jīng)受升高溫度的一個(gè)范圍持續(xù)一組時(shí)間段。例如，使測試蛋白經(jīng)受增加溫度的一個(gè)范圍。然后通過有關(guān)生物化學(xué)測定法來測定蛋白質(zhì)的活性。例如，可以通過功能或定量ELISA來確定結(jié)合蛋白的結(jié)合活性。用于確定結(jié)合親和力的另一種方法使用表面等離子體共振。表面等離子體共振是允許例如使用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白濃度改變對實(shí)時(shí)雙特異性相互作用進(jìn)行分析的一種光學(xué)現(xiàn)象。在其他實(shí)例中，通過測量其聚集傾向來確定本披露的組合物或蛋白質(zhì)的聚集抗性?？梢酝ㄟ^許多非限制性生物化學(xué)或生物物理技術(shù)對聚集進(jìn)行測量。例如，可以使用層析法，例如尺寸排阻層析(SEC)來評估本披露的組合物或蛋白質(zhì)的聚集。SEC基于尺寸大小分離分子。柱子填充有聚合物凝膠的半固體珠粒，該凝膠可以允許離子和小分子進(jìn)入它們內(nèi)部但是較大的分子不能進(jìn)入。當(dāng)將蛋白質(zhì)或組合物施加到柱子頂部時(shí)，與大的蛋白聚集體可獲得的相比較，緊密折疊的蛋白(即非聚集蛋白)通過更大體積的溶劑進(jìn)行分配。因此，大的聚集體更快地移動(dòng)通過該柱子，并且以此方式，該混合物可以被分離或分級分離成它的組分。當(dāng)每個(gè)餾分從凝膠中洗脫時(shí)，可以分開地對它進(jìn)行定量(例如，通過光散射)。因此，可以通過將餾分濃度與施加到凝膠上蛋白質(zhì)的總濃度進(jìn)行比較來確定本披露的蛋白質(zhì)或組合物的聚集百分比。聚集抗性組分作為基本上一個(gè)單個(gè)餾分從柱子中洗脫并且在洗脫譜圖或?qū)游鰣D中顯示為基本上一個(gè)單峰。
在其他實(shí)例中，在表達(dá)該蛋白質(zhì)之后(例如重組表達(dá))通過測量回收的蛋白質(zhì)的量(在此是產(chǎn)率”)對本披露的組合物的聚集抗性進(jìn)行評估。例如，可以通過針對每ml宿主培養(yǎng)基確定回收蛋白質(zhì)的毫克數(shù)(例如，mg/ml蛋白)來測量產(chǎn)率％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中(例如CHO細(xì)胞)表達(dá)之后評估產(chǎn)率％。仍然在另一個(gè)實(shí)例中，在儲(chǔ)存一定限定的時(shí)間段之后通過在一個(gè)溫度范圍下(例如，從約25°C至約80°C)監(jiān)測蛋白質(zhì)損失來評估本披露的組合物的聚集抗性。可以使用本領(lǐng)域已知的任何蛋白質(zhì)定量方法來確定回收蛋白質(zhì)的量或濃度，并且與蛋白質(zhì)的初始濃度進(jìn)行比較。示例性的蛋白質(zhì)定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford測定。仍然在其他實(shí)例中，可以通過對標(biāo)記化合物結(jié)合到結(jié)合分子的變性或去折疊的部分進(jìn)行定量來評估本披露的蛋白質(zhì)的聚集抗性。這類分子優(yōu)選地是疏水性的，因?yàn)樗鼈儍?yōu)選地與通常埋在天然蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸(但是在變性或去折疊的結(jié)合分子中它們是暴露的)的較大疏水補(bǔ)丁相結(jié)合或與其相互作用。一種示例性的標(biāo)記化合物是疏水性熒光染料，I-苯胺基-8-萘磺酸鹽(ANS)。其他實(shí)例涉及檢測蛋白質(zhì)的結(jié)合，該蛋白質(zhì)僅結(jié)合到正確折疊的可變域上(例如，蛋白A結(jié)合到正確折疊的IgG3VH上)。·
偶聯(lián)物本披露還提供了偶聯(lián)到另一種化合物上的本披露的蛋白質(zhì)，例如，包括偶聯(lián)到一個(gè)不同部分上的本披露的蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物(免疫偶聯(lián)物)，例如直接地或間接地結(jié)合到該蛋白質(zhì)上的治療劑。其他部分的實(shí)例包括但不限于酶、突光團(tuán)(fIuorophophore)、細(xì)胞毒素、放射性同位素(例如，碘-131、釔-90或銦-111)、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗新生血管形成和/或其他血管生成劑、毒素、抗增生劑、促凋亡劑、化學(xué)治療劑、以及治療性核酸。細(xì)胞毒素包括對細(xì)胞有害(例如殺死)的任何試劑。為了說明這些類別的本領(lǐng)域已知的藥物以及它們的作用機(jī)理，參見Goodman等人(1990)。與制備抗體免疫毒素相關(guān)的另外技術(shù)提供于例如US5，194, 594中。示例性的毒素包括白喉A鏈、白喉毒素的未結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及單端孢霉烯類。參見例如W093/21232。用于形成本披露免疫偶聯(lián)物的適當(dāng)治療劑包括紫杉酚、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素類、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、以及嘌羅霉素、抗代謝藥類(例如，甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羥基脲、門冬酰胺酶、吉西他濱、克拉屈濱)、烷化劑類(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、絲裂霉素C、順鉬和其他鉬衍生物類，例如卡鉬)、抗生素類(例如，更生霉素(以前的放線菌素)、博來霉素、柔紅霉素(以前的道諾霉素)、多柔比星、伊達(dá)比星、光輝霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))。多種放射性核素可用于生產(chǎn)放射性偶聯(lián)的抗體。實(shí)例包括但不限于212Bi、131I、9°Y、以及186Re。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)可以偶聯(lián)到“受體”(例如鏈霉親和素)上以用于預(yù)靶向，其中將蛋白-受體偶聯(lián)物施用于病人，緊接著使用清除劑從循環(huán)中去除未結(jié)合的偶聯(lián)物并且然后施用偶聯(lián)到治療劑(例如，放射性核素)上的一種“配體”(例如抗生物素蛋白)。本披露的蛋白質(zhì)可以進(jìn)一步修飾成包含本領(lǐng)域已知的并且易于獲得的另外的非蛋白質(zhì)部分。優(yōu)選地，適合于蛋白質(zhì)衍生的部分是水溶性的聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖或聚乙烯醇。用于將化合物偶聯(lián)到本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)殘基上的多種方法是本領(lǐng)域已知的并且對于熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)是清楚的。
本披露的蛋白質(zhì)用于多種應(yīng)用中包括研究、診斷/預(yù)測、工業(yè)和治療應(yīng)用。取決于該蛋白結(jié)合到其上的抗原，它可以用于將化合物遞送到細(xì)胞，例如用來殺死該細(xì)胞或阻止生長和/或用于成像和/或用于體外測定。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)用于成像以及將細(xì)胞毒劑遞送到細(xì)胞中兩者，即它偶聯(lián)到一個(gè)可檢測標(biāo)記上，并且細(xì)胞毒劑或組合物包括其中一些偶聯(lián)到細(xì)胞毒劑上而其中一些偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記上的蛋白質(zhì)的混合物。在此所述的蛋白質(zhì)還可以作為拮抗劑起作用用于抑制(它可以是降低或阻止)(a)(例如，配體、抑制劑)結(jié)合到受體上，(b)受體信號傳導(dǎo)功能，和/或(C)刺激功能。作為受體功能的拮抗劑起作用的蛋白質(zhì)可以直接或間接阻斷配體結(jié)合(例如，通過引起構(gòu)象改變)。本披露的蛋白質(zhì)還可以是受體的激動(dòng)劑，例如(a)增強(qiáng)或誘導(dǎo)(例如配體)結(jié)合到受體上，(b)增強(qiáng)或誘導(dǎo)受體信號傳導(dǎo)功能，和/或(C)提供刺激功能。
腿本披露考慮了包括能夠特異性地結(jié)合到除了在在此所述的任何實(shí)施方案、實(shí)例或權(quán)利要求中明確除外的那些之外的任何一種或多種抗原上的根據(jù)本披露修飾的至少一個(gè)Vh的蛋白質(zhì)，即與要求特異性抗原相對的本披露的一個(gè)實(shí)例是屬類的。 在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)未結(jié)合到來自微生物和/或來自鳥類的蛋白質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)未結(jié)合到溶菌酶(例如，雞蛋溶菌酶)和/或￠-半乳糖苷酶和/或淀粉酶(例如，a淀粉酶)和/或脫水酶(例如，碳酸酐酶)和/或B5R(例如，來自牛痘)上。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白質(zhì)未結(jié)合到人白蛋白上。在一個(gè)實(shí)例中，該蛋白未結(jié)合到人VEGF上。優(yōu)選的蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合到人蛋白上并且是從針對人蛋白產(chǎn)生的抗體衍生的。本披露的實(shí)例考慮了特異性地結(jié)合到與疾病或失調(diào)(即病癥)相關(guān)聯(lián)的抗原上的蛋白質(zhì)，例如與癌或癌性/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)或表達(dá)癌或癌性/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和/或與自身免疫疾病相關(guān)聯(lián)和/或與炎性疾病或病癥相關(guān)聯(lián)和/或與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)聯(lián)和/或與免疫缺陷失調(diào)相關(guān)聯(lián)。針對其可以產(chǎn)生本披露的蛋白質(zhì)的示例性抗原包括BMPR1B(骨形態(tài)生成蛋白受體類型 IB ；W02004063362)、E16(LAT1, SLC7A5, W02004048938)、STEAPl (前列腺的六跨膜上皮細(xì)胞抗原，W02004065577)、CA125(MUC16, W02004045553)、MPF(MSLN,SMR,巨核球增強(qiáng)因子，間皮素，W02003101283)、Napi3b(W02004022778)、Sema5b (W02004000997)、PSCA (US2003129192)、ETBR(W02004045516)、MSG783 (W02003104275)、STEAP2 (W02003087306)、TrpM4 (US2003 143557)、CRIPTO (US20032244 1 1)、CD 21(ff02004045520), CD 79b(ff02004016225), SPAPlB(ff020040 I 6225),HER2 (W02004048938)、NCA (W02004063709)、MDP (W02003016475)、IL_20Ra (EP1394274)、短蛋白聚糖(US2003186372)、EphB2R(W02003042661)、ASLG659(US20040101899)、PSCA(W02004022709)、GEDA(ff02003054 I 52)、BAFF-R(ff02004058309)、CD22(ff02003072036), CD79a(WO2003088808), CXCR5(WO2004040000)、HLA-DOB (W09958658)、P2X5 (W02004047749)、CD72 (W02004042346)、LY64 (US2002193567)、FcRHl (W02003077836)、IRTA2 (W02003077836)、TENB2 (W02004074320)、CD20 (W094/11026)、VEGF-A(Presta等人，1997)、p53、EGFR、孕酮受體、組織蛋白酶D、Bcl_2、E鈣粘著蛋白、CEA、Lewis X、Ki67、PCNA、CD3、CD4、CD5、CD7、CDllc、CDlId、c_Myc、tau、PrPSC、TNF a、音猬因子、肝細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子受體、EPHA2、催乳素受體、催乳素、IL-2、TNF-受體、 IL-21、IL-21 受體、CXCR7、FGFR2、FGF2 或八旦。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到可溶蛋白上，優(yōu)選體內(nèi)分泌的可溶蛋白。示例性的可溶蛋白包括細(xì)胞因子類。術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群體釋放的蛋白質(zhì)或多肽的通稱，它們在另一個(gè)細(xì)胞上作為細(xì)胞間介質(zhì)起作用。細(xì)胞因子的實(shí)例包括淋巴因子、單核因子、生長因子以及傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原(prorelaxin)、糖蛋白激素類例如卵泡刺激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)、肝生長因子；前列腺素、成纖維細(xì)胞生長因子、催乳素、胎盤催乳素、OB蛋白、腫瘤壞死因子-a和-0 ;繆勒管抑制物質(zhì)、促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、活化素、血管內(nèi)皮生長因子、整聯(lián)蛋白、血小板生成素(TPO)、神經(jīng)生長因子類例如NGF-B、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子類(TGF)例如TGF-a和TGF-P，胰島素樣生長因子-I或一 II，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，骨誘導(dǎo)性因子、干擾素類例如干擾素-a、、或-Y ;集落刺激因子類(CSF)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；以及粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)，白細(xì)胞介素類(Ils)例如 IL-1、IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21 以及 LIF。優(yōu)選的細(xì)胞因子是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成白細(xì)胞介素2、13或21、TNFa、TGF0 ,BAFF以及 GM-CSF。在另一個(gè)實(shí)例中，可溶蛋白是趨化因子。趨化因子通常作為化學(xué)引誘物起作用，以將免疫效應(yīng)細(xì)胞募集到趨化因子表達(dá)位點(diǎn)。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MlPl-a或MIPl-P。熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)理解的是某些細(xì)胞因子還已知具有化學(xué)引誘物作用并且還可能歸類到術(shù)語趨化因子下。一種優(yōu)選的趨化因子是RANTES。在另一個(gè)實(shí)例中，可溶蛋白是肽類激素。示例性的肽類激素包括胰島素、NPY、PYY、高血糖素和催乳素。在一個(gè)另外的實(shí)例中，可溶蛋白是蛋白酶。示例性的蛋白酶包括因子X、因子VII、因子IX或激肽釋放酶。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到受體或膜相關(guān)蛋白上。示例性的抗原包括G-蛋白偶聯(lián)受體(例如，CXCR7、CXCR5、CXCR3、C5aR或P -2-腎上腺素能受體)或離子通道(例如，鈉通道或鉀通道或鈣通道，優(yōu)選地，煙堿乙酰膽堿受體)或單跨膜蛋白(例如，T-細(xì)胞受體或催乳素受體或細(xì)胞因子受體(例如，IL-21-受體)或I類MHC或2類MHC或CD4 或 CD8)。在一個(gè)另外的實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到下面的一項(xiàng)或多項(xiàng)上干擾素a受體I (IFNARI)、血管生成素-2、IL-4Ra、IL-33、CXCL13、晚期糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)的受體、I COS、IgE、干擾素 a、IL-6、IL-6 受體、EphB4、CD 19, GM-CSF 受體、CD22、IL-22、EphA2、IL-13、高遷移率族蛋白I (HMGl)、間變型淋巴瘤激酶(ALK)、整聯(lián)蛋白(例如，整聯(lián)蛋白a 3)、Eph受體、IL-9、EphA4、PC-細(xì)胞衍生的生長因子(PCDGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、血小板衍生生長因子受體(H)GFR例如，PDGFRa 或 PDGFR 3 )或 IL-5。
本披露的蛋白質(zhì)可以從中衍生的示例性抗體對于熟練的業(yè)內(nèi)人士應(yīng)當(dāng)是清楚的并且包括上文列出的那些。示例性的雙特異性蛋白可以結(jié)合到感興趣抗原的兩個(gè)不同表位上。其他這類蛋白可以使一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)與用于另一種蛋白質(zhì)的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。可替代地，感興趣區(qū)域的抗抗原可以與結(jié)合到白細(xì)胞上的觸發(fā)分子上的一個(gè)區(qū)域相結(jié)合，觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(例如，CD3)或IgG(Fe y R)的Fe受體，例如Fe y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和/或Fe Y RIII (⑶16)，從而將細(xì)胞防御機(jī)制集中和定位到表達(dá)感興趣的抗原的細(xì)胞上。還可以使用雙特異性蛋白來將細(xì)胞毒劑定位到表達(dá)感興趣抗原的細(xì)胞上。這些蛋白質(zhì)具有結(jié)合感興趣抗原的一個(gè)區(qū)域以及結(jié)合該細(xì)胞毒劑的一個(gè)區(qū)域(例如，肥皂草素、抗-干擾素-a .、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。WO 96/16673說明了一種雙特異性抗_ErbB2/抗-Fe Y RIII抗體，并且美國專利號5，837，234披露了一種雙特異性抗_ErbB2/抗-Fe y RI抗體。一種雙特異性抗ErbB2/Fc a抗體示于W098/02463中。US5，821，337傳授了一種雙特異性抗_ErbB2/抗-⑶3抗體。
藥物組合物和治療方法本披露的蛋白質(zhì)(同義詞活性成分)用于腸胃外、局部、口服或局部給藥、氣溶膠給藥、或經(jīng)皮給藥用于預(yù)防性或用于治療性治療。能夠以多種單位劑型施用這些藥物組合物，這取決于給藥的方法。例如，適合于口服給藥的單位劑型包括粉末、片劑、丸劑、膠囊或錠劑或通過腸胃外給藥。應(yīng)當(dāng)理解的是，本披露的藥物組合物當(dāng)口服給藥時(shí)，應(yīng)當(dāng)保護(hù)避免消化。這典型地通過使這些蛋白質(zhì)與一種組合物復(fù)合從而使它抗酸水解或酶水解，或通過將該化合物包裝到適當(dāng)?shù)目剐暂d體例如脂質(zhì)體中來實(shí)現(xiàn)。保護(hù)蛋白質(zhì)避免消化的手段是本領(lǐng)域已知的。典型地，可以將治療有效量的蛋白質(zhì)配制成組合物以便施用于受試者體內(nèi)。短語“治療有效量”是指足以在受試者體內(nèi)促進(jìn)、誘導(dǎo)、和/或增強(qiáng)治療或其他療效的一個(gè)量。如應(yīng)當(dāng)清楚的是，在這些配制品中本披露的蛋白質(zhì)的濃度可以廣泛地改變，并且可以根據(jù)選擇給藥的具體模式以及病人的需要主要基于流體體積、粘度、體重等進(jìn)行選擇。取決于疾病的類型和嚴(yán)重性，治療有效量可以是大約I U g/kg至100mg/kg (例如，0. l-10mg/kg)蛋白質(zhì)，例如無論是通過一次或多次分開給藥還是通過連續(xù)輸注。典型的每日劑量范圍可以從大約I U g/kg至100mg/kg或更多。為了反復(fù)給藥持續(xù)數(shù)天或更長時(shí)間,取決于條件,治療是持續(xù)性的直至發(fā)生所希望的疾病癥狀的抑制。示例性的給藥分案包括施用大約4mg/kg的初始負(fù)荷劑量，緊接著大約2mg/kg蛋白質(zhì)的每周維持劑量。其他給藥方案可以是有用的。例如，以大約375mg/m2劑量來施用抗0)20抗體,例如利妥昔單抗。以5mg/kg_10mg/kg的劑量施用抗VEGF抗體,例如貝伐單抗。以4mg/kg-8mg/kg的負(fù)荷劑量以及2mg/kg_6mg/kg的每周一次/每兩周一次維持劑量施用抗_Her2/neu抗體,例如曲妥珠單抗。以大約400mg/周的劑量施用抗TNF a抗體例如阿達(dá)木單抗用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，或以160mg的負(fù)荷劑量持續(xù)第一周以及40mg/周的維持劑量，或以SOmg的負(fù)荷劑量以及40mg/周的維持劑量用于治療銀屑病。通過常規(guī)技術(shù)和測定法易于監(jiān)測治療過程。本披露的蛋白質(zhì)的適當(dāng)劑量可以依賴于特異性蛋白、有待診斷/治療/預(yù)防病癥和/或有待治療的受試者而改變。確定一個(gè)適合的劑量是在熟練醫(yī)生的能力之內(nèi)的，例如通過用次優(yōu)劑量開始并且逐漸增加地改變該劑量來確定最佳或有用劑量?？商娲?，為了確定用于治療/預(yù)防的適當(dāng)劑量，使用來自細(xì)胞培養(yǎng)測定或動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)，其中適當(dāng)劑 量是包括具有很小或無毒性的活性化合物的ED50的循環(huán)濃度的范圍之內(nèi)。該劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)改變，這取決于應(yīng)用的劑型以及使用的給藥途徑。最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測定法來估計(jì)治療性/預(yù)防性有效劑量。可以在動(dòng)物模型中配制劑量用來實(shí)現(xiàn)包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。可以使用這種信息來更精確地確定人類中的有用劑量。可以例如通過高效液相色譜法來測量血漿中的水平。可替代地，以濃縮劑量配制本披露的蛋白質(zhì),在施用于受試者之前將該濃縮劑量稀釋成一種治療有效劑量。本披露的組合物特別地用于腸胃外給藥，例如配制成通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、或其他這類途徑進(jìn)行注射，包括蠕動(dòng)給藥以及直接滴注到腫瘤或疾病位置中(腔內(nèi)給藥)。用于給藥的組合物通常將包括溶于一種藥學(xué)上可接受的載體(優(yōu)選一種水性載體)中的本披露的蛋白質(zhì)的溶液?？梢允褂枚喾N水性載體，例如緩沖鹽水等。其他示例性的載體包括水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、以及5%人血清白蛋白。還可以使用非水性載體例如混合的油類和油酸乙酯。脂質(zhì)體也可以用作載體。載體可以含有增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的少量添加劑，例如緩沖劑以及防腐劑。這些組合物可以根據(jù)大致的生理?xiàng)l件的需要包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。用于制備藥物組合物的技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的，如通過Remington’ sPharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980 舉例說明的。W02002/080967說明了用于施用包括用于治療例如哮喘的蛋白質(zhì)的噴霧組合物的組合物和方法，它們也適合施用本披露的蛋白質(zhì)。 本披露的蛋白質(zhì)可以與一種第二化合物結(jié)合在已知藥物組合物、配制品、或給藥方案中作為聯(lián)合療法。藥用組合配制品或給藥方案的第二化合物優(yōu)選地具有與該組合的蛋白質(zhì)互補(bǔ)的活性，這樣使得它們沒有不利地彼此影響。該第二化合物可以是化學(xué)治療劑、細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、和/或心臟保護(hù)劑。這類分子以組合形式以對于預(yù)期的目的有效的量而適當(dāng)?shù)卮嬖?。包含本披露蛋白質(zhì)的藥物組合物還可以具有治療有效量的化學(xué)治療劑，例如微管蛋白形成抑制齊U、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、或DNA結(jié)合劑。還可以使用藥物“緩釋”膠囊或組合物。緩釋配制品通常設(shè)計(jì)成在延長的時(shí)期內(nèi)給出恒定藥物水平并且可以用來遞送本披露的化合物。本披露還提供了一種治療或預(yù)防受試者體內(nèi)的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的本披露的一種蛋白質(zhì)施用于對其有需要的受試者體內(nèi)。如在此使用的，在防止病癥的背景中術(shù)語“防止”(“preventing”)、“防 止”(“prevent”)或“防止”(“prevention”)包括施用足以停止或抑制特定疾病或病癥的至少一種癥狀發(fā)展的一定量的在此所述的蛋白質(zhì)。如在此使用的，術(shù)語“治療” (“treating”)、“治療” (“treat”)或“治療”(“treatment”)包括施用足以降低或消除特定疾病或病癥的至少一種癥狀的治療有效量的在此所述的一種或多種抑制劑和/或試劑。如在此使用的，術(shù)語“受試者”應(yīng)當(dāng)理解成表示任何動(dòng)物，包括人類，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。示例性的受試者包括但不限于人類、靈長類、家畜(例如，綿羊、牛、馬、驢、豬)、伴侶動(dòng)物(例如，狗、貓)、實(shí)驗(yàn)室測試動(dòng)物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠)、俘獲的野生動(dòng)物(例如，狐貍、鹿)。優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物是人或靈長類。更優(yōu)選地該哺乳動(dòng)物是人。如在此使用的，“病癥”是對正常功能的破壞或干擾，并且將不限于任何特定病癥，并且可以包括疾病或失調(diào)。在一個(gè)實(shí)例中，該病癥是癌癥或自身免疫或炎性失調(diào)。示例性的癌癥包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、以及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。這類癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、包括胃癌(gastriccancer)或胃癌(stomach cancer)的胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)或腎癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、以及頭頸部癌。優(yōu)選地，癌癥是乳腺癌或肺癌或卵巢癌或前列腺癌。炎性或自身免疫病癥是由免疫球蛋白或T細(xì)胞受體對抗原的反應(yīng)而引起的病癥。這些病癥包括自身免疫疾病和超敏反應(yīng)(例如，類型I :過敏反應(yīng)、蕁麻疹、食物過敏、哮喘；類型II :自身免疫溶血性貧血、輸血反應(yīng)；類型III :血清病、壞死性血管炎、腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡；類型IV :接觸性皮炎、移植排斥)。自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性失調(diào)(像例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫綜合征、硬皮病、狼瘡例如SLE和狼瘡腎炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血癥、抗磷脂抗體綜合征、和銀屑病關(guān)節(jié)炎)、骨性關(guān)節(jié)炎、自身免疫胃腸和肝失調(diào)(像例如炎性腸疾病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、和乳糜瀉)、血管炎(像例如，ANCA-相關(guān)性血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韋格納肉芽腫病、和多動(dòng)脈炎)、自身免疫性神經(jīng)失調(diào)(像例如，多發(fā)性硬化，斜視性眼陣攣肌陣攣綜合征、重癥肌無力、視神經(jīng)脊髓炎、和自身免疫性多神經(jīng)病)、腎失調(diào)(像例如，腎小球腎炎、肺出血腎炎綜合征、和伯格病)、自身免疫性皮膚學(xué)失調(diào)(像例如，銀屑病、蕁麻疹(urticaria)、蕁麻疹(hives)、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡、和皮膚紅斑狼瘡)、血液學(xué)失調(diào)(像例如，血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜、以及自身免疫性溶血性貧血)、動(dòng)脈硬化、葡萄膜炎、自身免疫聽力疾病(像例如，內(nèi)耳疾病和聽力損失)、貝切特病、雷諾綜合征、器官移植、以及自身免疫性內(nèi)分泌失調(diào)(像例如，糖尿病相關(guān)自身免疫疾病，例如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、阿狄森病、以及自身免疫性甲狀腺病(例如，格雷夫斯病和甲狀腺炎))。更優(yōu)選的這類疾病包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、ANCA-相關(guān)性血管炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合征、格雷夫斯病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎、以及腎小球腎炎。
在另一個(gè)實(shí)例中，炎性病癥是涉及嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的一種病癥，其中發(fā)生細(xì)胞因子釋放、組胺釋放、氧化爆發(fā)、吞噬作用、其他顆粒酶和趨化性的釋放。超敏反應(yīng)(上述)也可以認(rèn)為是炎性疾病(急性或慢性)因?yàn)樗鼈兺ǔＩ婕把a(bǔ)體激活以及各種白細(xì)胞的募集/浸潤，例如嗜中性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞等。能夠以與劑量配方相容的方式以及以具有治療/預(yù)防有效性的量施用本披露的組合物。易于以多種方式施用配制品，例如通過攝取或注射或吸入。其他治療方案可以與施用本披露的蛋白質(zhì)相結(jié)合。聯(lián)合治療可以作為同時(shí)的或序貫的方案來施用。當(dāng)序貫地施用時(shí)，能夠以兩次或更多次給藥的方式施用該組合。該聯(lián)合給藥包括同時(shí)服用(施用分開的配制品或一個(gè)單個(gè)的藥物配制品)和以兩者中的任一順序的順序給藥，其中當(dāng)兩種(或所有)活性劑都同時(shí)產(chǎn)生它們的生物學(xué)活性時(shí)，優(yōu)選地存在一個(gè)時(shí)間段。在治療用途之前，優(yōu)選地在體外和/或體內(nèi)對本披露的蛋白質(zhì)進(jìn)行測試，例如如下說明的。
體外測試在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到一種抗原上，即使結(jié)合到一個(gè)化合物上。在蛋白質(zhì)是從預(yù)先存在的蛋白質(zhì)(例如抗體)衍生的情況下，本披露的蛋白質(zhì)可以至少與它從中衍生的蛋白質(zhì)同樣好地結(jié)合到該抗原上?？商娲兀九兜牡鞍踪|(zhì)以它從中衍生蛋白質(zhì)的至少大約10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%的親和力或親和度結(jié)合到抗原或缺乏負(fù)電荷殘基的蛋白質(zhì)的一種形式上。用于確定蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的示例性方法包括簡單的免疫測定，該免疫測定顯示了蛋白阻斷抗體結(jié)合到靶抗原上的能力，例如競爭性結(jié)合測定。在一個(gè)測定法中確定競爭性結(jié)合，其中測試的蛋白質(zhì)抑制了參考蛋白到共同抗原上的特異性結(jié)合。多種類型的競爭結(jié)合測定法是已知的，例如固相直接或間接放射性免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心式競爭測定(參見Stahli等人，1983)、固相直接生物素-親和素EIA (參見Kirkland等人，1986)、固相直接標(biāo)記的測定、固相直接標(biāo)記的夾心式測定(參見Harlow和Lane，1988);固相直接生物素-親和素EIA (Cheung等人，1990)、或直接標(biāo)記的RIA(Moldenhauer等人，1990)。典型地,這樣的測定涉及使用結(jié)合到固體表面或具有未標(biāo)記的測試蛋白和標(biāo)記參考蛋白之一的細(xì)胞上的純化抗原。在測試蛋白的存在下通過確定結(jié)合到固體表面或細(xì)胞的標(biāo)記的量來測量競爭性抑制。本披露還包括了用于測試本披露的蛋白質(zhì)的活性的方法。多種測定法可用于體外評定本披露的蛋白質(zhì)的活性。例如，將本披露的蛋白質(zhì)施用到細(xì)胞或其群體中，用于確定它是否能夠結(jié)合到所述細(xì)胞上和/或被所述細(xì)胞內(nèi)化。這樣的測定法是通過用可檢測標(biāo)記來標(biāo)記本披露的蛋白質(zhì)來促進(jìn)的(即，產(chǎn)生偶聯(lián)物)，然而，這不是重要的，因?yàn)楸九兜牡鞍踪|(zhì)也能夠用標(biāo)記的蛋白質(zhì)檢測。這樣的測定法用于評定本披露的蛋白質(zhì)，以將一種化合物(即有效載荷)遞送到細(xì)胞中的能力和/或它在成像中的利用。優(yōu)選地，該細(xì)胞表達(dá)本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到其上的一種抗原并且更優(yōu)選地是所希望被檢測或處理的細(xì)胞類型的一種細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。通常，本披露的蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性，例如偶聯(lián)到細(xì)胞毒性分子上，是通過如下測量的將表達(dá)抗原的細(xì)胞暴露于本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到其上的物質(zhì)；將這些細(xì)胞培養(yǎng)一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如從大約6小時(shí)至大約5天)使該蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物效應(yīng)；然后測量細(xì)胞生存力、細(xì)胞毒性和/或細(xì)胞死亡。用于測量活力(增殖)、細(xì)胞毒性、以及細(xì)胞死亡的基于細(xì)胞的體外測定是本領(lǐng)域已知的。例如，Cel丨Titer-G丨0 發(fā)光細(xì)胞生存力測定法(LuminescentCell ViabilityAssay)是一種基于鞘翅目螢光素酶(美國專利號5583024、5674713和5700670)的重組表達(dá)的可商購的(Promega公司，麥迪遜市,威斯康辛州)均相測定法。這種細(xì)胞增殖測定法是基于細(xì)胞中存在的ATP定量(代謝活性細(xì)胞的一個(gè)指示物)而確定培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù) 量?？商娲?，使用無熒光刃天青測定細(xì)胞生存力，在本披露的蛋白質(zhì)的存在下將它添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中?；罴?xì)胞將刃天青還原成紅色熒光的試鹵靈，可以使用例如顯微術(shù)或熒光酶標(biāo)儀容易地檢出。用于分析細(xì)胞活力的試劑盒可以從例如Molecular Probes, Eugene, OR,USA獲得。細(xì)胞活力的其他測定法包括當(dāng)DNA合成時(shí)確定3H-胸腺嘧啶核苷或14C-胸腺嘧啶核苷結(jié)合到DNA中(即，用于確定與細(xì)胞分裂相關(guān)的DNA合成)。在這樣的測定中，在標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷存在下將細(xì)胞孵育足以使細(xì)胞分裂發(fā)生的一段時(shí)間。在洗滌以便去除任何未結(jié)合的胸腺嘧啶核苷之后，例如使用閃爍計(jì)數(shù)器檢測標(biāo)記(例如，放射性標(biāo)記)。用于確定細(xì)胞增殖的替代測定法包括例如通過BrdU結(jié)合來測量DNA合成(通過ELISA或免疫組織化學(xué)，可從Amersham Pharmacia Biotech獲得試劑盒)。用于檢測細(xì)胞死亡的示例性測定法包括AP0PTEST (可從Immunotech獲得)染色凋亡早期細(xì)胞，并且不需要將細(xì)胞樣品固定(Martin等人，1994)。這種方法利用膜聯(lián)蛋白V抗體來檢測作為經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞特征的細(xì)胞膜重配置。然后能夠以熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、ELISA或通過使用固定的膜聯(lián)蛋白V抗體進(jìn)行粘附和淘選(panning)，將以這種方式染色的凋亡細(xì)胞進(jìn)行分選?？商娲?，使用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素?；疷TP切口末端標(biāo)記(TUNEL)測定來確定細(xì)胞死亡的水平。該TUNEL測定使用末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶，用生物素?；暮塑账針?biāo)記在凋亡期間產(chǎn)生的3’ -OH DNA末端。然后使用結(jié)合到檢測標(biāo)記上的鏈霉親和素來檢測生物素?；暮塑账帷Ｓ糜赥UNEL染色的試劑盒可以從例如紐約州帕切斯市Intergen公司獲得。還可以通過將本披露的蛋白質(zhì)暴露于血清和/或細(xì)胞并且隨后使用例如免疫親和純化來分離本披露的蛋白質(zhì)來評定或預(yù)測本披露的蛋白質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性?；厥盏谋九兜牡鞍踪|(zhì)的減少量表明本披露的蛋白質(zhì)在血清中或當(dāng)暴露于細(xì)胞時(shí)被降解。在另一個(gè)實(shí)例中，使用標(biāo)準(zhǔn)的放射免疫測定或熒光免疫測定來評定本披露的蛋白質(zhì)阻斷配體結(jié)合到受體上的能力。還可以通過在該蛋白質(zhì)存在或不存在下確定受體的信號傳導(dǎo)來評定本披露的蛋白質(zhì)激動(dòng)或拮抗受體的能力。
體內(nèi)測試還能夠針對在體內(nèi)其穩(wěn)定性和/或療效對本披露的蛋白質(zhì)進(jìn)行測試。例如，將本披露的蛋白質(zhì)施用于受試者體內(nèi)并且例如使用ELISA或通過檢測結(jié)合到該蛋白質(zhì)上的可檢測標(biāo)記，以檢測隨著時(shí)間的蛋白質(zhì)的血清水平。這允許確定本披露的蛋白質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性。還能夠?qū)⒈九兜牡鞍踪|(zhì)施用到人類疾病的動(dòng)物模型中并且確定它對其癥狀的影響。熟練的業(yè)內(nèi)人士將能夠基于本披露的蛋白質(zhì)結(jié)合到其上的抗原而容易地確定適合的
模型。例如人類癌癥的示例性模型是本領(lǐng)域已知的。例如，乳癌的小鼠模型包括過表達(dá)成纖維細(xì)胞生長因子 3 (Muller 等人，1990) ,TGF- a (Matsui 等人，1990)、erbB2 (Guy 等人，1992)的小鼠；或?qū)⑷祟惾榘┘?xì)胞移植到SCID小鼠中。卵巢癌的模型包括將卵巢癌細(xì)胞移植到小鼠(例如，如Roby等人，2000中說明的)、慢性地分泌促黃體激素的轉(zhuǎn)基因小鼠(Risma等人，1995)、或Wx/Wv小鼠中。前列腺癌的小鼠模型也是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如從增強(qiáng)表達(dá)SV40早期基因中得到的模型(例如，TRAMP模型，它利用最小限度的大鼠probasin啟動(dòng)子來表達(dá)SV40早期基因，或使用長probasin啟動(dòng)子來表達(dá)大T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠，總稱為‘LADY’模型，或表達(dá)c-myc或Bcl_2或Fgf8b或表達(dá)顯性負(fù)相TGFP的小鼠(參見，Matusik等人，2001，作為前列腺癌轉(zhuǎn)基因模型的一個(gè)綜述)。本披露的蛋白質(zhì)還可以施用于除了癌癥之外的疾病的動(dòng)物模型，例如NOD小鼠用于測試它們的抑制、預(yù)防、治療、或延遲糖尿病的能力(例如，如Tang等人，2004中說明的)和/或用于GVHD小鼠模型(例如，如Trenado，2002中說明的)和/或用于銀屑病小鼠模型(例如，Wang等人,2008)和/或用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型,例如SKG品系小鼠(Sakaguchi等人)，大鼠II型膠原關(guān)節(jié)炎模型，小鼠II型膠原關(guān)節(jié)炎模型或在幾個(gè)物種中抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(Bendele，2001))和/或多發(fā)性硬化模型(例如，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE ；Bradl and Linington，1996))和/或炎性氣道病(例如，OVA激發(fā)或蟑螂抗原激發(fā)(Chen等人2007)和/或炎性腸病模型(例如，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎或結(jié)腸炎的Muc2缺陷型小鼠模型(Van der Sluis等人2006)。
診斷/預(yù)測方法在一個(gè)實(shí)例中，本披露提供了用于診斷或預(yù)測病癥的方法。如在此使用的，術(shù)語“診斷”(“diagnosis”)，以及它的變體，例如但不限于“診斷” (“diagnose”)、“診斷” (“diagnosed”)或“診斷” (“diagnosing”)包括臨床狀態(tài)的任何初步診斷或復(fù)發(fā)性疾病的診斷。如在此使用的“預(yù)測” (“prognosis”)、“預(yù)測” (“prognosing”)以及它們的變體是指疾病的可能結(jié)果或過程，包括恢復(fù)或復(fù)發(fā)的可能性。在一個(gè)實(shí)例中，該方法包括確定樣品中抗原的量。因此，本披露的蛋白質(zhì)用于多種應(yīng)用中，例如細(xì)胞分選(例如，流式細(xì)胞術(shù)，熒光激活細(xì)胞分選)，用于診斷或研究目的。例如，使樣品與本披露的蛋白質(zhì)接觸一段時(shí)間并且在足以使它結(jié)合到抗原上的條件下并且形成一種復(fù)合物，然后對該復(fù)合物進(jìn)行檢測或確定復(fù)合物的水平。為了這些目的，這些蛋白質(zhì)可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。這些蛋白質(zhì)可以被直接標(biāo)記，例如使用在此所述的標(biāo)記。當(dāng)未標(biāo)記時(shí)，可以使用適當(dāng)手段例如在凝集測定中來檢測這些蛋白質(zhì)。未標(biāo)記的抗體或片段還可以與另一種(即，一種或多種)適合的試劑相結(jié)合使用，該試劑可以用來檢測蛋白質(zhì)，例如與該蛋白質(zhì)或其他適合的試劑(例如，標(biāo)記的蛋白A)具有反應(yīng)性的標(biāo)記抗體(例如，第二抗體)。優(yōu)選地，本披露的蛋白質(zhì)用于免疫測定中。優(yōu)選地，使用選自下組的測定法，該組由以下各項(xiàng)組成免疫組織化學(xué)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、熒光聯(lián)接免疫吸附測定(FLISA)蛋白質(zhì)印跡法、RIA、生物傳感器測定、蛋白芯片測定以及免疫染色測定(例如，免疫熒光)。標(biāo)準(zhǔn)的固相ELISA或FLISA形式特別地用于從多種樣品中確定蛋白質(zhì)的濃度。在一種形式中，這樣的測定涉及將生物學(xué)樣品固定到固體基質(zhì)上，像例如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或測驗(yàn)片、薄膜、或玻璃載體(例如，載玻片)。使特異性地結(jié)合到感興趣抗原上的本披露的蛋白質(zhì)與固定的樣品直接接觸，并且形成與所述樣品中存在的它的靶抗原中任何一種的直接結(jié)合。本披露的蛋白質(zhì)通常標(biāo)記有可檢出報(bào)告分子，像例如在 FLISA的情況下的熒光標(biāo)記(例如，F(xiàn)ITC或德克薩斯紅)或熒光半導(dǎo)體納米晶體(如US6，306，610中說明的)，或者在ELISA的情況下的酶(例如，辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)或￠-半乳糖苷酶))，或可替代地可以使用結(jié)合到本披露的蛋白質(zhì)上的標(biāo)記抗體。在洗滌以便去除任何未結(jié)合蛋白之后，直接地(在熒光標(biāo)記的情況下)或通過添加底物(像例如過氧化氫、TMB、或甲苯胺、或5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳吡喃糖酐(x_gal))(在酶標(biāo)記的情況下)來檢測標(biāo)記。這類基于ELISA或FLISA的系統(tǒng)特別適合于通過針對蛋白質(zhì)結(jié)合到其上的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(像例如分離的和/或重組蛋白或其免疫原性片段或其表位)的已知量校準(zhǔn)檢測系統(tǒng)來定量樣品中蛋白質(zhì)的量。在另一種形式中，ELISA或FLISA包括將本披露的蛋白質(zhì)或結(jié)合到感興趣抗原上的抗體固定到一種固體基質(zhì)上，像例如薄膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板、聚苯乙烯或聚碳酸酯測驗(yàn)片或玻璃載體。然后使樣品與本披露的所述蛋白質(zhì)或抗體進(jìn)行物理接觸，并且所述化合物結(jié)合到其上的蛋白質(zhì)被結(jié)合或“捕獲”。然后使用本披露的標(biāo)記蛋白對結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測，該標(biāo)記蛋白結(jié)合到不同的蛋白質(zhì)或同一抗原的不同位點(diǎn)上?？商娲兀梢允褂靡粋€(gè)第三標(biāo)記抗體，該抗體結(jié)合該第二(檢測)蛋白。
成像方法如熟練的業(yè)內(nèi)人士從上述內(nèi)容中應(yīng)當(dāng)清楚的,本披露還考慮了使用本披露的蛋白質(zhì)的多種成像方法。為了成像，本披露蛋白被偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記上，該標(biāo)記可以是能夠發(fā)射可以被成像檢出的信號的任何分子或試劑。例如，該可檢測標(biāo)記可以是蛋白質(zhì)、放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)射可見光的熒光團(tuán)、發(fā)射紅外線的熒光團(tuán)、金屬、鐵磁性物質(zhì)、發(fā)射電磁波的物質(zhì)、具有特異性磁共振(MR)光譜特征的物質(zhì)、吸收或反射X射線的物質(zhì)、或改變聲音的物質(zhì)。在成像步驟之前，可以將本披露的蛋白質(zhì)全身性地或局部地施用于有待成像的腫瘤、器官、或組織中。通常，以有效地實(shí)現(xiàn)所希望的腫瘤、組織、或器官的光學(xué)圖像的劑量來施用該蛋白質(zhì)。這類劑量可以依賴于所使用的具體蛋白質(zhì)、經(jīng)受成像操作的腫瘤、組織、或器官、所使用的成像設(shè)備等而在很大程度上變化。在本披露的一些實(shí)施方案中，本披露的蛋白質(zhì)作為組織和器官的體內(nèi)光學(xué)顯影劑用于多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，包括但不限于腫瘤成像、斷層攝影術(shù)、器官成像、器官功能的監(jiān)測、冠狀動(dòng)脈造影術(shù)、熒光內(nèi)窺鏡、激光引導(dǎo)的手術(shù)、光聲和聲至熒光方法等。其中本披露的蛋白質(zhì)用于成像的示例性疾病例如癌癥在此進(jìn)行了說明并且應(yīng)當(dāng)理解成將被考慮為在細(xì)節(jié)上加上必要的改動(dòng)而應(yīng)用于本披露的實(shí)例中。在一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白偶聯(lián)物用于通過監(jiān)測本披露的特定蛋白在受試者體內(nèi)哪里集中來檢測腫瘤和其他異常的存在。在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)用于激光輔助的引導(dǎo)手術(shù)，用于在腹腔鏡檢查時(shí)檢測腫瘤的微小轉(zhuǎn)移。仍然在另一個(gè)實(shí)例中，本披露的蛋白質(zhì)用于診斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及血塊。成像方法的實(shí)例包括磁共振成像(MRI)、MR光譜學(xué)、放射線照相術(shù)、CT、超聲、平面Y射線照相機(jī)成像、單光子發(fā)射計(jì)算斷層攝影術(shù)(SPECT)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、其他基于核醫(yī)學(xué)的成像、使用可見光的光學(xué)成像、使用熒光素酶的光學(xué)成像、使用熒光團(tuán)的光學(xué)成像、其他光學(xué)成像、使用近紅外線的成像、或使用紅外線的成像。本披露方法的某些實(shí)例進(jìn)一步包括在在受試者上的手術(shù)操作期間對組織成像。用于成像的多種技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這些技術(shù)中的任何一種可以用于本披露成像方法的背景中，用來測量來自可檢測標(biāo)記的信號。例如，光學(xué)成像是在醫(yī)學(xué) 特定領(lǐng)域中已經(jīng)得到廣泛接受的一種成像模式。實(shí)例包括細(xì)胞組分的光學(xué)標(biāo)記、以及血管造影術(shù)，例如熒光素血管造影術(shù)和吲哚氰綠因血管造影術(shù)。光學(xué)顯影劑的實(shí)例包括例如熒光素、熒光素衍生物、吲哚青綠、俄勒R綠、俄勒R綠衍生物的衍生物、羅丹明綠、羅丹明綠的衍生物、曙紅、赤蘚紅(ery11 irosin)、德克薩斯紅、德克薩斯紅的衍生物、孔雀綠、磺基琥珀酰亞胺酯納米金、級聯(lián)藍(lán)、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑衍生物、級聯(lián)黃染料、dapoxyl染料?？紤]了 Y照相機(jī)成像作為一種成像方法，該方法可以用于測量從可檢測標(biāo)記得到的信號。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟悉Y照相機(jī)成像的應(yīng)用技術(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，測量信號可以涉及mIn或99mTc偶聯(lián)物的Y照相機(jī)成像的用途，具體地是mIn-善得定或99mTc-促生長素抑制素類似物。在本披露背景中考慮了計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)作為成像模式。通過從不同角度取得一系列X射線并且然后用計(jì)算機(jī)軟件將它們組合，CT使得其有可能構(gòu)建出身體任何部分的一個(gè)三維圖像。計(jì)算機(jī)被編程為從任何角度并且以任何深度展示二維切片。可以將這些切片合并來建立三維畫像。在CT中，靜脈注射結(jié)合到感興趣抗原上的輻射透不過的偶聯(lián)到本披露的蛋白質(zhì)上的造影劑可以有助于鑒定和描繪組織塊(例如，軟組織塊)(當(dāng)初始CT掃描不是診斷性的時(shí))。類似地，造影劑有助于評定軟組織損傷的血管供應(yīng)。例如，使用造影劑可以幫助描繪腫瘤和鄰近的血管結(jié)構(gòu)的關(guān)系。CT造影劑包括例如碘化造影劑。這些試劑的實(shí)例包括碘酞酸鹽、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘醇、以及碘番酸鹽。也已經(jīng)報(bào)道了釓試劑能夠用作CT造影劑，例如釓噴胺。磁共振成像(MRI)是使用高強(qiáng)度磁體和射頻信號來產(chǎn)生圖像的一種成像模式。在MRI中，將有待成像的樣品置于強(qiáng)靜止磁場中并且用射頻(RF)輻射的脈沖激發(fā)用來在樣品中產(chǎn)生凈磁化。然后不同的磁場梯度和其他RF脈沖起作用，用來將空間信息編碼到記錄的信號中。通過收集和分析這些信號，有可能計(jì)算出三維圖像，類似于CT圖像，它通常以二維切片來展示。可以將這些切片合并用來建立三維表示。用于MRI或MR光譜學(xué)成像的造影劑與用于其他成像技術(shù)中的那些不同。MRI造影劑的實(shí)例包括釓螯合物、錳螯合物、鉻螯合物、以及鐵顆粒。例如，本披露蛋白偶聯(lián)到包括選自下組的順磁金屬螯合物的ー種化合物上，該組由以下各項(xiàng)組成鈧、鈧、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鑰、釕、鋪、銦、鐠、釹、钷、衫、銪、禮、鋪、鏑、欽、鉺、錢、以及鐿。用于本披露的顯影劑的ー個(gè)另外的實(shí)例是基于鹵烴的納米顆粒例如PFOB或其他基于氟的MRI試劑。CT和MRI兩者提供了解剖學(xué)信息，該信息幫助區(qū)別組織邊界和血管結(jié)構(gòu)。提供關(guān)于細(xì)胞水平信息例如細(xì)胞活力的信息的成像模式包括正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)。在PET中，病人咽下或注射有發(fā)射正電子的放射性物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)移動(dòng)通過身體時(shí)這些正電子可以被監(jiān)測。PET與SPECT之間的主要區(qū)別在于替代正電子發(fā)射物質(zhì)，SPECT使用發(fā)射高能光子的放射性示蹤劑。SPECT對于診斷包括冠狀動(dòng)脈疾病的多種疾病具有價(jià)值，并且每年在美國已經(jīng)進(jìn)行大約250萬的SPECT心臟研究。對于PET而言，本披露的蛋白質(zhì)通常標(biāo)記有正電子發(fā)射體，例如nC、13N、150、18F、82Rb、62Cu、和68Ga。對于SPECT，本披露的蛋白質(zhì)標(biāo)記有正電子發(fā)射體，例如99mTc、2CllTl、以及67Ga、mIn。 動(dòng)物和人的非侵入性熒光成像還能夠提供體內(nèi)診斷信息并且用于廣泛多樣的臨床專門項(xiàng)目中。例如，過去多年已經(jīng)開放出多種技術(shù)包括在熒光團(tuán)的UV激發(fā)后的簡單觀察，一直到使用先進(jìn)的設(shè)備進(jìn)行復(fù)雜的光譜學(xué)成像(參見例如Andersson-Engels等人，1997)。本領(lǐng)域已知的用于體內(nèi)檢測熒光(例如來自熒光團(tuán)或熒光蛋白)的特定設(shè)備或方法包括但不限于體內(nèi)近紅外熒光(參見例如Frangioni，2003)，Maestro 體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)(Cambridge Research & Instrumentation公司，沃本市，馬薩諸塞州)，使用飛點(diǎn)掃描儀進(jìn)行體內(nèi)突光成像(參見，例如Ramanujam等人,2001)等。用于檢測光學(xué)響應(yīng)的其他方法或設(shè)備包括但不限于視覺檢查、CXD照像機(jī)、錄像照相機(jī)、照相膠片、激光掃描設(shè)備、突光計(jì)、光電ニ極管、量子計(jì)數(shù)器、落射突光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、或使用光電倍增管的信號放大。在一些實(shí)例中，在用于人體中之前使用體外或體內(nèi)測定法對顯影劑進(jìn)行測試(例如使用在此所述的模型)。
制造物品本披露還提供了包含本披露蛋白質(zhì)的制造物品或“試劑盒”。該制造物品可以包括ー個(gè)容器和一個(gè)標(biāo)記或插入該容器上或與其相結(jié)合的包裝，例如提供說明書用來根據(jù)任何實(shí)施方案將本披露的蛋白質(zhì)用于在此所述的方法中。適當(dāng)?shù)娜萜靼ɡ缙?、小瓶、注射器、泡罩包裝等。這些容器可以是從許多種材料(如玻璃或塑料)形成的。該容器保持本披露的蛋白質(zhì)組合物并且可以具有一個(gè)無菌入口端(例如，該容器可以是ー種靜脈注射溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)?？商娲鼗蛄硗獾兀撝圃炱房梢赃M(jìn)一歩包括ー個(gè)第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包括一種藥學(xué)上可接受的緩沖劑，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、以及葡萄糖溶液。它可以進(jìn)ー步包含來自ー種商業(yè)的以及使用者立場的其他的所期望的材料，包括其他的緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、以及注射器。該試劑盒還可以或可替代地包括用于檢測本披露的蛋白質(zhì)和/或用于偶聯(lián)到本披露的蛋白質(zhì)上的試劑。在下面非限制性實(shí)例中對本披露進(jìn)行進(jìn)ー步說明。實(shí)例I:材料與方法基于HEL4 Vh結(jié)構(gòu)域(如Jespers等人，2004中說明的)，使用一種突變方法來鑒定使這種結(jié)構(gòu)域具有聚集抗性的突變。該方法是基于在HEL4與DP47 (從中衍生出HEL4的易于聚集的種系Vh)之間產(chǎn)生嵌合體。
I. I突變體Vh和scFv的產(chǎn)生使用Zoller和Smith (1987)說明的方法(其中由Kunkel等人(1987)引入了改迸)產(chǎn)生人可變域的突變體。為此目的，將編碼這些所希望突變的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的單鏈模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且連接從而形成共價(jià)閉環(huán)DNA。通過使用ApaLI和NotI位點(diǎn)將編碼單個(gè)人重鏈可變Vh)域(V3-23/DP-47)的DNA片段克隆到曬菌體展示載體FdMyc來產(chǎn)生模板。通過電穿孔將共價(jià)閉環(huán)DNA轉(zhuǎn)化到ung+大腸桿菌株TGl中，引起未突變dU-ssDNA的優(yōu)先破壞。通過DNA序列分析來證實(shí)構(gòu)建的突變體序列。為了產(chǎn)生scFv突變體，使用XhoI和NotI克隆位點(diǎn)將編碼單個(gè)V結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO 3)和合成接頭區(qū)(SEQ ID NO 4)的DNA片段克隆到相應(yīng)的FdMyc構(gòu)建體中。通過DNA序列分析來證實(shí)構(gòu)建的突變體序列。
I. 2聚集抗性的噬菌體ELISA ( “熱/冷測定”)在噬菌體ELISA形式中通過測量熱孵育之后信號停留對克隆的聚集抗性進(jìn)行分析(McCafferty等人，1990 ; Jespers等人,2004)。在用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的大約 5 μ g/ml濃度的蛋白A將Nunc Maxisorp免疫板的孔包被過夜。用PBS將孔板洗滌一次并且用稀釋于在PBS中的大約4% (w/v)奶粉(MPBS)封閉。從瓊脂平板中挑取單個(gè)克隆并且在補(bǔ)充有大約15 μ g/ml四環(huán)素的2xTY培養(yǎng)基(包含大約16g/L胰蛋白胨、大約10g/L酵母提取物、大約5g/LNaCl、pH 7.0)中生長過夜，在大約30°C下震蕩。通過離心將細(xì)胞移開并且在培養(yǎng)物上清液中通過添加生物素-PEO4-N-羥基琥珀酰亞胺酷(Pierce ;大約50 μ M的終濃度)直接將噬菌體生物素?；?。為了熱選擇，首先將上清液在大約80°C下孵育大約10分鐘并且然后在大約4°C持續(xù)大約10分鐘。將上清液添加到封閉的ELISA孔中。在用PBS洗滌三次之后，使用Extravidin-HRP偶聯(lián)物(Sigma)和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物來檢測結(jié)合的噬菌體顆粒。通過減去在450nm和650nm處的測量值來計(jì)算吸光度。
I. 3VH 文庫、‘Garvan-IA’ 和 ‘IB’ 的產(chǎn)生構(gòu)建了兩個(gè)Vh文庫，其中使用Zoller和Smith，1987說明的方法(其中由Kunkel等人，1987引入了改進(jìn))將HEL4 %克隆的⑶R3隨機(jī)化。為此目的，將編碼這些所希望的突變的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的單鏈模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且連接從而形成共價(jià)閉環(huán)DNA。通過使用ApaLI和NotI位點(diǎn)將編碼單個(gè)人Vh結(jié)構(gòu)域(HEL4)的DNA片段克隆到噬菌體展示載體FdMyc中來產(chǎn)生模板。通過電穿孔將共價(jià)閉環(huán)DNA轉(zhuǎn)化到ung+大腸桿菌株TGl中，引起未突變dU-ssDNA的優(yōu)先破壞。通過將位置96、97、98、99、100、100a、和IOOb處(根據(jù)Kabat等人，1992編碼)的7個(gè)氨基酸殘基隨機(jī)化(在所有7個(gè)位置使用簡并DVK密碼子)來產(chǎn)生‘Garvan-IA’文庫。同樣地，在位置95、96、97、98、99、100、100a、100b、以及IOOc處將‘Garvan_IB’文庫隨機(jī)化，其中在編碼核酸中使用簡并的NNK密碼子將95和IOOc隨機(jī)化，其中在編碼核酸中使用簡并的DVK編碼將剩余的位置隨機(jī)化。得到的文庫尺寸對于Garvan-IA是大約I. IxlO9個(gè)克隆，并且對于Garvan-ΙΒ是大約2. 2xl09個(gè)克隆。I. 4抗-hTNF和抗-mIL-21 Vh克隆的噬菌體展示選擇通過針對生物素酰化的重組hTNF (人腫瘤壞死因子；P印rotech)或mIL_21進(jìn)行2輪選擇將來自天然Garvan-IA和IB文庫的卩遼菌體(在FdMyc載體中)環(huán)化(基本上如前面說明的(Lee等人，2007))。在兩輪選擇之后，使用引物5’-ACGCGTCGACGCAGGTGCAGCTGTTGG-3，(SEQ ID NO: 16)和 5，-CTGTTAGGATCCGCTCGAGACGGTGACCAG-3，(SEQ ID NO: 17)從噬菌體DNA制劑中PCR擴(kuò)增編碼Vh結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。用SalI和BamHI限制性內(nèi)切酶來消化PCR產(chǎn)物并且克隆到編碼C-Myc和His6標(biāo)簽的修飾的pET12a表達(dá)質(zhì)粒(New England Biolabs)的相應(yīng)位點(diǎn)中。將得到的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株BL21-Gold(Stratagene)中并且在大約37°C下在大約250rpm震蕩下使每個(gè)抗原選擇的192個(gè)克隆生長于補(bǔ)充有大約4%葡萄糖和氨芐西林(約100μ g/mL)的2xTY肉湯中持續(xù)大約18小吋。使用過夜培養(yǎng)物來接種補(bǔ)充有大約O. I %葡萄糖和氨節(jié)西林(約100 μ g/mL)的新鮮的2xTY培養(yǎng)基并且生長至 OD6tltol大約O. 5，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加異丙基β-D-I-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至終濃度大約ImM用來誘導(dǎo)可溶性Vh表達(dá)。在30°C下在大約250rpm震蕩下使培養(yǎng)物生長大約18小吋。通過離心將細(xì)胞移開并且通過ELISA針對抗原結(jié)合對培養(yǎng)物上清液進(jìn)行測試。
對于ELISA,用在PBS中的大約5μ g/ml濃度的抗原將Nunc Maxisorp免疫板的孔包被過夜。用PBS將孔板洗滌一次并且用稀釋于PBS中的大約4% (w/v)奶粉進(jìn)行封閉。將上清液添加到封閉的ELISA孔中。在用PBS三次洗滌之后，使用生物素?；碾u-抗-c-Myc 抗體(Immunology Consultants Laboratory)進(jìn)行 hTNF 或生物素酸化的小鼠抗-c-Myc (Sigma,克隆9E10)用于mIL-21選擇，之后使用Extravidin-HRP偶聯(lián)物(Sigma)和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物來檢測結(jié)合的抗體結(jié)構(gòu)域。通過減去在450nm和650nm處的測量值來計(jì)算吸光度。
I. 5分離的Vg克隆的特異性ELISA通過ELISA確定分離的Vh克隆，G07(抗-hTNF ;SEQ ID NO 5)和Gll (抗-mIL-21 ；SEQ ID NO 6)的特異性。用大約5μ g/mL重組人TNF、小鼠TNF、人IL-21、小鼠IL-21、β-半乳糖苷酶、人催乳激素受體、鏈霉親和素、以及中性鏈親和素中的任ー項(xiàng)將Nunc Maxisorp免疫板的孔包被過夜。用PBS將孔板洗滌一次并且用稀釋于PBS緩沖液中的大約4% (w/v)奶粉進(jìn)行封閉。將稀釋于PBS中的純化的G07和Gll以大約10 μ g/mL添加到孔板中并且在室溫下孵育大約I小時(shí)。在用PBS三次洗滌之后，使用生物素?；碾u-抗-c-Myc抗體(用于G07)或生物素?；男∈罂?c-myc (用于Gl I)來檢測Vh’之后添加Extravidin-HRP和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物。通過減去再450nm和650nm處的測量值計(jì)算吸光度。
I. 6抗-hTNF和抗-mIL-21 V 克降的親和カ測量使用表面等離子體共振(使用Biacore機(jī)器；GE Healthcare)來測量Vh克隆G07(抗-hTNF ;SEQ ID NO 5)和 Gll (抗-mIL-21 ；SEQ ID NO :6)的親和力。為此目的，將在PBS中稀釋的生物素酰化的抗原注射在鏈霉親和素(SA)傳感器芯片(Biacore AB)上。將純化的Vh (具有范圍從大約O. 125 μ M至4 μ M的濃度)的連續(xù)稀釋以大約20 μ 1/min的流速注射到包含相應(yīng)祀抗原的流動(dòng)細(xì)胞上。使用BIAevaluation 4. I軟件包(Biacore AB)計(jì)算出平衡解離常數(shù)。
I. 7確定Vg結(jié)構(gòu)域的可溶性表達(dá)水平
使用蛋白A ELISA確定每個(gè)Vh結(jié)構(gòu)域的可溶性表達(dá)水平，其中針對同一純化Vh的標(biāo)準(zhǔn)曲線測量Vh中的可溶性Vh的濃度。從BL21 -GOLD大腸桿菌(Stratagene)中的pET12a(New England Biolabs)載體來表達(dá)DP47、HEL4和突變體VH。在42小時(shí)之后，通過離心將細(xì)胞移開并且通過添加生物素-PEO4-N-羥基琥珀酰亞胺酷(Pierce ;50μΜ終濃度)直接地在培養(yǎng)物上清液中將Vh生物素?；?。在已知濃度下將培養(yǎng)物上清液和相同突變體的生物素?；募兓疺h添加到用5 μ g/ml蛋白A(Sigma)包被過夜并且用4% MPBS封閉的Nunc 96孔Maxisorp免疫板上。在用PBST三次洗漆之后，使用Extravidin-HRP偶聯(lián)物(Sigma)和TMB底物來檢測結(jié)合的抗體結(jié)構(gòu)域。通過減去在450nm和650nm處的測量值來計(jì)算吸光度并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線外推每個(gè)樣品的濃度。
I. 8通過尺寸排阻層析法來確定聚集抗性將處于PBS中的10 μ M的純化Vh加熱到80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘或者不處理。在用包含125mM NaCl的25mM磷酸鈉(pH 7. 4)平衡的Superdex_G75柱(Pharmacia)上對加熱的和未加熱的樣品各500 μ I進(jìn)行分析之前在16，OOOxg下將加熱的 和未加熱的樣品兩者離心10分鐘。以500 μ I的體積以O(shè). 5ml/min流速注射蛋白質(zhì)。通過測量加熱樣品曲線下的面積來確定每種Vh突變體的回收率，表達(dá)為未加熱樣品的百分比。
I. 9使用圓二色性來確定聚集抗性在石英杯(Imm徑長)中使用J-815分光計(jì)(Jasco)通過圓二色性(CD)來測量熱去折疊的Vh結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)樣品是處于PBS (pH 7. 2)中2(^11的終濃度并且當(dāng)以1で/1^11將溶液從20°C加熱至80°C時(shí)通過使用Inm帶寬和I秒積分時(shí)間記錄在235nm處的⑶信號而獲得熔解曲線。通過以1°C /min將加熱的蛋白質(zhì)從80°C冷卻到4°C測試了每種樣品的聚集抗性。
I. 10通過尺寸排阻柱測量Vg結(jié)構(gòu)域的保留如前面所述表達(dá)和純化⑶Rl中包含突變的DP47 Vh結(jié)構(gòu)域。將每種蛋白樣品(在PBS中，5 μ M)加熱至80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘。在用包含125mM NaCl的25mM憐酸鈉(pH 7.4)平衡的Superdex_G75柱(Pharmacia)上進(jìn)行分析之前(姆個(gè)500μ I的樣品)在16，OOOxg下將加熱的樣品離心10分鐘。以500 μ I體積以O(shè). 5ml/min流速注射蛋白質(zhì)。
I. IIVh 文庫 ‘Garvan-2’ 的產(chǎn)生構(gòu)建了一個(gè)Vh文庫，其中使用Zoller和Smith，1987說明的方法(其中由Kunkel等人，1987引入了改進(jìn))將HEL4 Vh克隆的多個(gè)⑶R殘基隨機(jī)化。為此目的，將編碼這些所希望的突變的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的單鏈模板DNA上(dU-ssDNA)，在酶作用下延伸并且連接從而形成共價(jià)閉環(huán)DNA。通過將編碼單個(gè)人Vh結(jié)構(gòu)域(HEL4)的DNA片段克隆到卩遼菌體展示載體pHENl中來產(chǎn)生模板。通過電穿孔將共價(jià)閉環(huán)DNA轉(zhuǎn)化到ung+大腸桿菌株TGI中，引起未突變的dU-ssDNA的優(yōu)先破壞。通過將⑶Rl中的位置30和31處(根據(jù)Kabat等人，1992編號)的2個(gè)氨基酸殘基隨機(jī)化(使用簡并的KMT密碼子)來產(chǎn)生該文庫。同樣地，在位置50、52、55處使用簡并KMT密碼子，在位置52a處使用簡并RRT密碼子并且在位置53處使用簡并SMT密碼子將⑶R2隨機(jī)化。此外，將HEL4結(jié)構(gòu)域的位置29、94、IOOx (其中X指示C端簡并位置之后的位置)、101和102突變成相應(yīng)的DP47殘基。然后基本上如前面所述使用SOE-PCR誘變將位置95-100a或可替代地位置95_100c進(jìn)ー步隨機(jī)化(Higuchi, Krummel等人，1988)。在⑶R3設(shè)計(jì)中編碼的氨基酸殘基包括所有19個(gè)天然發(fā)生的氨基酸，但是不包括半胱氨酸和終止密碼子。通過電穿孔將共價(jià)閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)染到大腸桿菌株TGl中。得到的文庫大小包括大約4xl09個(gè)克隆。Garvan-2文庫編碼兩個(gè)或更多個(gè)負(fù)電荷(negative charge),它們中的兩個(gè)是在位置32和33處。
I. 12抗-hPRLR和抗-HEL Vh克隆的噬菌體展示選擇基本上如前所述通過多輪選擇將來自天然Garvan-2文庫的曬菌體環(huán)化((Lee等人，2007))。在選擇之后，在大約37°C下，在大約250rpm的震蕩下，使從每種抗原選擇得到的克隆生長在補(bǔ)充有大約4%葡萄糖和氨芐西林(大約100μ g/mL)的2xTY肉湯中持續(xù)大約18小吋。使用過夜培養(yǎng)物來接種補(bǔ)充有大約O. I %葡萄糖和氨芐西林(大約100μ g/mL)的新鮮的2xTY培養(yǎng)基并且生長至OD6tltlnm大約O. 5，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加異丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至終濃度大約ImM，以誘導(dǎo)可溶性Vh表達(dá)。在30°C下在約250rpm震蕩下使培養(yǎng)物生長大約18小吋。通過離心將細(xì)胞移開并且通過ELISA針對抗原結(jié)合對培養(yǎng)物上清液進(jìn)行測試。為了 ELISA,用在PBS中的大約5 μ g/ml濃度的抗原將Nunc Maxisorp免疫板的孔包被過夜。用PBS將孔板洗滌一次并且用稀釋于PBS中大約4% (w/v)奶粉進(jìn)行封閉。將上清液添加到封閉的ELISA孔中。在用PBS三次洗滌之后，使用生物素?；碾u-抗-c-Myc抗體(Immunology Consultants Laboratory)或生物素?；男∈罂?_c_Myc (Sigma,克隆9E10)，之后使用Extravidin-HRP偶聯(lián)物(Sigma)和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物來檢測結(jié)合的抗體結(jié)構(gòu)域。通過減去在450nm和650nm處的測量值計(jì)算吸光度。
I. 14抗-hPRLR和抗-HEL Vh克隆的親和カ測量使用表面等離子體共振(使用Biacore2000儀器；GE Healthcare)來測量Vh克隆的親和力。為此目的，將稀釋在PBS中的生物素酰化的抗原注射在鏈霉親和素(SA)傳感器芯片(Biacore AB)上。將連續(xù)稀釋的純化Vh注射在包含相應(yīng)靶抗原的流動(dòng)細(xì)胞上。使用BIAevaluation 4. I軟件包(Biacore AB)計(jì)算出平衡解離常數(shù)。
實(shí)例2 HEL4/DP47⑶R嵌合體的聚集抗性進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)用來研究將單個(gè)HEL4CDR(CDR1或CDR2或CDR3)引入到DP47中的作用。如上面詳述的(參見材料與方法部分)構(gòu)建了 HEL4/DP47 CDR嵌合體并且針對聚集抗性進(jìn)行了測試。簡言之，將噬菌體展示的Vh加熱到80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘。 通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的Vh并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。結(jié)果顯示在表I和圖2中?？傊?，引入HEL4-⑶Rl對DP47 Vh結(jié)構(gòu)域賦予了顯著的聚集抗性。另ー方面，將HEL4-⑶R2或HEL4-⑶R3引入到DP47中對Vh結(jié)構(gòu)域的聚集抗性具有有限影響。
表I :DP47/HEL4⑶R嵌合體的聚集抗性
VhΓ DP47]" HEL4 HEL4-CDRl 「HEL4-CDR2 Γ HEL4-CDR3
保持結(jié)合到蛋白A上 2% ' 88% 81%4%3%_
實(shí)例3 ADRl的作圖-DP47⑶Rl突變體的聚集抗性
進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)ー步鑒定負(fù)責(zé)為DP47 Vh結(jié)構(gòu)域提供聚集抗性的⑶Rl區(qū)域。如上面詳述(參見材料與方法部分)，構(gòu)建了 DP47 Vh結(jié)構(gòu)域的CDRl區(qū)域中的單個(gè)氨基酸改變以及它們的組合，并且針對聚集抗性進(jìn)行了測試。簡言之，將噬菌體展示的Vh加熱到80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘。通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的Vh并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。結(jié)果顯示在表2和圖3中?？傊?，在⑶Rl的位置31或32或33處引入帶負(fù)電荷的氨基酸導(dǎo)致％結(jié)構(gòu)域顯著的聚集抗性。此外，與針對單個(gè)氨基酸改變所觀察到的相比較，在31-33處的三重氨基酸突變(SYA31-33DED)導(dǎo)致了更大的聚集抗性。在位置28和35處的其他突變(T28R，S35G)對聚集抗性具有很小的影響。這些前面說明的突變不引入帶負(fù)電荷的氨基酸。
表2 :DP47-⑶Rl突變體的聚集抗性VhΓ T28R Γ S31D「Y32E「A33D Γ S35G Γ SYA3ト33DED I 5X mut
保持結(jié)合到蛋白A上2% 31% 41% 26% 4% 67%75%
實(shí)例4 :當(dāng)與共同ん鏈(為scFv)配對時(shí)DP47-CDR1突變體的聚集抗性以及它們的組
入上面說明的DP47-CDR1突變體通過ー個(gè)接頭(SEQ ID NO 4)以scFv形式(關(guān)于全部實(shí)驗(yàn)詳情參見材料與方法部分)與共同單個(gè)可變輕鏈;SEQ ID NO 3)進(jìn)行配對。簡言之，將噬菌體展示的Vh加熱到80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘。通過蛋白AELISA捕獲正確折疊的scFv并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。結(jié)果顯示在表3和圖4中?？傊?，處于scFv形式的DP47-⑶Rl突變體顯示與Vh形式類似的聚集抗性改進(jìn)(參見表2和圖3)。這些結(jié)果顯示當(dāng)與共同\鏈(如scFv)配對時(shí)在CDRl的位置31或32或33 (或它們的組合)引入帶負(fù)電荷的氨基酸改善了 Vh的聚集抗性。此外，與針對單個(gè)氨基酸改變所觀察到的相比較，在31-33處的三重氨基酸突變(SYA31-33DED)導(dǎo)致了更大的聚集抗性。在位置28和35處的其他突變(T28R，S35G)對聚集抗性具有很小的影響。這些前面說明的突變不引入帶負(fù)電荷的氨基酸。
表3.以scFv形式通過接頭偶聯(lián)到單個(gè)可變輕鏈(VL)上的DP47-⑶Rl突變體(VH)的聚集抗性
scFvDP47 HEL4 HEL4- T28R S31D Y32E A33D S35G SYA31- 5X
IIlUt
___ CDRl____33DED__
保持結(jié)合到蛋白 A 8% 56% 66% 4% 29% 27% 22% 5% 45% 41%
Jt I 1_ I I L J Li 1_
實(shí)例5 :在⑶Rl中包含雙突變的DP47 Vh構(gòu)建體的產(chǎn)生基本上如在上述實(shí)例中對于單個(gè)和多個(gè)DP47-⑶Rl突變體所說明，構(gòu)建了 Vh的⑶Rl區(qū)域中的雙突變。例如，在Vh的⑶Rl位置32和33位置處引入雙突變。可替代地，在Vh的⑶Rl位置31和32處引入雙突變。可替代地，在Vh的⑶Rl位置31和33處引入雙突變。
在以上的Vh的⑶Rl區(qū)中雙突變的實(shí)例中，在⑶Rl的位置32和33、或位置31和32、或位置31和33處引入帶負(fù)電荷的氨基酸例如天冬氨酸(D)和/或谷氨酸(E)。如在前面材料和方法部分中說明的，使用噬菌體“熱/冷”測定來測量雙重突變體DP47 Vh結(jié)構(gòu)域的聚集抗性。簡言之，將噬菌體展示的抗體加熱到大約80°C持續(xù)約10分鐘，之后在大約4°C下冷卻大約10分鐘。通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的Vh并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。在一些實(shí)例中，雙重突變體Vh構(gòu)建體與輕鏈(\)配對，以確定這些突變對scFv聚集抗性的影響。使用如前面材料與方法部分中所述的噬菌體“熱/冷”測定來測量突變體scFv的聚集抗性。簡言之，將噬菌體展示的抗體加熱到約80°C持續(xù)約10分鐘，之后在打約 4°C下冷卻大約10分鐘。通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的scFv并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。
實(shí)例6 :作為純化蛋白的CDRl突變體的聚集抗性在純化的Vh或VH-\組合(即，不展示在噬菌體上)的背景下，評估了前面實(shí)例中說明的這組⑶Rl突變體的聚集抗性。對于這些實(shí)驗(yàn)，基本上如前面在材料與方法部分中說明，表達(dá)和純化了突變體Vh(或Vh-VJ結(jié)構(gòu)域。通過圓二色性(CD)和/或尺寸排阻層析和/或通過混濁度分析來研究針對熱誘導(dǎo)聚集的抗性。通過圓二色性和/或熒光光譜學(xué)來確定熱力學(xué)穩(wěn)定性。
實(shí)例7 :引入CDRl突變的現(xiàn)有突變體的突變通過在位置28和/或30和/或31和/或32和/或33和/或35處引入帶負(fù)電荷的氨基酸來修飾現(xiàn)有的已知單克隆抗體，像例如Humira(本領(lǐng)域中也稱為阿達(dá)木單抗；在SEQ ID NO :10中列出的Vh序列)和/或Rituxan(本領(lǐng)域中也稱為美羅華或利妥昔單抗；SEQ ID NO :11)和/或赫賽汀(本領(lǐng)域中也稱為曲妥珠單抗；SEQ ID NO :12)和/或阿瓦斯汀(本領(lǐng)域中也稱為貝伐單抗；SEQ ID NO :13)。另外地，可以在位置26和/或39和/或40和/或50和/或52和/或52a和/或53處引入帶負(fù)電荷的氨基酸。這些修飾抗體的表征是以Vh結(jié)構(gòu)域或僅scFv (非完整的IgG)形式來實(shí)現(xiàn)的并且包括如上面在材料與方法部分中說明的“熱/冷”測定和/或?qū)嵗?中所述測定的任何ー項(xiàng)或多項(xiàng)。
實(shí)例8 :在IgG背景下的Vh突變體的分析在完整IgG的背景下進(jìn)行了 Vh突變體的測試。為此目的，表達(dá)并且純化了突變體IgG。通過圓二色性和/或尺寸排阻層析和/或通過混濁度分析研究了針對聚集的抗性。
實(shí)例9 =Garvan-IA和IB文庫的聚集抗性如上所述(參見材料與方法部分)構(gòu)建并且分離Garvan-IA和IB文庫。研究了來自Garvan-IA和IB人類Vh文庫的天然克隆的聚集抗性。簡言之，將噬菌體展示的抗體加熱到大約80°C持續(xù)大約10分鐘，之后在大約4°C下冷卻大約10分鐘。通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的Vh并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。這些聚集抗性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5A和5B中。總之，當(dāng)經(jīng)受“熱/冷”測定吋，Garvan-IA或-IB Vh文庫的天然(未選擇)克隆的大多數(shù)(其中將多樣性引入到HEL4的CDR3中)展示了聚集抗性的顯著水平。多樣性僅限于HEL4支架的CDR3，為7個(gè)或9個(gè)氨基酸殘基(對應(yīng)地IA和IB)。
實(shí)例10 G07和Gll克隆的分離和表征
如上詳述(參見材料與方法部分)針對它們結(jié)合到人腫瘤壞死因子(hTNF)或小鼠白細(xì)胞介素上21(mIL-21)選擇的兩種克隆是從Garvan-I文庫中分離的。如通過ELISA證明的，結(jié)合是抗原特異性的。進(jìn)行了抗人TNF克隆G07 (SEQ ID NO 5)和抗小鼠IL-21克隆Gl I (SEQ ID NO 6)的Biacore親和カ測量。將連續(xù)稀釋的每種純化蛋白(以4μΜ開始)運(yùn)行在對應(yīng)地包被有生物素?；膆TNF和mIL-21的鏈霉親和素(SA)芯片上。Biacore軟件分析對應(yīng)地估計(jì)了針對G07和Gll的I. 86 μ M和4. 07 μ M的親和カ。然后針對每種Vh研究抗原結(jié)合的特異性。針對結(jié)合到hTNF、mIL-21以及固定在Nunc Maxisorb ELISA孔板上的一定范圍的無關(guān)抗原上來測試純化的、c_Myc標(biāo)記的抗體結(jié)構(gòu)域。使用抗-C-Myc抗體來檢測結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)域。這些 結(jié)果如在圖6中所示?？傊瑑煞N克隆都特異性地結(jié)合到它們同源抗原上。還發(fā)現(xiàn)Gll結(jié)合到人IL-21(hIL-21)(—種mIL_21的同系物)上。
實(shí)例11 :抗原結(jié)合抗-hTNF克隆G07和抗_mIL_21克隆Gll的聚集抗性在噬菌體上測試抗原結(jié)合抗-hTNF克隆G07和抗_mIL_21克隆Gll的聚集抗性。而且，將這些克隆的⑶R3結(jié)合到在此所述的DP47-⑶Rl突變體的ー項(xiàng)或多項(xiàng)中，以研究點(diǎn)突變對抗原結(jié)合以及聚集抗性的影響。使用如前面材料與方法部分中所述的噬菌體“熱/冷”測定來測量突變體、抗原結(jié)合Vh的聚集抗性。此外，通過ELISA測試到抗原上的結(jié)合，以評估CDRl突變對抗原結(jié)合的影響。
實(shí)例12 :賦予聚集抗性的另外突變的鑒定為了鑒定在⑶Rl中的對Vh賦予聚集抗性的另外的殘基，將位置26至35 (根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)之間的DP47的表面暴露殘基取代為天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。還將位置39和40處的框架殘基取代為天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。將這些突變體Vh展示在噬菌體上并且經(jīng)受“熱/冷”測定，如實(shí)例12中所述。這個(gè)測定的結(jié)果顯示在表4和圖7中。簡言之，將噬菌體展示的Vh加熱到80°C持續(xù)10分鐘，之后在4°C下冷卻10分鐘。通過蛋白A ELISA捕獲正確折疊的Vh并且將處理樣品的吸光度信號計(jì)算為未處理樣品的百分比。
表4. Vh突變體的聚集抗性。在加熱到80°C持續(xù)10分鐘之后，保持蛋白A結(jié)合(以％計(jì))的DP47單突變體展示在噬菌體上，之后再4°C持續(xù)10分鐘，并且被蛋白A捕獲。
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，包括在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、P _半乳糖苷酶、a-淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中 (i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及 (ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包含天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。
2.一種包括抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的分離的蛋白質(zhì)，該可變區(qū)在選自下組的位置處包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，該蛋白質(zhì)能夠以大于10 y M的親和力特異性地結(jié)合到一種抗原上，其中 (i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及 (ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包含天冬氨酸，則它在位置28與35之間的包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。
3.一種包括根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)在位置28、33和/或35處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的一種分離蛋白，該蛋白能夠特異性地結(jié)合到除了雞蛋溶菌酶、P半乳糖苷酶、a淀粉酶、B5R之外的抗原上，或其中 (i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及 (ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包含天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。
4.一種包括根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)在位置28、33和/或35處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的分離蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠以大于IOyM的親和力特異性地結(jié)合到抗原上，其中 (i)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上并且在位置32和33處包括天冬氨酸，則它在位置29與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸；以及 (ii)如果該蛋白質(zhì)結(jié)合到人VEGF上并且在位置31和33處包含天冬氨酸，則它在位置28與35之間包括至少一個(gè)另外的帶負(fù)電荷的氨基酸。
5.如權(quán)利要求2或4所述的分離蛋白質(zhì),其中該蛋白質(zhì)能夠以大于IOOnM的親和力特異性地結(jié)合到一種抗原上。
6.如權(quán)利要求I至5的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，與在根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處沒有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，它具有降低的聚集傾向。
7.如權(quán)利要求I至5的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，與在根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處沒有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，它在加熱到至少大約60°C之后具有降低的聚集傾向。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，在加熱到至少大約60°C之后它具有特異性地結(jié)合到抗原上的能力。
9.如權(quán)利要求7或8所述的蛋白質(zhì)，在加熱到至少大約80°C之后它具有降低的聚集傾向和/或特異性地結(jié)合到抗原上的能力。
10.如權(quán)利要求I至9的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，能夠結(jié)合到一種人蛋白上。
11.如權(quán)利要求I至10的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，能夠結(jié)合到與人類病癥相關(guān)聯(lián)或其成因的一種蛋白質(zhì)上。
12.如權(quán)利要求I至11的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中在位置32處的帶負(fù)電荷的氨基酸是谷氨酸。
13.如權(quán)利要求I至12的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中該帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。
14.如權(quán)利要求I至13的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在單獨(dú)地或共同地選自下組的一個(gè)或多個(gè)殘基上另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat 編號系統(tǒng)的位置 26、30、39、40、50、52、52a 以及 53。
15.如權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)，其中該帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。
16.如權(quán)利要求I至15的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31和32和33上包括帶負(fù)電荷的氨基酸。
17.如權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)，包括 (i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31處的一個(gè)天冬氨酸。
(ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸或天冬氨酸；以及 (iii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置33處的一個(gè)天冬氨酸。
18.如權(quán)利要求I至15的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32和33上包括帶負(fù)電荷的氨基酸。
19.如權(quán)利要求18所述的蛋白質(zhì)，包括 (i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸或天冬氨酸；以及 (ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置33處的一個(gè)天冬氨酸。
20.如權(quán)利要求16至19的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，在位置28和/或35處另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
21.如權(quán)利要求20所述的蛋白質(zhì)，其中在位置28和/或35處的帶負(fù)電荷的氨基酸是天冬氨酸。
22.如權(quán)利要求I至21的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，在除了根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35之外的氨基酸位置上它是人的、人源化的或去免疫化的或融合到人蛋白或其區(qū)域上。
23.一種包括能夠特異性地結(jié)合到抗原上的一個(gè)修飾的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)，其中Vh在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28、31、33和/或35上包括帶負(fù)電荷的氨基酸，并且其中Vh的未修飾形式不包括一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
24.一種包括能夠特異性地結(jié)合到抗原上的修飾的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)，其中該Vh在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置包括帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，并且其中未修飾的蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處不包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的蛋白質(zhì)，包括 (i)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置31處的一個(gè)天冬氨酸；和/或 (ii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置32處的一個(gè)谷氨酸；和/或 (iii)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置33處的一個(gè)天冬氨酸。
26.如權(quán)利要求25所述的蛋白質(zhì)，在位置28和/或35處另外地包括一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
27.如權(quán)利要求26所述的蛋白質(zhì)，其中在位置28和/或35處的帶負(fù)電荷的氨基酸是 天冬氨酸。
28.如權(quán)利要求I至27的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成 (i)一種抗體； (ii)一種單域抗體 (iii)一種包含單鏈Fv(scFv)的蛋白質(zhì) (iv)一種雙鏈抗體、一種三鏈抗體或一種四鏈抗體，以及 (V) —種包括(ii)-(iv)的任一項(xiàng)以及一種抗體的Fe結(jié)構(gòu)域或其結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求I至28的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)結(jié)合到一種化合物上。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述蛋白質(zhì)，其中該化合物是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成放射性同位素、可檢測標(biāo)記、治療化合物、膠體、毒素、核酸、肽、蛋白質(zhì)、增加該蛋白質(zhì)在受試者體內(nèi)半衰期的化合物以及它們的混合物。
31.一種組合物，該組合物包括如權(quán)利要求I至30的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
32.—種文庫，包括根據(jù)權(quán)利要求I至30的任一項(xiàng)所述的多種蛋白質(zhì)。
33.一種包括包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的文庫，其中至少30%的￥11在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包括帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35。
34.一種用于分離如權(quán)利要求I至28的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括使如權(quán)利要求32或33所述的文庫與抗原相接觸，并且分離結(jié)合到其上的蛋白質(zhì)。
35.一種用于增加包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的聚集抗性的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在位置28、31、33和/或35處的一個(gè)氨基酸來修飾該Vh。
36.一種用于增加包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的聚集抗性的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸來修飾該Vh，其中未修飾的蛋白質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)取代的位置處不包含帶負(fù)電荷的氨基酸。
37.一種用于增加包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的聚集抗性的方法，該方法包括修飾該Vh使得它在選自下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處包括帶負(fù)電荷的氨基酸，該組由以下各項(xiàng)組成根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的28和/或31和/或32和/或33和/或35，其中未修飾的蛋白質(zhì)在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處不包括兩個(gè)或更多個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。
38.一種用于增加包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的可溶蛋白的產(chǎn)生水平的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代位于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸來修飾該VH，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生水平相比較，產(chǎn)生的可溶蛋白的水平增加了。
39.一種用于增加生產(chǎn)包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的可溶蛋白水平的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)位置28和/或31和/或33和/或35處的氨基酸來修飾該Vh并且生產(chǎn)該蛋白，其中與缺少帶負(fù)電荷的氨基酸蛋白的生產(chǎn)水平相比較，所生產(chǎn)的可溶蛋白的水平有所增加。
40.一種用于增加從一種層析樹脂中回收包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的水平或用于降低從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)所需溶液的體積的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸來修飾Vh，并且使該蛋白質(zhì)與層析樹脂接觸，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，從層析樹脂回收蛋白質(zhì)的回收水平增加了或者從層析樹脂回收蛋白質(zhì)所需溶液的體積降低了。
41.一種用于增加從一種層析樹脂中回收包含抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的蛋白質(zhì)的水平或用于降低從層析樹脂中回收蛋白質(zhì)所需溶液的體積的方法，該方法包括通過用帶負(fù)電荷的氨基酸取代根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的位置28、31、33和/或35處的氨基酸來修飾VH，并且使該蛋白質(zhì)與層析樹脂接觸，其中與缺乏帶負(fù)電荷的氨基酸的蛋白質(zhì)相比較，從層析樹脂回收蛋白質(zhì)的回收水平增加了并且從層析樹脂回收蛋白質(zhì)所需溶液的體積降低了。
42.如權(quán)利要求I至30的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求31所述的組合物在醫(yī)藥中的用途。
43.一種治療或預(yù)防受試者體內(nèi)的病癥的方法，該方法包括將如權(quán)利要求I至30的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物施用到對其有需要的受試者體內(nèi)。
44.一種用于將化合物遞送到細(xì)胞中的方法，該方法包括使該細(xì)胞與如權(quán)利要求29或30所述的蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物相接觸。
45.一種用于診斷或預(yù)測受試者體內(nèi)的病癥的方法，該方法包括使來自該受試者的樣品與如權(quán)利要求I至30的任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求31所述的組合物相接觸這樣使得該蛋白質(zhì)結(jié)合到抗原上并且形成一種復(fù)合物，然后檢測該復(fù)合物，其中復(fù)合物的檢測對于受試者體內(nèi)的病癥是診斷性的或預(yù)測性的。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，包括確定該復(fù)合物的水平，其中所述復(fù)合物的增強(qiáng)或降低的水平對于受試者體內(nèi)的病癥是診斷性的或預(yù)測性的。
47.一種用于局部化或檢測受試者體內(nèi)的抗原的方法，所述方法包括 (i)將如權(quán)利要求29或30所述的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求31所述的組合物施用于受試者這樣使得該蛋白質(zhì)結(jié)合到一種抗原上，其中該蛋白偶聯(lián)到一種可檢測標(biāo)記上；以及 (ii)體內(nèi)檢測或局部化該可檢測標(biāo)記。
全文摘要
本披露提供了包含一種抗體重鏈可變區(qū)(VH)的一種分離蛋白質(zhì)，該可變區(qū)在根據(jù)Kabat的編號系統(tǒng)的位置28和/或31和/或32和/或33和/或35處包含一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，該蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合到一種抗原上。
文檔編號C40B40/10GK102686609SQ201080058339
公開日2012年9月19日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者丹尼爾·克里斯特, 基普·達(dá)吉恩 申請人:加文醫(yī)學(xué)研究所