專利名稱：一種氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于制備特異識別氨芐青霉素的高效特異結(jié)合物與研制可以快速檢測氨芐青霉素殘留的免疫速測試劑盒的用途。
背景技術(shù)：
氨節(jié)青霉素(Ampicillin, Amp),別名:氨節(jié)西林、氨節(jié)青、安比西林等，分子式為C16H19N304S，分子量為349.41。氨芐青霉素游離酸含3分子結(jié)晶水，為白色結(jié)晶性粉末，味微苦，在水中微溶，不溶于氯仿、乙醇、乙醚或脂肪油，溶解于稀酸或稀堿溶液，PKa為2.5和7.3。由于在治療家禽疾病過程中超量應(yīng)用Amp，并通過食物鏈傳遞給人，使經(jīng)常食用的人對Amp的耐藥性增加。由于Amp的抗菌作用，使腸道細菌菌群混亂，引起出血性結(jié)腸炎。Amp的使用還會引起過敏性哮喘、過敏性休克等。在馬、豬中出現(xiàn)流汗、不安、呼吸困難、站立不穩(wěn)、心跳加速等癥狀。大劑量或超大劑量使用青霉素類獸藥，可干擾凝血機制而造成出血或引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒，引起動物抽搐、大小便失禁、癱瘓等癥狀。Lipocalin是從細菌到人都含有的一組胞外親脂蛋白的總稱，作為受體較強的結(jié)合小分子具有重要的生物學(xué)功能。這類蛋白能夠結(jié)合和轉(zhuǎn)運血漿中的疏水性生物活性因子，也可用于運輸和儲藏次級代謝產(chǎn)物如脂質(zhì)、信息激素、前列腺素等。盡管Iipocalin在一級結(jié)構(gòu)上存在多樣性，但其二級結(jié)構(gòu)與四級結(jié)構(gòu)卻驚人的相似:由N末端環(huán)、α螺旋、C末端環(huán)、β片層形成的剛性結(jié)構(gòu)核心組成，其形狀象一個洞穴。而8條反相平行的β折疊片與一個α螺旋扭曲形成一個折疊桶， 稱作桶，形成了“Lipocalin支架”結(jié)構(gòu)。桶的一個末端有溶解能力并含有一個配體結(jié)合位點，開口端由連接β條帶的多個Loop組成,是整個分子比較柔韌的部分，且氨基酸成員為極性氨基酸，LoopU Loop2、Loop3、Loop4是其隨機突變的區(qū)域，β桶的反相末端由短的環(huán)封閉。側(cè)鏈充滿了桶的下層部分，形成蛋白質(zhì)的疏水核心。最近，設(shè)計Lipocalin支架作為非天然配體用于蛋白質(zhì)特異性的研究。通過設(shè)計Iipocalin的支架可模擬抗體與小分子結(jié)合,這些設(shè)計的Iipocalin突變體稱為Anticalin，具有配體特異性。據(jù)此我們可采用隨機突變抗體庫技術(shù)制備具有抗體功能的特異識別結(jié)合分子，類似于抗體與抗原之間的關(guān)系。核糖體展示技術(shù)(ribosome display, RD)是一種體外展示技術(shù),基因型(DNA序列)和表型(蛋白質(zhì))可以聯(lián)系起來，即將可擴增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的突變體蛋白質(zhì)聯(lián)系在一起。RD技術(shù)中mRNA缺乏終止密碼子并經(jīng)過適當(dāng)修飾，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'末端，形成十分穩(wěn)定的“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物，這種三元復(fù)合體形式將蛋白質(zhì)和mRNA信息連接到一起，應(yīng)用RD可進行特殊功能的肽和蛋白質(zhì)篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種潛在的檢測用氨芐青霉素特異結(jié)合物。
本發(fā)明的第二個目的提供一種氨芐青霉素特異結(jié)合物的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:本發(fā)明提供的抗氨節(jié)青霉素特異結(jié)合物是從核糖體展示anticalin模擬抗體庫中篩選獲得的并進行了可溶性功能表達。本發(fā)明提供的抗氨芐青霉素特異結(jié)合物的制備方法為:1.核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為突變庫的模板,根據(jù)bbp序列及結(jié)構(gòu)，設(shè)計隨機突變位點，，隨機核酸編碼區(qū)設(shè)計成NNK(N為G、C、A、T ;K為G和Τ)，Anticalin抗體庫構(gòu)建由PCR完成，以合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計的引物進行重疊引物延伸PCR擴增來合成Anticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核糖體展示所需要的元件，最終構(gòu)建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫,該庫轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個5’_loop和3’_loop莖環(huán)結(jié)構(gòu),一個核糖體結(jié)合位點，突變的bbp庫，C末端間隔序列等,全長約950bp。其中突變庫的模板可以是其他Iipocalin分子,優(yōu)選bbp2.氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選將構(gòu)建的核糖體展示特異結(jié)合物文庫進行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后，用Amp-BSA和Amp-PLL(多聚賴氨酸，polylysine, PLL)作為抗原固相交替篩選氨芐青霉素的特異結(jié)合物，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的特異結(jié)合物-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫。然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴增過程，經(jīng)過七輪核糖體展示篩選后，文庫中抗原陽性的抗體得以富集?？梢圆捎冒逼S青霉素-BSA進行篩選，還可以采用氨芐青霉素-PLL進行篩選，優(yōu)選交叉篩選。3.氨芐青霉素特異結(jié)合物的可溶性功能表達將七輪篩選后對模擬抗體文庫進行序列鑒定，隨機挑選20個克隆子中有5株序列相同，將該基因與pTIG-TRX連接成表達載體，在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產(chǎn)物存在于破碎菌體后的上清液中。4.氨芐青霉素特異結(jié)合物的純化與鑒定利用金屬螯合親和層析柱對表達的特異結(jié)合物進行了純化，使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，競爭ELISA分析檢測特異結(jié)合物的競爭結(jié)合活性，并計算其檢測限與檢測范圍。本發(fā)明還可以提供一種測定環(huán)境和食品中氨芐青霉素殘留的檢測試劑盒中的最關(guān)鍵檢測試劑——特異結(jié)合物，盡管amp殘留嚴(yán)重威脅著人體健康，但它在畜牧業(yè)上的應(yīng)用能帶來較高的經(jīng)濟價值，這使得在社會上仍有非法濫用現(xiàn)象。本發(fā)明制備的氨芐青霉素特異結(jié)合物可以部分取代測定食品和環(huán)境樣品中氨芐青霉素殘留測定所需的特異抗體。本發(fā)明所制備的抗氨芐青霉素特異結(jié)合物的優(yōu)勢在于:(I)利用amp-BSA和氨芐青霉素-PLL作為抗原固相交替篩選，可以克服BSA 造成的干擾，從而獲得amp高特異性結(jié)合物；(2)所獲得的特異結(jié)合物序列清楚，便于基因工程操作，易于在大腸桿菌中大量功能表達。


圖1核糖體展示anticalin模擬抗體庫框架示意圖.
圖2重疊引物延伸PCR構(gòu)建核糖體展示anticalin模擬抗體庫的過程示意3核糖體展示anticalin庫瓊脂糖凝膠電泳圖,M為DNA marker, I為核糖體展不 anticalin 庫 DNA圖4antical in-amp 誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE 圖O為空質(zhì)粒對照，1、2、3為誘導(dǎo)后的全菌產(chǎn)物，4為誘導(dǎo)后破碎的上清，M為蛋白Marker，自上而下分子量依次為(單位 kD):170，130，95，72，56，43，34，26，17.
圖5直接ELISA分析anticalin-amp的結(jié)合活性.
圖6間接競爭ELISA分析anticalin-amp的競爭結(jié)合活性，線性回歸方程I =37.2771ogC+120.39，R2 = 0.9847，線性范圍為 0.004 0.9 μ g/mL, IC50 = 0.056 μ g/mL,IC20 = 0.007 μ g/mL。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可從常規(guī)試劑公司購買得到。實施例1核糖體展示anticalin模擬抗體的構(gòu)建一.引物合成根據(jù)bbp序列及構(gòu)建Anticalin抗體庫需要改變的突變位點來設(shè)計合成引物，隨機核酸編碼區(qū)設(shè)計成NNK (N為G、C、A、T ;K為G和T)，同時設(shè)計與核糖體展示元件相連的引物，主要引物如下表所示。表I寡核苷酸引物
權(quán)利要求
1.一種氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選方法，主要由以下步驟組成: (1)核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建 選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為突變庫的模板,根據(jù)bbp序列及結(jié)構(gòu)，設(shè)計隨機突變位點，，隨機核酸編碼區(qū)設(shè)計成NNK(N為G、C、A、T ;K為G和Τ)，Acticalin抗體庫構(gòu)建由PCR完成，以合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計的引物進行重疊引物延伸PCR擴增來合成Acticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核糖體展示所需要的元件，最終構(gòu)建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個5’ -loop和3’ -loop莖環(huán)結(jié)構(gòu),一個核糖體結(jié)合位點，突變的bbp庫，C末端間隔序列等,全長約950bp ； (2)氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選 將構(gòu)建的核糖體展示單鏈抗體文庫進行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后，用Amp-BSA和Amp-PLL (多聚賴氨酸，polylysine, PLL)作為抗原固相交替篩選氨芐青霉素的特異結(jié)合物，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的特異結(jié)合物-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫；然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴增過程，得到反復(fù)篩選幾輪的模擬抗體DNA文庫；經(jīng)過七輪核糖體展示篩選后，抗體文庫中抗原陽性的抗體得以富集； (3)antical in-amp的可溶性功能表達 將七輪篩選后對模擬抗體文庫進行序列鑒定，隨機挑選20個克隆子中有5株序列相同，將該基因與pTIG-TRX連 接成表達載體，在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達，經(jīng)SDS-PAGE和WesternBlot鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產(chǎn)物存在于破碎菌體后的上清液中； (4)ant ical in-amp的純化與鑒定 利用Ant1-His tag親和層析柱對表達的anticalin_amp進行了純化,使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，直接ELISA分析其結(jié)合活性，間接競爭ELISA分析其競爭結(jié)合活性。
2.權(quán)利要求1所述隨機突變庫的模板可以是其他Iipocalin分子,優(yōu)選bbp。
3.權(quán)利要求1所述篩選方法中的包被原可以選用氨芐青霉素-BSA，還可以選用氨芐青霉素-PLL進行篩選，優(yōu)選交叉篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及氨芐青霉素特異結(jié)合物的篩選方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，該特異結(jié)合物是由核糖體展示anticalin庫中篩選出來的并進行了可溶性表達。本發(fā)明還涉及應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選氨芐青霉素特異結(jié)合物的方法。本發(fā)明篩選出的氨芐青霉素特異結(jié)合物可以應(yīng)用于青霉素非法添加及濫用檢測與研制快速檢測青霉素殘留的免疫速測試劑盒的用途，為以后該物質(zhì)的檢測與研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C40B50/06GK103172694SQ20111044061
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者寧保安, 白家磊, 彭媛, 劉建青, 孫亞楠, 柳明, 孫思明, 高志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所