專利名稱：一種通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法。
背景技術(shù)：
過去幾年間，第二代高通量測序技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展。其中，基于連接酶來實現(xiàn)測序的方法具有準(zhǔn)確率高的優(yōu)點，但由于其單一讀長短，限制了這類測序方法的應(yīng)用。針對這種情況，近些年出現(xiàn)了通過構(gòu)建具有特殊結(jié)構(gòu)的測序文庫來提高測序讀長的方法，即在待測片段中插入一個或多個接頭序列，從而使同一測序文庫分子具有多個連接測序起始的位點，然后分別在這些不同的起始位點上進行連接測序，從而增加測序讀長。這種方法的核心在于，如何實現(xiàn)在待測片段中定向插入一個或多個接頭序列。 現(xiàn)有技術(shù)中是通過多次環(huán)化、酶切來實現(xiàn)的，其大致實現(xiàn)過程如下1)將待測片段與第一接頭連接，所述第一接頭包含限制酶的結(jié)合位點；2)環(huán)化來自步驟I)的產(chǎn)物以產(chǎn)生第一環(huán)形多核苷酸；3)用限制酶切割第一環(huán)形多核苷酸；4)連接第二接頭，所述第二接頭包含限制酶的結(jié)合位點；5)環(huán)化來自步驟4)的產(chǎn)物以產(chǎn)生第二環(huán)形多核苷酸；重復(fù)步驟3)到5)以在待測片段中插入多個接頭。但是該方法對待測片段的大小均有一定的要求，如果待測片段過短，將降低環(huán)化的效率，甚至不能環(huán)化，或者環(huán)化后得到的是非目標(biāo)產(chǎn)物，從而使得測序文庫構(gòu)建失敗。即，現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建具有特殊結(jié)構(gòu)的測序文庫的方法，要求用于構(gòu)建測序文庫的原材料(源核酸)大于150bp，而且當(dāng)建庫方法中還包括片段化步驟時，原材料的大小還要進一步加大，一般要求原材料與片段化產(chǎn)物的大小比在10 I以上，才能保證經(jīng)片段化步驟后得到的片段化產(chǎn)物的隨機性，進而保證后續(xù)測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。由上可知，現(xiàn)有技術(shù)在構(gòu)建上述具有特殊結(jié)構(gòu)的測序文庫時，很大程度上局限于原材料的大小，無法對小片段核酸分子通過環(huán)化方式完成文庫構(gòu)建，使得現(xiàn)有技術(shù)的實際應(yīng)用范圍較窄。因此需要一種新的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，能夠突破對原材料大小的局限性，擴大測序文庫構(gòu)建方法的適用范圍，并能進一步保證測序文庫構(gòu)建過程中環(huán)化的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)在構(gòu)建測序文庫時對原材料的大小具有較強的局限性，無法采用環(huán)化方式對小片段核酸分子進行測序文庫構(gòu)建的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，包括下述步驟A.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環(huán)化，得到第一環(huán)形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點；
B.基于步驟A所述酶切識別位點，利用內(nèi)切酶對第一環(huán)形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。其中，所述連接組件與核酸片段的大小比值大于等于4，即連接組件的大小至少是核酸片段的4倍。其中，所述連接組件的大小大于等于140bp ;更優(yōu)選的，所述連接組件的大小大于等于400bp。上述任一方案中，所述連接組件包括接頭和橋序列，所述接頭和/或橋序列含有Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點。其中，所述步驟A包括以下步驟Al.將核酸片段與接頭連接，得到含接頭的核酸片段；A2.將含接頭的核酸片段與橋序列連接并環(huán)化，得到第一環(huán)行分子。進一步的，所述接頭包括第一接頭和第二接頭，所述第一接頭含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟Al包括以下步驟All.將核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段；A12.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切含第一接頭的核酸片段，得到含第一接頭的酶切產(chǎn)物；A13.將含第一接頭的酶切產(chǎn)物與第二接頭連接，得到含接頭的核酸片段。更進一步的，所述步驟All包括以下步驟A111.對核酸片段進行處理，得到處理過的核酸片段；所述處理方法包括去磷酸化、末端補平、加A尾、加polyA尾中的至少一種；A112.將處理過的核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段。其中，所述步驟A2包括以下步驟A21.利用特異性切割劑分別對含接頭的核酸片段和橋序列進行切割，得到相對應(yīng)的切割產(chǎn)物；A22.利用連接酶，將相對應(yīng)的切割產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到第一環(huán)形分子；所述接頭和橋序列均含有用于切割的識別位點；所述特異性切割劑能夠特異性的識別接頭和橋序列的用于切割的識別位點，并對接頭、橋序列進行切割。上述任一方案中，所述接頭包括平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭和含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭中的至少一種。上述任一方案中，所述連接組件含有至少2個IIs限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟B具體為利用連接組件含有的IIs限制性內(nèi)切酶識別位點，通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對第一環(huán)行分子中的核酸片段中對應(yīng)的兩個酶切位點進行切割，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。上述任一方案中，在步驟B之后還包括以下步驟 C.更換內(nèi)切酶和橋聯(lián)組件，對步驟B得到的橋聯(lián)環(huán)化物進行酶切、連接和環(huán)化，以在核酸片段中插入至少兩個橋聯(lián)組件，得到環(huán)形測序文庫。進一步的，所述橋聯(lián)組件含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點。
進一步的，所述步驟B的橋聯(lián)組件為第一橋聯(lián)組件，其含有兩個IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟C包括以下步驟Cl.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切橋聯(lián)環(huán)化物中的核酸片段，該IIs型限制性內(nèi)切酶能特異性的識別第一橋聯(lián)組件中的一個Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點；C2.將第二橋聯(lián)組件與步驟Cl的產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到第二環(huán)形分子；C3.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第二環(huán)形分子中的核酸片段，該IIs型限制性內(nèi)切酶能特異性的識別第一橋聯(lián)組件中的另一個Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點；C4.將第三橋聯(lián)組件與步驟C3的產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到環(huán)形測序文庫。上述任一方案中，所述步驟C之后還包括以下步驟D.利用與環(huán)形測序文庫中的連接組件和/或橋聯(lián)組件互補的引物，對環(huán)形測序文庫進行擴增，得到線形測序文庫。上述任一方案中，所述步驟A之前包括以下步驟A’ .片段化源核酸，得到核酸片段。由上可知，本發(fā)明通過連接組件與核酸片段的連接，突破了構(gòu)建測序文庫時對原材料大小的限制，擴大了構(gòu)建測序文庫方法的適用范圍，并能進一步提高測序文庫構(gòu)建過程中環(huán)化的效率。


圖I是本發(fā)明一種實施例中的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法流程圖；圖2是本發(fā)明一個實施例中各實驗組的連接反應(yīng)產(chǎn)物和連接反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)PS-DNase消化處理后回收的產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明四個實施例中核酸片段與連接組件的連接環(huán)化示意圖；圖4是本發(fā)明一個實施例中核酸片段與連接組件連接的方法流程圖；圖5是本發(fā)明一個實施例中硫代磷酸脂鍵的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本發(fā)明一個實施例中的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法示意圖；圖7是本發(fā)明另一個實施例中的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法示意圖；圖8是本發(fā)明另一個實施例中的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法示意圖；圖9是本發(fā)明另一個實施例中的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法示意圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。圖I示出了本發(fā)明的構(gòu)建測序文庫的方法的一種實施方案，包括下述步驟SI.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環(huán)化，得到第一環(huán)形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點；S2.基于步驟SI所述酶切識別位點，利用內(nèi)切酶對第一環(huán)形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。需要說明的是在步驟SI中，所述核酸片段可以是基因組中的任意片段，包括但不限于基因、基因的一部分、調(diào)控序列、內(nèi)含子或內(nèi)含子的一部分；也可以是基因組DNA、cDNA、RNA (包括但不限于mRNA和rRNA)或DNA與RNA的雜合分子；還可以是基因組DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)上特定區(qū)域的擴增片段。所述核酸片段可以是任意長度，包括但不限于 IObp 1000bp、20bp 900bp、30bp 800bp、30bp 700bp、30bp 600bp、30bp 500bp、30bp 400bp、30bp 300bp、30bp 250bp、30bp 200bp、10bp 150bp、10bp 100bp、20bp 130bp、30bp 100bp、40bp 150bp、50bp 200bp、60bp 300bp、70bp 250bp ;可以是單鏈核酸分子，也可以是雙鏈核酸分子。優(yōu)選的，所述核酸片段為雙鏈核酸分子，大小在25bp IOObp之間。在步驟SI中，所述連接組件為序列信息已知的核酸分子，用于與核酸片段連接，使連接后得到的產(chǎn)物能夠以不增加大小的形式進行環(huán)化，其含有至少一個酶切識別位點。所述以不增加大小的形式環(huán)化，是指環(huán)化前的底物無需借助與其他核酸分子的連 接來實現(xiàn)成環(huán)，即環(huán)化后得到的產(chǎn)物的大小小于等于環(huán)化前的底物。包括但不限于以下幾種具體形式1)環(huán)化前的底物直接自身成環(huán)；2)環(huán)化前的底物的一端或兩端，經(jīng)酶切或特異性切割劑切割后，兩端形成互補配合的末端，進而成環(huán)。所述酶切識別位點，用于在步驟S2中對核酸片段進行酶切。進一步的，所述連接組件上的酶切識別位點為Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點；所述IIs型限制性內(nèi)切酶為切割位點在識別位點之外的限制性內(nèi)切酶，包括但不限于Acu I, Alw I.Bbs I、BbV I, Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I.Hph I、HpyAV、Mbo II.Mly I.Mme I.Mnl I、NmeAIII、Ple I.Sap I.SfaN I 和 TspDTI，優(yōu)選為 Acu I. Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。在步驟SI中，所述第一環(huán)行分子為核酸片段與連接組件連接并以不增加大小的形式環(huán)化后得到的環(huán)形分子。在步驟S2中，基于連接組件含有的酶切識別位點，能利用相應(yīng)的內(nèi)切酶對第一環(huán)形分子中的核酸片段進行酶切，從而將核酸片段切成兩段，并通過已知序列(連接組件)連接。在步驟S2中，所述橋聯(lián)組件為序列信息已知的核酸分子，用于與步驟S2中所述的酶切產(chǎn)物連接。在步驟S2中，所述橋聯(lián)環(huán)化物為步驟S2中的酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化后得到的，在核酸片段中插入橋聯(lián)組件的環(huán)形分子，其該環(huán)形分子可作為測序反應(yīng)的測序文庫。本方案通過連接組件與核酸片段的連接，保證了連接產(chǎn)物能以不增加連接產(chǎn)物大小的形式進行環(huán)化，并利用連接組件上的酶切識別位點，對第一環(huán)行分子中的核酸片段進行酶切，進而向核酸片段中定向插入已知序列(包括但不限于橋聯(lián)組件)，從而完成測序文庫的構(gòu)建。本方案突破了構(gòu)建測序文庫時對原材料大小的限制，擴大了構(gòu)建測序文庫方法的適用范圍，適用于任意長度的核酸片段，尤其適用于長度較短的核酸片段，避免了核酸片段因為片段過小而不能成環(huán)或成環(huán)效率低進而導(dǎo)致不能進行文庫構(gòu)建的現(xiàn)象。本方案可根據(jù)核酸片段的具體情況，采用不同的連接組件和具體的環(huán)化方式，具體將在后續(xù)的實施例中進一步闡述說明。
針對核酸片段的大小，連接組件可進行相應(yīng)的變化，以保證它們的連接產(chǎn)物能夠以不增加連接產(chǎn)物大小的形式進行環(huán)化。例如，當(dāng)核酸片段為15bp的雙鏈核酸分子時，連接組件可設(shè)計成大于等于135bp的核酸分子；當(dāng)核酸片段為30bp的單鏈核酸分子時，連接組件可設(shè)計成大于等于120bp的核酸分子；當(dāng)核酸片段為50bp的雙鏈核酸分子時，連接組件可設(shè)計成大于等于IOObp的核酸分子；當(dāng)核酸片段為70bp的雙鏈核酸分子時，連接組件可設(shè)計成大于等于80bp的核酸分子；當(dāng)核酸片段為IOObp的雙鏈核酸分子時，連接組件可 設(shè)計成大于等于50bp的核酸分子。要想將線形核酸分子環(huán)化成環(huán)形核酸分子，要求線形核酸分子的大小在IOObp以 上，但是當(dāng)線形核酸分子的大小在IOObp 150bp之間時，成環(huán)的效率極低，且在環(huán)化過程中所需的條件很苛刻，例如所需的連接酶的濃度較高、或者需其它的催化劑等，不適于工業(yè)應(yīng)用；而當(dāng)線形核酸分子的大小在150bp 400bp之間，線形核酸分子成環(huán)的效率仍然較低，且成環(huán)的效率隨著線形核酸分子的大小的增加而不斷增高；當(dāng)線形核酸分子的大小大于等于400bp時，不同大小的線形核酸分子的成環(huán)效率差異不大。其中，在保證連接組件與核酸片段能夠在常規(guī)條件下實現(xiàn)環(huán)化的前提下，即適于工業(yè)應(yīng)用的前提下，所述連接組件與核酸片段的大小比值大于等于4。為了使連接組件能夠適用于各種大小的核酸片段，優(yōu)選的，連接組件的大小大于等于140bp ;這個實驗方案中的連接組件能夠保證任意大小核酸片段均能夠在與之連接后，以不增加連接產(chǎn)物大小的形式進行環(huán)化。為了，更進一步的提高連接組件與核酸片段連接后得到的連接產(chǎn)物的成環(huán)效率，更優(yōu)選的，連接組件的大小大于等于400bp。本發(fā)明設(shè)計了一具體的對比實驗以支持上述結(jié)論。試劑核酸片段，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2按I : I的摩爾比退火形成；連接組件1，由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4按I : I的摩爾比退火形成；連接組件2，由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6按I : I的摩爾比退火形成；連接組件3，由SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8按I : I的摩爾比退火形成；連接組件4，由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO : 10按I : I的摩爾比退火形成；連接組件5，由SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO : 12按I : I的摩爾比退火形成；連接組件6，由SEQ ID NO 13和SEQ ID NO : 14按I : I的摩爾比退火形成；T4DNA Ligase(Fermentas, EL0011,5U/U L)；Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(Epicentre, E3101K)；E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit (OMEGA BIO-TEK, D6492-01)。實驗方案本實驗共分8組，如下表所示。表I各實驗組的連接反應(yīng)組分
實驗組連接反應(yīng)組分實驗組連接反應(yīng)組分
I核酸片段5核酸片段+連接組件4~
權(quán)利要求
1.一種通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟 A.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環(huán)化，得到第一環(huán)形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點； B.基于步驟A所述酶切識別位點，利用內(nèi)切酶對第一環(huán)形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件與核酸片段的大小比值大于等于4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件的大小大于等于140bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件的大小大于等于400bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件包括接頭和橋序列，所述接頭和/或橋序列含有Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟 Al.將核酸片段與接頭連接，得到含接頭的核酸片段； A2.將含接頭的核酸片段與橋序列連接并環(huán)化，得到第一環(huán)行分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述接頭包括第一接頭和第二接頭，所述第一接頭含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟Al包括以下步驟 All.將核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段； A12.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切含第一接頭的核酸片段，得到含第一接頭的酶切產(chǎn)物； A13.將含第一接頭的酶切產(chǎn)物與第二接頭連接，得到含接頭的核酸片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟All包括以下步驟 A111.對核酸片段進行處理，得到處理過的核酸片段；所述處理方法包括去磷酸化、末端補平、加A尾、加poly A尾中的至少一種； A112.將處理過的核酸片段與第一接頭連接，得到含第一接頭的核酸片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A2包括以下步驟 A21.利用特異性切割劑分別對含接頭的核酸片段和橋序列進行切割，得到相對應(yīng)的切割產(chǎn)物； A22.利用連接酶，將相對應(yīng)的切割產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到第一環(huán)形分子； 所述接頭和橋序列均含有用于切割的識別位點； 所述特異性切割劑能夠特異性的識別接頭和橋序列的用于切割的識別位點，并對接頭、橋序列進行切割。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述連接組件含有至少2個IIs限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟B具體為利用連接組件含有的IIs限制性內(nèi)切酶識別位點，通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對第一環(huán)行分子中的核酸片段中對應(yīng)的兩個酶切位點進行切割，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，在步驟B之后還包括以下步驟 C.更換內(nèi)切酶和橋聯(lián)組件，對步驟B得到的橋聯(lián)環(huán)化物進行酶切、連接和環(huán)化，以在核酸片段中插入至少二個橋聯(lián)組件，得到環(huán)形測序文庫。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述橋聯(lián)組件含有IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟B的橋聯(lián)組件為第一橋聯(lián)組件，其含有兩個IIs型限制性內(nèi)切酶識別位點，所述步驟C包括以下步驟 Cl.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切橋聯(lián)環(huán)化物中的核酸片段，該IIs型限制性內(nèi)切酶能特異性的識別第一橋聯(lián)組件中的一個Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點； C2.將第二橋聯(lián)組件與步驟Cl的產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到第二環(huán)形分子； C3.利用IIs型限制性內(nèi)切酶酶切第二環(huán)形分子中的核酸片段，該IIs型限制性內(nèi)切酶能特異性的識別第一橋聯(lián)組件中的另一個Hs型限制性內(nèi)切酶識別位點； C4.將第三橋聯(lián)組件與步驟C3的產(chǎn)物連接并環(huán)化，得到環(huán)形測序文庫。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟C之后還包括以下步驟 D.利用與環(huán)形測序文庫中的連接組件和/或橋聯(lián)組件互補的引物，對環(huán)形測序文庫進行擴增，得到線形測序文庫。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述核酸片段大小為25bp lOObp。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，所述步驟A之前包括以下步驟 A’ .片段化源核酸，得到核酸片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供了一種通過環(huán)化方式構(gòu)建測序文庫的方法。所述方法包括以下步驟A.將核酸片段與連接組件連接，并以不增加其大小的形式進行環(huán)化，得到第一環(huán)形分子；所述連接組件含有至少一個酶切識別位點；B.基于步驟A所述酶切識別位點，利用內(nèi)切酶對第一環(huán)形分子中的核酸片段進行酶切，并將酶切產(chǎn)物與橋聯(lián)組件連接并環(huán)化，得到橋聯(lián)環(huán)化物。本發(fā)明的方法適用范圍廣，能夠在小片段核酸分子中定向插入已知序列，從而構(gòu)建測序文庫，并能進一步提高建庫過程中環(huán)化的效率。
文檔編號C40B40/06GK102628079SQ20121009350
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼