專利名稱：一種目標(biāo)基因捕獲方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于文庫的目標(biāo)基因捕獲方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BAC、PAC、YAC等克隆載體的構(gòu)建為基因克隆提供了有力工具。在已知基因部分序列信息的情況下，為了獲得基因全長序列，現(xiàn)有的技術(shù)中，主要有兩種方法。第一種可行的方法是從BAC、PAC或YAC文庫中利用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法擴增帶有目標(biāo)片段的克??；第二種方法是利用特異序列重組BAC、PAC或YAC文庫，獲得帶有目標(biāo)片段的陽性克隆。可以看到，兩種方法都需要構(gòu)建BAC、PAC或YAC基因組文庫，但BAC、PAC、YAC文庫構(gòu)建及重組操作復(fù)雜、保存不穩(wěn)、價格昂貴、周期長、步驟繁瑣，并且第一種方法PCR擴增假陽性率高、第二種方法重組效率極低，大大限制了對中小片段基·因功能的研究。Red重組技術(shù)可簡單的實現(xiàn)對基因進行敲除、敲入、點突變等操作，還可在靶基因的上下游加入適當(dāng)?shù)膯幼雍徒K止子序列以調(diào)節(jié)基因的表達。廣泛應(yīng)用于構(gòu)建具有特定突變的工程菌，改變生物代謝途徑，阻斷副反應(yīng)的進行，防止副產(chǎn)物或有毒產(chǎn)物形成，促進目的產(chǎn)物積累等方面。Murphy (1998)較早利用質(zhì)粒pTP223表達Red重組酶，使線性DNA片段與染色體發(fā)生重組，構(gòu)建的大腸桿囷基因缺陷重組效率大大提聞；Zhang等(2000)利用Red重組技術(shù)將一段兩端與靶基因兩翼同源的序列(各有42bp)、中間為藥物抗性基因的線性DNA片段和含有靶基因的載體同時電轉(zhuǎn)入菌株細胞，抗性基因成功地將靶基因置換下來；，Yu等(2000)利用這種Red重組系統(tǒng)將大腸桿菌染色體和質(zhì)粒上多個靶基因敲除。Ellis(2001)等在將70bp的單鏈DNA與染色體DNA進行重組，修復(fù)galKtyrl45am琥珀突變和刪除313kb長的基因片段獲得了同樣高的重組效率。Datsenko等(2000)在Red重組酶的作用下，PCR片段借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對應(yīng)區(qū)域發(fā)生重組，染色體上的靶基因被抗性基因所替代。Marta Nedelkova等(2011)構(gòu)建了 GB05RedTrfA+pSC101 β菌株，使大片段的同源重組的效率獲得提高。但是上述重組技術(shù)的改進仍克服不了基于大片段基因組文庫的目標(biāo)基因捕獲技術(shù)操作復(fù)雜、價格昂貴、周期長的缺點，不便于研究中小片段基因功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種目標(biāo)基因捕獲方法極其應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一種目標(biāo)基因捕獲方法，包括將打斷成2_4k的基因組DNA片段與載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101 β感受態(tài)細胞，培養(yǎng)獲得重組載體細菌文庫；制備帶篩選標(biāo)記的待捕獲目標(biāo)基因的雙鏈DNA重組片段；將重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，篩選陽性克隆獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。具體的，包括下列步驟I)獲取基因組DNA，將基因組DNA打斷成片段大小主要為2_4k的片段，使用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為2-4k的片段，對回收片段進行末端補平；2)將打斷并補平末端的片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；3)將步驟2)獲得的重組載體電轉(zhuǎn)入用GB05RedTrfA+pSC101 β做的感受態(tài)細胞，并在合適的條件下在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)感受態(tài)細胞直至長出大量含有重組載體的克隆，得到重組載體細菌文庫； 4)制備重組片段制備兩翼為待捕獲目標(biāo)基因的同源臂，中間插入篩選標(biāo)記的雙鏈DNA重組片段；5)重組將步驟4)制備的重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，利用所述雙鏈DNA重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。其中，步驟I)中所述目標(biāo)基因捕獲是指在已知某一基因部分序列(基因序列片段)的情況下，通過實驗方法從相應(yīng)物種的基因組DNA中獲得該基因的全部序列。提取基因組DNA的方法可采用常規(guī)手段，如CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、濃鹽法和煮沸法等。由于本發(fā)明的方法對于高等動植物復(fù)雜基因的研究特別適用，因此，所述基因組DNA優(yōu)選來自高等動植物。較佳的，使用DNA打斷儀將基因組DNA打斷成大小為24Κ的片段(可根據(jù)需要調(diào)整打斷儀的參數(shù))。本發(fā)明實施例采用hydroshear打斷儀器對基因組DNA打斷。為了后續(xù)實驗的穩(wěn)定性，需回收打斷后大小為2-4k的片段，只需采用瓊脂糖凝膠即可回收打斷后大小為24K的片段。利用瓊脂糖凝膠電泳挖膠回收的方法純化2-4K的片段，確保片段大小的準確性。打斷片段補平的方法可采用現(xiàn)有技術(shù)，例如采用DNA聚合酶補平。步驟2)中將目標(biāo)片段與含有氨芐抗性的載體連接的方法可采用常規(guī)。所述含有氨芐抗性的載體可選自PUC19載體、PUC18載體、pMD18_T載體等常用含有氨芐抗性的載體。步驟3)中GB05RedTrfA為改造后的GB05生物工程大腸桿菌；pSC101 β為含有能編碼RedP 蛋白基因的質(zhì)粒；68051^(11'忖4+口5(1010 為含有 pSClOiP 質(zhì)粒的 GB05RedTrfA菌株。三者的構(gòu)建方法參見文獻 “Nedelkova, Μ.，M. Maresca, et al. (2011). " Targetedisolation ofcloned genomic regions by recombineering for haplotype phasing andisogenic targeting. " Nucleic Acids Res 39(20) :el37.，，。其中含有 pSClOiP 質(zhì)粒的 GB05RedTrfA 細胞，即 GB05RedTrfA+pSC101 β 可經(jīng)商購獲得(例如The BiotechnologyCenter (BIOTEC) of theTechnische Universitat Dresden)。由于pSClOl β為溫感型載體，故培養(yǎng)溫度約30°C為佳。所述固體培養(yǎng)基可選用LB固體培養(yǎng)基。
可根據(jù)所選載體上的區(qū)別于感受態(tài)細胞中的篩選標(biāo)記選擇合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞以獲得含有重組載體的克隆。例如，當(dāng)步驟2)選擇PUC19載體時，可采用加入X-Gal和IPIG固體培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞。本發(fā)明構(gòu)建文庫過程中，無需電脈沖電泳，對基因組DNA的質(zhì)量要求也不高，因此易于操作。步驟4)中需針對待捕獲目標(biāo)基因的已知DNA片段設(shè)計同源臂引物，設(shè)計同源臂的設(shè)計原則為，同源臂長度為40-60bp。同源臂之間插入篩選標(biāo)記。所述篩選標(biāo)記與步驟2)所采用的含有氨芐抗性的載體(Amp)、及步驟3)所選用的感受態(tài)細胞GBO5RedTrfA+pSClO10 (CM、tet)中的抗性標(biāo)記進行區(qū)分。例如為卡那霉素抗性篩選標(biāo)記。一種簡單制備兩翼為同源臂中間插入篩選標(biāo)記的雙鏈DNA重組片段的方法為以 含有所述篩選標(biāo)記的現(xiàn)有載體為模板，采用所設(shè)計的同源臂引物經(jīng)PCR擴增獲得。例如利用同源臂引物設(shè)計，從PRI909載體(寶生生物工程有限公司)或PET32載體卡那霉素抗性區(qū)域兩側(cè)進行PCR擴增，獲得含有卡那霉素抗性的雙鏈DNA重組片段。步驟5)中重組具體步驟可為利用含有氨芐抗性的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟3)獲得的重組載體細菌文庫中的陽性克隆，然后以鼠李糖誘導(dǎo)步驟4)制備的重組片段與所述陽性克隆重組，最后用重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。本發(fā)明第二方面，提供了一種可用于目標(biāo)基因捕獲的基因組DNA文庫，采用包括下列步驟的方法制得將打斷成2-4k的基因組DNA片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101 β感受態(tài)細胞，培養(yǎng)獲得重組載體細菌文庫。進一步的，所述基因組DNA文庫采用前述目標(biāo)基因捕獲方法中的步驟1)-3)制得。本發(fā)明第三方面，提供了上述目標(biāo)基因捕獲方法及文庫在基因研究領(lǐng)域的用途。上述目標(biāo)基因來自高等動植物。本發(fā)明的方法，尤其適用于大小為4kb以下的基因的功能研究。本發(fā)明的方法，可用于高等動植物復(fù)雜基因上下游調(diào)控序列分析、基因打靶技術(shù)及基因克隆技術(shù)。本發(fā)明的方法相比前人所用的BAC、YAC等方法，操作更簡單、周期短、費用低、重組效率高，是一種快速有效的對感興趣基因組進行重組捕獲的方法，尤其適用于某些較難克隆的復(fù)雜基因組，條件一般的實驗室也很容易實施，可對后續(xù)的信息分析帶來方便。


圖I重組流程A :片段化的基因組DNA ；B :含有基因組插入片段的載體；C :含有基因組插入片段的細菌克??；D :抗性篩選含有插入片段的克?。籈 鼠李糖誘導(dǎo)PCR產(chǎn)物與目標(biāo)克隆的重組；
F :抗性篩選含有目標(biāo)片段的克隆。圖2:DNA檢測結(jié)果圖3 Hydroshear打斷后電泳檢測圖4:PUC19 質(zhì)粒5 :菌落生長情況圖6:測序結(jié)果比較圖a:理論序列b:實測序列
c: 一致性比較
具體實施例方式為了測試基于小片段基因組DNA文庫重組的目標(biāo)區(qū)域捕獲效率，本發(fā)明選取了大豆GmcpSecA基因,測試了從大豆基因組中捕獲GmcpSecA全長基因的實驗效果。具體地，包括如下步驟I.用hydroshear打斷儀對基因組進行打斷，其片段大小要控制適當(dāng)，并使打斷后的片段更集中，經(jīng)測試，本方法打斷后DNA片段集中在2-4K為佳；2.打斷后的片段和PUC19載體進行連接獲得重組載體；3.重組載體電轉(zhuǎn)入用GB05RedTrfA+pSC101 β做的感受態(tài)細胞，因pSClOl β為溫感型載體故需要30°C培養(yǎng)，直至長大量的克隆；4.針對待捕獲基因的已知DNA片段進行同源臂引物設(shè)計，從pRI909載體(寶生生物工程有限公司)卡那霉素抗性區(qū)域兩側(cè)進行PCR擴增，獲得含有卡那霉素抗性的雙鏈DNA片段；5.用培養(yǎng)基洗脫步驟3中的大量克隆，以鼠李糖為誘導(dǎo)；利用含有氨芐抗性的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟3)中獲得的PUC19陽性重組載體細菌克隆，然后以鼠李糖誘導(dǎo)步驟4的雙鏈DNA片段與PUC19陽性克隆重組，最后卡那霉素篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。以篩選標(biāo)記進行陽性篩選并計算重組率；結(jié)果顯示，本發(fā)明的方法確實能夠較大程度地使得基因重組，并且重組效率要高于前人所用的BAC、YAC方法。6. 3730 測序。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式
加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明。實施例I測試大豆中GmcpSecA基因的捕獲效果材料大豆基因組DNA，用CTAB法提取DNA。步驟
一)大豆I)獲取基因組DNA，將基因組DNA打斷至大小為2-4K，瓊脂糖凝膠電泳回收2-4Κ的基因組片段，產(chǎn)物純化后進行末端補平。用CTAB法提取大豆基因組DNA。使用Quant-iT系列(Invitrogen公司)雙鏈DNA濃度檢測試劑盒檢測DNA濃度，之后取IOOng經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量。結(jié)果如圖2，為主帶清晰、無降解或少量降解的DNA，符合后續(xù)步驟要求。使用Hydroshear儀器打斷，其打斷參數(shù)見(表I)，其中DNA量為2 μ g。打斷后的片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測DNA打斷效果，打斷后DNA片段主要分布在2-4K (圖3)，符合重組的要求。
表I、Hydroshear儀器打斷參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種目標(biāo)基因捕獲方法，包括將打斷成2-4k的基因組DNA片段與載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101 β感受態(tài)細胞，培養(yǎng)獲得重組載體細菌文庫；制備帶篩選標(biāo)記的待捕獲目標(biāo)基因的雙鏈DNA重組片段；將重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，篩選陽性克隆獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。
2.如權(quán)利要求I所述目標(biāo)基因捕獲方法，具體包括下列步驟 O獲取基因組DNA，將基因組DNA打斷成片段大小主要為2-4k的片段，使用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為2-4k的片段，對回收片段進行末端補平； 2)將打斷并補平末端的片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體； 3)將步驟2)獲得的重組載體電轉(zhuǎn)入用GB05RedTrfA+pSC101β做的感受態(tài)細胞，并在合適的條件下在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)感受態(tài)細胞直至長出大量含有重組載體的克隆，得到重組載體細菌文庫； 4)制備兩翼為待捕獲目標(biāo)基因的同源臂，中間插入篩選標(biāo)記的雙鏈DNA重組片段； 5)將步驟4)制備的重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，利用所述雙鏈DNA重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。
3.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟I)中，采用CTAB法、SDS法、苯酚抽提法、濃鹽法或煮沸法獲取基因組DNA。
4.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟I)中，使用DNA打斷儀將基因組DNA打斷成大小為2-4Κ的片段。
5.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟I)中，所述含有氨芐抗性的載體選自PUC19載體、PUC18載體或PMD18-T載體。
6.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟3)中，培養(yǎng)溫度約30°C。
7.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟4)中，所述同源臂的長度為40-60bp，所述篩選標(biāo)記與步驟2)所采用的含有氨芐抗性的載體及步驟3)所選用的感受態(tài)細胞GB05RedTrfA+pSC101 β中的抗性標(biāo)記進行區(qū)分。
8.如權(quán)利要求7所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，所述篩選標(biāo)記為卡那霉素抗性篩選標(biāo)記。
9.如權(quán)利要求2所述目標(biāo)基因捕獲方法，其特征在于，步驟5)中，重組具體步驟為利用含有氨芐抗性的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟3)獲得的重組載體細菌文庫中的陽性克隆，然后以鼠李糖誘導(dǎo)步驟4)制備的重組片段與所述陽性克隆重組，最后用重組片段中的篩選標(biāo)記篩選獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。
10.一種基因組DNA文庫，采用包括下列步驟的方法制得將打斷成2-4k的基因組DNA片段與含有氨芐抗性的載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101 β感受態(tài)細胞，培養(yǎng)獲得重組載體細菌文庫。
11.如權(quán)利要求10所述基因組DNA文庫，其特征在于，所述基因組DNA文庫采用權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述目標(biāo)基因捕獲方法中的步驟I)-步驟3)制得。
12.權(quán)利要求1-9任一權(quán)利要求所述目標(biāo)基因捕獲方法或權(quán)利要求10或11所述基因組DNA文庫在基因研究領(lǐng)域的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于文庫的目標(biāo)基因捕獲方法及其應(yīng)用。本發(fā)明目標(biāo)基因捕獲方法包括下列步驟將打斷成2-4k的基因組DNA片段與載體連接獲得重組載體；重組載體電轉(zhuǎn)化GB05RedTrfA+pSC101β感受態(tài)細胞，培養(yǎng)獲得重組載體細菌文庫；制備待捕獲目標(biāo)基因的雙鏈DNA重組片段；將重組片段與重組載體細菌文庫中的陽性克隆重組，篩選陽性克隆獲得含有目標(biāo)基因片段的細菌克隆。本發(fā)明還進一步公開了一種可用于目標(biāo)基因捕獲的基因組DNA文庫。本發(fā)明的目標(biāo)基因捕獲方法及基因組DNA文庫可用于基因研究。
文檔編號C40B40/08GK102925428SQ20121043498
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者肖珊, 李萍, 陶曄, 林芹, 胡秋萍 申請人:上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司