結(jié)構(gòu)化多肽特異性的調(diào)控的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了對人血漿激肽釋放酶特異的肽配體。
【專利說明】結(jié)構(gòu)化多肽特異性的調(diào)控
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及共價連接至分子支架的多肽，其中兩個或更多肽環(huán)在支架的附著點之間相對。特別地，本發(fā)明描述了對人蛋白酶血漿激肽釋放酶特異的肽。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)狀肽能夠以高親和性和靶標(biāo)特異性結(jié)合蛋白靶標(biāo)，因而是用于治療開發(fā)的有吸引力的分子類型。實際上，數(shù)個環(huán)狀肽已經(jīng)成功用于臨床，例如，如抗菌肽萬古霉素，免疫抑制藥物環(huán)孢霉素或抗癌藥物ocreotide (無對應(yīng)中譯文)(Driggers等人，NatRev Drug Discov2008，7 (7)，608-24)。良好的結(jié)合特性來自肽和靶標(biāo)之間形成的相對大的相互作用表面，以及降低的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)象柔性。典型地，大環(huán)結(jié)合數(shù)百平方埃的表面，例如，環(huán)狀肽 CXCR4 措抗劑 CVX 15(400 A2; Wu, B 等人，Science330 (6007)，1066-71)、
結(jié)合整合素a Vb3的具有Arg-Gly-Asp基序的環(huán)狀肽055 A2) (Xiong, J.P.,等人，Science2002，296 (5565)，151-5)、或結(jié)合尿激酶型纖溶酶原激活物的環(huán)狀肽抑制劑upain-Ι (無對應(yīng)中譯文，(603 A2； Zhao, G.,等人,J Struct Biol2007, 160 (I), 1-10)。
[0003]由于其環(huán)狀構(gòu)型，肽大分子比線性肽柔性低，導(dǎo)致了在結(jié)合靶標(biāo)時熵?fù)p失較少，得到了較高的結(jié)合親和性。降低的柔性還導(dǎo)致鎖定靶標(biāo)特異性構(gòu)象，與線性肽相比增加了結(jié)合特異性。該效果已經(jīng)被基質(zhì)金屬蛋白酶8 (MMP-8)有效的選擇性抑制劑例證了，其中當(dāng)其環(huán)打開時，失去了對其它MMP的選擇性(Cherney, R.J.，等人，J MedCheml998，41 (11)，1749-51)。通過大環(huán)化實現(xiàn)有利的結(jié)合特性，甚至在具有一個以上肽環(huán)的多環(huán)肽中更顯著，例如，在萬古霉素、乳酸鏈球菌肽或放線菌素中。
[0004]先前不同的研究小組將帶有半胱氨酸殘基的多肽連接至合成的分子結(jié)構(gòu)上(Kemp, D.S 和 McNamara, P.E., J.0rg.Chem, 1985; Timmerman, P.等人，ChemBioChem, 2005)。Meloen和同事使用三(溴甲基)苯和相關(guān)分子將多個肽環(huán)快速且定量地環(huán)化至合成的支架上，用于蛋白表面的結(jié)構(gòu)化模擬(Timmerman, P.等人，ChemBioChem, 2005)。生成候選藥物化合物的方法公開于W02004/077062和W02006/078161中，其中通過將含有半胱氨酸的多肽連接至例如三(溴甲基)苯的分子支架生成所述化合物。
[0005]W02004/077062公開了選擇候選藥物化合物的方法。特別地，該文獻(xiàn)公開了包括第一和第二反應(yīng)基團的各種支架分子，以及使上述支架與另外的分子接觸，在偶聯(lián)反應(yīng)中，在支架和另外的分子之間形成至少兩個連接。
[0006]W02006/078161公開了結(jié)合化合物、免疫原性化合物和模擬肽。該文獻(xiàn)公開了來自現(xiàn)有蛋白的各種肽集合的人工合成。然后將這些肽與具有某些引入氨基酸改變的恒定合成肽組合，以生成組合文庫。通過由化學(xué)連接將該多樣性引入以區(qū)分各種氨基酸改變?yōu)樘卣鞯碾?，為發(fā)現(xiàn)希望的結(jié)合活性提供了增加的機會。該文獻(xiàn)的圖1表示代表各種環(huán)肽構(gòu)建體的合成的示意圖。該文獻(xiàn)中公開的構(gòu)建體依賴-SH功能化肽，典型地包含半胱氨酸殘基，和支架上的雜芳基，典型地包含芐基鹵取代基如二或三溴苯基苯。這樣的基團發(fā)生反應(yīng)，從而在肽和支架之間形成硫醚連接。
[0007] 我們最近開發(fā)了基于噬菌體展示的組合方法，用于產(chǎn)生和篩選興趣靶標(biāo)的雙環(huán)肽的大文庫(Heinis，等人，Nat Chem Biol2009, 5 (7)，502-7;還參見國際專利申請W02009/098450)。簡言之，含三個半胱氨酸殘基和兩個六個隨機氨基酸(Cys- (Xaa) 6_Cys_ (Xaa) 6_Cys)的區(qū)域的線性肽組合文庫在曬菌體上展示,通過半胱氨酸側(cè)鏈共價連接至小分子(三(溴甲基)苯)進行環(huán)化。在對人蛋白酶組織蛋白酶G和血漿激肽釋放酶(PK)的親和性選擇中，分離的雙環(huán)肽具有納摩爾級的抑制常數(shù)。最好的抑制劑(PK15)以3nM的Ki抑制人PK (hPK)。在數(shù)個分離雙環(huán)肽的氨基酸序列中的相似性表明二個肽環(huán)均對結(jié)合有貢獻(xiàn)。在最高測試濃度(10 μ M)下，ΡΚ15即不抑制大鼠PK (81%序列同一性)，也不抑制同源的人絲氨酸蛋白酶因子XIa ChfXIa ;69%序列同一性)，也不抑制凝血酶(36%序列同一性XHeinis,等人，Nat Chem Biol2009，5 (7)，502—7)。這一發(fā)現(xiàn)表明雙環(huán)抑制劑是高度特異的，其它人胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶不被抑制。具有上述效力和靶標(biāo)選擇性的合成小肽抑制劑(如PK15)具有用作治療劑來控制遺傳性血管性水腫中PK活性的潛力或防止心肺分流術(shù)中的接觸激活，其中遺傳性血管性水腫是威脅生命的疾病，其特征為水腫的反復(fù)發(fā)作。
[0008]肽PK15分離自基于肽PK2、H-ACSDRFRNCPLWSGTCG_NH2的文庫，其中第二個6-氨基酸環(huán)是隨機的。PK15的序列是H-ACSDRFRNCPADEALCG-NH2，并且對人激肽釋放酶的IC50結(jié)合常數(shù)是1.7nM。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]我們分析了選自若干具有不同環(huán)長度的文庫的結(jié)構(gòu)化多肽對人激肽釋放酶的特異性。結(jié)果，我們成功地分離了能夠以改進的結(jié)合特異性結(jié)合激肽釋放酶的結(jié)構(gòu)化肽。
[0010]在第一方面，提供了對人激肽釋放酶特異的肽配體，所述肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，其中肽配體的環(huán)包含三個、四個或五個、但是少于六個氨基酸。
[0011]令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)在各環(huán)中含有少于6個氨基酸的肽對激肽釋放酶具有更高的結(jié)合親和性。例如,文中描述的5x5肽達(dá)到了 0.08nM或更小的結(jié)合常數(shù)。
[0012]在一個實施方案中，肽配體環(huán)包含三個氨基酸，且多肽具有共有序列GfxxGJVxGy其中是反應(yīng)基團。
[0013]例如，多肽可以是表3中所示多肽之一。
[0014]在另一個實施方案中，肽配體環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)包括共有序列G,GGxxNG,，其中G,是反應(yīng)基團。
[0015]例如，多肽的兩個鄰近環(huán)可以包括共有序列GrGGxxNGrRxxxxGr。
[0016]例如，多肽可以是表4中所示肽之一。
[0017]在一個實施方案中，肽配體環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)包括基序G^VfPxVkGp其中4是反應(yīng)基團。在本上下文中，提及“第一”環(huán)時，并不一定指序列中環(huán)的特定位置。但是，在某些實施方案中，第一環(huán)可以是在氨基端至羧基端肽序列中的近端環(huán)。例如，多肽進一步包含第二、遠(yuǎn)端環(huán)，其含有基序G/人Hq/tXL4。第一環(huán)序列的實例包括G^WPARGpGrXffPSRGr, GrXFPFRGr和GjFPYRGr。在這些實例中，x可以是任何氨基酸，但例如是S或R。
[0018]在一個實施方案中，肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)含有基序GpHxDLGp其中G1^是反應(yīng)基團。
[0019]在一個實施方案中，肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)含有基序GJHxxLG,，其中4是反應(yīng)基團。
[0020]在一個實施方案中，多肽含有兩個鄰近的環(huán)，其包含基序Gy7FPXK/KG//JlQ/TDLGp[0021 ] 我們已經(jīng)表明，某些位置的性質(zhì)能影響序列中的其它位置。特別是，使用肽06-34和06-34-03進行的實驗證明位置I和6影響位置4。優(yōu)選，只有位置I和6分別是S和T時，位置4是A。
[0022]在文中的實施例中，編號指環(huán)中的位置，忽略反應(yīng)基團。因而，在Gy/FPxK/KG//LHQ/TDLGr中，X在位置1，T/L在位置6。
[0023]例如，多肽可以是表4、表5或表6所不多肽之一。
[0024]例如，多肽配體可以包含表4至表6之一中所示多肽之一。
[0025]在前述實施方案中，反應(yīng)基團優(yōu)選是反應(yīng)氨基酸。優(yōu)選，反應(yīng)氨基酸是半胱氨酸。
[0026]如上所述，可通過鑒定對突變有用的那些殘基并通過制備在那些位置上包含突變的文庫，制備根據(jù)本發(fā)明這一方面的多肽變體。例如，表4中的多肽06-56可在位置Q4和TlO突變，而不損失活性(參見以下實施例)。可選擇在這些位置含有突變的多肽配體，該多肽配體與06-56相比具有改進的結(jié)合活性。
[0027]在另一方面，提供了根據(jù)本發(fā)明以上方面的多肽配體，其含有一個或多個非天然氨基酸取代，且抵抗蛋白酶降解。
[0028]我們發(fā)現(xiàn)某些非天然氨基酸允許以nM Ki結(jié)合血漿激肽釋放酶，同時顯著增加血漿中的停留時間。
[0029]在一個實施方案中，非天然氨基酸選自N-甲基精氨酸、高精氨酸和羥基脯氨酸。優(yōu)選地，精氨酸的N-甲基和同源(homo-)衍生物用于取代精氨酸，脯氨酸3可優(yōu)選地被羥基脯氨酸、氮雜環(huán)丁烷羧酸或α取代的氨基酸(如氨基異丁酸)取代。在另一個實施方案中，精氨酸被胍基苯丙氨酸取代。
[0030]在一個實施方案中，多肽包括含有基序G^WPARh的第一環(huán)，其中P被氮雜環(huán)丁烷羧酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或R被胍基苯丙氨酸取代。
[0031 ] 在一個實施方案中，多肽包含含有基序G^FPYRh的第一環(huán)，其中R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代，其中脯氨酸被氮雜環(huán)丁烷羧酸取代；和/或R被胍基苯丙氨酸取代。
[0032]根據(jù)第二方面，提供了生產(chǎn)突變體多肽配體的方法，所述方法產(chǎn)生比母體多肽配體改進的對靶標(biāo)的結(jié)合活性水平，其中母體多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述方法包括步驟:(a)對于各環(huán)序列中兩個或更多氨基酸位置的每一個，產(chǎn)生η個不同的突變體文庫，各文庫由母體多肽組成，在母體多肽中環(huán)序列中所述氨基酸位置之一通過被η個不同的非母體氨基酸之一取代而突變；(b)篩選各文庫對母體靶標(biāo)的結(jié)合，對各突變評分；(c)鑒定可耐受突變的氨基酸位置；(d)生成一個或多個在步驟(C)中鑒定的氨基酸位置上含有一個或多個突變的突變體多肽。
[0033]在一個實施方案中，步驟(d)包括制備含有在步驟(C)鑒定的兩個或更多氨基酸位置上引入突變的多肽的文庫，以及篩選文庫中具有改進的對靶標(biāo)的結(jié)合活性水平的多肽。
[0034]可根據(jù)不同突變體的數(shù)量選擇值n，其意圖在每個文庫中產(chǎn)生。例如，如果希望包含所有可能天然氨基酸的突變體，η可以是20。如果包含了非天然氨基酸，如N-甲基化氨基酸，則η可以大于20，如22或23。例如，η可以是2或更大；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19 或 20。
[0035]在第三方面，提供了多肽配體的文庫，其中多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述文庫由m個多肽配體的不同突變體組成，其中環(huán)序列中限定的氨基酸位置通過被m個不同氨基酸之一所取代而突變，其中m是至少2。
[0036]在第四個方面，提供了一套多肽配體文庫，其中多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述套包含兩個或更多多肽配體文庫，各所述多肽配體文庫由多肽配體的m個不同突變體組成，其中環(huán)序列中限定的氨基酸位置通過被m個不同氨基酸之一取代而突變。
[0037]優(yōu)選地，m在2和20之間；在一個實施方案中，m是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、 17、18、19或20、或更多，如上述對η所設(shè)定的。
[0038]在另一方面，本發(fā)明提供了肽配體，所述肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，其中通過引入至少一個非天然氨基酸修飾肽。
[0039]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方面的肽配體具有蛋白酶抗性。非天然氨基酸取代增加多肽的蛋白酶抗性水平。
[0040]在一個實施方案中，非天然氨基酸選自N-甲基精氨酸、高精氨酸和氮雜環(huán)丁烷羧酸和胍基苯丙氨酸。優(yōu)選地，精氨酸的N-甲基和同源衍生物用于取代精氨酸，氮雜環(huán)丁烷羧酸取代脯氨酸。在另一個實施方案中，可以用胍基苯丙氨酸取代精氨酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1雙環(huán)肽的噬菌體選擇。(a)雙環(huán)肽噬菌體文庫。隨機氨基酸表示為“X”，丙氨酸表示為“A”，以及恒定的三個半胱氨酸表示為“C”。(b)具有3、5或6個氨基酸的環(huán)的化學(xué)合成雙環(huán)肽結(jié)構(gòu)的模式。由三個半胱氨酸側(cè)鏈將線性肽連接至三(溴甲基)苯(TBMB)產(chǎn)生所述結(jié)構(gòu)。在雙環(huán)肽中不同的氨基酸由“Xaa”表示。(c-e)從文庫5x5 (C)，文庫3x3A
(d)和文庫3x3B (e)分離的雙環(huán)肽的序列。通過陰影突出顯示氨基酸的相似性。
[0042]圖2比較hPK的表面氨基酸和同源絲氨酸蛋白酶。(a)帶有表面表征的hPK(H)B
進入2ANW)結(jié)構(gòu)。暴露于表面的氨基酸原子和比4、8和12 A更靠近結(jié)合SI 口袋的苯甲脒(灰色)的氨基酸原子染色更深。(b)hPK的結(jié)構(gòu)。突出了 hfXIa中不同的氨基酸側(cè)鏈。(c)hPK結(jié)構(gòu)。突出了 rPK中不同的氨基酸側(cè)鏈。
[0043]圖3繪圖表示用于確定多肽配體中對于突變優(yōu)選的殘基的方法。[0044]圖4在2nM下，肽與血漿激肽釋放酶結(jié)合中分析肽06_34中的氨基酸取代(表4)。對于各位置，表明了與母體序列相比，在該位置不同突變的作用。
[0045]圖5在2nM下，肽與血漿激肽釋放酶結(jié)合中分析肽06_56中的氨基酸取代(表4)。對于各位置，表明了與母體序列相比，在該位置不同突變的作用。
[0046]圖6在IOnM下，肽與血漿激肽釋放酶結(jié)合中分析肽06-56中的氨基酸取代(表4)。對于各位置，表明了與母體序列相比，在該位置不同突變的作用。
[0047]圖7表明了在t0、第1、2和3天暴露于35%大鼠血漿后Ac-06-34-18 (TMB)-NH2的質(zhì)譜的質(zhì)譜輸出(方法I)。由于干擾離子和片段的低濃度，質(zhì)量精確性多少會有不同；但是，鑒定離散的蛋白水解片段是可能的。
[0048] 圖8暴露于大鼠血漿后鑒定的Ac-06-34-18 (TMB) -NH2代謝物M1、M2、M3的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0049]圖9 Ac-06-34-18 (TMB) -NH2 前導(dǎo)物(lead)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0050]圖10 Ac-06-34-18 (TMB)-NH2前導(dǎo)物和其第一環(huán)亂序重排(scrambled)衍生物對激肽釋放酶的酶抑制試驗。觀察到親和性的急劇降低，顯示W(wǎng)PAR藥效團完整性的重要性。
[0051]圖11精氨酸及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0052]圖12 Trp和潛在疏水類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0053]圖13 Pro和潛在的限制類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0054]圖14 Aze3、NMeArg5和雙修飾Ac-06-34_18 (TMB) -NH2的可比較的激肽釋放酶抑制。
[0055]圖15丙氨酸及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0056]圖16 F2Y4、F2Y2HR5和雙修飾Ac-06-34_18 (TMB) -NH2的可比較的激肽釋放酶抑制。
【具體實施方式】
[0057]除非另有定義，所有用于文中的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同涵義，如肽化學(xué)領(lǐng)域、細(xì)胞培養(yǎng)和噬菌體展示領(lǐng)域、核酸化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三 版，2001，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, NY;AusubeI 等人,Short Protocols in MolecularBiology (1999)第四版，John ffiley&Sons, Inc.)引入文中作參考。
[0058]如文中引用的肽配體，指與分子支架共價連接的肽。典型地，該肽含有兩個或更多能夠與支架形成共價鍵的反應(yīng)基團，以及在所述反應(yīng)基團之間相對(subtended)的序列,其被稱為環(huán)序列，因為當(dāng)肽和支架結(jié)合時，其形成環(huán)。在本情況中，肽包含至少三個反應(yīng)基團，并在支架上形成至少兩個環(huán)。
[0059]反應(yīng)基團是能夠與分子支架形成共價鍵的基團。典型地，反應(yīng)基團存在于肽的氨基酸側(cè)鏈上。實例是含有氨基的基團，如半胱氨酸、賴氨酸和硒代半胱氨酸。
[0060]在本文的上下文中，特異性指配體結(jié)合或與其同類(cognate )靶標(biāo)相互作用、而排除與所述靶標(biāo)相似的實體的能力。例如，特異性可以指配體抑制人酶的相互作用、但不抑制來自不同物種的同源酶的相互作用的能力。使用文中描述的方法，可以調(diào)控(即增加或降低)特異性，從而使配體與預(yù)期靶標(biāo)的同系物或旁系物的相互作用能力更強或更弱。特異性與活性、親和性或活力并不是同義詞，配體對其靶標(biāo)的作用效力(如，例如結(jié)合親和性或抑制水平)并不一定與其特異性相關(guān)。
[0061]如文中使用的結(jié)合活性，指來自結(jié)合試驗的定量結(jié)合測量，例如文中所描述的。因而，結(jié)合活性指在給定靶標(biāo)濃度下結(jié)合的肽配體的量。
[0062]多特異性是結(jié)合兩個或更多靶標(biāo)的能力。典型地由于其構(gòu)象特征，結(jié)合肽能結(jié)合單一靶標(biāo)，如抗體情況中的表位。但是可開發(fā)能結(jié)合兩個或更多靶標(biāo)的肽；例如，如以上提到的本領(lǐng)域中已知的雙特異抗體。本發(fā)明中，肽配體能結(jié)合兩個或更多靶標(biāo)，因此是多特異性的。優(yōu)選，其結(jié)合兩個靶標(biāo)，是雙特異性的。結(jié)合可以是獨立的，這意味著在肽上對靶標(biāo)的結(jié)合位點不被一個或另一個靶標(biāo)結(jié)合所結(jié)構(gòu)性地阻礙。在這樣的情況中，兩個靶標(biāo)可獨立地結(jié)合。更一般的是，可預(yù)期一個靶標(biāo)的結(jié)合將至少部分地阻礙另一個的結(jié)合。
[0063]雙特異性配體和具有包括兩個相關(guān)靶標(biāo)特異性的配體之間存在根本的差異。在第一種情況中，配體分別對兩個靶標(biāo)有特異性，以特異的方式與每個靶標(biāo)相互作用。例如，配體中的第一環(huán)可以結(jié)合第一靶標(biāo)，第二環(huán)結(jié)合第二靶標(biāo)。在第二種情況中，因為在兩個靶標(biāo)之間不存在差異，所以配體是非特異性的，例如其通過與兩個靶標(biāo)共同的靶標(biāo)表位相互作用。
[0064]在本發(fā)明的上下文中，例如，對靶標(biāo)和直系同源物具有活性的配體有可能是雙特異配體。但是，在一個實施方案中，配體不是雙特異性的，但是其特異性的精度較低，因而其結(jié)合靶標(biāo)和一個或多個直系同源物。一般地，沒有被選擇針對靶標(biāo)和其直系同源物的配體不太可能因為調(diào)控環(huán)長度而是雙特異性。
[0065]如果配體確實是雙特異性，在一個實施方案中，配體靶標(biāo)特異性的至少一種將是所選配體中共同的，且可通過文中公開的方法調(diào)控該特異性水平。第二或其它特異性沒有必要是共享的，也不需要是文中所示過程的對象。
[0066]靶標(biāo)是肽配體結(jié)合、或與肽配體相互作用的分子或其部分。盡管結(jié)合被看做大多數(shù)活性類型的首要條件，其自身就是一種活性，還可以設(shè)想其它活性。因而，本發(fā)明不需要直接或間接地測量結(jié)合。
[0067]分子支架是能夠在多個點上連接肽以便影響肽的一種或多種結(jié)構(gòu)特性的任何分子。其不是交聯(lián)劑，因為其不只是取代二硫鍵；相反，其為肽提供了兩個或更多附著點。優(yōu)選，分子支架包含至少三個肽的附著點，稱為支架反應(yīng)基團。這些基團能夠與肽上的反應(yīng)基團反應(yīng)，形成共價鍵。優(yōu)選的分子支架的結(jié)構(gòu)如下所述。
[0068]根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進行結(jié)合活性(或任何其它希望的活性)的篩選，例如來自曬菌體展示技術(shù)。例如，固定于固相的祀標(biāo)可用于鑒定和分離組庫(repertoire)的結(jié)合成員。篩選能夠根據(jù)希望的特征選擇組庫的成員。
[0069]術(shù)語文庫指異源多肽或核酸的混合物。文庫由不同的成員組成。從這個意義上講，文庫是組庫的同義詞。文庫成員間序列差異決定了文庫中存在的多樣性。該文庫可以采用多肽或核酸簡單混合物的形式，或者可以是用文庫的核酸轉(zhuǎn)化的生物體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動物或植物細(xì)胞等。優(yōu)選地，每個單獨的生物體或細(xì)胞僅含有一個或數(shù)量有限的文庫成員。
[0070]在一個實施方案中，為了允許表達(dá)核酸編碼的多肽，將核酸引入表達(dá)載體中。因而，在一個優(yōu)選的方面，文庫可以是宿主生物體群的形式，各生物體含有一個或多個表達(dá)載體的拷貝，所述表達(dá)載體含有核酸形式的文庫的單一成員，該核酸可被表達(dá)以生成對應(yīng)的多肽成員。因而，宿主生物體群具有編碼遺傳學(xué)上各種各樣多肽變體的大組庫的潛能。
[0071]在一個實施方案中，核酸的文庫編碼多肽組庫。優(yōu)選文庫的各核酸成員具有與文庫中一個或多個其它成員相關(guān)的序列。通過相關(guān)的序列，指與文庫的至少一個其它成員具有至少50%同一性、例如至少60%同一性、例如至少70%同一性、例如至少80%同一性、例如至少90%同一性、例如至少95%同一性、例如至少98%同一性、例如至少99%同一性的氨基酸序列?？稍诳缭街辽?個氨基酸，例如，至少4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，例如至少12個氨基酸，例如至少14個氨基酸，例如至少16個氨基酸，例如至少17個氨基酸，或全長參照序列的連續(xù)節(jié)段上判斷同一性。
[0072]組庫是變體集合，在本文的情況中是多肽變體，其序列不同。典型地，反應(yīng)基團的位置和性質(zhì)將不變，但是在其之間形成環(huán)的序列可以是隨機的。組庫的大小是不同的，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)為其包含至少IO2個成員。可以構(gòu)建IO11或更多成員的組庫。
[0073]如文中使用的，一套(a set of )多肽配體，指可被用于文中所述方法中的選擇中的多種多肽配體。可能地，一套可以是組庫，但其也可以是小的多肽集合，從至少2個多至 10、20、50、100 或更多。
[0074]如文中使用的，一組(a group of)多肽配體，指兩個或更多配體。在一個實施方案中，一組配體僅包含共有至少一個靶標(biāo)特異性的配體。典型地，一組由至少2、3、4、5、6、7、
8、9或10、20、50、100或更多配體組成。在一個實施方案中，一組由2個配體組成。
[0075](A)肽配體的構(gòu)建
[0076](i)分子支架
[0077]分子支架描述于，例如W02009098450中，其在文中引用，特別是描述于W02004077062 和 W02006078161 中。
[0078]如先前的文獻(xiàn)中注意到的，分子支架可以是小分子，如小的有機分子。
[0079]在一個實施方案中，分子支架可以是，或者可以是基于天然單體，如核苷、糖或甾體。例如，分子支架可以包含這樣的實體的短聚合物，如二聚物或三聚物。
[0080]在一個實施方案中，分子支架是毒性已知的化合物，例如，低毒性的化合物。合適的化合物的實例包括膽固醇、核苷酸、留體或現(xiàn)有的藥物，如tamazepam (無對應(yīng)中譯文)。
[0081]在一個實施方案中，分子支架可以是大分子。在一個實施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物組成的大分子。
[0082]在一個實施方案中，分子支架包含能夠與多肽官能團反應(yīng)、形成共價鍵的反應(yīng)基團。
[0083]分子支架可以包括化學(xué)基團如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、疊氮化物、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、烷基鹵和?；u。
[0084]在一個實施方案中，分子支架可以包含、或可以由三(溴甲基)苯組成，特別是1，3，5-三(溴甲基)苯(TBMB)或其衍生物。
[0085]在一個實施方案中，分子支架是2，4，6-三(溴甲基)三甲基苯。其與1，3，5-三(溴甲基)苯類似，但是含有額外的三個附著于苯環(huán)的甲基。其優(yōu)點是額外的甲基可形成與多肽進一步的接觸，因而增加了額外的結(jié)構(gòu)性限制。[0086]本發(fā)明的分子支架含有化學(xué)基團，該化學(xué)基團允許本發(fā)明編碼文庫的多肽的官能團與分子支架形成共價鍵。所述化學(xué)基團選自大范圍的官能基，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、疊氮化物、烷基鹵和?；u。
[0087](ii)多肽
[0088]可通過天然或非天然氨基酸的側(cè)鏈提供多肽的反應(yīng)基團。多肽的反應(yīng)基團可選自疏基、氣基、竣基、狐基、酌二基或羥基。多妝的反應(yīng)基團可選自置氣化物、麗擬基、炔基、烯基或芳基鹵基團。用于連接分子支架的多肽反應(yīng)基團可以是多肽的氨基或羧基端。
[0089]在某些實施方案中，用于連接分子支架的各多肽反應(yīng)基團是相同類型的。例如，各反應(yīng)基團可以是半胱氨酸殘基。進一步的細(xì)節(jié)在W02009098450中提供。
[0090]在某些實施方案中，用于連接分子支架的反應(yīng)基團可以包含兩個或更多不同的類型，或可以包含三個或更多不同的類型。例如，反應(yīng)基團可以包含兩個半胱氨酸殘基和一個賴氨酸殘基，或包含一個半胱氨酸殘基、一個賴氨酸殘基和一個N-端胺。
[0091]可采用半胱氨酸，是由于其具有最不同于所有其它氨基酸的反應(yīng)性的優(yōu)點?？捎糜诜肿又Ъ苌吓c半胱氨酸的巰基反應(yīng)的支架反應(yīng)基團是烷基鹵(或也稱為鹵代烴或鹵代烷)。實例是溴甲基苯(由TBMB示例的支架反應(yīng)基團)或碘乙酰胺。用于選擇性地將化合物偶聯(lián)至蛋白中半胱氨酸的其它支架反應(yīng)基團是馬來酰亞胺?？捎米鞅景l(fā)明中分子支架的馬來酰亞胺的實例包括:三-(2-馬來酰亞胺乙基)胺、三-(2-馬來酰亞胺乙基)苯、三-(馬來酰亞胺基)苯。硒代半胱氨酸也是天然氨基酸，其具有與半胱氨酸相似的反應(yīng)性，可用于相同的反應(yīng)。因而，除非上下文特別指明，無論在哪兒提及半胱氨酸，典型地可認(rèn)為其可取代硒代半胱氨酸。
[0092]賴氨酸(和肽N端的伯胺)也適合作為反應(yīng)基團通過連接分子支架修飾噬菌體上的肽。但是，在噬菌體蛋白中其比半胱氨酸更豐富，噬菌體顆粒可能交聯(lián)或可能損失其傳染性的風(fēng)險更高。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)賴氨酸尤其可用于分子內(nèi)部反應(yīng)中(如，當(dāng)分子支架已經(jīng)連接到噬菌體肽時)從而與分子支架形成第二或連續(xù)的連接。在該情況中，分子支架優(yōu)選與展示肽的賴氨酸反應(yīng)(特別是，非常接近的賴氨酸)。選擇性地與伯胺反應(yīng)的支架反應(yīng)基團是琥珀酰亞胺、醛、或烷基鹵。在許多隨附的實施例中使用的溴甲基基團中，苯環(huán)的電子可穩(wěn)定陽離子過渡狀態(tài)。因而，該特定的芳基鹵比烷基鹵反應(yīng)性高100-1000倍。用作分子支架的琥珀酰亞胺的實例包括三-(琥珀酰亞胺基氨基三乙酸)、1，3，5-苯基三乙酸。用作分子支架的醛的實例包括三甲?；淄?。用作分子支架的烷基鹵的實例包括1，3，5-三(溴甲基)_2，4，6-三甲基苯、1，3，5-三(溴甲基)苯、1，3，5-三(溴甲基)-2，4，6-三乙基苯。
[0093]帶有用于連接分子支架的反應(yīng)基團的氨基酸可位于多肽中任何合適的位置。為了影響生成的特定結(jié)構(gòu)或環(huán)，帶有反應(yīng)基團的氨基酸的位置可根據(jù)技術(shù)操作人員而不同，例如，為了使生成的多肽發(fā)生突變，可通過操作編碼多肽的核酸。通過這種手段，可根據(jù)本文的教導(dǎo)操作環(huán)長度。
[0094]例如，多肽可以包含序列AC(X)nC(X)mCG,其中X代表隨機的天然氨基酸，A代表丙氨酸，C代表半胱氨酸，G代表甘氨酸，以及η和m可以相同或不同，是3至6之間的數(shù)。
[0095](iii)多肽的反應(yīng)基團
[0096]本發(fā)明的分子支架可以通過多肽上的官能或反應(yīng)基團鍵合至多肽。其典型地從多肽聚合物中存在的特定氨基酸的側(cè)鏈形成。這樣的反應(yīng)基團可以是半胱氨酸側(cè)鏈、賴氨酸側(cè)鏈、或N端氨基或任何其它適合的反應(yīng)基團。再一次地，細(xì)節(jié)可參見W02009098450。
[0097]天然氨基酸反應(yīng)基團的實例是半胱氨酸的巰基，賴氨酸的氨基，天冬氨酸或谷氨酸的羧基，精氨酸的胍基，酪氨酸的酚基或絲氨酸的羥基。非天然氨基酸可提供更寬范圍的反應(yīng)基團，包括疊氮化物、酮-羰基、炔炔烴、烯炔烴、或芳基鹵基團。多肽末端的氨基和羧基還可以作為反應(yīng)基團與分子支架/分子核心形成共價鍵。
[0098]本發(fā)明的多肽含有至少三個反應(yīng)基團。所述多肽還可以含有四個或更多反應(yīng)基團。使用的反應(yīng)基團越多，在分子支架中可形成越多的環(huán)。
[0099]在一個優(yōu)選的實施方案中，生成帶有三個反應(yīng)基團的多肽。所述多肽與帶有三倍旋轉(zhuǎn)對稱的分子支架/分子核心反應(yīng)生成單一產(chǎn)物異構(gòu)體。出于幾個原因，單一產(chǎn)物異構(gòu)體的生成是有利的?；衔镂膸斓暮怂醿H編碼多肽的一級序列，但是并不編碼多肽與分子核心反應(yīng)時所形成的分子異構(gòu)狀態(tài)。如果僅形成一個產(chǎn)物異構(gòu)體，向產(chǎn)物異構(gòu)體的核酸指定就清楚限定了。如果形成多個產(chǎn)物異構(gòu)體，核酸就不能給出關(guān)于篩選或選擇過程中分離的產(chǎn)物異構(gòu)體性質(zhì)的信息。如果合成本發(fā)明文庫的特定成員，單一產(chǎn)物異構(gòu)體的形成也是有利的。在此情況中，多肽與分子支架的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生了單一產(chǎn)物異構(gòu)體，而不是異構(gòu)體的混合物。
[0100]在本發(fā)明的另一個實施方案中，產(chǎn)生具有四個反應(yīng)基團的多肽。所述多肽與帶有四面體對稱的分子支架/分子核心反應(yīng)生成兩個產(chǎn)物異構(gòu)體。盡管兩個不同的產(chǎn)物異構(gòu)體由一個相同的核酸編碼，可通過化學(xué)合成兩個異構(gòu)體、分離兩個異構(gòu)體、以及檢測兩個異構(gòu)體對靶標(biāo)配體的結(jié)合來確定分離的異構(gòu)體的異構(gòu)體性質(zhì)。
[0101]在本發(fā)明的一個實施方案中，多肽反應(yīng)基團的至少一個對其余反應(yīng)基團是正交的。使用正交反應(yīng)基團允許 將所述正交反應(yīng)基團引導(dǎo)至分子核心的特定位點。可以使用涉及正交反應(yīng)基團的連接策略來限制形成的產(chǎn)物異構(gòu)體的數(shù)量。換言之，相對于針對至少三個鍵中其余的鍵所選的那些，通過針對至少三個鍵的一個或多個選擇差異或不同的反應(yīng)基團，可以有用地實現(xiàn)特定順序的鍵合或多肽的特定反應(yīng)基團引導(dǎo)至分子支架上的特定位置。
[0102]在另一個實施方案中，本發(fā)明多肽的反應(yīng)基團與分子接頭反應(yīng)，其中所述接頭能夠與分子支架反應(yīng)，從而所述接頭將在最終鍵合狀態(tài)下介于分子支架和多肽之間。
[0103]在某些實施方案中，多肽文庫或套的成員氨基酸可以被任何天然或非天然氨基酸取代。從這些可互換氨基酸中排除的是，攜帶將多肽交聯(lián)至分子核心的官能團的那些，因而單獨的環(huán)序列是可互換的?？苫Q多肽序列可具有隨機序列、恒定序列或帶有隨機和恒定氨基酸的序列。帶有反應(yīng)基團的氨基酸也可以位于多肽中限定的位置，因為這些氨基酸的位置決定了環(huán)的大小。
[0104]在一個實施方案中，帶有三個反應(yīng)基團的多肽具有序列(X)1Y(X)mY(X)nY(X)tj,其中Y代表帶有反應(yīng)基團的氨基酸，X代表隨機氨基酸，m和η是3和6之間的數(shù)值，其定義了插入多肽節(jié)段的長度，多肽節(jié)段可以相同或不同，以及I和ο是O和20之間的數(shù)值，定義了側(cè)翼多肽節(jié)段的長度。
[0105]可使用硫醇介導(dǎo)的綴合的替代物通過共價相互作用將分子支架附著至肽?？商鎿Q地，在根據(jù)本發(fā)明選擇或分離多肽后，這些技術(shù)可用對多肽進行進一步半簇(如，不同于分子支架的感興趣的小分子)的修飾或附著中，-在這樣的實施方案中，而后很明顯附著不需要是共價的，可以包括非共價的附著。通過產(chǎn)生展示帶有非天然氨基酸的蛋白和肽的噬菌體，可使用這些方法，而不是硫醇介導(dǎo)的方法(或者與硫醇介導(dǎo)的方法組合)，所述非天然氨基酸具有必需的化學(xué)反應(yīng)基團，組合帶有互補反應(yīng)基團的小分子，或者當(dāng)在選擇/分離相后生成分子時，通過將非天然氨基酸引入化學(xué)或重組合成的多肽中進行。更多細(xì)節(jié)可參見W02009098450 或 Heinis,等人，Nat Chem Biol2009, 5 (7)，502-7。
[0106](iv)組合環(huán)以形成多特異性分子
[0107]有利地，通過測序和重新合成引入組合環(huán)的多肽組合來自肽配體、或肽配體組庫的環(huán)。可替換地，可以合成編碼這種多肽的核酸。
[0108]當(dāng)組合組庫時，特別是組合單一環(huán)組庫時，有利地消化編碼組庫的核酸，并再連接以形成具有與構(gòu)成其的組庫不同的環(huán)組合的新組庫。噬菌體載體可包含多接頭和其它限制性酶的位點，限制性酶的位點提供了獨特的切割和降級(relegation)載體的點，以生成希望的多特異性肽配體。在抗體方面操作噬菌體文庫的方法是公知的，也可以用于本發(fā)明的情況中。
[0109](V)效應(yīng)物基團和官能團的附著
[0110]可將效應(yīng)物和/或官能團附著至，例如，多肽的N或C端，或附著至分子支架。
[0111]合適的效應(yīng)物基團包括抗體和其部分或片段。例如，效應(yīng)物基團可包括抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)、抗體CHl重鏈結(jié)構(gòu)域、抗體CH2重鏈結(jié)構(gòu)域、抗體CH3重鏈結(jié)構(gòu)域、或其任意組合，另外還包括一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。效應(yīng)物基團還可以包括抗體鉸鏈區(qū)(這種區(qū)域通常存在于IgG分子的CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間)。
[0112]在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的效應(yīng)物基團是IgG分子的Fe區(qū)域。有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體效應(yīng)物基團包括或由肽配體Fe融合體組成，所述肽配體Fe融合體具有I天或更長、2天或更長、3天或更長、4天或更長、5天或更長、6天或更長、或7天或更長的半衰期。最有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體包含或由具有I天或更長的t β半衰期的肽配體Fe融合體組成。
[0113]官能團通常包括結(jié)合基團、藥物、用于其它實體附著的反應(yīng)基團、輔助大環(huán)肽攝入細(xì)胞的官能團等等。
[0114]肽穿透細(xì)胞的能力將使得針對細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的肽起效。可通過具有穿透細(xì)胞能力的肽評估的靶標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子如酪氨酸激酶、以及參與凋亡通路的分子。能夠穿透細(xì)胞的官能團包 括被添加到肽或分子支架的肽或化學(xué)基團。如那些衍生自如VP22、HIV_Tat、果蜆(觸角)同源盒蛋白的肽,例如,在Chen和Harrison, BiochemicalSociety Transactions (2007) 35 卷，第四部分，p821〃Cell_penetrating peptides indrug development: enabling intracellular targets〃和 Gupta 等人在 Advanced DrugDiscovery Reviews (2004) 57卷9637 中的“Intracellular delivery of large moleculesand small peptides by cell penetrating peptides” 中描述的。已經(jīng)表明在通過衆(zhòng)膜移位中有效的短肽實例包括來自果蠅觸角蛋白的16個氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)J Biol.Chem.269卷pl0444“The third helix of the Antennapedia homeodomaintranslocates through biological membranes”)、18 個氨基酸的“模型兩親性妝”(0ehlke等人(1998)Biochim Biophys Actsl414 卷 pl27“Cellular uptake of an alpha-helicalamphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds intothe cell interior non-endocytically’’)、和 HIV TAT 蛋白的富含精氨酸的區(qū)域。非肽的方法包括使用小分子模擬物或容易附著于生物分子的SMOC (Okuyama等人(2007)Nature Methods4 卷 pl53 ‘Small-molecule mimics of an a-helix for efficienttransport of proteins into cells’)。其它向分子添加胍基的化學(xué)策略也能增強細(xì)胞穿透(Elson-Scwab 等人(2007) J Biol Chem282 卷 pl3585 “Guanidinylated NeomcyinDelivers Large Bioactive Cargo into cells through a heparin Sulphate DependentPathway”)?？梢詫⑿》肿恿糠肿?，如留體添加到分子支架以增強細(xì)胞的攝入。
[0115]可附著至肽配體的一類官能團包括抗體和其結(jié)合片段，如Fab、Fv或單一結(jié)構(gòu)域片段。特別是，可以使用結(jié)合能夠增加肽配體體內(nèi)半衰期的蛋白的抗體。
[0116]還可以引入RGD肽，所述RGD肽結(jié)合存在于許多細(xì)胞上的整合素。
[0117]在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽配體效應(yīng)物基團具有選自如下的半衰期:12小時或更長、24小時或更長、2天或更長、3天或更長、4天或更長、5天或更長、6天或更長、7天或更長、8天或更長、9天或更長、10天或更長、11天或更長、12天或更長、13天或更長、14天或更長、15天或更長或20天或更長。有利地，根據(jù)本發(fā)明的肽配體效應(yīng)物基團或組合物具有12至60小時范圍內(nèi)的半衰期。在進一步的實施方案中，其具有I天或更長的t半衰期。在進一步的實施方案中，其在12至26小時范圍內(nèi)。
[0118]官能團包括藥物，如用于癌癥治療的細(xì)胞毒性劑。這些包括烷化劑，如順鉬和卡鉬、以及奧沙利鉬、氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺；抗代謝物，包括嘌呤類似物硫唑嘌呤和巰嘌呤)，或嘧啶類似物；植物生物堿和萜，包括長春花生物堿，如長春新堿、長春堿、長春瑞濱和長春地辛；足葉草毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初被稱為紫杉醇(Taxol);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，包括喜樹堿:伊立替康和拓?fù)涮婵?，以及II型抑制劑，包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、和替尼泊苷。進一步的制劑可包括抗腫瘤抗生素，其包括免疫抑制劑更生霉素(其用于腎移植)、多柔比星、表柔比星、博來霉素等。
[0119]可能的效應(yīng)物基團還包括酶，例如如用于酶/前藥治療中的羧肽酶G2，其中肽配體取代了 adept中的抗體。
[0120](vi)合成
[0121]應(yīng)當(dāng)注意到，一旦感興趣的多肽根據(jù)本發(fā)明被分離或鑒定，那么其隨后的合成可被盡可能簡化。因而，不需要通過重組DNA技術(shù)生成多肽的組或套。例如，可以確定感興趣多肽的序列，并可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以及隨后的在體外與分子支架的反應(yīng)合成地生產(chǎn)多肽。當(dāng)進行時，可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，因為不再需要保持遺傳編碼的載體顆粒(如噬菌體)的功能性或完整性。這使得能夠快速大規(guī)模地制備可溶性物質(zhì)，用于進一步的下游實驗或驗證。在該方面，通過本發(fā)明方法鑒定的候選物或前導(dǎo)物的大規(guī)模制備可使用傳統(tǒng)的化學(xué)方法完成，如在Timmerman等人中公開的。
[0122]因而，本發(fā)明還涉及制備如文中所示選擇的多肽或綴合物，其中制備包括如下所解釋的任選進一步的步驟。在一個實施方案中，這些步驟在化學(xué)合成得到的終產(chǎn)物多肽/綴合物上進行，而不是在噬菌體上。
[0123]任選地，當(dāng)制備綴合物或復(fù)合物時，例如在初始的分離/鑒定步驟后，興趣多肽中的氨基酸殘基可被取代。[0124]例如，肽還可以被延伸以引入另一個環(huán)，從而導(dǎo)入多個特異性。
[0125]為了延伸肽，可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相或溶液相化學(xué)方法，使用正交保護的賴氨酸(和類似物)，在其N端或C端或環(huán)內(nèi)簡單地化學(xué)延伸。標(biāo)準(zhǔn)蛋白化學(xué)方法可用于導(dǎo)入可激活的N或C端。可替換地,可通過如(Dawson PE, Muir Tff, Clark-Lewis I, Kent, SBH.1994.Synthesisof Proteins by Native Chemical Ligation.Science266:776-779)中描述的片段縮合或天然化學(xué)連接、或通過酶進行添加，例如使用如(Subtiligase:a tool for semisynthesisof proteins Chang TK, Jackson DY, Burnier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sci U SA.1994Dec20;91(26):12544-8 或 Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters Tags forlabelling protein N-termini with subtiligase for proteomicsl8 卷，22 期，2008 年11 月 15 日，6000-6003頁Tags for labeling protein N-termini with subtiligase forproteomics 中;Hikari A.1.Yoshihara, Sami Mahrus 和 James A.Wells)中描述的副連接酶(subtiligase)。
[0126]可替換地，可通過二硫鍵的進一步綴合使肽延伸或修飾。其具有另外的優(yōu)點，即一旦在細(xì)胞的還原環(huán)境中時，允許第一和第二肽彼此分離。在這樣的情況中，可在第一肽的化學(xué)合成期間添加分子支架(如TBMB)，從而與三個半胱氨酸基團反應(yīng)；然后可將另外的半胱氨酸附加于第一肽的N端，從而該半胱氨酸僅與第二肽的游離半胱氨酸反應(yīng)。
[0127]相似的技術(shù)可同樣地應(yīng)用于兩個雙環(huán)和雙特異性大環(huán)的合成/偶聯(lián)，潛在地產(chǎn)生一個四特異性分子。
[0128]而且，可以使用 適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在N端或C端偶聯(lián)或通過側(cè)鏈以相同的方式完成其它官能團或效應(yīng)物基團的添加。在一個實施方案中，以這樣的方式進行偶聯(lián)，其不阻斷任一實體的活性。
[0129](Vii)肽修飾
[0130]為了將雙環(huán)肽(雙環(huán)(Bicycles);綴合至分子支架的肽)開發(fā)成適合的類藥物分子，無論是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用，都需要考慮一些特征。以下列出至少需要設(shè)計到給定前導(dǎo)雙環(huán)中的:
[0131]?蛋白酶穩(wěn)定性，無論這涉及雙環(huán)對血漿蛋白酶的穩(wěn)定性、上皮(“膜錨定”)蛋白酶的穩(wěn)定性、胃腸蛋白酶的穩(wěn)定性、肺表面蛋白酶的穩(wěn)定性、胞內(nèi)蛋白酶等的穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)在不同的物種之間維持蛋白酶穩(wěn)定性，從而可以在動物模型中開發(fā)雙環(huán)前導(dǎo)候選物，并可以有信心向人施用。
[0132]?氧化敏感殘基的取代，為了改善分子的藥物穩(wěn)定性譜，如具有抗氧化類似物的色氨酸和蛋氨酸，
[0133]?希望的溶解度譜，其是帶電和親水性殘基與疏水性殘基比例的函數(shù)，其對制劑和吸收目的而言很重要，
[0134].帶電殘基與疏水殘基的正確平衡，因為疏水殘基影響血漿蛋白結(jié)合的程度，從而影響血漿中游離的可用部分的濃度，而帶電的殘基(特別是精氨酸)可能會影響肽與細(xì)胞表面磷脂膜的相互作用。二者組合可能影響半衰期、分布體積和肽藥物的暴露，并且可以根據(jù)臨床端點進行定制。此外，正確的組合和帶電殘基相對于疏水殘基的數(shù)值可以減少在注射部位的刺激(為皮下施用肽藥物)。
[0135].根據(jù)臨床指征和治療方案定制的半衰期?？赡茉诩毙约膊」芾碓O(shè)置中明智地開發(fā)未修飾的分子用于短期暴露，或開發(fā)具有化學(xué)修飾的雙環(huán)肽，以增強血漿半衰期，因此對于較慢性疾病狀態(tài)的管理是最佳的。
[0136]穩(wěn)定治療性肽候選物對抗蛋白水解降解的方法有多種，與模擬肽領(lǐng)域重疊(參見綜述，Gentilucci 等人，Curr.Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203,和 Nestor 等A Curr.Medicinal Chem(2009)，16,4399-418)。
[0137]其包括
[0138].肽環(huán)化
[0139].N端和C端加帽，通常是N-端乙?；虲-端酰胺化。
[0140]. 丙氨酸掃描，以揭示和潛在地去除蛋白水解攻擊位點。
[0141]-D-氨基酸取代，以探測氨基酸側(cè)鏈的空間要求，通過空間阻礙、以及通過D-氨基酸穩(wěn)定β轉(zhuǎn)角構(gòu)象的傾向，增加蛋白水解的穩(wěn)定性(Tugyi等人(2005)PNAS，102(2),413 -418)。
[0142].N-甲基/N-烷基氨基酸取代，以通過易斷裂酰胺鍵的直接修飾給予蛋白水解保護(Fiacco 等人，Chembiochem.(2008)，9 (14)，2200 - 3)。N-甲基化還強烈地影響肽鍵的扭轉(zhuǎn)角，并被認(rèn)為有助于細(xì)胞穿透和口服利用度(Biron等人(2008)，Angew.Chem.1nt.Ed.，47, 2595 - 99)。
[0143]?非天然氨基酸的引入，即，通過采用
[0144]-等比容的(isosteric)/等電子側(cè)鏈，其不被蛋白酶識別，而對靶標(biāo)效力沒有影響，
[0145]-受限制的氨基酸側(cè)鏈，從而附近肽鍵的蛋白水解在構(gòu)象上和空間上受到阻礙。特別是，其涉及脯氨酸類似物、龐大的側(cè)鏈、C α -雙取代衍生物(其中最簡單的衍生物是Aib，H2N-C(CH3)2-COOH),和環(huán)氨基酸，一個簡單的衍生物是氨基環(huán)丙基羧酸)。
[0146]?肽鍵替代物，實例包括
[0147]-N-烷基化(見以上，即C0-NR)
[0148]-還原的肽鍵(CH2-NH-)
[0149]-類肽(N-烷基氨基酸，NR-CH2-CO)
[0150]-硫代酰胺(CS-NH)
[0151]-氮雜妝(azapeptide)(CO-NH-NR)
[0152]_ 反式稀經(jīng)(RHC=C-)
[0153]-翻轉(zhuǎn)(retro-1nverso)(NH-CO)
[0154]-尿素替代物(NH-CO-NHR)
[0155]?肽骨架長度的調(diào)控
[0156]-即β 2/3 氨基酸，(NH-CR-CH2-CO、NH-CH2-CHR-CO)，
[0157].氨基酸上α碳的取代，其限制了骨架構(gòu)象，最簡單的衍生物是氨基異丁酸(Aib)0
[0158]應(yīng)當(dāng)明確地指出，這些修飾中的某些也可以用于有意改進肽對靶標(biāo)的效力，或，例如用于鑒定強效的氧化敏感氨基酸的替代物(Trp和Met)。還應(yīng)當(dāng)指出，雙環(huán)前導(dǎo)Ac-06-34-18 (TMB) -NH2已經(jīng)具有能給予蛋白水解降解抗性的兩個修飾，這兩個修飾為N/C-端加帽，和(雙)環(huán)化。[0159](B)多肽配體的組庫、套和組
[0160](i)文庫的構(gòu)建
[0161]旨在用于篩選的文庫可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)構(gòu)建，例如，如W02004/077062中所示的，或使用文中描述的生物系統(tǒng)，包括噬菌體載體系統(tǒng)。其它載體系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的，包括其它噬菌體(如，噬菌體λ )、細(xì)菌質(zhì)粒表達(dá)載體、基于真核細(xì)胞的表達(dá)載體，包括酵母載體等等。例如，參見W02009098450或Heinis,等人，Nat ChemBiol2009, 5(7)，502-7。
[0162]如W02004/077062中所示的那些非生物系統(tǒng)基于傳統(tǒng)的化學(xué)篩選方法。其簡單，但是缺乏生物系統(tǒng)的能力，因為其不可能用于篩選肽配體的大文庫、或者至少不切實際的繁重。但是，例如，當(dāng)僅需要篩選小量肽配體時，其是有用的。然而，通過這樣的獨立試驗進行的篩選，可能耗時、且能夠檢測到結(jié)合特異性靶標(biāo)的獨特分子的數(shù)量通常不超過IO6個化學(xué)實體。
[0163]相反地，生物篩選或選擇方法通常允許更大數(shù)量的不同分子的取樣。因而，生物方法可用于本發(fā)明的應(yīng)用中。在生物過程中，在單一反應(yīng)容器內(nèi)分析分子，具有有益性質(zhì)(即，結(jié)合)的分子從無活性分子中物理分離?？色@得允許生成并同時分析多于IO13個獨立化合物的選擇策略。高效的親和性選擇技術(shù)的實例是噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、酵母展示、細(xì)菌展示或RNA/DNA適體方法。這些體外生物選擇的方法共同之處在于配體組庫由DNA或RNA編碼。這允許通過測序增殖和鑒定所選配體。例如，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被用于對實質(zhì)上任何靶標(biāo)具有非常高的結(jié)合親和性的抗體分離。
[0164]當(dāng)使用生物系統(tǒng)時，一旦選擇載體系統(tǒng)，并將一個或多個編碼興趣多肽的核酸序列克隆至文庫載體中，人們可以通過在表達(dá)前進行誘變生成克隆分子中的多樣性；可替換地，可以在進行誘變和額外的選擇循環(huán)之前表達(dá)和選擇編碼蛋白。
[0165]通過標(biāo)準(zhǔn)分子方法進行編碼結(jié)構(gòu)優(yōu)化多肽的核酸序列的誘變。特別使用聚合酶鏈反應(yīng)，或 PCR(Mullis 和 Faloona(1987)Methods Enzymol.，155:335，并入此處作為參考)。PCR是本領(lǐng)域公知的，其使用由熱穩(wěn)定、DNA依賴的DNA聚合酶催化多個循環(huán)的DNA復(fù)制，來擴增感興趣的祀標(biāo)序列。多種抗體文庫的構(gòu)建已經(jīng)在Winter等人(1994) Ann.Rev.1mmunology 12，433-55中討論了，其在此引做參考。
[0166]可替換地，考慮到根據(jù)本發(fā)明多肽的短鏈長度，優(yōu)選變體從頭合成，并插入合適的表達(dá)載體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行肽合成，如上所述。自動肽合成儀可廣泛獲得，如 Applied Biosystems ABI433 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ?
[0167](ii)遺傳編碼的多樣性
[0168]在一個實施方案中，感興趣多肽是遺傳編碼的。這提供了增加的多樣性和容易處理的優(yōu)點。遺傳多肽文庫的一個實例是mRNA展示文庫。另一個實例是可復(fù)制的遺傳展示包(rgdp)文庫，如噬菌體展示文庫。在一個實施方案中，感興趣多肽是作為噬菌體展示文庫而遺傳編碼的。
[0169]因而，在一個實施方案中本發(fā)明的復(fù)合物包含可復(fù)制的遺傳展示包(rgdp)，如噬菌體顆粒。在這些實施方案中，核酸可包含于噬菌體基因組。在這些實施方案中，多肽可包含于曬菌體衣殼。
[0170]在某些實施方案中，本發(fā)明可用于生成遺傳編碼的多肽組合文庫，所述多肽通過將許多核酸翻譯成相應(yīng)的多肽、并將所述分子支架的分子連接至所述多肽而產(chǎn)生。
[0171] 遺傳編碼的多肽組合文庫可以由噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示、細(xì)菌展示或mRNA展示生成。
[0172]用于進行噬菌體展示的技術(shù)和方法可見于W02009098450。
[0173]在一個實施方案中，可如下所述進行篩選:使多肽配體的文庫、套或組與靶標(biāo)接觸，并分離結(jié)合所述靶標(biāo)的一個或多個成員。
[0174]在另一個實施方案中，所述文庫、套或組的個體成員與篩選中的靶標(biāo)接觸，鑒定與所述靶標(biāo)結(jié)合的所述文庫的成員。
[0175]在另一個實施方案中，所述文庫、套或組的成員同時與靶標(biāo)接觸，選擇結(jié)合所述靶標(biāo)的成員。
[0176]靶標(biāo)可以是肽、蛋白、多糖、脂質(zhì)、DNA或RNA。
[0177]靶標(biāo)可以是受體、受體配體、酶、激素或細(xì)胞因子。
[0178]革巴標(biāo)可以是原核蛋白、真核蛋白、或archeal蛋白(無對應(yīng)中譯文)。更特別地,革巴標(biāo)配體可以是哺乳動物蛋白或昆蟲蛋白或細(xì)菌蛋白或真菌蛋白或病毒蛋白。
[0179]靶標(biāo)配體可以是酶，如蛋白酶。
[0180]應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明還包括從根據(jù)本發(fā)明的篩選中分離的多肽配體。在一個實施方案中，本發(fā)明的篩選方法進一步包括以下步驟:制備一定量的作為能夠結(jié)合所述靶標(biāo)而分離的多肽。
[0181]本發(fā)明還涉及具有兩個以上環(huán)的肽配體。例如，可通過連接與根據(jù)本發(fā)明的分子支架相連的雙環(huán)多肽的N和C端，生成連接至分子支架的三環(huán)多肽。在該方式中，連接的N和C端產(chǎn)生第三個環(huán)，生成三環(huán)多肽。該實施方案不需要在噬菌體上進行，但是可在如文中所述的多肽-分子支架的綴合物上進行。連接N和C端是常規(guī)的肽化學(xué)問題。如果需要任何指導(dǎo)的情況下，C末端可以被激活和/或N和C端可延伸，例如向每一端加入半胱氨酸，然后通過二硫鍵合將它們連接?？商鎿Q地，可通過使用引入N/C端的接頭區(qū)域來實現(xiàn)連接。可替換地，通過常規(guī)的肽鍵連接N和C端?？商鎿Q地，可以采用連接N和C端的任何其它適當(dāng)?shù)姆椒?，例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行N-C-環(huán)化,例如,在Linde等人Peptide Science90,671-682 (2008)〃Structure_activity relationship and metabolic stabilitystudies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides'或在 Hess 等人 J.Med.Chem.51，1026-1034 (2008)"backbone cyclic peptidomimeticmelanocortin-4receptor agonist as a novel orally administered drug lead fortreating obesity〃中公開的那些。這樣的三環(huán)分子的一個優(yōu)點是避免了游離端蛋白水解的降解，特別是由外切蛋白酶作用引起的。該性質(zhì)的三環(huán)多肽的另一個優(yōu)點是第三環(huán)可被用于一般的應(yīng)用功能，如BSA結(jié)合、細(xì)胞進入或運送作用、標(biāo)記或任何其它這種用途。應(yīng)當(dāng)指出的是，該第三環(huán)一般不用于選擇(因為其不是在噬菌體上產(chǎn)生的，而僅僅是在多肽-分子支架綴合物上產(chǎn)生的)，因而有利地用于其它這種生物功能，留下環(huán)I和2用于特異性的選擇/產(chǎn)生。
[0182](iii)噬菌體純化
[0183]可以使用任何適合的純化噬菌體的方法。在本發(fā)明中可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，通過過濾或沉淀純化曬菌體，如PEG沉淀；可如之前所描述的,通過聚乙二醇(PEG)沉淀生產(chǎn)和純化噬菌體顆粒。細(xì)節(jié)參見W02009098450。
[0184]如果需要進一步的指導(dǎo)，可參照J(rèn)espers等人(Protein Engineering Designand Selection200417 (10):709-713.Selection of optical biosensors fromchemisynthetic antibody libraries)。在一個實施方案中，可如其中所教導(dǎo)的純化卩遼菌體。該公開的正文特別地引入文中作為噬菌體純化方法的參考；特別地，參考Jespers等人第709頁右欄下部材料和方法章節(jié)的開始部分。
[0185]而且，可以如Marks等人J.Mol.Biol222卷pp581_597所公開的純化噬菌體，如何進行噬菌體生產(chǎn)/純化的具體描述尤其并入此處引做參考。
[0186](iv)反應(yīng)化學(xué)
[0187]本發(fā)明利用多肽修飾的化學(xué)條件，其有利地保留產(chǎn)物遺傳編碼元件的功能和完整性。特別地，當(dāng)遺傳編碼元件是展示在編碼其的噬菌體表面上的多肽時，化學(xué)方法有利地并不損害噬菌體的生物完整性。一般地，條件在W02009098450中設(shè)定了。
[0188](c)根據(jù)本發(fā)明多肽配體的用途
[0189]根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的多肽配體可用于體內(nèi)治療和預(yù)防的應(yīng)用、體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用、體外試驗和試劑應(yīng)用等。具有選定特異性水平的配體在涉及檢測非人動物的應(yīng)用中是有用的，其中希望有交叉反應(yīng)，或在診斷應(yīng)用中是有用的，其中需要仔細(xì)控制與同系物或旁系物的交叉反應(yīng)。在某些應(yīng)用中，例如疫苗應(yīng)用中，可利用激發(fā)對預(yù)定范圍抗原的免疫反應(yīng)的能力定制特定疾病和病原體的疫苗。
[0190]優(yōu)選將至少90至9 5%同質(zhì)性的基本上純的肽配體施用于哺乳動物，最優(yōu)選98至99%或更高同質(zhì)性的基本上純的肽配體用于藥學(xué)應(yīng)用，特別是當(dāng)哺乳動物是人時。一旦部分純化、或純化至希望的同質(zhì)性，所選的多肽可用于診斷或治療(包括體外的)或開發(fā)和進行試驗步驟、免疫突光染色等等(Lefkovite和Pernis, (1979和1981) ImmunologicalMethods,卷 I 和 II，Academic Press, NY)。
[0191]本發(fā)明的肽配體典型地在預(yù)防、抑制或治療炎癥狀態(tài)、變應(yīng)性超敏反應(yīng)、癌癥、細(xì)菌或病毒感染、和自體免疫性疾病(其包括但不局限于I型糖尿病、多發(fā)硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、和重癥肌無力)中是有用的。
[0192]在本申請中，術(shù)語“預(yù)防”包括在疾病誘發(fā)之前施用保護性組合物。“抑制”指誘導(dǎo)事件之后，但在疾病的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)前施用組合物?！爸委煛鄙婕凹膊〉陌Y狀明顯之后施用保護性組合物。
[0193]可用于篩選肽配體保護免受疾病或治療疾病有效性的動物模型系統(tǒng)是可獲得的。本發(fā)明促進了動物模型系統(tǒng)的利用，其允許開發(fā)能與人和動物靶標(biāo)交叉反應(yīng)的多肽配體，以允許使用動物模型。
[0194]檢驗易感小鼠中系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法是本領(lǐng)域公知的(Knight等A.(1978)J Exp.Med.，147:1653;Reinersten 等人(1978)New Eng.J:Med.，299:515)。通過使用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導(dǎo)疾病，在S幾/J雌性小鼠中檢測到重癥肌無力(MG) (Lindstrom 等人.(1988)Adv.1nzn7unol.，42:233)。通過注射 II 型膠原蛋白在小鼠易感株中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Stuart等人(1984) Ann.Rev.1mmunol.，42:233)。已經(jīng)描述了通過注射結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎的模型(Van Eden等人(1988)Nature，331:171)。如所述，通過施用甲狀腺球蛋白在小鼠中誘導(dǎo)甲狀腺炎(Maron等人(1980) J.Exp.Med.，152:1115)。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)是天然發(fā)生的或如Kanasawa等人(1984)Diabetologia, 27:113所述的在某些小鼠株中誘導(dǎo)。小鼠和大鼠中的EAE用作人MS的模型。在該模型中，通過施用髓鞘堿性蛋白誘導(dǎo)脫髓鞘疾病(參見Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer 等人編.,Grune 和 Stratton, NewYork, pp.179-213;McFarlin 等人(1973)Science, 179:478:以及 Satoh 等人(1987)J;Immunol., 138:179)。
[0195]一般地，本發(fā)明的肽配體將以純化形式與藥學(xué)上合適的載體一起使用。典型地，這些載體包括任何包括鹽和/或緩沖介質(zhì)的水溶液或醇/水溶液、乳液或懸浮液。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉和乳酸林格氏液。如果需要保持懸浮液中的多肽復(fù)合物，可以從增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽中選擇合適的生理學(xué)上可接受的佐劑。
[0196]靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑和電解質(zhì)補充劑，如基于林格氏右旋糖的那些。也可存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982) RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences,第 16 版)。
[0197]本發(fā)明的肽配體可作為獨立施用的組合物或與其它試劑聯(lián)合施用。其可以包括抗體、抗體片段和各種免疫治療藥物，例如環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、亞德里亞霉素或順鉬、和免疫毒素。藥物組合物可包括各種細(xì)胞毒性或其它試劑組合本發(fā)明的所選抗體、受體或其結(jié)合蛋白的“混合物”，或甚至具有不同特異性的根據(jù)本發(fā)明的所選多肽的組合，如使用不同靶標(biāo)配體所選的多肽，無論是否在施用之前將其合并到一起。
[0198]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用途徑可以是任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常知道的那些。對于治療，包括但不局限于免疫治療，所選的本發(fā)明的抗體、受體或其結(jié)合蛋白可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)施用給任何患者?？梢酝ㄟ^任何合適的模式施用，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)肺途徑、或也適當(dāng)?shù)?，通過直接的導(dǎo)管輸注。施用的劑量和頻率取決于患者的年齡、性別和狀態(tài)、其它藥物的同時施用、禁忌癥和臨床醫(yī)生需要考慮的其它參數(shù)。
[0199]本發(fā)明的肽配體可被凍干用于保存，并在使用前在適當(dāng)?shù)妮d體中重配。表明該技術(shù)是有效的，可以使用本領(lǐng)域公知的凍干和重配技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解凍干和重配將導(dǎo)致不同程度的活性損失，可能不得不向上調(diào)整使用水平以補償該活性的損失。
[0200]可施用包含本發(fā)明肽配體或其混合物的組合物用于預(yù)防性和/或治療性治療。在某些治療的應(yīng)用中，實現(xiàn)所選細(xì)胞群的至少部分抑制、抑制、調(diào)控、殺死、或某些其它可測量參數(shù)的足夠的量被定義為“治療有效劑量”。需要實施該劑量的量將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)，但是通常范圍從每千克體重0.005至5.0mg選擇的肽配體，0.05至2.0mg/kg/劑量的劑量更常使用。為了預(yù)防的應(yīng)用，含有本發(fā)明肽配體或其混合物的組合物還可以以相似或稍低劑量施用。
[0201]含有根據(jù)本發(fā)明肽配體的組合物可用于預(yù)防和治療設(shè)置，以輔助改變、失活、殺死或移除哺乳動物中所選的靶標(biāo)細(xì)胞群。另外，所選的文中所述的多肽組庫可用于體外或體外選擇性殺死、消除或有 效地從異質(zhì)細(xì)胞集合中移除靶標(biāo)細(xì)胞群。來自哺乳動物的血液和選擇的肽配體可體外組合，從而殺死或從血液中移除不想要的細(xì)胞，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)重輸回哺乳動物。[0202](D)多肽的突變
[0203]典型地，通過在一個或多個位置改變選擇的分子生成希望的多樣性。選擇待改變的位置,從而構(gòu)建環(huán)序列中各獨立位置的文庫。合適時,可從選擇步驟中忽略一個或多個位置，例如，如果很明顯這些位置中不存在不損失活性的突變。
[0204]然后或者可通過隨機化實施變異，在其間原位氨基酸被任何氨基酸或其類似物、天然或合成的氨基酸取代，產(chǎn)生非常大量變體，或者可通過用一個或多個限定的氨基酸亞組取代原位氨基酸，產(chǎn)生數(shù)量更有限的變體。
[0205]已經(jīng)報道了引入這種多樣性的各種方法。用于突變所選位置的方法也是本領(lǐng)域公知的，包括使用錯配的寡核苷酸或簡并的寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通過靶向抗原結(jié)合環(huán)的突變，產(chǎn)生了一些合成的抗體文庫。在本發(fā)明的上下文中可以使用相同的技術(shù)。例如，人破傷風(fēng)類毒素結(jié)合Fab的H3區(qū)域已被隨機化而產(chǎn)生一系列新的結(jié)合特異性(Barbas 等人(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4457)。隨機或半隨機 H3 和 L3 區(qū)域已被附加到種系V基因節(jié)段，其產(chǎn)生具有突變的框架區(qū)的大文庫(H00genb00m-&Winter(1992)R Mol.Biol., 227:381;Barbas 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4457;Nissim 等人(1994) EMBO J, 13:692; Griffiths 等人(1994) EMBO J, 13:3245; De Kruif 等人(1995)J.Mol.Biol.，248:97)。該多樣化已經(jīng)擴展到包括一些或全部其它抗原結(jié)合環(huán)(Crameri等人(1996) Nature Med.，2:100; Riechmann 等人(1995) BiolTechnology, 13:475;Morphosys,W097/08320,見上)。
[0206]但是，由于用于本發(fā)明的多肽比抗體更小，優(yōu)選的方法是重頭合成突變體多肽。結(jié)構(gòu)化多肽的誘變連同文庫的構(gòu)建在上面描述了。
[0207]參照以下實施例進一步描述本發(fā)明。
[0208]實施例
[0209]材料和方法
[0210]噬菌體文庫的克隆
[0211]根據(jù)Heinis 等人，Nat Chem Biol2009, 5(7)，502-7)生成噬菌體文庫。在Heinis等人中，以正確的方向?qū)⒕幋a具有序列Xaa-Cys- (Xaa) 3_Cys_ (Xaa) 3_、接頭Gly-Gly-Ser-Gly、和兩個無二硫化物的結(jié)構(gòu)域Dl和D2的半隨機肽的基因(Kather，等人，J Mol Biol2005，354 (3) ,666-78)克隆至噬菌體載體fdOD12中，得到“文庫3x3”。編碼肽組庫和兩個基因3結(jié)構(gòu)域的基因在兩個連續(xù)的PCR反應(yīng)中分步生成。首先，用兩個引物(5，-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3，)和 sfi2fo(5，-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCATTGACAGG-3J PCR擴增Dl和D2的基因；限制性位點下劃線表示，使用載體fdg3p0ss21 (Kather,等人，J Mol Biol2005, 354 (3)，666-78)作模板。第二，使用引物 sficx3ba:5’ -TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCANNKTGTNNKNNKNNKTGCNNKNNKN NKNNKTGTNNKGGGCGGTTCTGGCGCTG-3’ (限制性位點是下劃線部分)和sfi2fo，在PCR反應(yīng)中附加編碼隨機肽的DNA0 55和11 μ g Sfi1-消化的fdOD12質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的連接在1020x20cm氯霉素(30 μ g/ml)2YT的板上生成5.6xl08個菌落。用補充有15%甘油的2YT介質(zhì)從板上剝離菌落，保存在-80°C。采用相同的技術(shù)進行文中描述的文庫構(gòu)建，以生成例如3x3文庫的半隨機肽Pro-Ala-Met-Ala-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)3-Cys,因而用以下替代 sficx3ba 引物序列:5’_TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATGTNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3，。根據(jù)相同的方法生成具有其它環(huán)長度的文庫。
[0212]B策菌體選擇
[0213]噬菌體文庫的甘油儲液在500ml2YT/氯霉素(30 μ g/ml)培養(yǎng)物中稀釋至OD6tltl=0.1，在30 °C下過夜生產(chǎn)噬菌體(15-16小時)。如Heinis,等人，NatChemBiol2009, 5(7)502-7所述，純化和化學(xué)修飾噬菌體，生物素化hPK(3y g) (IHPKA,來自人血衆(zhòng)，Innovative Research, Novi, MI, USA)與50 μ I預(yù)先清洗的磁性鏈霉親和素珠(Dynal,來自Invitrogen的Μ-280, Paisley,英國)在室溫下孵育10分鐘。清洗珠3次,而后用含 1%BSA和 0.l%Tween20 的 0.5ml 清洗緩沖液(IOmM Tris-Cl, pH7.4，150mM NaCl, IOmMMgCl2, ImM CaCl2)在室溫下旋轉(zhuǎn)封閉30分鐘。隨后通過加入含有3%BSA和0.3%Tween20的Iml清洗緩沖液封閉化學(xué)修飾的噬菌體(典型地101(l-10nt.u.溶解于2ml清洗緩沖液)。而后封閉的珠與封閉的化學(xué)修飾的噬菌體混合，在室溫下在旋轉(zhuǎn)輪上孵育30分鐘。用含有0.l%Tween20的清洗緩沖液清洗珠8次，并用清洗緩沖液清洗2次，而后用100 μ 150mM甘氨酸，pH2.2孵育5分鐘。將洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)移到50 μ IlM Tris-Cl, ρΗ8進行中和，與30mlOD600=0.4的TGl細(xì)胞在37°C下孵育90分鐘，將細(xì)胞鋪板于大的2YT/氯霉素板。使用相同的過程進行一或二輪額外的選擇。在第二輪選擇中，包被親和素的磁珠被用來防止鏈霉親和素特異性肽的富集。根據(jù)供應(yīng)商的說明書，通過0.8mg親和素(Pierce, Rockford, IL, USA)與0.5ml甲苯磺?；せ畹拇胖?Dynal,來自Invitrogen的M-280, Paisley,英國)反應(yīng)制備親和素珠。
[0214]人、猴子和大鼠PK的克隆和表達(dá) [0215]人、猴子和大鼠PK的催化結(jié)構(gòu)域在哺乳動物細(xì)胞中作為失活的前體表達(dá)，所述失活的前體具有通過ProTEV切割位點而N端連接至催化結(jié)構(gòu)域的前肽?？寺”磉_(dá)載體，并如下所述表達(dá)、激活和純化蛋白。編碼PK信號序列、多組氨酸標(biāo)簽、proTEV切割位點、PK的成熟催化結(jié)構(gòu)域和終止密碼子的合成基因購自Geneart (雷根斯堡，德國)(補充材料)。制備含有人、猴子(Macaca mulatta)和大鼠PK合成基因的質(zhì)粒DNA，使用限制性酶對XhoI和HindIII (Fermentas,維爾紐斯，拉脫維亞)，以及T4DNA連接酶(Fermentas)將基因轉(zhuǎn)移到PEXPR-1BA42哺乳動物表達(dá)載體(IBA Biotechnology, GdttingeM惠國)。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XL-1藍(lán)色電效能細(xì)胞(Stratagene, Santa Clara, USA),鋪板于含氨節(jié)西林(10 μ g/ml)的2YT瓊脂板上。生成來自三個表達(dá)載體的DNA (命名為mPK、rPK和hPK)，通過DNA測序確認(rèn)正確的序列(Macrogen,首爾，韓國)。
[0216]如下所述在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)三種直系同源血漿激肽釋放酶。50ml懸浮液配制的HEK-293細(xì)胞生長在不含血清的ExCel 1293介質(zhì)中(SAFC Biosciences, St.Louis，MO)，所述介質(zhì)中存在4mM谷氨酰胺和組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸(3.75mM),在 100mL 燒瓶中在存在 5%C02、在 37 °C 下在 ISF-4-W 培養(yǎng)箱(KiihnerAG，Birsfelden,瑞士)中以180rpm的軌道振蕩。胚腎(HEK-293)細(xì)胞在高細(xì)胞密度下(20xl06細(xì)胞/ml) (Backliwal,等人 Biotechnol Bioeng2008, 99(3)，721-7)使用線性聚乙烯亞胺(PEI, Polysciences, Eppenheim,德國)被三種質(zhì)粒(300 μ g/ml)轉(zhuǎn)染。在7天的生產(chǎn)相結(jié)束時，在4°C、2500rpm離心15分鐘，收獲細(xì)胞。通過0.45 μ m PES膜(Filter_top250ml低蛋白結(jié)合TPP)過濾從介質(zhì)中除去任何額外的細(xì)胞碎片。使用N1-NTA樹脂、清洗緩沖液(500mMNaCl, 25mM Na2HPO4, pH7, 4)和洗脫緩沖液(500mM NaCl, 25mM Na2HPO4, pH7, 4，500mM 咪唑)通過Ni親和性色譜純化帶有多組氨酸標(biāo)簽的蛋白。用(50單位)proTEV(Promega, Madison,威斯康星州，USA)部分激活蛋白，用Ni親和性色譜和凝膠過濾O3Dio柱，150mM NaCl, O, 5mMEDTA, 50mM HEPES, pH7)額外地純化蛋白。
[0217]開發(fā)具有改進的結(jié)合活性的多肽
[0218]各位置的隨機化
[0219]文庫構(gòu)建:為了繪制結(jié)合雙環(huán)肽的激肽釋放酶中的氨基酸，構(gòu)建了一套小文庫。對于含有2個5殘基環(huán)的雙環(huán)，生成10個獨立的文庫，其中每個文庫在肽序列中特定密碼子上隨機化。設(shè)計各文庫的寡核苷酸，以通過位點定向誘變突變噬菌體基因組DNA。誘變包括感興趣密碼子的隨機化(變成NNS)，從模板基因組序列中移除獨特的ApaLl限制性位點。使用QIAgen QIAquick PCR純化試劑盒純化誘變產(chǎn)物，其中在超純水中洗脫。使用各文庫，通過使用BioRad Micropulser儀器(Ecl程序)和1_ BioRad比色皿，通過電穿孔分別轉(zhuǎn)化TGl大腸桿菌。I小時后在37C下、Iml SOC介質(zhì)中回收，文庫轉(zhuǎn)化體過夜生長在含抗生素的25ml2TY肉湯中，以選擇性地僅生長文庫轉(zhuǎn)化體。通過離心收獲細(xì)菌，使用QIAgenPlasmid Plus Midi試劑盒從大腸桿菌中純化文庫噬菌體DNA，并在蒸餾水中洗脫。NewEngland Biolabs緩沖液4中用ApaLl將純化的DNA消化2小時，以除去母體物質(zhì)。消化后，用QIAgen PCR純化試劑盒(如上所述)再純化DNA，并將其用于轉(zhuǎn)化TGl (電穿孔；如上所述)。在SOC中回收I小時后，將轉(zhuǎn)化體鋪板于含選擇性抗生素的LB瓊脂板上，使菌落在37C下過夜生長。
[0220]個體克隆的結(jié)合試驗:隨機挑選文庫轉(zhuǎn)化體菌落，作為個體培養(yǎng)物在含有選擇性抗生素的2TY肉湯中生 長。使用QIAgen PyroMark Q96DNA測序儀DNA測序所挑選的菌落，以揭示在每個克隆中存在氨基酸取代。分離時，如下所述分析了各獨特取代的克隆的人血衆(zhòng)激肽釋放酶結(jié)合。從培養(yǎng)物中收獲含卩遼菌體的上清，根據(jù)Heinis等人(Nature ChemicalBiology卷5pp502-507 (2009))的方法用三溴甲基苯(TBMB)環(huán)化噬菌體。使用基于同質(zhì)板的結(jié)合試驗，分析該步驟中純化的噬菌體對生物素化人血漿激肽釋放酶的結(jié)合；在BMGLabtech Pherastar FS板閱讀器上測量試驗的讀取。來自一式三份試驗樣品的定量結(jié)合數(shù)據(jù)取平均(平均值)，表示為信號:背景(其中背景是沒有靶標(biāo)物質(zhì)的試驗樣品)。信號:背景表示為平行母體樣品的％。誤差條指示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。所示的試驗代表至少2個獨立的實驗。分析數(shù)據(jù)用肽序列校對?；疑珮?biāo)記的取代是未檢測(不是分離自隨機文庫取樣的克隆)。平行分析未結(jié)合的雙環(huán)樣品(任意的)，以說明試驗的基線。
[0221]肽結(jié)構(gòu)域的隨機化
[0222]文庫構(gòu)建:根據(jù)上述Heinis等人在“噬菌體文庫的克隆”中描述的方法生成小的曬菌體文庫。修飾sficx3ba引物,從而使編碼雙環(huán)的部分基于母體5x5雙環(huán)(5x5:兩個
5-殘基的環(huán))DNA序列，其中僅4-6個密碼子隨機化成NNS。隨機化密碼子是編碼感興趣肽結(jié)構(gòu)域/基序的那些。
[0223]個體克隆的結(jié)合試驗:挑選文庫轉(zhuǎn)化體菌落、或選擇輸出的菌落，作為個體培養(yǎng)物在含有選擇性抗生素的2TY肉湯中生長。使用QIAgen PyroMark Q96DNA測序儀DNA測序所挑選的菌落，以揭示在每個克隆中存在的氨基酸取代，如下所述分析了其對人血漿激肽釋放酶的結(jié)合。從培養(yǎng)物中收獲含卩遼菌體的上清，根據(jù)Heinis等人(Nature ChemicalBiology卷5pp502-507 (2009))的方法用三溴甲基苯(TBMB)環(huán)化噬菌體。使用基于同質(zhì)板的結(jié)合試驗，分析該步驟中純化的噬菌體對生物素化人血漿激肽釋放酶的結(jié)合；在BMGLabtech Pherastar FS板閱讀器上測量試驗的讀取。來自一式三份試驗樣品的定量結(jié)合數(shù)據(jù)取平均(平均值)，表示為信號:背景。所示的分析數(shù)據(jù)代表至少2個獨立的實驗。分析數(shù)據(jù)用肽序列校對。
[0224]雙環(huán)肽的合成和純化
[0225]肽序列如表1和2所示。肽合成基于Fmoc化學(xué)、使用Peptide Instruments制造的Symphony肽合成儀進行。使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc氨基酸(Sigma, Merck),其具有以下的側(cè)鏈保護基:Arg(Pbf);Asn(Trt);Asp (OtBu);Cys(Trt);GIu(OtBu);Gln(Trt);His (Trt);Lys(Boc);Ser (tBu) ; Thr (tBu) ; Trp (Boc), Tyr (tBu) (Sigma)。偶聯(lián)試劑是 HCTU (Pepceuticals)，二異丙基乙胺(DIPEA，Sigma)用作堿，用20%DMF中的哌啶(AGTC)實現(xiàn)脫保護。使用0.37mmole/gr Fmoc-Rink酰胺AM樹脂(AGTC),在IOOumole規(guī)模上進行合成，以相對于氨基酸而言4倍過量地使用Fmoc氨基酸，以及4倍過量地使用堿。氨基酸以0.2M溶解于DMF中，HCTU以0.4M溶解于DMF，DIPEA以1.6M溶解于N-甲基吡咯烷酮(Alfa Aesar)。偶聯(lián)時間一般為30分鐘，脫保護時間為2x2.5分鐘。Fmoc-N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-OH, Merck)偶聯(lián)I小時，隨后殘基的脫保護和偶聯(lián)時間分別是20分鐘和I小時。合成后，用二氯甲烷清洗樹脂，并干燥。使用 10mL95:2.5:2.5:2.5v/v/v/w TFA/H20/iPr3SiH/ 二硫蘇糖醇持續(xù) 3 小時有效從支持物上切割側(cè)鏈保護基。切割后，通過過濾除去用過的樹脂，將濾液加入35mL已經(jīng)在-80°C中冷卻的二乙醚中。離心肽沉淀物，棄去醚上清，用冷卻的乙醚清洗肽沉淀物2次以上。然后將肽再溶解于5-10mL乙腈-水中，凍干。取少量樣品用于通過質(zhì)譜分析粗產(chǎn)品的純度(MALD1-T0F,來自Applied Biosystems的Voyager DE)。凍干后，將肽粉末溶解于補充有0.5mLlM二硫蘇糖醇的IOmL H20中的6M鹽酸胍中，并加樣到C8Luna制備型HPLC柱(Phenomenex)。用0.1 %七氟丁酸酸化溶劑(H20，乙腈)。梯度范圍為15分鐘內(nèi)30-70%乙腈、以15/20mL/分鐘的流速、使用Gilson制備型HPLC系統(tǒng)。組合含有純的線性肽物質(zhì)(如通過MALDI鑒定的)的餾分，并用三溴甲基苯(TBMB，Sigma)修飾。為此，線性肽用H20稀釋到~35mL，加入~500uL100mM乙腈中的TBMB，并且用5mLlM的H20中NH4HC03 (pH8)啟動反應(yīng)。使反應(yīng)在室溫下繼續(xù)進行~30-60分鐘，一旦反應(yīng)完成(通過MALDI判斷)，凍干。凍干后，如上述純化修飾的肽，但是用Gemini C18柱(Phenomenex)取代Luna C8,并將酸變成0.1 %三氟乙酸。合并含有正確TMB-修飾物質(zhì)的純餾分，凍干并保存在-20°C下進行儲存。
[0226]需要來自表7所示來源的非天然氨基酸。
[0227]大的或阻礙的氨基酸(NMe-Ser、NMe-Trp、NorHar、4苯基脯氨酸、Agb、Agp、NMe-Arg、Pen、Tic、Aib、Hyp、NMe-Ala、NMe_Cys、4, 4_BPA1、3, 3-DPA> Dpg、1NA1、2NA1、Aze、4芐基脯氨酸、Ind)通常偶聯(lián)I小時(20分鐘脫保護)，對于隨后的殘基進行6小時(20分鐘脫保護)。如之前所述HCTU用作偶聯(lián)劑。規(guī)模通常在50umole。
[0228]酶試駘
[0229]在1OmM Tris HCl, 150mM NaCl, IOmM MgC12, ImM CaCl2 和 lmg/mL BSA(均來自Sigma英國)pH7.4中，在25°C下,在固體黑色96孔板上進行功能性酶試驗。簡言之，
26.5pM人血衆(zhòng)激肽釋放酶(購自Stratech,英國)或500pM大鼠血衆(zhòng)激肽釋放酶(在室內(nèi)表達(dá)和純化)，在不存在或存在濃度遞增的測試肽下孵育15分鐘，而后添加產(chǎn)生熒光的底物Z-PheArg-AMC(Enzo Lifesciences英國)至在4%DMS0中的最終試驗濃度100 μ Μ。使用 Pherastar FS (BMG Labtech),在 360nm 激發(fā)和 460nm 發(fā)射下,測量 AMC 釋放。在 MARS數(shù)據(jù)分析軟件中計算(BMG labtech)反應(yīng)線性相的速率(通常5至45分鐘)。然后在Prism(GraphPad)中用該速率計算IC50和Ki。一個四參數(shù)抑制非線性回歸方程用來計算IC50。單一位點匹配(One site_fit)Ki方程用于計算Ki，對于150 μ M的底物，將Ki限制至Km。所有Ki/IC50值是至少兩個獨立實驗的平均值，并至少三個用于Ki值低于InM的肽。
[0230]肽作為TFA鹽以其粉末形式溶解，存儲溶液通常在水中制備。離心并過濾(20μπι注射器過濾器)所有的溶液，而后在280nm測量吸光度。根據(jù)肽和TMB的Trp/Tyr含量計算消光系數(shù)(TMB核心，當(dāng)包含在肽中時，具有~SOOM-1CnT1的ε )。對于具有可疑的發(fā)色性質(zhì)的含有非天然氨基酸的肽(即，NorHar、4苯基脯氨酸、3Pal、4Pal、Tic、4GuanPhe、4，4-BPA1、3，3_DPA、1NA1、2NA1、4芐基脯氨酸、Ind)，通過稱重粉末并將肽溶解于確定量的水中確定濃度。對于對激肽釋放酶的Ki在InM或更低的肽，獨立地分兩次制備。
[0231] 血漿穩(wěn)定件譜
[0232]使用三種方法評估血漿中雙環(huán)(綴合至分子支架的肽)的穩(wěn)定性。
[0233]方法1:
[0234]開發(fā)了一種快速的血漿穩(wěn)定性譜試驗，其應(yīng)用母體質(zhì)量的質(zhì)譜檢測(MALD1-TOF, Voyager DE, Applied Biosystems),直至母體肽的質(zhì)量再也觀察不到時。特別地，在35%大鼠或人血漿(血清實驗室，使用檸檬酸作為抗凝劑)存在時、在37°C下孵育200uM肽，其中補充了 Ix PBS(來自IOxPBS存儲液，Sigma)。在不同的時間點(即，t=0、3、24小時，而后是每天，直至第10天)，將2uL樣品加入到18uLl:1的乙腈:H20混合物中30mM碳酸氫銨中。樣品冷凍在_80°C直至分析的時候。對于質(zhì)譜分析，確定該肽的大約的檢測窗口，將給定時間點的乙腈=H2O稀釋的樣品直接點樣(0.7uL)在MALDI板上?；|(zhì)(α -氰基肉桂酸，Sigma，制備成含有0.1 %三氟乙酸的1:1乙腈:水中的飽和溶液)蓋在樣品(IuL)上?？稍谙嗨频募す鈴姸仍O(shè)定下，在MALDI TOF上，隨后確定時間，直到不再檢測到母體肽。應(yīng)當(dāng)指出，這是一個定性試驗，用于檢測血漿穩(wěn)定性的相對變化。
[0235]方法2:
[0236]為了更快地獲得穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)，還在95%血漿中評估了肽。在此，省去PBSJf ImM肽存儲液(DMS0中)直接稀釋于血漿(即，2.5uL存儲液至47.5uL血漿中)，指定最終濃度為50uM。在適當(dāng)?shù)臅r間點取5uL樣品，冷凍于-80°C。為了分析，將樣品解凍，與15uLl:1乙腈:甲醇混合，在13k離心5分鐘。吸取5uL含肽的上清，并與1:1乙腈:H20混合液中的30mM碳酸氫銨混合。然后將IuL該混合物點樣在MALDI板上，如上所述進行分析。如上所述，應(yīng)當(dāng)指出，這是一個用于檢測血漿穩(wěn)定性的相對變化的定性測量。
[0237]方法3:
[0238]為了定量獲得血漿穩(wěn)定性，肽存儲液(DMS0中ImM)運送到Biofocus，英國，其進行該分析。將肽用水稀釋到IOOuM,以1:20在血漿中稀釋(5uM最終濃度，血漿為95%)，適時地取樣，如上述沉淀，使用Waters Xevo TQ-MS定量。
[0239]實施例1:鑒定結(jié)合活性的優(yōu)選殘基
[0240]從表4中所示的5X5肽的實施例中，可能鑒定肽之間具有結(jié)合活性的保守氨基酸。為了確定哪個殘基對結(jié)合活性是優(yōu)選的，進一步研究了來自兩個鑒定的肽家族的代表。這些是肽06-34，其在雙環(huán)的第一環(huán)中包含了 CXWPARC基序，以及肽06-56，其在穿過雙環(huán)的兩個環(huán)中都包含CGGxxNCR基序。對于各肽序列，產(chǎn)生一套10個噬菌體的文庫，其中環(huán)殘基的9個保持恒定，另一個殘基是隨機的，從而文庫中任何氨基酸可表達(dá)在那個位置(參見上述方法中的“各位置的隨機化-文庫構(gòu)建”)。對于各文庫，在噬菌體結(jié)合試驗中篩選一套20個隨機選擇的噬菌體克隆對人激肽釋放酶的結(jié)合，以鑒定對靶標(biāo)結(jié)合重要的殘基(參見上述方法中的“各位置的隨機化-各克隆的結(jié)合試驗”)。來自該實驗的數(shù)據(jù)表示在圖4-6中。
[0241]對于肽06-34(圖4)，很明顯雙環(huán)的Argl可被多種不同的氨基酸取代，而保留或增強對人血漿激肽釋放酶的結(jié)合。相反地，由大多數(shù)氨基酸取代的殘基2、3、4、5(Trp2、Pix)3、Ala4、Arg5)大幅降低了試驗中所見的信號，該試驗設(shè)置了對高親和性結(jié)合物的嚴(yán)格截止值(cut-off)。Val6可被許多不同的氨基酸取代，并保留或增強其結(jié)合活性。在第二環(huán)中其它殘基的取代表明只有LeulO能夠被多種不同氨基酸取代而保留活性。位置7、8和9限制了取代的能力，沒有鑒定到增強結(jié)合的取代。
[0242]對于肽06-56 (圖5和6)，很明顯位置I和2上的甘氨酸是非常優(yōu)選的用于結(jié)合血漿激肽釋放酶的殘基，如位置6、8和9上的精氨酸、色氨酸和蘇氨酸。位置4上的谷氨酰胺和位置10上的蘇氨酸可被各種殘基取代，而保留良好的結(jié)合活性。三個其余的殘基-位置I上的脯氨酸、位置5的天冬酰胺和位置7的蘇氨酸具有有限的取代能力。
[0243]氨基酸取代的分析
[0244]從之前的分析中，明顯地看出對于06-34，位置I和位置6可被各種氨基酸取代，而仍然保留等同于或大于母體肽的結(jié)合活性。為了評估這些觀察是否也涉及分離的合成肽，根據(jù)圖4的發(fā)現(xiàn)設(shè)計了一套肽，其中Argl由絲氨酸取代，Val6由蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代。也合成了采用這些取代的各種組合的肽。這些取代在試驗中生成了更高的結(jié)合信號(表5)。
[0245]所有的合成肽變體在酶抑制試驗中，與06-34母體肽相比具有大約相同或增強的對人血漿激肽釋放酶的活性，表明這種類型的分析可用于微調(diào)靶標(biāo)結(jié)合親和性，表明了鑒定非常高效力的前導(dǎo)肽候選物的途徑。
[0246]還在分離的酶試驗中測試了肽對大鼠血衆(zhòng)激肽釋放酶。Argl至Serl的取代最低限度地影響對大鼠激肽釋放酶的活性，而Val6至蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸的取代產(chǎn)生了具有明顯增加的對大鼠血漿激肽釋放酶效力的肽。對人激肽釋放酶的活性完全保留了。因而，通過確定可被取代的位置，可以鑒定具有希望的特性的肽，如靶標(biāo)直系同源的交叉反應(yīng)。
[0247]為了證實用非天然氨基酸取代這兩個位置，從而具有導(dǎo)入母體肽中不存在的功能或特性的能力的可能性，06-34-03中的Argl和Val6在位置I上被丙氨酸或N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、或N-甲基絲氨酸取代，并評估結(jié)合。明顯地，如表6所示，位置1/6可以一起移除側(cè)鏈，因為RlA/V6A(06-34-03Alal，6)肽與母體相比，完全保留了效力。用N-甲基甘氨酸取代殘基1,6(06-34-03匪eGlyl，6)引起效力的降低，但是結(jié)合親和性保留在低納摩爾范圍。在位置I導(dǎo)入N-甲基絲氨酸引起效力10倍的損失，但是結(jié)合保留在皮摩爾范圍。因而，可鑒定雙環(huán)中允許肽骨架結(jié)構(gòu)變化或側(cè)鏈變化的某些位置，這些位置可考慮被用于增強蛋白酶的穩(wěn)定性、增強溶解性、降低聚集勢能和導(dǎo)入直系同源的官能團。
[0248]實施例2:ffPAR結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)分析[0249]在06-34-03肽的情況中，分析從實施例1中鑒定的WPAR基序，以鑒定WPAR基序的替代物或改進。構(gòu)建文庫，其中06-34-03的位置1、6、7、8、9和10固定、位置2、3、4和5隨機化(參見以上方法中的“肽結(jié)構(gòu)域的隨機化-文庫構(gòu)建”)。在各種嚴(yán)格度上進行對人血漿激肽釋放酶的篩選(參見以上方法中的“噬菌體選擇”)。鑒定所有的輸出序列，分析其靶標(biāo)結(jié)合(參見以上方法中的“肽結(jié)構(gòu)域的隨機化-各克隆的結(jié)合試驗”)。表17列舉了每個獨特的序列、其在選擇輸出中的相對豐度(頻率)和根據(jù)靶標(biāo)結(jié)合強度的排名。
[0250]表17表明WPAR基序給予了對人血漿激肽釋放酶最好的結(jié)合，盡管其它激肽釋放酶結(jié)合序列以高豐度從選擇中恢復(fù)。這些序列包括但不局限于:WPSR、WPAR、WSAR、WPFR、WPYR、FPFRJPFPFR。在位置2、3、4和5上最有效和豐富的基序可被總結(jié)為:W/F P x %。
[0251]表18 (A)表明WPAR和WPSR是在更嚴(yán)格的選擇輸出中最豐富的；FPFR和FPYR在較低嚴(yán)格度的選擇輸出中是豐富的。這表明WPAR樣序列比FPFR樣序列是更強的結(jié)合物。在靶標(biāo)結(jié)合試驗中(表18 (B))，各基序的分析(在06-34-03的情況中)揭示了在06-34-03序列的位置2、3、4和5的WPAR是激肽釋放酶結(jié)合的最佳序列。
[0252]實施例3:ffPAR以外序列的優(yōu)化
[0253]已經(jīng)在肽06-34-03的情況中研究了 WPAR基序及其變體。圖1證明了當(dāng)取代為其它殘基時，WPAR基序以外的某些位置能保留激肽釋放酶結(jié)合。為了研究激肽釋放酶結(jié)合的非WPAR決定簇，如以上方法中所述的“肽結(jié)構(gòu)域的隨機化-文庫構(gòu)建”用固定的WPAR序列生成噬菌體文庫，所有其它位置被隨機化(￡XWPAR￡XXXXX￡)。
[0254]80個隨機的文庫成員直接從文庫池(無選擇)分離，在高和低嚴(yán)格度下分析對激肽釋放酶的結(jié)合(參見以上方法中的“肽結(jié)構(gòu)域的隨機化-各克隆的結(jié)合試驗”)。這些在WPAR以外含有隨機序列的文庫成員表現(xiàn)出低的、或沒有對人血漿激肽釋放酶的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，表明WPAR基序的單獨存在并不足以保留可測得的激肽釋放酶結(jié)合:雙環(huán)序列中的其余部分也一定對相互作用有貢獻(xiàn)、或影響。
[0255]為了研究激肽釋放酶結(jié)合的非WPAR決定簇，用該文庫進行了對人血漿激肽釋放酶的選擇，以及分離最佳的含WPAR的肽序列。分離超過150個選擇的輸出序列，篩選對人血漿激肽釋放酶的結(jié)合(如以上方法中所述)。這些序列按激肽釋放酶結(jié)合的次序排序，前50的序列在表19中比對。表19表明在位置I的殘基不影響激肽釋放酶結(jié)合，但是在位置7看到了組氨酸的強烈一致(這支持以上實施例1中的發(fā)現(xiàn))。來自實施例1工作中的肽
06-34-03是最好的序列之一。第二環(huán)的組合物表明當(dāng)具有WPAR基序時，給予強的激肽釋放酶結(jié)合的明顯趨勢。
[0256]最好的含有WPAR的結(jié)合至人血漿激肽釋放酶的結(jié)合物具有趨勢:
[0257]CX W P A R C Vl H Vt D LC
[0258]H7、D9和LlO在含有WPAR的激肽釋放酶結(jié)合序列中是高度保守的。
[0259]在第二雙環(huán)的環(huán)中鑒定到兩個基序(位置6-10):
[0260]1.CX W P A R C T H % D LC (位置 6，7&10: “THxxL”)
[0261]2.CX W P A R C t/lH7t D LC (位置 7，8，和 10: “xHxDL”)
[0262]超過120個鑒定的人血漿激肽釋放酶結(jié)合物(選擇的輸出序列)根據(jù)其來自基序“THxxL”還是來自“xHxDL”，被分為2個不同的組。對于所有組，輸出序列的平均激肽釋放酶結(jié)合試驗信號被標(biāo)注為指定組的激肽釋放酶結(jié)合的測量(表20)。[0263]表20所示的激肽釋放酶結(jié)合試驗證明，當(dāng)雙環(huán)肽中具有WPAR基序時，‘THxxL’和‘xHxDL’基序產(chǎn)生最好的激肽釋放酶結(jié)合。2個基序‘THxDL’的組合提供了對人血漿激肽釋放酶最高的結(jié)合，包括06-34-03肽的‘THQDL’第二環(huán)序列。
[0264]實施例4:血漿穩(wěn)定性的系統(tǒng)分析
[0265] 對于抑制激肽釋放酶的雙環(huán)，適當(dāng)獲得足夠的蛋白酶穩(wěn)定性譜，從而其在血漿或其它相關(guān)環(huán)境中具有低的蛋白酶驅(qū)動的清除。在觀察大鼠血漿中母體肽的進展性消失的快速可比較的血漿穩(wěn)定性試驗(方法章節(jié)，方法I)中，發(fā)現(xiàn)N端丙氨酸(其存在于選擇的時間，原本包含在前導(dǎo)序列的合成肽中)在大鼠和人血漿中測試的所有雙環(huán)序列中被快速移除。通過合成不含N和C端丙氨酸的前導(dǎo)候選物可避免該降解。為了移除潛在的氨基和羧基肽酶的識別位點，現(xiàn)在位于前導(dǎo)候選物Cysl上的游離氨基端在肽合成期間被醋酸酐加帽，產(chǎn)生了 N端乙?；姆肿印Ｔ诘韧臏y量中，C端半胱氨酸作為酰胺被合成，從而移除潛在的羧基肽酶識別位點。因而，雙環(huán)前導(dǎo)候選物具有下述通用序列=Ac-C1AA1AA2AAnC2AAlriAA1^2AAn+3C3 (TMB) -NH2，其中“Ac”指N-端乙?；?NH2〃指C端酰胺化，其中"C1, C2, C3〃指序列中的第一、第二和第三半胱氨酸，其中"AA1"至〃AAn〃指氨基酸的位置(其性質(zhì)“AA”通過上述選擇定義)，其中〃 (TMB) 〃指已經(jīng)被TBMB或任何其它合適的反應(yīng)支架環(huán)化的肽序列。
[0266]由于Ac-06-34-18 (TMB) -NH2 對人(Ki=0.17nM)和大鼠激肽釋放酶(IC50=1.7nM)的高親和性，我們選擇該雙環(huán)用于前導(dǎo)開發(fā)。使用上述相同的快速血漿穩(wěn)定性譜試驗，Ac-06-34-18 (TMB) -NH2具有大約2天的可觀察窗口(方法章節(jié)，方法I )，其等于~2小時的大鼠血漿半衰期(如通過LC/MS定量確定的，參見以下，表23，方法3)。
[0267]為了試圖鑒定Ac-06-34-18 (TMB) -NH2中的蛋白水解識別位點，隨著時間在35%大鼠血漿中取樣肽(方法1)，使用MALD1-T0F質(zhì)譜分析各樣品的肽片段的進展性出現(xiàn)。Ac-06-34-18 (TMB)-NH2的母體質(zhì)量是1687Da。隨著時間(圖7)，出現(xiàn)的片段質(zhì)量是1548.6 (Ml)、1194.5 (M2)和 1107.2 (M3)。從 Ac-06-34-18 (TMB) -NH2 (Ac-C1S1W2P3A4R5C2L6H7Q8D9L10C3-NH2)序列中，可以計算 Ml 的峰對應(yīng)于不含 Arg5 (-R5)的 Ac-06-34-18 (TMB) -NH2。這看起來是初期蛋白水解事件，其隨后是Ac-06-34-18 (TMB) -NH2中4個氨基酸的節(jié)段WPAR的移除(M2，-WPAR)，和最后Ac-06-34-18 (TMB)-NH2的完整第一環(huán)被切除(M3，-SWPAR)(圖8)。從該數(shù)據(jù)，很明顯地Ac-06-34-18 (TMB)-NH2的Arg5是負(fù)責(zé)雙環(huán)降解的主要大鼠血漿蛋白酶識別位點。
[0268]丙氨酸取代和第一環(huán)的亂序重排:
[0269]已經(jīng)鑒定了 Arg5構(gòu)成大鼠血漿蛋白酶識別位點，進行了 Ac-06-34_18 (TMB)-NH2衍生物的化學(xué)合成行動，目的是鑒定具有更高的血漿蛋白水解穩(wěn)定性的候選物。重要的是，這種修飾不應(yīng)影響對人或大鼠激肽釋放酶的效力。通過用A2A3或A2Q3取代W2P3,以及通過使雙環(huán)的部分或完整的第一環(huán)亂序重排，進行有關(guān)WPAR序列/藥效團作用的初步探索(圖9，10)。如下表8表示序列和相應(yīng)的對激肽釋放酶的親和性。
[0270]從這些數(shù)據(jù)中，清楚地表明伴隨W2P3的移除，以系數(shù)~100000極大地降低了對激肽釋放酶的結(jié)合，有效地給予分子藥理惰性。通過四個亂序重排肽(Scram2-4)表明了氨基酸正確序列的重要性，因為其全部展現(xiàn)對激肽釋放酶親和性實質(zhì)上的降低(圖10)。奇怪的是，所有的肽具有大致相同的大鼠血漿穩(wěn)定性譜(在I至2天之間，方法1)，表明血漿蛋白酶識別位點依賴精氨酸的存在(圖7)，而不是其在序列中的位置。[0271]接著，生成五個Ac-06-34-18 (TMB) -NH2的衍生物，其中W2、P3> A4, R5和C2被其對應(yīng)的D對映體的對應(yīng)部分取代(表9)。
[0272]從該數(shù)據(jù)中，明顯地A4、R5和c2的D氨基酸取代增加了肽對血漿蛋白酶的穩(wěn)定性。由于被大鼠血漿蛋白酶切除Arg5似乎是肽降解中的第一事件，肽鍵的初始水解將發(fā)生在Arg5的N和/或C端側(cè)?？梢院侠淼卣J(rèn)為，用其D對映體取代Arg5兩側(cè)的氨基酸能通過空間阻礙阻斷相鄰肽鍵的水解。事實上，該作用在之前已經(jīng)觀察到(Tugyi等人(2005)PNAS, 102(2)，413 - 418)。
[0273]D氨基酸取代對激肽釋放酶親和性的不利作用在所有情況中是顯著的；效力損失的范圍從300-(D-Arg5)至45000倍(D_Trp2)。這表明這些側(cè)鏈正確的三維展示對激肽釋放酶雙環(huán)結(jié)合口袋的重要性。同樣顯著的是D-Ala4的作用:在此，改變單一甲基基團(作為Ala側(cè)鏈)的方向降低親和性7000倍。
[0274]N-甲某化
[0275]隨后，在第一環(huán)中的殘基系統(tǒng)性地被其N-甲基的對應(yīng)部分取代。N-甲基化作為肽鍵自身的直接保護；但是，由于缺少酰胺氫、添加了空間體積(甲基基團)和改變了優(yōu)選的扭轉(zhuǎn)角，在效力中的損失是可預(yù)期的。
[0276]表10總結(jié)了數(shù)據(jù)。
[0277]環(huán)I中氨基酸 的N-甲基化展現(xiàn)了對效力整體較小顯著的不利作用。特別是，Arg5的N-甲基化仍產(chǎn)生單數(shù)位納摩爾的結(jié)合物(與野生型肽相比，親和性降低20倍)，其大鼠血漿穩(wěn)定性超出了試驗時間(MS中沒有觀察到肽的片段化)，使得其成為有吸引力的改進的前導(dǎo)候選物。由于具有D氨基酸取代，與Arg5相鄰殘基的甲基化給予對肽增加的穩(wěn)定性，大概是通過空間干擾影響Arg5的N和/或C端肽鍵的蛋白酶催化的水解。需要注意的是，Serl可被N-甲基化，而無顯著的效力損失，表明該位置中肽骨架的完整性對結(jié)合不是很必要的。
[0278]精氨酸取代
[0279]考慮到Arg5在大鼠血漿蛋白酶識別中的重要性，在Ac-06-34_18 (TMB)-NH2前導(dǎo)中測試了一套精氨酸類似物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖11所示，效力對穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)在表11中表示。
[0280]顯著地，所有精氨酸類似物增加了肽的穩(wěn)定性，超過了試驗的窗口時間，確認(rèn)了在血衆(zhòng)蛋白酶識別中Arg5完整性的重要性。增加(HomoArg)或降低側(cè)鏈長度(Agb, Agp)均降低親和性，但是HomoArg類似物仍然產(chǎn)生非常好的結(jié)合物(Ki=2.1nM),該結(jié)合物具有增加的穩(wěn)定性。通過Arg5中的一個亞甲基基團延長氨基酸骨架(所謂的β氨基酸)而保留相同的側(cè)鏈(i3-homoArg5)也產(chǎn)生具有增強的穩(wěn)定性的結(jié)合物，但是代價是更顯著降低的親和性(Ki=8.2nM)。用苯環(huán)取代Arg側(cè)鏈的脂肪族部分產(chǎn)生了共振穩(wěn)定的、更大的、剛性的含胍基的側(cè)鏈(4GuanPhe)。在所有測試的Arg類似物中,4GuanPhe在增加的血清穩(wěn)定性方面具有最大的親和性(與野生型相比降低2倍)。有趣的是，胍基苯基基團結(jié)構(gòu)上接近已知的小分子激妝釋放酶抑制劑苯甲脈(Stiirzebecher等人(1994)，Novel plasma Kallikreininhibitors of the benzamidine type.Braz J Med Biol Res.27(8):1929-34;Tang 等人(2005), Expression, crystallization, and three-dimensional structure of thecatalytic domain of human plasma Kallikrein.J.Biol.Chem.280:41077-89)。而且，衍生的苯基胍已被用作其它絲氨酸蛋白酶uPA的選擇性抑制劑(Sperl等人(4-aminomethyl)phenylguanidine derivatives as nonpeptidic highly selective inhibitors ofhuman urokinase (2000) Proc Natl Acad Sci U S A.97 (10): 5113-8.)。因而，含有Ac-06-34-18 (TMB) -NH2的4GuanPhe5可被視為小分子抑制劑，其選擇性由周圍的雙環(huán)肽所給予。這包含了對其它基于雙環(huán)的抑制劑的原理，其中已知的低選擇性小分子抑制劑被“接枝”到雙環(huán)的正確位置，產(chǎn)生了優(yōu)良效力和選擇性的分子。
[0281]通過甲基化(SDMA，NDMA)、正電荷的移除(CU，其中胍基團被等比容但不帶電的脲基團取代)、或完全刪除Arg(AArg)，精氨酸胍基基團的修飾自身對激肽釋放酶結(jié)合效力具有強的不利作用。因而，重要的是胍基的完整性和存在，而不是在Arg5上連接至胍基或骨架的側(cè)鏈性質(zhì)。應(yīng)當(dāng)提到的是，Arg5可以被賴氨酸取代，但是又降低了親和性(參見WPAK 肽)。
[0282]總之，至此的數(shù)據(jù)表明利用HomoArg、NMeArg或4GuanPhe作為精氨酸取代的Ac-06-34-18 (TMB) -NH2可以構(gòu)建具有高親和性的血漿穩(wěn)定性增強的候選物。
[0283]實施例5:通過非天然修飾和組合增強血漿穩(wěn)定性的修飾改進前導(dǎo)候選物的效力
[0284]可通過一些機制可行地實施給定雙環(huán)候選物效力的改進。這些在實施例4中部分解決了，可以改寫為如下:
[0285]1、引入開拓疏水作用并產(chǎn)生較低的分離率(off rate )的疏水半簇，從而實現(xiàn)較高的親和性。
[0286]2、引入開拓大范圍離子相互作用的帶電基團，產(chǎn)生較快的結(jié)合率(on rate)和較高的親和性(參見例如 Schreiber 等人Rapid, electrostatically assisted associationof proteins (1996), Nature Struct.Biol.3，427-31)。
[0287]3、引入對肽另外的限制，即通過
[0288]-正確地限制氨基酸側(cè)鏈，使得與靶標(biāo)結(jié)合時熵的損失最??；
[0289]-限制骨架的扭轉(zhuǎn)角，使得與靶標(biāo)結(jié)合時熵的損失最?。?br> [0290]-以同一理由在分子中引入另外的環(huán)化。
[0291](綜述參見GentiIucci等人Curr.Pharmaceutical Design, (2010)，16，3185-203，以及 Nestor 等人,Curr.MedicinalChem(2009), 16, 4399-418)。
[0292]色氨酸和疏水類似物取代:
[0293]最初，在Trp2位點引入一系列疏水氨基酸取代，以鑒定能夠取代氧化敏感的色氨酸的候選物，并鑒定能夠提高效力的候選物(解決以上的第一點)。這些氨基酸的側(cè)鏈在圖12中顯示，親和性數(shù)據(jù)匯總于以下表12中。
[0294]如預(yù)期地，沒有修飾增加血漿穩(wěn)定性。2-萘基丙氨酸最接近Trp2，表現(xiàn)出比野生型稍弱的效力，使其成為好的Trp2抗氧化取代。有趣的是，3，3-DPA2具有與Trp非常不同的結(jié)構(gòu)，但其相應(yīng)的肽仍然保留高效力。這表明Trp接觸激肽釋放酶上的口袋能通過鑒定正確設(shè)計的疏水實體開發(fā)較高的結(jié)合親和性。
[0295]脯氨酸類似物
[0296]接著，我們驚喜地確定了 Pro3在Ac-06-34_18 (TMB) -NH2的WPAR藥效團中的作用。由于已知其在誘導(dǎo)肽骨架上額外的剛性和螺旋性中的特性，選擇4-羥基-或4-氟-反式(L)-脯氨酸(HyP3、4Flu0Pr03)(圖15，表13)。另外，Hyp上存在羥基探測了脯氨酸側(cè)鏈的溶劑可接近性。相應(yīng)衍生物的Ki幾乎與野生型相同，表明對肽骨架的任何作用是微不足道，但是也證明側(cè)鏈?zhǔn)强山咏?。為了進一步說明這一點，對Ac-06-34-18 (TMB)-NH2兩個額外的衍生物進行了測試，這兩個衍生物在Pro3側(cè)鏈的Y碳上包含大的延伸(4苯基-脯氨酸，4芐基-脯氨酸)。前者顯示明顯的效力保留，而后者則受到嚴(yán)重影響，這表明脯氨酸側(cè)鏈?zhǔn)强山咏?，但僅限于不同的修飾。盡管在這些修飾中的空間體積，血漿穩(wěn)定性與野生型是相同的。因此，這些修改不改進對其它蛋白酶的選擇性。
[0297]為了探測脯氨酸環(huán)的大小對結(jié)合的作用，高度限制的4元Ρι.ο類似物氮雜環(huán)丁烷羧酸(Aze)，以及更高柔性的6元環(huán)(哌啶酸，Pip)取代Pro3。Ac-06-34-18 (TMB) -NH2Aze3以目前所有衍生物中的最高親和性結(jié)合激肽釋放酶，超過野生型3個系數(shù)(factor)(圖14)。在環(huán)大小和Ki之間看起來是反比關(guān)系，其表明在Ac-06-34-18 (TMB)-NH2位置3的構(gòu)象限制對緊密結(jié)合分子是關(guān)鍵的。
[0298]在可容納的大體積基團中脯氨酸側(cè)鏈的柔性被雙/三環(huán)脯氨酸類似物Tic、NorHar和Ind強調(diào)(圖13)。特別是對于后二者的情況，在一位數(shù)納摩爾范圍的親和性仍然很好。
[0299]最后，我們試圖探測對Pro3上全部環(huán)結(jié)構(gòu)的要求。為此，我們選擇了氨基異丁酸(Aib，圖13，表13)，其中由于在α-碳上的雙甲基取代，其對誘導(dǎo)α或31(|螺旋的相鄰氨基酸具有強的結(jié)構(gòu)性效果(Toniolo等人(1993), Biopolymers33, 1061-72;Karle等人(1990), Biochemistry29, 6747-56)。值得注意的是,這種非天然、非環(huán)狀氨基酸在Pro3位置中耐受性良好，Ki為1.2nM。因此，Pro3在WPAR藥效團中的作用是向肽骨架引入一個限制。這種限制可以通過采用具有降低的環(huán)大小的脯氨酸類似物得到加強(見Aze3)。相反，脯氨酸環(huán)可相對有效地 被非環(huán)狀但誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的氨基酸(如Aib)取代。
[0300]多種類似物
[0301]在表10中，表明Ac-06-34-18 (TMB)-NH2環(huán)I中的Serl可以是對效力具有非常小影響的N-甲基化(WT中0.5對0.17nM Ki)。我們試圖確定該位置是否耐受位置IiCa上大的雙取代。為了這個目的，用Dpg(二丙基甘氨酸)取代Serl (圖15)。該肽對激肽釋放酶的親和性是1.1nM，表明位置I是非常柔韌的，實際上可適應(yīng)任何大的殘基。因而，環(huán)I中的該位置可用于考慮包容希望的化學(xué)功能或基團，包括增溶氨基酸、放射標(biāo)記、染料標(biāo)記、接頭、綴合位點等等。
[0302]還在位置4測試了一些丙氨酸類似物。如用N-甲基和D-丙氨酸已經(jīng)看到的(表2，3)，Ala4對Ca上的空間定位、或?qū)羌茏陨淼男揎椄叨让舾?。該類的兩個以上的衍生物強調(diào)了這點，因為在Ala4 (i3_Ala4)的肽骨架延伸大大降低親和性(~20μΜ)。正如由D-Ala4預(yù)期的，Aib4將親和性降低至幾乎相同的程度(289ηΜ，圖15和表14)。值得注意的是，Ala側(cè)鏈的延伸一個亞甲基(Aba4)看起來增強對激肽釋放酶的親和性。
[0303]最后，中央的半胱氨酸(Cys2)被更大且更限制的類似物取代，由于其降低對相鄰Arg5蛋白酶識別位點的空間進入，希望青霉胺(Pen，圖15)增加蛋白水解穩(wěn)定性。實際上，大鼠血漿穩(wěn)定性輕度增加，但是效力顯著降低，強調(diào)了該結(jié)構(gòu)性的連接有支架的殘基的充分完整性的重要性。
[0304]將增強血漿穩(wěn)定性和增強效力的非天然氨基酸組合到單一雙環(huán)前導(dǎo)中
[0305]保留相當(dāng)效力和最大大鼠血漿穩(wěn)定性的Ac-06-34-18 (TMB)-NH2中的非天然取代(如方法I所確定的)是Arg5變體高精氨酸(HomoArg5)、4_胍基苯丙氨酸(4GuanPhe5)和N-甲基精氨酸(匪eArg5)。與野生型肽相比Ac-06-34-18 (TMB)-NH2中增加效力的非天然取代是Pro3類似物氮雜環(huán)丁燒羧酸(Aze3)和Ala4類似物2_氨基丁酸(Aba4)。因而，Aze3、Ab a4與增加蛋白酶穩(wěn)定性的HomoArg5、4GuanPhe5和NMeArg5組合,來確定是否能產(chǎn)生具有高血漿穩(wěn)定性和增加效力的肽候選物。
[0306]表15和16代表了各種構(gòu)建體的親和性，以及血漿穩(wěn)定性。
[0307]首先，含有精氨酸類似物的肽的大鼠血漿半衰期(第4列，表15)的定量確定，揭示了 Arg5N-甲基化在肽的保護中是最強效的(t1/2>20小時)，隨后是HomoArg5和GuanPhe5。Arg N-甲基化的強保護作用可能并不奇怪，因為其直接防止肽鍵的水解。當(dāng)這些化合物中包含Aze3時，這些肽的親和性在所有情況中將增強，使得Ac-(06-34-18) Aze3HomoArg5和Ac-(06-34-18)Aze3NMeArg5成為進一步開發(fā)的有吸引力的候選物(表15，圖16)。
[0308]Aba4增加親和性的作用在Aze3和任何精氨酸類似物的情況下不能再現(xiàn)，因為Ki值比沒有Aba4時觀察到的Ki值高。因而，Aze3增加效力的作用不依賴于精氨酸取代的類型,而Aba4的作用則似乎不是。
[0309]最后，這些肽對大鼠激肽釋放酶的活性顯著降低(表15)。但是，這些值是相對的，在該階段并不是定量的，因為大鼠激肽釋放酶的蛋白制備并非平常，且含有雜質(zhì)。
[0310]實施例6:不含Trp的FPYR激肽釋放酶雙環(huán)前導(dǎo)的血漿穩(wěn)定性增加和Aze3引起的親和性增加。
[0311]從實施例1-4的選擇輸出中，我們發(fā)現(xiàn)一些類似Ac-06-34-18 (TMB)-ΝΗ2的序列，其具有高豐度但是含有改變的WPAR基序。其是WPSR和FPYR。后者特別有趣，因為其缺少氧化敏感的色氨酸。
[0312]合成了含有WPSR、FPYR、WPYR和FPAR的雙環(huán)，并與WPAR母體肽比較(表21)。
[0313]如預(yù)期的，沒有肽表現(xiàn)出顯著不同的血漿穩(wěn)定性。用Phe2取代Trp2導(dǎo)致Ki降低40倍，強調(diào)了需要更大的Trp2側(cè)鏈。但是，該降低可通過用Tyr4取代Ala4 (得到了 FPYR基序)補償，從而親和性再次增加到幾乎是野生型WPAR序列的水平(Ki=0.46nM)。因而，在Ac-06-34-18 (TMB) -NH2雙環(huán)的位置2和位置4的殘基之間存在協(xié)同的相互作用?？紤]到高的靶標(biāo)結(jié)合親和性和缺少Ac-06-34-18 (TMB)-NH2Phe2Tyr4中的Trp2，采用如上實施例中描述的方法研究了該候選物增加的大鼠血漿半衰期。而且，通過用非天然氨基酸類似物取代這些殘基，我們研究了 Phe2和Tyr4之間的相互作用。
[0314]Ac-06-34-18 (TMB) ~NH2Phe2Tvr4 中 Phe2/Tvr4 的非天然取代
[0315]我們進行了一套非窮盡的合成，在Ac-06-34-18 (TMB) _NH2Phe2Tyr4前導(dǎo)的Phe2或Tyr4上引入取代。從與圖F6相同的套中選擇非天然氨基酸，親和性數(shù)據(jù)總結(jié)在表22中。
[0316]此處，用任何受試氨基酸進行的取代通常是良好耐受的，不管側(cè)鏈?zhǔn)欠袷请s芳(3Pal，4Pal)、芳香的且大的(INal、2Nal、4，4-BPal)或環(huán)脂族(Cha)實體。3Pal在位置2上很好地耐受(Ki=0.91)，其有趣是因為Pal含有可電離基團(即，其能夠被開發(fā)成制劑)。但是，看起來原始的Phe2/Tyr4組合仍然最有效力。
[0317]大鼠血漿中Ac-06-34-18 (TMB)-NH2Phe2Tvr4的穩(wěn)定和氮雜環(huán)丁烷3取代的作用
[0318]用高精氨酸、4胍基苯丙氨酸和N-甲基精氨酸取代，在Aze3不存在和存在時，制備Ac-06-34-18 (TMB) _NH2Phe2Tyr4。HomoArg/4Guanphe 耐受良好，Ki 值幾乎與母體 Phe2Tyr2肽相同(表23)，且大鼠血漿穩(wěn)定性增加了 13的系數(shù)(t1/2=12.2小時，表23)。而且，對大鼠激肽釋放酶的IC50值與母體相似，表明其是有吸引力的體內(nèi)研究候選物。
[0319]在FPYR情況中Pro3至Aze3的取代也產(chǎn)生了具有增強親和性的肽候選物，事實上生成了 Ki小于InM的肽，其在大鼠(Ac-(06-34-18)Phe2Aze3Tyr4NMeArg5)中具有超過20小時的半衰期。
[0320]除非另有說明，在實現(xiàn)或測試本發(fā)明時可以使用與文中描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料。在上面描述了適合這樣的用途的方法、裝置和材料。文中引用的所有文獻(xiàn)以其全文并入文中作參考，目的是描述和公開文獻(xiàn)中報道的可用于本發(fā)明的方法、試劑和工具。
[0321]表
[0322] 表1具有不同環(huán)長度的雙環(huán)肽的靶標(biāo)特異性。表明hPK和不同旁系同源和直系同源蛋白酶的Ki值。Ki值是至少兩次測量的平均值。
[0323]
【權(quán)利要求】
1.一種對人激肽釋放酶特異的肽配體，所述肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，其中肽配體的環(huán)包含三個、四個或五個、但是少于六個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中肽配體的環(huán)包含三個氨基酸，且所述多肽具有共有序列G/xxGrRVxG,，其中G,是反應(yīng)基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽配體，其含有表3中所示的多肽之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)包括共有序列G,GGxxNG,，其中G,是反應(yīng)基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽配體,其中兩個鄰近的環(huán)包括共有序列GfGxxNGJxxxxGp
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的肽，其包含表4中所示的肽之一。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)包括基序GrXw/FPXK/KGr，其中Gr是反應(yīng)基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽配體，進一步包括含有基序G/人Hq/txL4的第二環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)含有基序GrXHxDLG,，其中G,是反應(yīng)基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽配體，其中肽配體的環(huán)包含五個氨基酸，且第一環(huán)含有基序GJHxxLG,，其中G,是反應(yīng)基團。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項所述的肽配體，其中兩個鄰近的環(huán)包含基序G^VfPxk/EGrT/LH7TDLGr0
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項所述的肽配體，其包含表4、表5或表6所示的多肽之
O
13.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項所述的肽配體，其中第一環(huán)包括序列G^WPARGp
14.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項所述的肽配體，其中第一環(huán)包括序列G^WPSRGp
15.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項所述的肽配體，其中第一環(huán)包括序列G^FPFRGp
16.根據(jù)權(quán)利要求7至11任一項所述的肽配體，其中第一環(huán)包括序列GrxFPYRGp
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16任一項所述的肽配體，其中X是S或R。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的肽配體，其中反應(yīng)基團是半胱氨酸。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的多肽配體，其含有一個或多個非天然氨基酸取代，且抵抗蛋白酶降解。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多肽配體，其中修飾的氨基酸選自N-甲基精氨酸、高精氨酸、羥基脯氨酸和胍基苯丙氨酸、和氮雜環(huán)丁烷羧酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的多肽配體，其中多肽包括含有基序G^WPARG1的第一環(huán)，其中Pro被氮雜環(huán)丁烷羧酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或R被胍基苯丙氨酸取代。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的多肽配體，其中多肽包含含有基序G,xFPYRG,的第一環(huán)，其中R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代，和/或R被胍基苯丙氨酸取代，以及其中Pro被氮雜環(huán)丁烷羧酸取代。
23.一種生產(chǎn)突變體多肽配體的方法，所述方法產(chǎn)生比母體多肽配體改進的對靶標(biāo)的結(jié)合活性水平，其中母體多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述方法包括步驟: (a)對于各環(huán)序列中兩個或更多氨基酸位置的每一個，產(chǎn)生η個不同的突變體文庫，各文庫由母體多肽組成，在母體多肽中環(huán)序列中所述氨基酸位置之一通過被η個不同的非母體氨基酸之一所取代而突變； (b)篩選各文庫對母體靶標(biāo)的結(jié)合，并對各突變評分； (c)鑒定可耐受突變的氨基酸位置；和 Cd)生成在步驟(c)中鑒定的氨基酸位置上含有一個或多個突變的一個或多個突變體多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟(d)包括制備含有在步驟(c)鑒定的兩個或更多氨基酸位置上引入突變的多肽的文庫，以及篩選文庫中具有改進的對靶標(biāo)的結(jié)合活性水平的多肽。
25.一種多肽配體的文庫，其中多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述文庫由多肽配體的m個不同突變體組成，其中環(huán)序列中限定的氨基酸位置通過被m個不同氨基酸之一所取代而突變，其中m是至少2。
26.一套多肽配體的文庫，其中多肽配體包含含有被至少兩個環(huán)序列分開的至少三個反應(yīng)基團、和與 多肽的反應(yīng)基團形成共價鍵的分子支架的多肽，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環(huán)，所述套包含兩個或更多多肽配體的文庫，各所述多肽配體的文庫由多肽配體的m個不同突變體組成，其中環(huán)序列中限定的氨基酸位置通過被m個不同氨基酸之一所取代而突變。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的一套文庫，其中m是2至20之間。
【文檔編號】C40B40/02GK103906865SQ201280049406
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月7日
【發(fā)明者】J·泰特, E·沃克, C·斯泰斯, D·托伊費爾 申請人:拜斯科醫(yī)療有限公司