專利名稱：一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片及應(yīng)用，涉及的技術(shù)領(lǐng)域是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和基因芯片技術(shù)。是一種用于幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療的檢測(cè)型基因芯片，可同時(shí)對(duì)人基因組CYP4502C19*2，CYP4502C19*3多態(tài)性和幽門螺桿菌克拉霉素、喹諾酮類耐藥位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(H. pylori,HP)是WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定的I類致癌因子。我國(guó)HP感染率為40% -90%，平均為59%，屬于HP相關(guān)疾病的重災(zāi)區(qū)。HP感染是引起慢性胃炎以及導(dǎo)致消化性潰瘍發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要原因，且與低度惡性胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，幽門螺桿菌感染為胃癌發(fā)生的病因，對(duì)幽門螺桿菌的根除可明顯降低人群胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而HP耐藥是一個(gè)全球性問(wèn)題，是HP根治率下降的主要原因。以質(zhì)子泵抑制劑(PPI)結(jié)合阿莫西林和克拉霉素(或甲硝唑)的三聯(lián)療法，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一線抗HP感染治療組合[6]。喹諾酮類藥物是HP根治的二線藥物。抗HP治療的療效主要受到以下兩個(gè)因素影響一是由于近年來(lái)抗生素的濫用，克拉霉素、甲硝唑、喹諾酮耐藥不斷上升，使得三聯(lián)療法中的克拉霉素或喹諾酮類藥物的有效率下降 ’另外一個(gè)影響三聯(lián)療法用藥成功率的重要影響因素是PPI抑制劑的使用。PPI代謝與人細(xì)胞色素P450(CYP450)同工酶CYP2C19密切相關(guān)，CYP2C19的基因多態(tài)性型決定了 PPI在人體內(nèi)的代謝速度(強(qiáng)代謝、中代謝和弱代謝)[7;8]。因此，在使用三聯(lián)療法之前，如果能夠提供準(zhǔn)確的克拉霉素或甲硝唑、喹諾酮藥敏結(jié)果和CYP2C19的類型，針對(duì)性地選擇藥物進(jìn)行個(gè)體化用藥，則能夠保證治療成功率，同時(shí)減少抗生素濫用帶來(lái)的不良反應(yīng)和資源浪費(fèi)。HP克拉霉素、喹諾酮耐藥及人CYP450基因多態(tài)性主要是由于相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)導(dǎo)致的。針對(duì)基因分型的檢測(cè)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作人員的要求高，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng) (約I周)，工作量大，且上述方法并不能提供人CYP450多態(tài)性信息，因此限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。PCR等快速檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但檢測(cè)通量較低，一次僅能檢測(cè)2-3個(gè)靶點(diǎn)，也不能完全滿足臨床實(shí)際需要。同樣，測(cè)序技術(shù)雖然為我們提供了方便、快捷的檢測(cè)方法，但其需要昂貴的儀器，而且檢測(cè)靈敏度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及芯片技術(shù)。基因芯片技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種程序化、規(guī)?；幕蚪Y(jié)構(gòu)分析與表達(dá)研究的新技術(shù)，可同時(shí)進(jìn)行單基因多位點(diǎn)或多基因多位點(diǎn)的多態(tài)性分型檢測(cè)，具有信息量大、靈敏度高、平行快速檢測(cè)等特點(diǎn)。一旦前期研究工作完成得到成熟的基因芯片產(chǎn)品(檢測(cè)探針與雜交反應(yīng)條件確定)，即可實(shí)現(xiàn)一次對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)等位基因進(jìn)行基因分型的程序化與常規(guī)化，這是其他基因分型技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)越性所在?；蛐酒?Gene Chip)是將大量的寡核苷酸分子固定于固相載體上形成DNA微點(diǎn)陣，借助核酸分子雜交配對(duì)的特性對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效解讀和分析。DNA芯片的制備方法主要有兩種一種是直接在固定面上原位化學(xué)合成一系列寡核苷酸，另一種是將預(yù)先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式點(diǎn)樣、固定在固相面上。制備好的芯片通過(guò)化學(xué)處理后即可進(jìn)行雜交反應(yīng)。病原微生物，包括細(xì)菌、病毒的基因序列研究逐步測(cè)出，為其分析提供了一個(gè)很好的切入點(diǎn)，二基因芯片又為檢測(cè)和平行研究病原微生物提供了有力的工具。將基因芯片技術(shù)用于疾病的診斷預(yù)測(cè)已成為全球研究的熱點(diǎn)，并已研制成功檢測(cè)部分細(xì)菌等微生物的基因芯片?；蛐酒夹g(shù)用于疾病診斷預(yù)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面一是高度的靈敏和準(zhǔn)確性，用樣本極少；二是快速簡(jiǎn)便、時(shí)間短；三是可同時(shí)檢測(cè)多人的多種疾病。鑒于生物芯片技術(shù)具有巨大的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，我國(guó)一些科研實(shí)力較雄厚的單位已開(kāi)展了這方面的研究工作。然而，國(guó)內(nèi)實(shí)用芯片研究多剛剛起步，截至目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)用于針對(duì)我國(guó)人群的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療的快速基因檢測(cè)芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是建立一種用于幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療的檢測(cè)型基因芯片，這種芯片能不經(jīng)培養(yǎng)在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)人基因組CYP4502C19*2，CYP4502C19*3多態(tài)性和幽門螺桿菌克拉霉素、喹諾酮類耐藥位點(diǎn)。通過(guò)分析篩選人基因組CYP4502C19*2，CYP4502C19*3的DNA及幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類耐藥位點(diǎn)DNA序列，分別設(shè)計(jì)不同的寡核苷酸片段，建立了包括檢測(cè)及鑒定基因芯片技術(shù)在內(nèi)的綜合分析檢測(cè)方法，以期達(dá)到快速、準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)目的，并進(jìn)行應(yīng)用。全球有超過(guò)半數(shù)的人感染HP，80% -90%感染者有臨床癥狀，10% -15%發(fā)展為消化性潰瘍，1% -2%發(fā)展為惡性腫瘤。幽門螺桿菌與消化道疾病的關(guān)系已經(jīng)被廣泛接受，對(duì)HP進(jìn)行根除可以治愈其引起的疾病，并能避免發(fā)展為更嚴(yán)重的疾病，有著重大的社會(huì)應(yīng)用前景。本發(fā)明主要針對(duì)幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療，通過(guò)分析篩選人基因組CYP4502C19*2，CYP4502C19*3的DNA及幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類耐藥位點(diǎn)DNA序列，分別設(shè)計(jì)不同的寡核苷酸片段，建立了包括檢測(cè)及鑒定基因芯片技術(shù)在內(nèi)的綜合分析檢測(cè)方法，以期達(dá)到快速、準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)目的，并進(jìn)行了應(yīng)用。除研制出能同時(shí)給出人基因組CYP4502C19*2、CYP4502C19*3多態(tài)性及幽門螺桿菌克拉霉素、喹諾酮耐藥信息的基因芯片，還為更多的細(xì)菌性疾病的 分子生物學(xué)檢測(cè)和鑒定以及防制建立了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片，其特征在于芯片包括(I)幽門螺桿菌23s基因上的克拉霉素耐藥突變位點(diǎn)A2142G和A2143G對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(2)幽門螺桿菌gyrA基因上的喹諾酮耐藥突變位點(diǎn)Asn87 (N87K)和Asp91 (D91G/Y/N)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(3)人細(xì)胞色素酶CYP450上質(zhì)子泵抑制劑代謝相關(guān)的2C19*2(G6981A)和2C19*3 (G636A)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(4)芯片質(zhì)量控制寡核苷酸探針；(5)寡核苷酸探針固化在載體材料上形成的探針陣列。所謂的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片是指同時(shí)檢測(cè)人CYP450代謝相關(guān)基因2C192、2C193的基因類型以及幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥基因型的寡核苷酸陣列；所謂的寡核苷酸探針是指能與目的基因雜交的多聚寡核苷酸，長(zhǎng)度十到五十個(gè)堿基;所謂的質(zhì)量控制探針至少包括兩種探針，即陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交和準(zhǔn)確定位，陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染；所謂的載體材料包括玻片、金屬片、硅片、硝酸纖維素膜。該檢測(cè)型基因芯片特征在于設(shè)計(jì)選擇了幽門螺桿菌23s基因上的克拉霉素耐藥突變位點(diǎn)A2142G和A2143G對(duì)應(yīng)的野生型和突變型、幽門螺桿菌gyrA基因上的喹諾酮耐藥突變位點(diǎn)Asn87 (N87K)和Asp91 (D91G/Y/N)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型、人細(xì)胞色素酶CYP450上質(zhì)子泵抑制劑代謝相關(guān)的2C19*2(G6981A)和2C19*3 (G636A)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型共15條SNP分型寡核苷酸探針。設(shè)計(jì)了多組對(duì)上述靶基因進(jìn)行檢測(cè)的高特異性的擴(kuò)增引物，其設(shè)計(jì)原則為每一個(gè)引物必須在對(duì)應(yīng)的靶基因的高度特異性部位，每對(duì)引物的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榘谢虻奶卣餍蛄?；引物包括了針?duì)芯片檢測(cè)所需的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、多重聚合酶鏈反應(yīng)、常規(guī)PCR、不對(duì)稱PCR等特異性引物，每一對(duì)特異性引物能夠擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)靶基因片段。這些探針的固相載體材料包括玻片、金屬片、硅片、硝酸纖維素膜等。這些固相載體表面以具有雙活性基因的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物進(jìn)行修飾，常用的具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物試劑有戊二醛、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚賴氨酸，可采用其中的一種或其中的兩種組合。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可通過(guò)標(biāo)記熒光素Cy3、熒光素Cy5、生物素的引物進(jìn)行標(biāo)記等，也可在基因擴(kuò)增過(guò)程中加入熒光素Cy3、熒光素Cy5、生物素等標(biāo)記的dUTP或dCTP。該檢測(cè)型基因芯片，能在幽門螺桿菌感染“三聯(lián)法”治療用藥前的檢測(cè)、診斷、監(jiān)測(cè)中應(yīng)用?？捎糜谫|(zhì)子泵抑制劑代謝、克拉霉素及喹諾酮耐藥情況的檢測(cè)。我們?cè)诓殚啔v年來(lái)大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，從GeneBank獲取人CYP2C19*2、CYP2C19*3和幽門螺桿菌的核苷酸序列，采用C`lustalxl. 8. msw Alignment軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析，確定相對(duì)保守區(qū)，結(jié)合了 Primer Premier5. O等專業(yè)用語(yǔ)PCR測(cè)序引物設(shè)計(jì)和評(píng)估的分析軟件，再應(yīng)用NCBI的BLAST程序進(jìn)行篩選，結(jié)合擴(kuò)增要求和引物篩選要求，進(jìn)行了 PCR引物設(shè)計(jì)?；蛐酒袘?yīng)用的探針為核酸分子探針，是已知的特定序列的核酸片段，能與互補(bǔ)的核酸序列發(fā)生分子雜交，因此可以利用探針雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)樣品中特定基因的特征片段和或測(cè)定位置基因的序列。針對(duì)靶基因組的特征性片段、染色體DNA的序列多態(tài)性、基因變異的位點(diǎn)及特征等，設(shè)計(jì)和選擇合適的核酸探針并制成芯片。通過(guò)與樣品中提取的核酸(DNA)雜交，一步檢測(cè)就可以獲得人CYP450代謝相關(guān)基因2C19*2、2C19*3的代謝信息以及幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥信息。根據(jù)核酸分子探針的來(lái)源及其性質(zhì)可以分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、肽核酸探針和寡核苷酸探針等。寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)是可以根據(jù)需要來(lái)隨心所欲地調(diào)整和合成相應(yīng)的序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重復(fù)序列所帶來(lái)的不利影響。寡核苷酸探針具有以下特點(diǎn)探針長(zhǎng)度一般為10 50bp，并且由于序列的復(fù)雜性低，雜交所需的時(shí)間較短。寡核苷酸探針還可以用于檢測(cè)個(gè)別堿基的變異，用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析。我們采用了合成寡核苷酸探針的方法。探針選擇的正確與否，將會(huì)直接影響雜交結(jié)果的分析。選擇探針最基本的原則上應(yīng)具有高度特異性，同時(shí)考慮Tm值、堿基數(shù)目和制作的方便等因素。
探針設(shè)計(jì)的原則如下(I)高度的特異性和敏感性篩選出的探針應(yīng)該位于特異性引物擴(kuò)增序列中的高保守區(qū)，以保證探針的特異性和敏感性；同時(shí)，篩選的探針應(yīng)該與其他細(xì)菌和微生物、相關(guān)動(dòng)物的基因組序列、環(huán)境中常見(jiàn)植物基因序列盡可能同源性低，以避免假陽(yáng)性結(jié)果；分型探針無(wú)交叉反應(yīng)。尋找和篩選出高度特異性的探針，這是至關(guān)重要的。(2)探針的Tm值盡可能一致因?yàn)樵谝粡埿酒弦瑫r(shí)進(jìn)行多個(gè)探針的雜交反應(yīng)，在一定的溫度下，此時(shí)各探針Tm值至關(guān)重要，如果Tm值不一致，差距過(guò)大，雜交后的信號(hào)強(qiáng)弱會(huì)受到相當(dāng)?shù)挠绊?。一般Tm值相差小于三度比較適宜。(3)篩選的探針盡可能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)探針一個(gè)最好沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、自身二聚體、錯(cuò)配等。否則容易形成錯(cuò)誤的結(jié)果。(4)盡量避免選取C、G富集區(qū)域的序列作探針。(5)各探針的互補(bǔ)序列之間不形成二聚體和錯(cuò)配等。從Gene Bank調(diào)出所需的基因序列，比較同一靶基因序列有無(wú)存在變異的情況。確定要擴(kuò)增的靶基因片段及引物后，根據(jù)上述探針設(shè)計(jì)的原則，用Primer Primer5. O等生物學(xué)軟件在所需基因的堿基對(duì)齊圖上PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)尋找出所有可能的探針，結(jié)合Clustalxl. 8. mswAlignment等同源性分析軟件找出特定祀基因序列擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的高度保守區(qū)和各自特異性序列，在特定的擴(kuò)增片段內(nèi)的高度保守區(qū)，并且具有屬、種特異性結(jié)構(gòu)的序列作為分型探針。登錄美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)主頁(yè)(http://www. ncb1. nlm. nih. gov)選擇核酸序列的 BLAST,進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)類似檢索，在核酸擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)篩選的探針與已知的其它常見(jiàn)細(xì)菌和微生物、相關(guān)動(dòng)物的基因組序列、環(huán)境中常 見(jiàn)植物基因序列盡可能同源性低，Tm值平均近似60，G+C含量約為50%,根據(jù)Blast結(jié)果，再結(jié)合需求和經(jīng)驗(yàn)，手工對(duì)篩出的探針進(jìn)行微調(diào)和修整。在后面實(shí)際的芯片雜交檢測(cè)中，根據(jù)總體需要和檢測(cè)結(jié)果，調(diào)整了部分使用的探針。選擇醛基修飾載玻片為芯片的載體，玻片為國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醛基片。將合成的探針溶于特制點(diǎn)樣液內(nèi)，采用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。將15條探針、I條陰性對(duì)照探針和一條陽(yáng)性質(zhì)控探針設(shè)計(jì)形成一個(gè)點(diǎn)樣陣列，每個(gè)玻片有10各相同的點(diǎn)樣陣列。除陽(yáng)性質(zhì)控探針外每條探針點(diǎn)3各點(diǎn)，在陣列上方平行點(diǎn)8個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控探針點(diǎn)。點(diǎn)樣完畢，芯片常溫干燥保存?zhèn)溆谩榱讼疵撔酒衔磁c醛基結(jié)合的寡核苷酸，將芯片依次用洗脫液和ddH20沖洗后，自然干燥后即可投入使用。我們收集樣本，測(cè)試比較并優(yōu)化了各種被檢樣本的處理方法，建立了快速提取高質(zhì)量目的DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。相同的樣本盡量采取相同的處理方法。針對(duì)所需片段基因，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的PCR擴(kuò)增方法在9 5 °C，變性15分鐘；然后9 5 °C，3O秒；65 °C, Imin ;這樣運(yùn)行44個(gè)循環(huán)；最后在72°C，延伸5分鐘。雜交和洗滌方法^fPCR產(chǎn)物與雜交液混合，加到所述的芯片上在45°C水浴鍋中雜交I小時(shí)后洗滌；然后加入Streptavidin_Nanogold37°C反應(yīng)30min后洗漆,置室溫晾干。顯色方法將銀染試劑A液和B液等體積混合，加到芯片上，待芯片上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的灰色或黑色圓點(diǎn)后停止顯色，用去尚子水清洗，晾干。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)芯片未見(jiàn)有非特異性的交叉反應(yīng)。對(duì)多份樣品進(jìn)行檢測(cè)，均顯示了較好的特異性和敏感性。與測(cè)序技術(shù)及熒光定量P C R方法相比，此方法可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)分析幽門螺桿菌克拉霉素、喹諾酮耐藥位點(diǎn)和PPI代謝相關(guān)人CYP2C19的基因多態(tài)性，提高了檢測(cè)效率。同時(shí)，此方法的準(zhǔn)確性與測(cè)序技術(shù)相同，而檢測(cè)靈敏度則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因測(cè)序技術(shù)，能夠檢測(cè)到患者胃部少量的幽門螺桿菌，在感染初期發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，以便在早期采取相應(yīng)的治療措施。與傳統(tǒng)的藥敏培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)相比，可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)能不經(jīng)培養(yǎng)，在6小時(shí)內(nèi)給出準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，相對(duì)藥敏培養(yǎng)的6 7天，可以大量節(jié)省了工作人員及患者的等待時(shí)間，為及時(shí)治療爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)高特異性芯片檢測(cè)的特異性是經(jīng)過(guò)雙重篩選的，與測(cè)序結(jié)果特異性一致；(2)對(duì)樣品的高通量檢測(cè)和多樣品的平行檢測(cè)能同時(shí)給出人CYP450代謝相關(guān)基因2C19*2、2C19*3的代謝信息以及幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥信息；(3)高靈敏度和可靠性檢測(cè)芯片是分子雜交技術(shù)和生物素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的新型分子診斷方法，并且在模板和探針雜交時(shí)，反應(yīng)條件和反應(yīng)體積完全一致，消除了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人為的和其它誤差；(4)檢測(cè)時(shí)間短，耗樣量少，反應(yīng)體積小，適合于臨床檢測(cè)的需要；(5)重現(xiàn)性好。


圖1 :幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片最終的探針陣列圖。圖中一個(gè)圓點(diǎn)代表探針的一次點(diǎn)樣，垂直方向的3個(gè)圓點(diǎn)為一條探針的3次重復(fù)點(diǎn)樣。虛線框內(nèi)的圓點(diǎn)為15種特異性探針，最后一條為空白對(duì)照。虛線框外的圓點(diǎn)為標(biāo)識(shí)列。圖2 :幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片特異性評(píng)價(jià)結(jié)果圖。圖中1為克拉霉素2142W-2143W，喹諾酮87-WC，喹諾酮91-MG ；2為克拉霉素2142W-2143M，喹諾酮87-MG，喹諾酮91-W ；3克拉霉素2142M-2143W，喹諾酮87-MA，喹諾酮91-W ；4為克拉霉素2142W-2143M,喹諾酮 87-WT，喹諾酮 91-MA ；5 為 CYP450_2C19*2W，CYP450-2C19*3ff ；6 為CYP450-2C19*2M，CYP450_2C19*3M。圖3 :幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片靈敏度檢測(cè)分析結(jié)果圖。以幽門螺桿菌耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)克拉霉素2142W-2143M，喹諾酮87-WT，喹諾酮91-MA及人基因組CYP4502C19*2-W，CYP4502C19*3_W為例，其中圖中A-1代表其靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果。A-1依次表示幽門螺桿菌 102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml、阻性對(duì)照，人基因組 IOng/μ l、5ng/ μ l、2ng/ μ1、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片，包括了模板的處理和擴(kuò)增；寡核苷酸探針及其固化；檢測(cè)和分析等。實(shí)施例一一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片的制備1.制備特異引物選擇幽門螺桿菌23s基因克拉霉素耐藥突變位點(diǎn)A2142G和A2143G ;幽門螺桿菌gyrA基因上的喹諾酮耐藥災(zāi)變位點(diǎn)Ash87、Asp91 ;選擇人細(xì)胞色素酶CYP450上質(zhì)子泵抑制劑代謝相關(guān)的2C19*2(G6981A)和2C19*3 (G636A)作為檢測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)(見(jiàn)表I)。所有下游引物5’端標(biāo)記生物素。表I特異性引物及其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增靶基因種類
權(quán)利要求
1.一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片，其特征在于芯片包括(I)幽門螺桿菌23s基因上的克拉霉素耐藥突變位點(diǎn)A2142G和A2143G對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(2)幽門螺桿菌gyrA基因上的喹諾酮耐藥突變位點(diǎn)Asn87(N87K)和Asp91 (D91G/Y/N)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(3)人細(xì)胞色素酶CYP450上質(zhì)子泵抑制劑代謝相關(guān)的2C19*2(G6981A)和2C19*3 (G636A)對(duì)應(yīng)的野生型和突變型SNP分型寡核苷酸探針；(4)芯片質(zhì)量控制寡核苷酸探針；(5)寡核苷酸探針固化在載體材料上形成的探針陣列。
所謂的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片是指同時(shí)檢測(cè)人CYP450代謝相關(guān)基因2C192、2C193的基因類型以及幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥基因型的寡核苷酸陣列； 所謂的寡核苷酸探針是指能與目的基因雜交的多聚寡核苷酸，長(zhǎng)度十到五十個(gè)堿基； 所謂的質(zhì)量控制探針至少包括兩種探針，即陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交和準(zhǔn)確定位，陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染； 所謂的載體材料包括玻片、金屬片、硅片、硝酸纖維素膜； SNP分型對(duì)應(yīng)的15條基因探針如下表所示 表1.特異性探針序列
2.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)設(shè)計(jì)SNP分型探針以幽門螺桿菌23s基因和gyrA基因以及人細(xì)胞色素酶CYP450基因?yàn)榘?，從中選取權(quán)利要求1所述的探針序列； 2)合成探針使用DNA合成儀合成； 3)探針處理在3’或5’末端加上polyT尾巴，并進(jìn)行氨基修飾，使它能夠固化在基質(zhì)上; 4)基因芯片的制備使用點(diǎn)樣儀在基質(zhì)上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣； 5)將點(diǎn)好的芯片在室溫放置干燥18小時(shí)以上，使探針牢固固定在基質(zhì)上。
3.如權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片的使用方法，其特征在于包括如下步驟 1)核酸提取將胃粘膜標(biāo)本按提供的試劑盒提取以獲得細(xì)菌DNA和人基因組DNA備用； 2)PCR擴(kuò)增標(biāo)記樣品PCR擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管仲加入PCR待反應(yīng)物、處理好的標(biāo)本和標(biāo)記引物，按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增 在95°C，變性15分鐘;然后95°C，30秒；65°C,lmin ;這樣運(yùn)行44個(gè)循環(huán)；最后在72°C，延伸5分鐘； 3)雜交和洗滌將PCR產(chǎn)物與雜交液混合，加到所述的芯片上在45°C水浴鍋中雜交I小時(shí)后洗漆；然后加入Streptavidin-Nanogold37°C反應(yīng)30min后洗漆,置室溫晾干。
4)顯色將銀染試劑A液和B液等體積混合，加到芯片上，待芯片上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的灰色或黑色圓點(diǎn)后停止顯色，用去離子水清洗，晾干。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療檢測(cè)基因芯片在幽門螺桿菌病原的鑒定、克拉霉素及喹諾酮耐藥分析和指導(dǎo)質(zhì)子泵抑制劑個(gè)體化用藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程類檢測(cè)產(chǎn)品及其用途。具體說(shuō)是一種幽門螺桿菌感染個(gè)體化治療的檢測(cè)型基因芯片，該芯片能同時(shí)檢測(cè)幽門螺桿菌克拉霉素耐藥突變位點(diǎn)A2142G和A2143G、喹諾酮耐藥突變位點(diǎn)Asn87(N87K)和Asp91(D91G/Y/N)和人細(xì)胞色素酶CYP450上質(zhì)子泵抑制劑代謝相關(guān)的2C19*2(G6981A)和2C19*3(G636A)位點(diǎn)的多態(tài)性。該芯片檢測(cè)法快速、準(zhǔn)確，可進(jìn)行幽門螺桿菌病原的鑒定、克拉霉素及喹諾酮耐藥分析以及質(zhì)子泵抑制劑代謝個(gè)體化差異的分析，用于指導(dǎo)幽門螺桿菌感染“三聯(lián)法”治療的個(gè)體化用藥。
文檔編號(hào)C40B50/06GK103060455SQ201310012008
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者王升啟, 姚雪, 劉琪琦, 陳蘇紅, 張敏麗, 朱坤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所