專利名稱:一種預測放射不良反應相關基因突變檢測芯片的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域,涉及一種放射不良反應相關基因突變檢測芯片。
背景技術:
惡性腫瘤是威脅人類健康的重大慢性疾病。超過一半的腫瘤患者需要進行放射治療,但腫瘤患者放療不良反應個體差異較大。過去解決腫瘤放療不良反應個體差異,集中在放療手段或技術的提高。隨著分子生物學的發(fā)展及人類基因組計劃的完成,尤其是藥物基因組學和放射基因組學的發(fā)展,使從分子基因水平尋找腫瘤放療不良反應個體差異的原因成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)一些基因或蛋白與腫瘤放療不良反應密切相關,包括癌基因、抑癌基因、細胞周期蛋白、細胞凋亡基因、生長因子、DNA修復基因等。檢測放射治療不良反應個體差異的腫瘤生物遺傳標志物,以便在放療前對不良反應進行預測和評估,將有利于臨床醫(yī)生制定放療的個體化治療方案。生物芯片技術始于上世紀80年代末和90年代初南點雜交發(fā)明人Dr.Sountern研發(fā)的反向南點雜交實驗。生物芯片產業(yè)技術主要涉及到生物芯片制備、生物芯片應用、生物芯片信息處理分析等方面。生物芯片技術已成為高效、大規(guī)模獲取相關信息的重要手段。目前生物芯片技術已廣泛應用于分子生物學研究、疾病的預防診斷與治療、新藥研發(fā)、司法鑒定、環(huán)境污染監(jiān)測和食品衛(wèi)生監(jiān)督等諸多領域。本發(fā)明采用生物芯片技術檢測與放射治療不良反應相關的基因突變位點,提前預測放射治療可能引起的不良反應,將有利于臨床醫(yī)生個體化選擇放療方案,使患者治療利益最大化。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在針對目前在腫瘤放射治療過程中,出現(xiàn)對放療不良反應個體差異的預測。提供一種方便、快捷的輔助臨床醫(yī)生制定個體化放療相關基因型診斷芯片。為了達到上述目的,本發(fā)明提供的技術方案為:—種預測放射不良反應相關基因突變檢測芯片,包括固相基片和點載在固相基片上的基因探針陣列;所述基因探針含有與放射不良反應相關基因突變位點的互補寡核苷酸序列;所述不良反應相關基因突變位點是TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880, XRCClrs25487,XRCC3 rs861539,ATM rsl801673, TP53 rsl042522 和 N0S3 rsl799983。所述 TGFB1,S0D2,XRCCl, XRCC3, ATM, TP53 和 N0S3 的序列如 SEQ ID N0.1-7 所示。其中,所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針,基因探針長度為17-22bp ;具體而言,所述基因探針包括:TGFBl rsl800469 野生型探針 5' -CAGGGTCAGTGCCGTAAT-3'(SEQ ID N0.8)
TGFBl rsl800469 突變型探針 5' -TACTGTCAAAATGCCGCT-3'
(SEQ ID N0.9)S0D2 rs4880 野生型探針 5' -GTCCTCGGGGTAATACATCCAA-3'(SEQ ID N0.10)S0D2 rs4880 突變型探針 5' -GAAGGTTTTCGGCAGACGTGAC-3'(SEQ ID N0.11)XRCCl rs25487 野生型探針 5' -CTTGTCAACATAGGATCAT-3'(SEQ ID N0.12)XRCCl rs25487 突變型探針 5' -TGGCTGCAAAATGCGATCT-3'(SEQ ID N0.13)XRCC3 rs861539 野生型探針 5' -ATGGGCCCACTGTGTTATTT-3'(SEQ ID N0.14)XRCC3 rs861539 突變型探針 5' -CCCTGAGATTACGGCTTAAA-3'(SEQ IDN0.15)ATM rsl801673 野生型探針 5' -TTGAGCTCCATTGGTCAT-3'(SEQ ID N0.16)ATM rsl801673 突變型探針 5' -TCAGACTGGTTCTCTAGT-3'(SEQ ID N0.17)TP53 rsl042522 野生型探針 5' -ACATACGTGTGCGAGGA-3'(SEQ ID N0.18)TP53 rsl042522 突變型探針 5' -ATATGAACGATGCAACA-3'(SEQ ID N0.19)N0S3 rsl799983 野生型探針 5' -AATCAACTTACTGTAAACTTG-3'(SEQ ID N0.20)N0S3 rsl799983 突變型探針 5' -AATGAGTCGCCTCCTACTAGC-3'(SEQ ID N0.21)所述基因探針還包括陽性參照探針5, -ACTCTAAGTGCTATGCC-3 ' (SEQ IDN0.22)。所述固相基片材料為硅片、玻璃片、塑料片或尼龍膜中的一種或它們的任意組合。所述基因探針及固相基片表面包被多聚賴氨酸或瓊脂糖。所述基因探針及固相基片表面修飾有氨基或醛基。下面結合原理及使用方法對本發(fā)明作進一步說明:本發(fā)明的預測放療不良反應芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針,基因探針含有放療不良反應預測相關基因突變位點的互補寡核苷酸序列,根據(jù)藥物基因組學和/或放射基因組學的研究結果,這些突變位點在人群中的發(fā)生率較高,且對腫瘤放療反應有明顯影響。此外,為了控制芯片質量,芯片上基因探針陣列里亦可設置陽性參照探針。每個突變位點設計野生型基因探針陣列和突變型基因探針陣列兩種探針,其探針長度為17-22bp。每個承載基片上可設置多個基因探針陣列即多個點樣區(qū)域。承載基片可采用硅片、玻璃片、 塑料片、尼龍膜等固相介質,其表面可經(jīng)過化學修飾。本發(fā)明預測放射不良反應相關基因芯片制造方法是:根據(jù)所需檢測的基因位點附近的堿基序列,每個突變位點設計野生型和突變型兩種探針,設計長度為17-22bp的探針,使用DNA序列合成儀合成探針,用點樣裝置將探針按一定的間距點在基片上,點樣面積可根據(jù)探針數(shù)量、探針間距、點的大小等因素進行調整,點樣后將芯片按探針與基片結合方式的不同,采取適當?shù)姆椒ㄟM行固化。然后立即使用或貯存于4° C備用。承載基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龍膜等固相介質。為提高探針與基片結合的效率和檢測靈敏度,探針和基片可作進一步修飾和包被。如其基片表面處理方式可為多聚賴氨酸包被、瓊脂糖包被、氨基或醛基化修飾。本發(fā)明預測放射不良反應相關基因突變芯片的使用方法為:(I)采樣從病人身上采血2ml ;(2)樣本處理使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA ;以下涉及到熒光標記引物及其產物的操作步驟均在避光條件下(有紅燈的暗室內)進行。(3) PCR反應擴增使用基因突變位點特異性引物通過PCR反應對DNA標本擴增,使用熒光物質或同位素對引物或dNTP進行標記;
(4)雜交取PCR產物混合液,加陽性參照溶液及預熱的雜交液,混勻,變性3分鐘后置冰上,全部轉移到放射不良反應相關基因突變檢測芯片的點樣區(qū)域(對照點樣矩陣定位芯片),加蓋玻片(注意不要有氣泡);雜交艙里加幾滴水,以保持濕度;將芯片放入雜交艙,密封雜交艙,然后放進恒溫箱或水浴保溫一小時;(5)洗片打開雜交艙,取出芯片,用洗脫液沖掉蓋玻片,然后把芯片放入洗脫液中,室溫(25° C±10° C)放置5分鐘,用滅菌雙蒸水沖洗二遍,室溫下干燥;(6)讀片推薦使用ScanArray4000掃描儀在60-85掃描強度下掃描;(7)結果分析采用人工判讀或使用配套軟件分析。根據(jù)基因型分析結果判斷腫瘤患者對放射治療的不良反應性。利用本發(fā)明的芯片,只需病人2毫升血液,便能夠再3-4小時內迅速得到結果,并配合專用軟件,向臨床醫(yī)生提供明確的建議。采用這一新的檢測芯片,醫(yī)生可以在病人放療前前對放療方案進行調整,大大減少了病人不必要的痛苦與經(jīng)濟負擔。并且,采用基因芯片技術,可以同時檢測多個變異位點,一次判斷出病人可能對放療的不良反應或耐受,檢測結果可以終生指導其放療治療。
具體實施例方式以下根據(jù)本發(fā)明制造的用于預測放療不良反應相關基因突變芯片為例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
根據(jù)臨床上選出腫瘤患者放療不良反應密切相關的基因突變位點,并選擇在中國人中發(fā)生頻率比較高、有應用價值的7個基因突變位點,制作檢測這幾個突變位點的基因型檢測芯片。用于腫瘤患者預測放射不良反應的基因芯片含有檢測7個基因突變位點的探針,這7個基因突變位點為:TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880, XRCCl rs25487,XRCC3rs861539, ATM rsl801673, TP53 rsl042522, N0S3 rsl799983?;幚?基片采用玻璃介質,其表面處理方式采用氨基化修飾。具體步驟為:(I)在2mol/L NaOH70 %乙醇溶液中清洗玻片2h后,用蒸餾水沖洗5遍,110° C烤干并冷卻至室溫;(2)將玻片置于1%的3-氨丙基三甲基娃燒-95%丙酮溶液中浸泡2min ;(3)取出后用丙酮沖洗10次,每次5min ;(4)110。C 干燥 45min;(5)在lg/L的1,4-苯二異硫氰酸鹽溶液中處理2h ;(6)用甲醇清洗5min,丙酮沖洗5min,室溫干燥。探針制備:(I)在DNA合成儀上合成所需序列的寡核苷酸(包括V端的1(Γ15個堿基的polyT);(2)在DNA序列合成儀上,將寡核`苷酸poly (T)分子臂引入活潑的脂族氨基臂。(3)以HOLC純化5'端氨基修飾的寡核苷酸,離心干燥后,溶于100mmol/LNa2C03/NaHCO3 溶液(PH9.0),濃度為 2mmol/L?;蛐酒闹谱?在一塊玻璃介質的基片上上劃分為兩個基因探針點樣區(qū)域,每個點樣區(qū)域的面積為lOmmXSmm,在每個點樣區(qū)域內的陣列式分布的基因探針陣列中第I行的探針和第I列的探針都為陽性參照探針,第2行為突變點TGFBl rsl800469基因探針,第3行為突變位點S0D2 rs4880基因探針,第4行為突變位點XRCCl rs25487基因探針,第5行為突變位點XRCC3 rs861539基因探針,第6行為突變位點ATM rsl801673基因探針,第7行為突變位點TP53 rsl042522基因探針,第8行為突變位點N0S3 rsl799983基因探針。基因探針陣列中包括野生型基因探針和突變型基因探針。基因探針如表I所不:表I
權利要求
1.一種預測放射不良反應相關基因突變檢測芯片,包括固相基片和點載在固相基片上的基因探針陣列,其特征在于,所述基因探針含有與放射不良反應相關基因突變位點的互補寡核苷酸序列;所述不良反應相關基因突變位點是TGFBl rsl800469, S0D2 rs4880,XRCCl rs25487, XRCC3 rs861539, ATM rsl801673, TP53 rsl042522 和 N0S3rsl799983。
2.如權利要求1所述的芯片,其特征在于,所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針,基因探針長度為17-22bp。
3.如權利要求1所述的芯片,其特征在于,所述基因探針包括: TGFBl rsl800469 野生型探針 5' -CAGGGTCAGTGCCGTAAT-3' TGFBl rsl800469 突變型探針 5' -TACTGTCAAAATGCCGCT-3' S0D2 rs4880 野生型探針 5' -GTCCTCGGGGTAATACATCCAA-3' S0D2 rs4880 突變型探針 5' -GAAGGTTTTCGGCAGACGTGAC-3' XRCCl rs25487 野生型探針 5' -CTTGTCAACATAGGATCAT-3' XRCCl rs25487 突變型探針 5' -TGGCTGCAAAATGCGATCT-3' XRCC3 rs861539 野生型探針 5' -ATGGGCCCACTGTGTTATTT-3' XRCC3 rs861539 突變型探針 5' -CCCTGAGATTACGGCTTAAA-3' ATM rsl801673 野生型 探針 5' -TTGAGCTCCATTGGTCAT-3' ATM rsl801673 突變型探針 5' -TCAGACTGGTTCTCTAGT-3' TP53 rsl042522 野生型探針 5' -ACATACGTGTGCGAGGA-3' TP53 rsl042522 突變型探針 5' -ATATGAACGATGCAACA-3' N0S3 rsl799983 野生型探針 5' -AATCAACTTACTGTAAACTTG-3' N0S3 rsl799983 突變型探針 5' -AATGAGTCGCCTCCTACTAGC-3'
4.如權利要求3所述的芯片,其特征在于,所述基因探針還包括陽性參照探針5' -ACTCTAAGTGCTATGCC-3'。
5.如權利要求1所述的芯片,其特征在于,所述固相基片材料為硅片、玻璃片、塑料片或尼龍膜中的一種或它們的任意組合。
6.如權利要求1所述的芯片,其特征在于,所述基因探針及固相基片表面包被多聚賴氨酸或瓊脂糖。
7.如權利要求1所述的芯片,其特征在于,所述基因探針及固相基片表面修飾有氨基或醛基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預測放射不良反應相關基因突變檢測的芯片。該檢測芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針,基因探針含有多個與放射不良反應相關基因突變位點的互補寡核苷酸序列。每個突變位點設計野生型和突變型兩種探針,設計長度為17-22bp的探針。利用本發(fā)明的芯片,只需病人2毫升血液,便能夠再3-4小時內迅速得到結果,并配合專用軟件,向臨床醫(yī)生提供明確的建議。采用這一新的檢測芯片,醫(yī)生可以在病人放療前前對放療方案進行調整,大大減少了病人不必要的痛苦與經(jīng)濟負擔。
文檔編號C40B40/06GK103173543SQ201310062989
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權日2013年2月28日
發(fā)明者郭成賢, 尹繼業(yè), 裴奇, 周伯庭, 孟祥光, 王瑛, 陳娟 申請人:中南大學