一種染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法，其主要特征是取因診治需要而作染色體病診斷后并已確診為疑難染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，以轉基因技術導入借T4DNA連接酶連接同時經BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag?DNA所構建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質粒，使重組子與細胞DNA整合，以G418篩選整合有重組子的永生化細胞，作傳代擴增后凍存活細胞，然后提取數例各自制備的不同病例的細胞，按質控所需比例混合，使原先每例細胞只有一種染色體異常轉變?yōu)楹胁煌壤摹⒁子谡`診的多種染色體異常，增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復雜性，標本易得且將廢棄的多余細胞轉化為有效的質控材料。
【專利說明】一種染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法，主要應用于醫(yī) 學領域的細胞遺傳學診斷實驗室作染色體核型分析的技術考核、室內質控和室間質評。

【背景技術】
[0002] 染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 隨細胞周期及生長情況而有所變化，一般占1%?10%。
[0003] 染色體結構異常、數目異常及嵌合體，臨床上表現為染色體病，屬于常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發(fā)性閉經、兩性畸型等。染色體結構異常包括染色體易位、缺失、倒位、環(huán) 狀等；染色體數目異常指多1條或數條染色體、多1條或數條染色體片段；嵌合體核型是指 同一病例個體并存數種染色體核型。目前分析染色體核型的常規(guī)方法是用被檢的組織或 細胞，經過常規(guī)細胞培養(yǎng)、0. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細胞生長、分離中期細胞、0. 075mol/L KC1低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體制片程序后，最后用胰酶消化、染色顯帶，從 而作出染色體結構和數目是否異常的判斷。目前通過染色體分析來診斷染色體病已被各級 產前診斷中心或醫(yī)院檢驗科普遍地開展，并廣泛應用于產前、胚胎植入前染色體病的診斷 以及作為異常妊娠、血液病、腫瘤等臨床診斷或發(fā)病機理研究的重要指標。
[0004] 作為所開展的各類實驗診斷項目，均應有相應規(guī)范的質量控制措施。實驗室的質 量控制是確保實驗診斷結果準確性的前提，已成為政府行為。為了加強實驗室的質量控制， 我國于1982年成立了衛(wèi)生部臨床檢驗中心，下設室間質評辦公室，專職從事于實驗診斷項 目的質量控制。衛(wèi)生部[衛(wèi)醫(yī)發(fā)]1997第31號文件、《臨床實驗室管理辦法》、《醫(yī)院評審標 準實施細則》以及大量的文獻均指出，實驗室必須有規(guī)范的質量控制標準，所開展的實驗診 斷項目必須參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的室間質評。自1982年以來，在臨床檢驗學科先 后開展了臨床實驗的室內質控、室間質評。包括了對各檢驗項目的實驗前、中、后以及儀器、 試劑和實驗人員的質量控制。質量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細胞形態(tài) 學診斷等各個實驗項目。實驗室的質量控制已成為開展實驗診斷項目的準入制度、成為醫(yī) 院等級評審的重要標準。
[0005] 產前診斷的質量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 是益重視，近年來各省市均建立了產前診斷中心，開展了 21三體綜合癥、18三體綜合征、 神經管畸形等重大出生缺陷的產前篩查和產前診斷，其中與重大出生缺陷相關的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產前診斷的主要項目。由于產前診斷是新開展的學科，大多 專業(yè)人員的技術經驗較為缺乏，特別是對于疑難、罕見病例、國內外首報病例以及如貓叫綜 合癥等染色體異常不明顯但臨床后果嚴重的病例，誤診現象時有發(fā)生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號）公布的"產前診斷法規(guī)標準"以及國務院辦公廳[國發(fā)辦 (1999) 15號]轉發(fā)衛(wèi)生部"關于做好提高出生人口素質工作意見"的通知中均強調指出， "各省、市產前診斷中心必須加強產前診斷的質量控制、嚴把質量關"。
[0006] 產前診斷的質量控制是許多學者致力于研究的重要課題。國外有較多的文獻報 道了產前診斷質量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產前細胞遺傳學診斷的細胞培 養(yǎng)及制片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內質量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學產前診斷的質量控制方法；Pihlk等認為必須加強產前篩查的質量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實驗室作了弓形蟲產前分子診斷的室間 質量評價，認為室間質評對促進實驗室間的技術交流、發(fā)現問題、提高實驗診斷質量起到重 要的作用。
[0007] 研制可行的質控物，是開展產前細胞遺傳學診斷室間質評和室內質控的關鍵環(huán) 節(jié)。雖然我國行政主管部門以及學術界十分重視產前診斷的質量控制（包括室內質控和室 間質評），但因沒有可行的質控物，所以無法開展實質性的質量控制。也就是說，要開展產前 細胞遺傳學診斷的室間質評，首先必須要有質控物。這是質量管理人員以及本專業(yè)的技術 人員長期以來想方設法解決但始終沒有解決的難題。
[0008] 我們經長期的研究和探索，設想如果能成功研發(fā)疑難、罕見、易于誤診的染色體異 常永生化質控細胞，就能解決長期困擾的產前細胞遺傳學診斷無質控物的問題。由于產前 細胞遺傳學診斷主要是診斷病理細胞的染色體數目和結構是否異常，所以，如果能從不同 環(huán)節(jié)收集到各種疑難、罕見、易于誤診的染色體異常病例細胞，通過制成可以無限地人為復 制、擴增的永生細胞，再將這種細胞由主管部門分發(fā)到各級產前診斷實驗室，同步于產前診 斷的染色體病診斷，使幾乎每位產前診斷專業(yè)人員能共享這些疑難、罕見、易于誤診的染色 體異常病例細胞的診斷，并用于考核各實驗人員對疑難、罕見、易于誤診染色體病的能力， 以此開展室間質評，對增加專業(yè)人員對疑難病例的診斷經驗，從而減少誤診的發(fā)生、提高產 前診斷的準確性，具有重要的意義。
[0009] 國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。SV40T抗原 基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定 的增殖特性和功能狀態(tài)。


【發(fā)明內容】

[0010] 為了解決在產前細胞遺傳學診斷中無可行質控物的問題，本發(fā)明人提出了本發(fā) 明。
[0011] 本發(fā)明的目的是要提供一種用于醫(yī)學領域的細胞遺傳學診斷實驗室作染色體核 型分析質量控制的染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法。
[0012] 本發(fā)明的目的是這樣實現的：取因臨床診治需要而作常規(guī)染色體病實驗診斷后并 已確診為疑難、罕見染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，以轉基因技術 導入借T4DNA連接酶連接同時經BamHI酶切的PCDNA3. 1 (-) DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電 泳分離的SV40LTag DNA所構建的SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重組質粒，使重組子與細胞DNA 整合，以G418篩選整合有重組子的永生化細胞，作傳代擴增后凍存活細胞，然后提取數例 各自制備的不同病例的細胞，按質控所需比例混合，使原先每例細胞只有一種染色體異常 轉變?yōu)楹胁煌壤?、易于誤診的多種染色體異常，集中保存，備作染色體核型分析的質 量控制之用。
[0013] 本發(fā)明取自因臨床診治需要而作常規(guī)染色體病實驗診斷后并已確診為疑 難、罕見染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，以轉基因技術導入 SV40LTag-pcDNA3. 1(_)重組質粒，使重組子與細胞DNA整合而成為可永久生存、無限擴增 的永生化細胞后，再作反復傳代、大量擴增細胞、收獲貼壁細胞，制備原液質控細胞，然后將 各自制備的不同例次的原液質控細胞按質控需要比例混合，使之成為應用質控細胞，所制 備的質控細胞不但數量足夠的多，具有取之不盡、反復復制使用的特點，而且使原先一般每 份原液質控細胞中只有一種染色體異常核型轉變?yōu)榫哂性谕环輵觅|控細胞中同時含 有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體異常核型的特征，從而在本來就易誤診的基 礎上更加增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復雜性，標本易得且將廢棄的多余 細胞轉化為可用于染色體核型分析的技術考核、室內質控及室間質評，對及時發(fā)現質量問 題、制定改進預案、提高診斷水平具有意想不到的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明制備的一種染色體核型為46, XY，15P+的疑難病例羊水組織細胞 (代表性細胞）的傳代至第55代、貼壁生長至第7天的質控細胞。
[0015] 如圖1，細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長 匯合率達95%以上。

【具體實施方式】
[0016] 1、原始細胞：所用的原始細胞來源于因臨床診治需要而作常規(guī)染色體病實驗診斷 后并已確診為疑難、罕見染色體異常、發(fā)出診斷報告后的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代 活細胞，細胞類型為胎兒羊水、絨毛組織等細胞。
[0017] 2、SV40大T抗原DNA (SV40LTag DNA)的提?。孩?SV40DNA酶切：從市售購買含有 大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H20或TE緩沖液中，加2uL10 X 酶切緩沖液和18uL H20，加限制性內切酶BamH I(l-5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱 15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液（也可通過加入0. 5mol/LEDTA)終止反應以備電 泳。②SV40DNA電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的 凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足 夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10X加樣緩沖液制備DNA 樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電 極，使DNA向陽極移動，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關閉 電源。③從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA :在300-360nm長波紫外光源下（使 用長波紫外光源以防止DNA損傷）將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透 析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽（長度 方向與電泳平行），加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫 外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于 l-5mlEppcndorf管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分 鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿（2個） 抽提2次，上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇， 于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄 干乙醇，加入50μ1 TE溶解DNA。
[0018] 3、SV40大T抗原DNA與pcDNA3. 1基因載體的連接：取9 μ 1上述DNA成份 (0· l-5yg)、10y 12X 連接緩沖液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA連接酶（20 ?500 粘性末端單 位）或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3. 1空載體混合，15°C溫育24h，構建成SV40T/pcDNA3. 1 重組子。
[0019] 4、SV40T/pcDNA3. 1重組子的擴增、分離與鑒定：①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基 本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化，用 CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大 多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌 落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有l(wèi)OOmlLB培養(yǎng)基 的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉搖床200?300r/min)，每隔 20?30min測量0D600值?0. 4,在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯 離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭） 以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒數培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培 養(yǎng)液流盡，以l〇ml用冰預冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3 轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置 lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0. 1M CaCl2重 懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無 菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200 μ 1轉移到無菌的微量離心管中，每管加 DNA或連 接反應混合物（體積彡1〇μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將 離心管放到預加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速 將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基 加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗 生素抗性標記基因，將適當體積（每個90mm平板可達200μ1)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到 含200mmol/LMgS04和相應抗生素的S0B培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平 皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現菌落。②重組子的篩選、擴增與提?。河脽o菌牙簽或滅 菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基（如超級肉湯或TB超級 肉湯培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基（含有適當抗生素）的2L燒瓶 中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)（0D 6C4,為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒 瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4°C，6000g離心10min，用4mL GTL溶 液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中（細菌沉淀可以在-20°C或_70°C 無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min， 加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置 10min，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放 置10min，于4°C，20000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可 見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0. 6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?10min， 于室溫，1500g離心10min，加入2mL70% 7醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇， 并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。③重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的 DNA (含重組子SV40T/pcDNA3. 1)，同上法用限制性內切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝 膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大 小。
[0020] 5、SV40T/pcDNA3. 1重組子導入染色體異常組織細胞及其陽性克隆的篩選與擴 增：①染色體異常組織細胞的收集與培養(yǎng)：以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多 余、廢棄的染色體異常組織細胞，以細胞終濃度約為lXl〇5/mL備用，取上述呈單個分散 的細胞或經處理后成為單個分散的細胞接種于含5?10nm 〇l/L胰島素、20%胎牛血清的 RPMI1640液中或接種于含20 %胎牛血清、5?10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基 中，置于37°C，體積分數5 % C02培養(yǎng)箱內，細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小 園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數生長期時，即考慮 收集培養(yǎng)細胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l_2ml0. 01 %的膠原酶II液（以消化液 能覆蓋整個瓶底為準），靜置2-10min (顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測），吸去膠原酶II液，加入低糖 DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，轉 入離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子 導入。②SV40T/pcDNA3. 1的導入：方法1 :在上法分離所得細胞中，選用脂質體轉染法，將 上述2X 105個細胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細胞生成 單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%? 65%、處于將進入或剛進入對數生長期時，即轉染重組子SV40T/pcDNA3. 1，在1. 5ml微量離 心管中制備下列溶液：管4，將5￥4017?(^嫩3.1溶于10(^1無血清培養(yǎng)液中；管8，將2(^1 Lipofectamine溶于80 μ 1無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min，吸去細胞 培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞2次，在Lip〇f ectamine-SV40T/pCDNA3. 1混合物中加 入lml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養(yǎng)皿內，然后加入lml無血清培養(yǎng)液，在 C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l〇h，吸出轉染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度 為400mg · Γ1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培 養(yǎng)后再加大G418濃度到800mg · Γ1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進行傳 代擴增，另外染色體異常組織細胞與SV40或EB病毒共同培養(yǎng)后，感染了病毒DNA并發(fā)生整 合的染色體異常組織細胞進行傳代擴增。方法2 :吸取1/10-1/40細胞懸液，配制成終濃度 為1 X 105/mL細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/ L胎牛血清、10nm〇l/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細胞生成單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅 見少于10 %小園形細胞、貼壁細胞匯合率達55 %?65 %、處于將進入或剛進入對數生長期 時，采用脂質體轉染的方法，將重組子SV40T/pcDNA3. 1轉染至染色體異常組織細胞內，或 將SV40直接感染至染色體異常組織細胞內，用含700mg/L G418的培養(yǎng)液篩選lwk，將G418 濃度改為300mg/L，至出現陽性克隆，將其轉移至新培養(yǎng)瓶進行擴大、傳代培養(yǎng)；方法3 :將 上述的細胞懸液以低糖DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)液配成5 X 108/L終濃度的細胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板，當細胞長至90 %融合率時，將0. 2 μ g含量的重組子SV40T/pcDNA3. 1，用DMEM或 RPMI 1640調整體積為50 μ 1，室溫放置5min ;脂質體6 μ 1，用DMEM調整體積為50 μ 1，室溫 放置5min，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20min，同時將24孔板內的細胞用DMEM洗3次后， 再在每孔加培養(yǎng)液1〇〇μ 1，加脂質體_SV40T/pcDNA3. 1混合液，輕輕在細胞表面鋪均勻，于 37°C C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0. 01g/L膠原酶將細胞消化，轉入6孔板內，加入完全培養(yǎng) 基，次日加 G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細胞長出。約10d后有單克隆細 胞集落長出，挑出置于24孔板內繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的G418維持并穩(wěn)定傳代擴增培養(yǎng)。
[0021] 6、染色體異常組織細胞系的傳代、擴增：收集上述經脂質體轉染法導入SV40大T 抗原基因的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約1 X 105/mL的細胞 懸液，接種于數瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nm 〇l/L胰島素的 低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細胞貼壁生長、匯合率達80?85 %、處于對數生長期的前 期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數并觀察細胞生 長特點。如圖1所示，細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細 胞生長匯合率達95%以上；在第56代后繼續(xù)傳代，細胞生長力減弱，生長變慢，貼壁稀疏。
[0022] 7、原液質控細胞的制備：（1)原液活質控細胞株的制備：取生長狀態(tài)良好、處于 對數生長期的不同世代的貼壁細胞，經過消化、終止和離心分離（1200r/min，6min)，用含 二甲亞砜的凍存液0. 5?lml重懸細胞，細胞密度為5X105個/ml，加入凍存管，經4°C， 0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。（2)原液固定質控細胞的制備：（1)終止 培養(yǎng)、收獲細胞前2?3h，加入濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號針頭， 力口 3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續(xù)培養(yǎng)2?3h，以積 累較多停止在中期的分裂象。（2)收獲細胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，以0.25%胰蛋白酶消化 貼壁細胞5分鐘，每次收獲1瓶，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后將 細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心lOmin，去上清液。（3)低滲處理：加入37°C預 溫的〇· 〇75mol/LKC18ml，反復吹打（約一百次）后，置37°C水浴箱中低滲處理25min左右。 (4)預固定：加入新鮮制備固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。（5)離心：2000 轉/min,離心lOmin，吸棄上清液。（6)固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固 定lOmin。（7)離心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液8ml，混勻，固定lOmin。（9) 離心：同上，吸去上清液。（10)制備原液質控細胞懸液：根據細胞量多少，加入適量固定液， 充分混勻，制成濃度為l〇 5/ml的細胞懸液，保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 8、應用質控細胞的制備：（1)應用活質控細胞株的制備：提取數例在不同時間制 備的、凍存于_196°C液氮中的不同病例的疑難染色體異常核型的原液活質控細胞株，按1 例原液活質控細胞株分別與另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、 12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1?50例原液活質控細胞株以1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1 ?20 的體積比例或細 胞數比例進行混合，混合后的應用活質控細胞株含有不同類型和比例的染色體異常細胞， 但作為同一例次的質控細胞。（2)應用固定質控細胞的制備：提取數例在不同時間制備的、 不同病例的疑難染色體異常核型的原液固定質控細胞，按1例原液固定質控細胞分別與另 夕卜1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17 例、18例、19例、20例、1?50例原液固定質控細胞以1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、 1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1?20的體積比例或細胞數比例進行混合，混合 后的應用固定質控細胞含有不同類型和比例的染色體異常細胞，但作為同一例次的質控細 胞。經如此傳代擴增細胞、收獲細胞、混合不同病例的染色體異常細胞所制備的質控細胞， 不但數量足夠的多，而且使原先一般每份原液質控細胞中只有一種染色體異常核型轉變?yōu)?具有在同一份應用質控細胞中同時含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體異常核 型的特征，從而在本來就易誤診的基礎上更加增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度 和復雜性，標本易得且將廢棄的多余細胞轉化為可用于染色體核型分析的技術考核、室內 質控及室間質評，在室內質量控制、室間質量評價、提高診斷水平的應用中具有意想不到的 效果。
[0024] 9、染色體核型分析永生化質控細胞庫的建立：將上述在不同時間制備的固定質控 細胞（原液固定質控細胞和應用固定質控細胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液配 成濃度為l〇5/ml的細胞懸液，經分裝、加滿固定液至管口和封口后，按年、月、日的制備日期 及標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存于_20°C，備作染色體核型分析的質量控制 之用。同時將相應的各種染色體異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以及標本 來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機管理系統，使用時從計算機中抽取待用質控細胞 編號，然后從質控細胞庫中找出相應的質控細胞作質量評價；活質控細胞株（原液活質控 細胞株和應用活質控細胞株）以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）配成濃度為10 5/ml 的細胞懸液，經每管lml分裝后，按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母 編號，集中保存于_196°C液氮中，備作染色體核型分析的質量控制之用。同時將相應的各種 染色體異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以及標本來源地址的大寫英文字母 編號錄入計算機管理系統，使用時從計算機中抽取待用質控細胞編號，然后從質控細胞庫 中找出相應的質控細胞作質量評價
[0025] 10、室間質評中的應用：從計算機中抽取待用質控細胞編號，然后從質控細胞庫中 找出相應的質控細胞，發(fā)送到各實驗室或相關專業(yè)技術人員，在收到質控細胞后，各室按常 規(guī)作染色體制片、烤片干燥、胰蛋白酶消化分帶、G顯帶、常規(guī)染色體核型分析、按時反饋染 色體核型診斷結果，組織者或考核者評價各受試對象所匯總的診斷結果的準確性、誤診情 況，分析原因、定期討論、改正存在問題，以增加技術人員的見識和經驗，提高診斷質量。也 可取質控細胞送交被考核者，以書面、口頭、當場考核被考核者診斷技術水平。
[0026] 11、室間質評調查舉例：我們按本發(fā)明的應用思路，使用1個組合單位的染色體異 常質控細胞并建立了質控細胞庫，每個組合單位含有6種染色體異常核型，其核型分別為 46，X，t(Y ;5) (ql2 ;q21)、46，XY，15P+、46，XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46，X，r(Xp)、46，X，t(Y ; Y)和46, XX，t(9 ;20) (P13 ;pl3)，均屬較為疑難、罕見的異常核型，并作了細胞遺傳學診斷 的室間質評試驗。我們向35個實驗室各發(fā)放了 1個組合單位的染色體異常質控細胞，共計 35個組合單位，各受試者作染色體核型分析后所回報的結果，相對應于46, X，t (Y ;5) (ql2 ; q21)、46, XY，15P+、46, XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46, X，r(Xp)、46, X，t(Y ;Y)和 46, XX，t(9 ; 20) (P13 ;pl3)的6種染色體異常核型排序的結果，其完全正確率分別為82. 2%、92. 0%、 84. 5 %、80· 9 %、86· 1 %、74· 2 %，完全錯誤率分別為 10. 7 %、8· 0 %、11· 5 %、19· 2 %、 13. 8%、18. 5%，總的完全正確率、部分正確率、部分錯誤率和完全錯誤率分別為83. 2%、 0.6%、2. 5%和13.7%。表明各受試者的細胞遺傳學診斷結果存在較高的誤診率。這可能 是因為：1、以染色體異常核型作室間質評，對特別疑難、罕見的異常核型難以作進一步的鑒 定；2、被選擇的室間質評對象偏向于基層單位；3、染色體核型分析是近年才被普遍開展起 來的，技術人員缺乏對疑難罕見染色體病例的實驗診斷經驗；4、初次參與室間質評，缺乏相 關的室間質評經驗；5、沒有按統一標準規(guī)范化地描述染色體核型的結構；6、本室間質評方 法所確定的質評標準偏高。我們所發(fā)現的室間質評中的誤診情況是，其中有5例46, X，t (Υ ; 5) (ql2 ;q21)被誤診為46, X，t (5 ; 15)，前者除了生育功能可能會有影響外，臨床體癥一般 正常，但后者表現為原發(fā)性閉經的性異常；有7例46, XY，15P+被誤診為46, XY，t (15 ;21)，前 者一般為臨床體癥正常的多態(tài)性核型，但后者為先天愚型的核型；有2例46, XX，t (13 ;18) (ql2 ;q21)被誤診斷為46, XX，-18, +mar、1例被誤診為46, XX，del (18) [1]，前者在生育子 代時易發(fā)生流產，其本人臨床體癥一般正常，但后者表現為染色體缺失的癥狀，一般不會活 到出生；有3例46, X，r (Xp)被誤診為46, X，+mar、2例被誤診為45, X、被誤診為46, XY和 46, X，Xp各1例，特別是被誤診為46, XY后，就要采取外科手術切除"隱睪"以防惡變；有4 例463，以￥;￥)被誤診為46，乂，-￥+11、3例被誤診為463，-￥，+(^1(11)，原核型多了1個 Y染色體，誤診后卻沒有Y染色體了；46, XX，t (9 ;20)被誤診為46, XX，-20, +17、和46, XX， del (9)各1例，原核型屬染色體易位，在生育子代時易發(fā)生自然流產，本人臨床體癥一般正 常，但誤診后的46，XX為正常核型、另外2種核型一般都不會成活到出生。我們對于在室間 質評中發(fā)現的誤診問題，作了分析討討和逐一糾正。
[0027] 由此可見，在疑難、罕見核型的細胞遺傳學診斷中所存在的問題及其誤診所產生 的較為嚴重的后果。說明使用本發(fā)明制作的染色體異常核型室間質控細胞并用于開展細胞 遺傳學診斷室間質評的必要性和可行性，對發(fā)現問題、及時糾正、提高診斷水平具有重要的 意義。
【權利要求】
1. 一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫及其構建方法，其主要 特征是取因診治需要而作染色體病診斷后并已確診為疑難染色體異常的剩余的呈貼 壁生長的原代或傳代活細胞，以轉基因技術導入借T4DNA連接酶連接同時經BamHI酶 切的pcDNA3. 1 (-) DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA所構建的 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重組質粒，使重組子與細胞DNA整合，以G418篩選整合有重組子的 永生化細胞，作傳代擴增后凍存活細胞，然后提取數例各自制備的不同病例的細胞，按質控 所需比例混合，經如此傳代擴增細胞、收獲細胞、混合不同病例的染色體異常細胞所制備的 質控細胞，不但數量足夠的多，而且使原先一般每份質控細胞中只有一種染色體異常核型 轉變?yōu)榫哂性谕环葙|控細胞中同時含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體異常 核型的特征，從而在本來就易誤診的基礎上更加增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難 度和復雜性，標本易得且將廢棄的多余細胞轉化為實用、有效的染色體核型分析技術考核、 室內質控及室間質評的質控細胞。
2. 根據權利要求1所述的一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫及 其構建方法，其特征是SV40LTag DNA與疑難染色體異常組織細胞DNA整合、制成了傳代至 第55代、培養(yǎng)至第7天仍能呈圓形、梭形、鋪滿瓶底、細胞生長匯合率達95%以上質控細胞 株。
3. 根據權利要求1、2所述的一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫 及其構建方法，其特征是應用活質控細胞株由1例原液活質控細胞株分別與另外1例、2例、 3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19 例、20例、1?50例原液活質控細胞株以1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、 1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1?20的體積比例或細胞數比例混合構成。
4. 根據權利要求1、3所述的一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫 及其構建方法，其特征是應用固定質控細胞由1例原液固定質控細胞分別與另外1例、2例、 3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19 例、20例、1?50例原液固定質控細胞以1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、 1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1?20的體積比例或細胞數比例混合構成。
5. 根據權利要求1所述的一種用于醫(yī)療領域的染色體核型分析永生化質控細胞庫 及其構建方法，其特征是質控細胞庫包含：以固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介 的、-20°C保存的、按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號的、疑難染 色體異常永生化細胞濃度為l〇 5/ml的、由原液固定質控細胞和應用固定質控細胞構成的固 定質控細胞；以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）為媒介的、-196°C液氮保存的、按年、 月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號的、疑難染色體異常永生化細胞濃 度為l〇 5/ml的、由原液活質控細胞株和應用活質控細胞系構成的活質控細胞株。
【文檔編號】C40B40/02GK104060329SQ201310109734
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權日:2013年3月19日
【發(fā)明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥