轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以純化擴(kuò)增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的克氏綜合征細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)、免疫組化、細(xì)胞增殖周期及其凋亡率符合永生細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT轉(zhuǎn)染克氏綜合征細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)染hTERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)重組基因(hTERT介導(dǎo))構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，主要用于人類生殖健康研究領(lǐng)域，為克氏綜合征的體外研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]克氏綜合征是染色體出生缺陷之一，又稱為原發(fā)性小睪丸癥或曲細(xì)精管發(fā)育不良，是一種較為常見(jiàn)的男性性染色體異常疾病。本病的特點(diǎn)是染色體數(shù)目異常，多了一條X染色體。最常見(jiàn)的核型為47，XXY。有的患者具有兩個(gè)以上的X，稱為Klinefelter的變異型，如:48，XXXY、49，xXXXY，一般X越多，臨床癥狀越嚴(yán)重。本病的發(fā)病率為0.1%。青春期前，一般無(wú)明顯癥狀。青春期癥狀逐漸明顯，外陰發(fā)育差，陰莖短小，睪丸小而硬，男性第二性發(fā)育延遲甚至不發(fā)育，皮膚細(xì)白，全身體毛發(fā)育差，陰毛、胡須稀少而腋毛經(jīng)常缺如，喉結(jié)不明顯，身才高，下體長(zhǎng)于上體，近半數(shù)患者乳房發(fā)育呈女性型乳房?；颊咝杂拖?，性功能不良，除個(gè)別患者外幾乎均為無(wú)精癥而不能生育。因性功能不良及不能生育等原因，且一般治療無(wú)效，這種患者的出生，必給患者本人及家庭造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦。
[0003]克氏綜合征主要因?yàn)樵诰咽诰Y(jié)合時(shí)，染色體不分離造成的。有文獻(xiàn)報(bào)道，造成染色體不分離的原因與物理、化學(xué)、生物、遺傳等因素有關(guān)。但是，由于沒(méi)有可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的、可用于克氏綜合征發(fā)病機(jī)制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，就難以從細(xì)胞水平在體外研究克氏綜合征受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制，從而嚴(yán)重限制了克氏綜合征的進(jìn)一步研究。
[0004]國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。
[0005]但最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長(zhǎng)了壽命，或僅僅渡過(guò)了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說(shuō)明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)某些研究也存在一定程度的限制性。
[0006]國(guó)外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來(lái)已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性等相對(duì)“正?！钡纳L(zhǎng)特征?？梢杂糜谌祟惡蛣?dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對(duì)借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。
[0007]在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。
[0008]但是，至今尚未見(jiàn)有關(guān)以hTERT構(gòu)建可用于在體外從細(xì)胞水平研究克氏綜合征發(fā)病機(jī)制的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的文獻(xiàn)報(bào)道，也無(wú)法開(kāi)展相關(guān)項(xiàng)目的研究。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是要提供轉(zhuǎn)染hTERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)重組基因(hTERT介導(dǎo))構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，另一目的是為在體外從細(xì)胞水平研究克氏綜合征的發(fā)病機(jī)制提供hTERT介導(dǎo)克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1n Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以擴(kuò)增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的克氏綜合征細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞的DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽(yáng)性重組子的克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT介導(dǎo)克氏綜合征體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究克氏綜合征的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0011]本發(fā)明以PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳提純hTERT，經(jīng)基因載體pLXSNneo和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入克氏綜合征細(xì)胞而構(gòu)建其細(xì)胞模型，其組織細(xì)胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細(xì)胞粘連的膠原被消化或使細(xì)胞懸浮，減少了細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)被消化而傷及細(xì)胞，使細(xì)胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)過(guò)快而影響hTERT基因的整合，也不會(huì)因缺少營(yíng)養(yǎng)或細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子而使細(xì)胞在未達(dá)到要求的匯合率、未進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前就過(guò)早死亡，或?qū)?shù)生長(zhǎng)期縮短；制備的細(xì)胞系在_196°C液氮中凍存I個(gè)月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能生長(zhǎng)出貼壁細(xì)胞；在作細(xì)胞系染色體鑒定時(shí)，秋水仙素的用量及作用時(shí)間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計(jì)數(shù)和分析；此外，與SV40相比，以hTERT構(gòu)建細(xì)胞模型更可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征，更能保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性及渡過(guò)M2危機(jī)期等生長(zhǎng)特征，對(duì)在體外從細(xì)胞水平研究克氏綜合征的病理機(jī)制具有更大的意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是本發(fā)明制備的克氏綜合征細(xì)胞模型(貼壁生長(zhǎng))圖。
[0013]如圖1，細(xì)胞傳代至第87代、培養(yǎng)至第12天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)93%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏。

【具體實(shí)施方式】
[0014]1、hTERT 的提取:①酶切 pCIneo-hTERT:hTERT 位于質(zhì)粒 pClneo-hTERT 的 EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。市售購(gòu)買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10 X酶切緩沖液和18uLH20，加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。②hTERT電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10 %瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使hTERT向陽(yáng)極移動(dòng)，在l_10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。③hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長(zhǎng)波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加A2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5mlEppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇,于20°C過(guò)夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。
[0015]2、hTERT與pLXSNneo載體的連接:取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol /T, ATP、10ul Ligat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo 空載體混合，15°C 溫育 24h，構(gòu)建 pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0016]3、pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測(cè)量0D600值?0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?。②以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ I轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積彡10 μ 1，DNA ( 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mn平板可達(dá)200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子:用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_?4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4°C,6000g離心1min,用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20°C或_70°C無(wú)限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長(zhǎng)期保存)。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，370C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min，按試劑盒說(shuō)明書(shū)小量提取并純化重組質(zhì)粒；WEcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10 X buffer2ul、重組質(zhì)粒1ul、加水補(bǔ)足至20ul，37 V酶切Ih0酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
[0017]4、pLXSNneo-hTERT重組子導(dǎo)入克氏綜合征細(xì)胞及其陽(yáng)性克隆的篩選:①克氏綜合征細(xì)胞的收集與培養(yǎng):以無(wú)菌操作提取在作其他實(shí)驗(yàn)或其他檢查后多余、廢棄的克氏綜合征患兒羊水脫落細(xì)胞，以細(xì)胞終濃度約為I X 1VmL備用，取上述呈單個(gè)分散的細(xì)胞或經(jīng)處理后成為單個(gè)分散的細(xì)胞接種于含5?lOnmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即考慮收集培養(yǎng)細(xì)胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液或胰酶(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))，靜置2-10min (顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè))，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入離心管離心沉淀，去上清液，細(xì)胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo)入。②pLXSNneo-hTERT重組子的導(dǎo)入:方法1:在上法分離所得細(xì)胞中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述2X 15個(gè)細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，轉(zhuǎn)染重組子pLXSNneo-hTERT，在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管么，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中；管B，將20 μ I Lipofectamine溶于80 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入Iml-無(wú)血清培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg.Γ1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個(gè)細(xì)胞集落進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后再加大G418濃度到800mg.L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的克隆行傳代擴(kuò)增。方法2:吸取1/10-1/40細(xì)胞懸液，配制成終濃度為IX 105/mL細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組子pLXSNneo-hTERT轉(zhuǎn)染至克氏綜合征細(xì)胞內(nèi)，用含700mg/L G418的培養(yǎng)液篩選lwk，將G418濃度改為300mg/L，至出現(xiàn)陽(yáng)性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述的細(xì)胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液配成5X 108/L終濃度的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)90%左右融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染，將0.2μ g含量的重組子pLXSNneo-hTERT,用DMEM或RPMI1640調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min ;脂質(zhì)體6 μ 1，用DMEM調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20min，將24孔板內(nèi)的細(xì)胞用DMEM洗3次，每孔加培養(yǎng)液100 μ 1，加Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合液，輕輕在細(xì)胞表面鋪均勻，于37°C C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出。約1d后有單克隆細(xì)胞集落長(zhǎng)出，挑取并置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的G418維持并穩(wěn)定傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。以此構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型。
[0018]5、pLXSNneo-hTERT轉(zhuǎn)染克氏綜合征細(xì)胞模型的傳代、擴(kuò)增:收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入pLXSNneo-hTERT的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約IX 105/mL的細(xì)胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、1nmoI/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、匯合率達(dá)80?85 %、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期時(shí)收集細(xì)胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)。如圖1，細(xì)胞傳代至第87代、培養(yǎng)至第12天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)93%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏。其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)是指細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，通常按常規(guī)按種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)I?2天便可在顯微鏡下找到生長(zhǎng)的單個(gè)細(xì)胞；4?5天時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞集落，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1/3，培養(yǎng)7?13天時(shí)可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2/3以上，甚至細(xì)胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達(dá)95?100% )，細(xì)胞光亮，無(wú)顆粒、無(wú)粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系來(lái)判斷；死亡的細(xì)胞少，每周因死亡而漂浮的細(xì)胞少于10% [通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比]。
[0019]6、克氏綜合征細(xì)胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用pLXSNneo-hTERT建立細(xì)胞模型后，鑒定的關(guān)鍵問(wèn)題有:一是要求該細(xì)胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細(xì)胞形態(tài):在倒置光學(xué)顯微鏡下每日觀察細(xì)胞是否呈典型的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，是否呈梭形、或小園形生長(zhǎng)。本細(xì)胞系傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)與正常人成纖維細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異；②觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4X 14細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepatoZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過(guò)分析染色體核型，如果染色體核型為“47，XXY”，或相同于本發(fā)明采集的原代細(xì)胞，則說(shuō)明該細(xì)胞系沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒(méi)有，也說(shuō)明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85-95% (其中小園形細(xì)胞占10% )、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)，吸干培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長(zhǎng)試驗(yàn):將細(xì)胞以5XlOVml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的永生化細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點(diǎn)裸鼠致瘤試驗(yàn):將永生化細(xì)胞以3X 17接種裸鼠背部皮下，2個(gè)月后，4只裸鼠均未見(jiàn)腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:按試劑盒做PCR擴(kuò)增后電泳，檢出hTERT mRNA條帶。如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見(jiàn)大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi)；?轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性:收集細(xì)胞系，按試劑盒說(shuō)明制備裂解液，作PCR擴(kuò)增和電泳分析，以302nm紫外光觀察結(jié)果，可見(jiàn)呈端粒酶陽(yáng)性條帶。⑧流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說(shuō)明是hTERT整合、表達(dá)的結(jié)果；另外以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率，本細(xì)胞系的細(xì)胞增殖指數(shù)較轉(zhuǎn)染前后無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率較轉(zhuǎn)染前明顯降低。
[0020]所以，本發(fā)明的細(xì)胞模型為①細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)；②細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；@染色體核型為“47，XXY”，或相同于本發(fā)明采集的原代克氏綜合征細(xì)胞核型；④細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；⑤細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性細(xì)胞的DNA中整合了 hTERT基因，表達(dá)hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；?細(xì)胞傳代至第87代、培養(yǎng)至第12天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)93%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏。
[0021]7、hTERT介導(dǎo)克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù):篩選并繼續(xù)傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5X 15個(gè)/ml，加入凍存管分裝、標(biāo)注，經(jīng)4°C，0.5h ；-20°C，2h ；-70°C，過(guò)夜，Λ _196°C液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為克氏綜合征發(fā)病機(jī)制體外研究的細(xì)胞模型，以加速拓展克氏綜合征研究的新途徑，從細(xì)胞水平在體外研究克氏綜合征細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制。
[0022]8、細(xì)胞模型應(yīng)用
[0023]I)克氏綜合征細(xì)胞模型作為科研細(xì)胞:使克氏綜合征細(xì)胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(xué)(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長(zhǎng)期傳代的不同周期的活細(xì)胞、傳代過(guò)程的凋亡細(xì)胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，對(duì)比研究克氏綜合征細(xì)胞模型、正常對(duì)照細(xì)胞模型對(duì)有害物的耐受性的差異、有害物致克氏綜合征的機(jī)制。例如應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運(yùn)用原位雜交(FISH) ,Northern blot、Real_timePCR、CHIP、EMSA等技術(shù)檢測(cè)基因所在研究細(xì)胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達(dá)、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)胞模型長(zhǎng)期傳代中蛋白質(zhì)代謝過(guò)程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、MALD1-T0F質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細(xì)胞模型在長(zhǎng)期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究克氏綜合征細(xì)胞對(duì)環(huán)境有害因素的耐受性和適應(yīng)性，例如:①環(huán)境中常見(jiàn)的毒性物質(zhì)苯并芘致克氏綜合征的研究:使克氏綜合征細(xì)胞模型和對(duì)照細(xì)胞分別在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測(cè)在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時(shí)間的可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的細(xì)胞凋亡、壞死、雙核細(xì)胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)10000個(gè)雙核細(xì)胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個(gè)活細(xì)胞中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)，以及檢測(cè)細(xì)胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μ L 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結(jié)晶物充分溶解，本酶標(biāo)儀以490nm測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算出細(xì)胞存活率。還可以其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的含毒性物與不含毒性物、克氏綜合征細(xì)胞模型與正常細(xì)胞中各組細(xì)胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分泌功能、染色體畸變、細(xì)胞存活率(壽命)等，以從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究環(huán)境有害因素對(duì)克氏綜合征的作用。②以某種病源微生物替換毒性物質(zhì)苯并芘做同樣的研究，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究克氏綜合征對(duì)生物因素的耐受性和適應(yīng)性及作用機(jī)制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學(xué)物質(zhì)以及細(xì)胞模型共同培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程壽命、基因突變、各種分子變化等，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究藥物對(duì)克氏綜合征的治療效果及干預(yù)效果。④同樣可用克氏綜合征細(xì)胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗(yàn)。⑤以細(xì)胞模型的形式保存克氏綜合征遺傳資源。
[0024]2)細(xì)胞模型作為質(zhì)控細(xì)胞
[0025]實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制是開(kāi)展實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目的準(zhǔn)入制度，已成為政府行為。克氏綜合征細(xì)胞模型可用作質(zhì)控細(xì)胞，用于室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)。例如在同步于臨床標(biāo)本的染色體病實(shí)驗(yàn)診斷方法的前提下，用細(xì)胞模型作常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備、染色體核型分析，以考核實(shí)驗(yàn)過(guò)程的試劑質(zhì)量、儀器性能、操作方法等是否可靠，相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性、陰性對(duì)照；可將細(xì)胞模型經(jīng)常規(guī)染色體制備、染色體核型分析所得到的圖像作整理后，發(fā)送到各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，以考核各室對(duì)各種染色體異常圖像的診斷的準(zhǔn)確性；可將細(xì)胞模型發(fā)送到各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，在各室自行作出常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制片、染色體核型分析后回報(bào)結(jié)果，對(duì)各室的診斷結(jié)果作室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，通過(guò)評(píng)比各室的準(zhǔn)確性，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)問(wèn)題、解決問(wèn)題、提高診斷質(zhì)量；可將細(xì)胞模型與各種正常染色體細(xì)胞按質(zhì)控所需要的種類及比例混合，制成含有不同種類和比例的混合質(zhì)控細(xì)胞，作為熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)染色體數(shù)目異常室內(nèi)質(zhì)控細(xì)胞和室間質(zhì)評(píng)細(xì)胞，如果某實(shí)驗(yàn)室在作FISH中沒(méi)有檢測(cè)出(漏診)質(zhì)控細(xì)胞的不同種類的染色體異常、沒(méi)有準(zhǔn)確檢測(cè)出不同種類的染色體異常的比率(％ )，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法存在質(zhì)量問(wèn)題，應(yīng)找原因改正?，F(xiàn)以幾種染色體異常細(xì)胞模型混合后制備的質(zhì)控細(xì)胞在熒光原位雜交室間質(zhì)評(píng)中的具體應(yīng)用為例說(shuō)明如下:①準(zhǔn)備質(zhì)控細(xì)胞:取I例或數(shù)例克氏綜合征細(xì)胞模型，按質(zhì)控所需要的例次或比例混合而成質(zhì)控細(xì)胞，混合的質(zhì)控細(xì)胞還可經(jīng)擴(kuò)增后發(fā)放使用。如果以I例克氏綜合征細(xì)胞模型與染色體正常細(xì)胞以等比例細(xì)胞數(shù)混合，則每種染色體數(shù)目異常的細(xì)胞各占50%。然后將質(zhì)控細(xì)胞發(fā)送到各受試對(duì)象做熒光原位雜交檢測(cè)染色體數(shù)目異常的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。②熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)質(zhì)控細(xì)胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定:各受試對(duì)象收到質(zhì)控細(xì)胞后，可酌情對(duì)質(zhì)控細(xì)胞株進(jìn)行傳代擴(kuò)增后測(cè)試，以增加細(xì)胞數(shù)。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVys1n試劑盒,完成2條染色體的數(shù)目分析，方法是取X和Y染色體探針，并取質(zhì)控細(xì)胞，同步于實(shí)驗(yàn)室被檢標(biāo)本的操作，經(jīng)2000r/min離心1min,去上清，留沉淀0.2ml,離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min,2000r/min離心lOmin,去上清,然后加入5ml預(yù)溫的15mol/L KCl,在37水浴中低滲25min,2000r/min離心lOmin,去上清。加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定1min,離心2000r/min離心1min去上清，反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標(biāo)本片自冰柜中取出，依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置73V，70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ I加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過(guò)夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜交效果，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)60?100個(gè)細(xì)胞，記錄雜交信號(hào)數(shù)目并采集圖像,要求細(xì)胞核膜必須完整，核內(nèi)雜交信號(hào)明亮清晰無(wú)重疊，信號(hào)彌散及微弱均不作統(tǒng)計(jì)。③測(cè)試結(jié)果:經(jīng)探針雜交后，細(xì)胞內(nèi)X(女性)染色體顯示綠色的點(diǎn)，每條X染色體顯示I個(gè)綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)綠色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)綠色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)Y(男性)染色體顯示紅色的點(diǎn)，每條Y染色體顯示I個(gè)紅色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)紅色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)紅色的點(diǎn)。如果某實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)中，未檢測(cè)出X染色體的信號(hào)，或X染色體信號(hào)模糊，或X染色體信號(hào)增加或減少，或其比例偏差大，不符合質(zhì)控細(xì)胞(模型)的數(shù)值，則說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)室的操作條件、技術(shù)、儀器、試劑等存在問(wèn)題，應(yīng)行校準(zhǔn)等措施。
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligat1n Mix連接經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞以純化擴(kuò)增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染離體傳代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的克氏綜合征細(xì)胞，使重組子與細(xì)胞DNA整合，并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子克隆，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)、免疫組化、細(xì)胞增殖周期及其凋亡率符合永生細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為hTERT介導(dǎo)克氏綜合征體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平(替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外長(zhǎng)期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所指細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)；(2)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為“47，XXY”，或相同于本發(fā)明采集的原代克氏綜合征細(xì)胞核型；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中整合了 hTERT基因，表達(dá)hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第87代、培養(yǎng)至第12天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)93%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏；(8)作為細(xì)胞模型用于在體外從細(xì)胞水平研究克氏綜合征的發(fā)病機(jī)制、遺傳資源貯存、實(shí)驗(yàn)對(duì)照及質(zhì)控細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是取自因其他實(shí)驗(yàn)所需而采集的、并在其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的克氏綜合征患兒羊水脫落細(xì)胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的克氏綜合征組織細(xì)胞，在原代擴(kuò)增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代克氏綜合征組織細(xì)胞，其時(shí)機(jī)選擇的指標(biāo)是細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65 %、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞；傳代細(xì)胞系收集的指標(biāo)是選擇細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的匯合率達(dá)80?85%、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期時(shí)收集細(xì)胞；染色體核型分析的細(xì)胞收集指標(biāo)是細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85-95 %、小園形細(xì)胞占10 %以上、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長(zhǎng)的克氏綜合征組織細(xì)胞，作染色體核型分析時(shí)，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)染hTERT重組基因構(gòu)建克氏綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的hTERT介導(dǎo)的克氏綜合征細(xì)胞；(2)作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5X 15個(gè)/ml的細(xì)胞懸液；(5)按照4°C，.0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過(guò)夜；入-196°C液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地長(zhǎng)期保存hTERT介導(dǎo)克氏綜合征細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號(hào)】C40B40/02GK104419673SQ201310407538
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 李曉, 徐向榮, 朱瑞建, 馬裕, 金帆 申請(qǐng)人:翁炳煥