一種組織勻漿法分離活細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織勻漿法分離胎兒附屬物組織細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的方法，目的在于構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)時(shí)步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)、易于質(zhì)控和規(guī)范化。本發(fā)明由下述步驟組成：(1)胎兒附屬物組織的清洗；(2)組織的勻漿前處理；(3)組織勻漿處理分離細(xì)胞(團(tuán))；(4)勻漿后組織的過(guò)濾處理和細(xì)胞(團(tuán))的收集；(5)細(xì)胞(團(tuán))檢測(cè)；(6)凍存分離的細(xì)胞(團(tuán))，構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、不引入外源試劑、易于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制以及細(xì)胞獲得量大等優(yōu)點(diǎn)，為提高胎兒附屬物細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建效率，獲得高質(zhì)量用于治療的干細(xì)胞具有重要的意義。
【專利說(shuō)明】一種組織勻漿法分離活細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及胎兒附屬物組織細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，更具體地說(shuō)是一種從胎兒附屬物組織分離細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的物理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胎兒附屬物組織主要由胎盤小葉、胎盤底座、基蛻膜、羊膜和臍帶組織構(gòu)成。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的胎盤是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細(xì)胞組成，是胎兒最早期的造血器官，含有大量的間質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤亞全能干細(xì)胞和豐富的造血干細(xì)胞，從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細(xì)胞將為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用開辟一個(gè)嶄新而豐富的來(lái)源。
[0003]胎盤亞全能干細(xì)胞來(lái)源于胎盤組織，自胚胎形成的第5到7天開始出現(xiàn)，能分化形成200多種人體組織器官細(xì)胞，但不能形成一個(gè)完整的人體。具備多能干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征，該細(xì)胞體外可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝上皮樣細(xì)胞等定向分化。
[0004]胎盤造血干細(xì)胞是存在于胎盤組織中的一群原始造血細(xì)胞，是血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等)的始祖，是高度未分化細(xì)胞，也可以說(shuō)它是一切血細(xì)胞(其中大多數(shù)是免疫細(xì)胞)的原始細(xì)胞。胎盤組織中造血干細(xì)胞的含量是臍帶血中造血干細(xì)胞含量的5-10倍，足可供小孩自用幾次，或提供給1-2個(gè)成人患者的治療。同時(shí)有效解決了移植時(shí)骨髓或動(dòng)員后外周血來(lái)源不足，臍帶血數(shù)量不夠等技術(shù)難題，將有望取代骨髓、動(dòng)員后外周血和臍帶血用于造血干細(xì)胞移植。
[0005]基蛻膜是母親妊娠時(shí)胚泡的滋養(yǎng)層細(xì)胞一經(jīng)與子宮內(nèi)膜接觸，引起其附近的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞肥大增殖形成的組織。基蛻膜形成胎盤隔將叢密絨毛膜分隔成若干個(gè)絨毛小葉，其中含有母親源的基蛻膜干細(xì)胞。
[0006]羊膜(amnion)是覆蓋在羊膜腔內(nèi)表面的一層薄膜，從細(xì)胞滋養(yǎng)層演化而來(lái)，是人類兩層胎膜的內(nèi)層，其厚度為0.02~0.05mm，是人體中最厚的基底膜，由羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cell, HAEC)、基底膜、實(shí)質(zhì)層、纖維母細(xì)胞層、海綿層5層結(jié)構(gòu)組成。人羊膜上皮細(xì)胞位于羊膜的最內(nèi)層，羊膜上皮細(xì)胞在受精后第8天從外胚葉發(fā)育而來(lái)，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細(xì)胞的可塑性，在治療中樞神經(jīng)障礙方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值:1996年，Sakuragawa等最先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志。隨后的研究表明，培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞能合成和釋放神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿，兒茶酚胺和多巴胺。人羊膜上皮細(xì)胞移植治療大鼠帕金森病(PD)的實(shí)驗(yàn)表明其在體內(nèi)不僅能存活并表達(dá)絡(luò)氨酸羥化酶(TH)活性，而且可以逆轉(zhuǎn)病情和防止神經(jīng)元死亡。人羊膜上皮細(xì)胞對(duì)于靈長(zhǎng)類的脊髓損傷同樣具有良好的治療效果。
[0007]臍帶是胎兒和母體連接的紐帶。臍帶內(nèi)有三根血管通過(guò)，一根靜脈和二根動(dòng)脈，起著溝通母子間血液循環(huán)的作用。足月胎兒的臍帶長(zhǎng)約30~70厘米。臍帶華通氏膠(Wharton’ s Jelly)中的干細(xì)胞主要是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0008]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種多能干細(xì)胞,在胚胎發(fā)育中來(lái)源于中胚層。在機(jī)體正常的組織損傷修復(fù)過(guò)程中，MSC是一種重要的參與組織再生的細(xì)胞。在組織損傷引起的特殊信號(hào)作用下，MSC遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據(jù)不同的損傷信號(hào)沿著不同途徑分化。MSC易于分離擴(kuò)增，體外倍增能力旺盛，即使擴(kuò)增I億倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一種實(shí)用的組織修復(fù)種子細(xì)胞。
[0009]MSC具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下具有分化為:上皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞，肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。可以用來(lái)修復(fù)受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、骨組織病、角膜損傷、燒傷燙傷、肌病等多種疾?。徊⑶?，MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能，抑制機(jī)體亢進(jìn)的免疫反應(yīng)，使機(jī)體免疫功能恢復(fù)平衡，從而可以用來(lái)治療造血干細(xì)胞移植之后的免疫排斥反應(yīng)以及克隆氏病、紅斑狼瘡，硬皮病等自身免疫系統(tǒng)疾??；MSC還是人體微環(huán)境的重要組成部分，移植間充質(zhì)干細(xì)胞可以改變?cè)煅h(huán)境，重建免疫系統(tǒng)，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，與造血干細(xì)胞共移植能顯著提高白血病和難治性貧血等的治療效果。
[0010]胎兒附屬物細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建，將原來(lái)作為醫(yī)療廢棄物直接處理掉的新生兒的臍帶和胎盤組織通過(guò)處理，提取其中豐富的干細(xì)胞資源，并通過(guò)成熟的深低溫冷凍技術(shù)使之在休眠狀態(tài)下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，作為一種寶貴的生物資源儲(chǔ)備，將來(lái)，可以應(yīng)用于許多自體重大疾病的治療；同時(shí)，也可以用于異體的移植與治療；還可以通過(guò)再研發(fā)和處理，開發(fā)成干細(xì)胞藥物，造福全社會(huì)。
[0011]胎兒附屬物細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建包括細(xì)胞的組織分離，純化，冷凍保存，病原微生物的檢測(cè)以及質(zhì)量控制等方面。本專利所涉及的胎兒附屬物細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法是其中組織中細(xì)胞分離的方法，尤其是細(xì)胞從實(shí)體組織中分離的技術(shù)。從組織中分離細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的方法目前有化學(xué)酶解法和細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)法。其中化學(xué)酶解法是廣為采用的主要方法。
[0012]化學(xué)酶解法是利用消化酶將活體細(xì)胞從組織中分離的方法。具體分離過(guò)程先將組織剪切成約1-1.5mm3的小塊，再采用膠原酶或膠原酶和胰酶組合使用進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)消化，并利用血清等酶消化終止液終止消化，最后過(guò)濾清洗獲取細(xì)胞。例如授權(quán)號(hào)CN101608174B《一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法》的專利，間充質(zhì)干細(xì)胞的分離就是采用膠原酶消化的方法。授權(quán)號(hào)CN100344757C《人胎盤、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)及其構(gòu)建方法》的專利，建庫(kù)的間充質(zhì)干細(xì)胞采用的方法為膠原酶和胰酶依次消化法?；瘜W(xué)酶解法具有以下特點(diǎn):1)由于需要使用大量的化學(xué)酶和消化終止液，實(shí)驗(yàn)成本較高；2)由于不同的操作方法和人員情況，每次獲得的細(xì)胞產(chǎn)量差異較大。3)由于采用的消化方法不同，整個(gè)消化酶解的時(shí)間長(zhǎng)短不一，從30分鐘到幾小時(shí)都有。
[0013]細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)法是一種物理和培養(yǎng)相結(jié)合將細(xì)胞從組織中分離的方法，也是構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)可選用的一種方法。具體分離過(guò)程先將組織剪切成約1-1.5mm3的小塊，接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)分離細(xì)胞。例如授權(quán)號(hào)CN102010850B《一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法》的專利，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的分離就是采用的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)法。該方法具有以下特點(diǎn):1)僅需要將組織剪切成1-1.5mm3的細(xì)胞團(tuán)和簡(jiǎn)單的培養(yǎng)，操作比較簡(jiǎn)單；2)細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)需要幾天的時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離，耗時(shí)較長(zhǎng)；3)細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，污染的可能性比較大。
[0014]由此可見(jiàn)，目前構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的實(shí)體組織細(xì)胞分離方法操作流程比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，完全依賴于人工操作，對(duì)技術(shù)員的操作技能要求高。另外，化學(xué)酶解法又引入了動(dòng)物來(lái)源的外源性試劑，會(huì)加大公共細(xì)胞庫(kù)的干細(xì)胞藥物治療的風(fēng)險(xiǎn)性。
[0015]在本發(fā)明基于細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建中保證細(xì)胞分離方法簡(jiǎn)單、省時(shí)、易于質(zhì)控和規(guī)范化的原則，采用組織勻漿方法分離胎兒附屬物組織，獲得大量用于建庫(kù)的細(xì)胞，以滿足科研、醫(yī)藥和臨床等領(lǐng)域?qū)?xì)胞庫(kù)資源的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明的目的是提供一種組織勻漿分離胎兒附屬物細(xì)胞(團(tuán))建立細(xì)胞庫(kù)的方法。
[0017]本發(fā)明優(yōu)選使用的組織細(xì)胞處理器PlacentaPiX)是發(fā)明人為本發(fā)明設(shè)計(jì)的一種儀器，該儀器包含控制裝置和勻漿容器兩部分，如圖1所示，控制裝置包括機(jī)身(1)，勻漿容器放置孔(2)，旋轉(zhuǎn)頭(3)，卡槽(4)，散熱孔(5);勻漿容器包括杯體(6)，杯蓋(7)，密封圈
(8)，旋轉(zhuǎn)頭連接器(9)，固定軸(10)，刀頭(11)，卡頭(12)。
[0018]機(jī)身(I)側(cè)面設(shè)置有散熱孔(5)，機(jī)身(I)頂部為勻漿容器放置孔(2)，勻漿容器放置孔(2)內(nèi)壁設(shè)有卡槽(4)，勻漿容器放置孔(2)底部為旋轉(zhuǎn)頭(3)，處理組織時(shí)，勻漿容器放置入勻漿容器放置孔(2)中，杯蓋(7)底部的旋轉(zhuǎn)頭連接器(9)下端與旋轉(zhuǎn)頭(3)接合，上端通過(guò)固定軸(10)與刀頭(11)連接，杯蓋(7)通過(guò)密封圈(8)與杯身(6)緊密接合，杯身(6)外側(cè)壁的卡頭(12)與卡槽⑷接合。
[0019]其中關(guān)鍵部件為特殊設(shè)計(jì)的刀頭(11)。刀頭(11)呈四葉刀刃，由上下層疊放置且互相垂直的刀片(13)和刀片(14)組成。刀片(13)分5段，包含4個(gè)彎折，兩端兩個(gè)彎折呈130-150度(優(yōu)選138度)，中間兩個(gè)彎折呈140-160度(優(yōu)選148度)；刀片(14)分3段，包含2個(gè)彎折，兩個(gè)彎 折呈110-130度(優(yōu)選123度)；
[0020]工作時(shí)，將組織塊裝入杯身(6)，蓋上杯蓋(7)后，將勻漿容器放入勻漿容器放置孔(2)內(nèi)，通過(guò)控制器-旋轉(zhuǎn)頭(3)-旋轉(zhuǎn)頭連接器(9)-固定軸(10)-刀頭(11)的一些列傳動(dòng)。帶動(dòng)刀頭(11)轉(zhuǎn)動(dòng)，從而起到勻衆(zhòng)作用。
[0021 ] 雖然目前市場(chǎng)上已經(jīng)有少量與本發(fā)明所用的組織細(xì)胞處理器PI acentaPro作用相似的儀器，如德國(guó)美天旎公司的gentleMACS標(biāo)本處理器也能分離組織得到細(xì)胞懸液。但是第一，市面上已有的儀器的處理量都相對(duì)較小，一般只能處理5克以下的樣本，而PlacentaPro最多能處理400克的樣本，為建立細(xì)胞庫(kù)和大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)奠定了很好的基礎(chǔ)；第二，市面上已有的儀器由于結(jié)構(gòu)限制，只能處理易破碎的組織，如脾臟、肝臟、肺等，對(duì)于具有很強(qiáng)韌性的胎兒附屬物組織，如含有大量華通氏膠的臍帶也無(wú)能為力，而PlacentaPro由于結(jié)構(gòu)的特殊性，能夠在不破壞細(xì)胞活性的情況下，將韌性大的組織，如胎兒附屬物組織進(jìn)行勻漿，直接分離得到細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)方案包括組織的清洗、勻漿前處理、組織勻漿處理、過(guò)濾回收及細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程，具體步驟如下:
[0023](I)組織清洗:通過(guò)適量清洗液(例如含雙抗的PBS緩沖液)對(duì)獲得的胎兒附屬物組織進(jìn)行沖洗，直到組織表面的殘留血液被沖洗干凈。
[0024](2)組織勻漿前處理:根據(jù)組織細(xì)胞處理器PlacentaPiO的勻漿容器的大小，將得到的組織剪成小塊，放入組織細(xì)胞處理器中，加入0.5-2倍質(zhì)量的緩沖液(例如PBS緩沖液)并密封組織細(xì)胞處理器；[0025](3)組織勻漿處理:組織細(xì)胞處理器PlacentaPiO通過(guò)轉(zhuǎn)子帶動(dòng)特殊刀頭的旋轉(zhuǎn)將組織切碎和勻漿，對(duì)組織進(jìn)行細(xì)胞分離和提??；
[0026](4)組織過(guò)濾處理，細(xì)胞收集:將步驟(3)得到的組織碎片轉(zhuǎn)移至過(guò)濾裝置，對(duì)胎盤組織進(jìn)行研磨，收集濾液，對(duì)濾液進(jìn)行細(xì)胞清洗，離心收集細(xì)胞；對(duì)臍帶組織收集過(guò)濾器上的細(xì)胞團(tuán)，清洗細(xì)胞團(tuán)并收集。
[0027](5)分離的細(xì)胞(團(tuán))構(gòu)建細(xì)胞庫(kù):將步驟⑷分離的細(xì)胞(團(tuán))置液氮保存，按其ABO / Rh血型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出細(xì)胞庫(kù)。
[0028]根據(jù)本發(fā)明步驟⑴所述需要處理的樣品是胎兒附屬物組織，包括胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織、胎盤羊膜組織和臍帶組織。
[0029]根據(jù)本發(fā)明步驟(2)所述處理的組織樣品大小為:
[0030]胎盤小葉和基蛻膜30_120g，優(yōu)選60_90g，加入的緩沖液或培養(yǎng)基的體積為20-110ml，優(yōu)選 50-80ml ；
[0031 ] 臍帶5_30g，優(yōu)選10_20g，加入的緩沖液或培養(yǎng)基的體積為10_45ml，優(yōu)選15-30ml ；
[0032]胎盤底座100_300g，優(yōu)選150_200g，加入的緩沖液或培養(yǎng)基的體積為100_300ml，優(yōu)選 150-200ml;
[0033]胎盤羊膜5_25g，優(yōu)選10_20g，加入的緩沖液或培養(yǎng)基的體積為10_40ml，優(yōu)選15-25ml ；
[0034]根據(jù)本發(fā)明步驟(2)所述組織細(xì)胞處理器PlacentaPiO處理:
[0035]胎盤小葉和基蛻膜組織處理轉(zhuǎn)速為1000-2400rpm，優(yōu)選地，1400-1800rpm ；
[0036]臍帶組織處理轉(zhuǎn)速為1500-3500rpm，優(yōu)選地，2500_2800rpm ；
[0037]胎盤底座組織處理轉(zhuǎn)速為1500-2500rpm，優(yōu)選地，2000rpm ；
[0038]胎盤羊膜組織處理轉(zhuǎn)速為2000-3000rpm，優(yōu)選地，2300_2500rpm ；
[0039]根據(jù)本發(fā)明步驟(4)所述組織碎片過(guò)濾裝置為100-400目金屬過(guò)濾器，胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織過(guò)濾時(shí)優(yōu)選200目的過(guò)濾器，臍帶組織、胎盤羊膜組織過(guò)濾時(shí)優(yōu)選400目的過(guò)濾器。
[0040]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明采用自主研制的組織細(xì)胞處理器PlacentaPiO對(duì)胎兒附屬物組織細(xì)胞進(jìn)行分離的方法，具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、無(wú)外源試劑加入、易于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制以及細(xì)胞獲得量大等優(yōu)點(diǎn)，為提高細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建效率，保障細(xì)胞庫(kù)優(yōu)質(zhì)的質(zhì)量具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1組織細(xì)胞處理器PlacentaPro結(jié)構(gòu)示意圖
[0042]圖2原代細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)
[0043]圖3臍帶組織處理得到的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)并傳至P3代的細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)圖
[0044]圖4臍帶組織處理得到的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)并傳至P3代的細(xì)胞流式圖
[0045]圖5胎盤羊膜組織處理后得到的細(xì)胞團(tuán)的原代培養(yǎng)形態(tài)圖
【具體實(shí)施方式】[0046]實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0047]實(shí)施例1:采用組織勻漿法分離胎盤小葉細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)
[0048]胎盤小葉組織勻漿的方法包括以下步驟:
[0049](I)胎盤組織清洗:胎盤組織是在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行處理，根據(jù)胎盤大小使用適量含1%雙抗的PBS緩沖液對(duì)胎盤組織進(jìn)行沖洗，至胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無(wú)血液凝塊；
[0050](2)胎盤小葉組織前期處理:使用手術(shù)剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把胎盤小葉轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上并剪成小塊，把60-90克的胎盤小葉組織塊放入組織細(xì)胞處理器PlacentaPro的勻漿容器中，加入50-80毫升的PBS并密封處理杯；
[0051](3)胎盤小葉組織勻漿處理:利用組織細(xì)胞處理器PlacentaPiO將步驟(2)得到的胎盤小葉組織塊通過(guò)組織切碎和勻漿的物理處理進(jìn)行細(xì)胞分離和提取，攪拌速度為1400rpm-1800rpm之間，處理時(shí)間為5分鐘；
[0052](4)胎盤小葉組織過(guò)濾處理:將步驟(3)處理完畢后的胎盤小葉組織轉(zhuǎn)移到200目金屬過(guò)濾器上,對(duì)組織碎片進(jìn)行研磨并利用另一個(gè)培養(yǎng)皿收集過(guò)濾完的液體,分成2次往金屬過(guò)濾器加入10-15ml的PBS清洗組織并繼續(xù)研磨。
[0053](5)細(xì)胞計(jì)數(shù):用50ml離心管收集步驟(4)獲得的細(xì)胞懸液，以1400rpm /分鐘的速度離心10分鐘,去上清并加入PBS重懸細(xì)胞，抽取小量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0054]胎盤小葉組織細(xì)胞分離處理測(cè)試共分8組分別進(jìn)行，每一組進(jìn)行了兩個(gè)不同的測(cè)試設(shè)定，分別為(a) 1400rpm, 5分鐘和(b) 1800rpm, 5分鐘。胎盤組織來(lái)源于8個(gè)不同的供者，處理量在60克左右之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0055]
[0056]表1 (a)胎盤小葉組織勻漿處理細(xì)胞提取數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征是由下述步驟組成: (1)對(duì)胎兒附屬物組織提供者進(jìn)行ABO/ Rh血型檢測(cè)、HLA分型檢測(cè)、微生物免疫檢測(cè)、用含雙抗的緩沖液去除殘留血液； (2)組織勻漿前處理:將清洗后的組織剪成小塊，放入組織細(xì)胞處理裝置樣品室中，加入0.5-2倍質(zhì)量的緩沖液或培養(yǎng)基，密封組織細(xì)胞處理裝置； (3)組織勻漿處理:運(yùn)轉(zhuǎn)組織細(xì)胞處理裝置，在轉(zhuǎn)速為1000-3500rpm，處理時(shí)間為1_15分鐘的條件下，將組織切碎和勻漿，對(duì)組織進(jìn)行細(xì)胞(團(tuán))的分離處理； (4)組織過(guò)濾處理:將步驟(3)得到的勻漿液通過(guò)100-400目的濾網(wǎng)過(guò)濾:對(duì)于胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織，對(duì)濾網(wǎng)上殘留的少許胎盤組織塊進(jìn)行研磨，收集濾液；對(duì)于臍帶組織、胎盤羊膜組織，收集濾網(wǎng)上的細(xì)胞團(tuán)。 (5)細(xì)胞(團(tuán))收集與清洗:對(duì)于細(xì)胞，用離心管收集步驟(4)得到的細(xì)胞懸液，以1400-1800rpm /分鐘的速度離心5_15分鐘，去上清并加入緩沖液重懸細(xì)胞；對(duì)于細(xì)胞團(tuán)，用緩沖液清洗后直接收集細(xì)胞團(tuán)。 (6)將步驟(5)分離的細(xì)胞(團(tuán))置液氮保存，按其ABO/ Rh分型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出細(xì)胞庫(kù)。
2.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(I)中，胎兒附屬物組織包括胎盤小葉和基蛻膜、胎盤底座、胎盤羊膜和臍帶。
3.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中.，所使用的組織細(xì)胞處理裝置為組織勻漿處理器，優(yōu)選發(fā)明人研制的組織細(xì)胞處理器PlacentaPro。
4.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，組織細(xì)胞處理裝置所處理的胎兒附屬物組織樣品的大小為5-300g，其中臍帶組織為5-30g，胎盤小葉和基蛻膜組織為30-120g，胎盤底座組織為100-300g，胎盤羊膜組織為5-25g。
5.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，胎盤小葉和基脫膜組織處理轉(zhuǎn)速優(yōu)選1000-2400rpm ;臍帶組織處理轉(zhuǎn)速優(yōu)選1500-3500rpm ;胎盤底座組織處理轉(zhuǎn)速優(yōu)選1500_2500rpm ;胎盤羊膜組織處理轉(zhuǎn)速優(yōu)選2000-3000rpm。
6.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，過(guò)濾胎盤小葉和基蛻膜組織、胎盤底座組織時(shí)，優(yōu)選200目的金屬濾網(wǎng)；過(guò)濾臍帶組織、胎盤羊膜組織時(shí)，優(yōu)選400目的金屬濾網(wǎng)。
7.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中，細(xì)胞庫(kù)可以是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)、胎盤造血干細(xì)胞庫(kù)、胎盤亞全能細(xì)胞庫(kù)、基蛻膜干細(xì)胞庫(kù)和羊膜上皮細(xì)胞庫(kù)。
8.如權(quán)利要求1所述的組織勻漿法分離胎兒附屬物組織構(gòu)建細(xì)胞(團(tuán))庫(kù)的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中，質(zhì)量控制包括了細(xì)胞來(lái)源的調(diào)查；細(xì)胞污染的檢測(cè)，如乙肝兩對(duì)半、丙肝、艾滋、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和梅毒；遺傳病檢測(cè)；HLA-ABC / DR配型檢測(cè)；細(xì)胞活性的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK103469309SQ201310413590
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】許曉椿, 肖海蓉 申請(qǐng)人:博雅干細(xì)胞科技有限公司