超強抗砷菌As-6及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從環(huán)境樣品中選育和分離的具有超強抗砷性能，可高效氧化含砷硫化礦特別是砷黃鐵礦的浸礦菌及其在高砷金礦預(yù)氧化中的應(yīng)用，屬于微生物冶金【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的超強抗砷菌As-6經(jīng)鑒定為氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum?ferrooxidans)，系從高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣中選育分離所得，其抗砷濃度達(dá)21.5％。用該菌對含砷量43％的超高砷金精礦進(jìn)行預(yù)氧化，可使氧化渣的含砷量降低92.16％，重量下降53.02％；提金試驗表明，氧化渣金的浸出率達(dá)到93.04％，是未經(jīng)細(xì)菌預(yù)氧化的金精礦的5倍。超強抗砷菌As-6對于提高我國難處理高砷金礦資源的利用率具有重要作用，其應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】超強抗砷菌As-6及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種從環(huán)境樣品中選育和分離具有超強抗砷性能，可高效氧化含砷硫化礦特別是砷黃鐵礦的浸礦菌及其在高砷金礦預(yù)氧化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]含砷硫化礦是有價金屬特別是貴金屬的重要載體礦物，全球超過2 / 3我國約有I / 3的金礦是含砷礦。含砷金礦的金被包裹在砷黃鐵礦一類的硫化礦中，屬于難利用金礦，如不進(jìn)行預(yù)處理金的提取率很低。目前國內(nèi)外普遍采用氧化法預(yù)處理含砷難利用金礦，包括氧化焙燒法、加壓氧化法、化學(xué)氧化法和微生物氧化法等(鄭存江.含砷難浸金礦的研究及應(yīng)用[J].陜西地質(zhì).2003，21 (I):88-97;李俊萌.難處理金礦石預(yù)處理方法研究現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢[J].稀有金屬，2003，27 (4):478-481 ;陳聰，姚香.難處理金礦石預(yù)處理方法簡述[J].黃金科學(xué)技術(shù)，2004，12 (4):27-30 ;王力軍，劉春謙.難處理金礦石預(yù)處理技術(shù)綜述[J].黃金.2000,21(1):38-45)，其中微生物預(yù)氧化法對環(huán)境無污染、流程簡單、投資少、成本低，是最有發(fā)展前景的預(yù)處理方法(伍贈玲.高砷微細(xì)浸染型難處理金礦細(xì)菌預(yù)氧化-氰化提金試驗研究[J].礦冶工程，2010，30 (I) =54-56,61.;王康林，汪模輝，蔣金龍.難處理金礦石的細(xì)菌氧化預(yù)處理研究現(xiàn)狀[J].黃金科學(xué)技術(shù)，2001，9 (I):19-24.)。由于含砷金礦中的三價砷有很強的生物毒性，用于含砷金礦預(yù)氧化的微生物必須具備抗砷性能和砷氧化能力，微生物的抗砷性能和砷氧化能力決定了含砷金礦的微生物預(yù)處理效果，進(jìn)而決定了金的回收率和提取成本。目前用于含砷金礦預(yù)氧化的微生物對砷濃度都有一定要求，大多在2%~10%之間，最高不超過15%，這是因為過高的砷將對微生物造成毒害甚至致死，嚴(yán)重影響預(yù)氧化效果。而事實上很多含砷金精礦的含砷量甚至達(dá)到40%以上，目前這部分砷含量超高的金礦還不能利用微生物進(jìn)行預(yù)處理。因此，尋找抗15%以上砷濃度的超強抗砷菌對于提高我國含砷金礦資源的利用率具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003]技術(shù)問題
[0004]針對上述問題本發(fā)明從高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣中選育和分離了一株超強抗砷菌As-6，并應(yīng)用于高砷金精礦的預(yù)氧化。該菌的抗砷濃度達(dá)到21.5%。本發(fā)明提供的超強抗砷菌，將對我國含砷難處理金礦的高效利用產(chǎn)生重要的推動作用。
[0005]技術(shù)方案
[0006](I)菌種選育
[0007]采集高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣，加入2倍體積的稀硫酸水溶液(pH2.0)，緩慢攪拌混溶，制成懸濁液。
[0008]取一只已滅菌的250mL三角瓶，加入150mL培養(yǎng)基1，按5%的接種量接入上述樣品懸濁液，用稀硫酸調(diào)PH至2.0，在30°C下震蕩培養(yǎng)，定期檢測培養(yǎng)液的Fe2+，當(dāng)Fe2+氧化率達(dá)到95%以上時，按配方比例重新向培養(yǎng)液中加入FeSO4.7H20，并用滅菌水補足培養(yǎng)液至原體積(150mL)，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)10d，此為第一代富集物。
[0009]將第一代富集物按2%的接種量，轉(zhuǎn)接到150mL培養(yǎng)基2中，在相同條件下震蕩培養(yǎng)，定期檢測菌密度，待菌密度到達(dá)拐點時終止培養(yǎng)，此為第二代富集物。
[0010]取第二代富集物，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到相同體積的培養(yǎng)基3中，在相同條件下連續(xù)震蕩培養(yǎng)，定期檢測菌密度，直到菌密度達(dá)峰值時停止培養(yǎng)，此為第三代富集物。
[0011]吸取第三代富集物，按15%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基4中，改為攪拌培養(yǎng)，其它條件相同，待菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第四代富集物。
[0012]取第四代培養(yǎng)物，按15%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基5中，在上述相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，檢測菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第五代富集物。
[0013]取第五代培養(yǎng)物，按20%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基6中，在相同條件下繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，檢測菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第六代富集物。
[0014](2)菌種分離
[0015]將第六代富集物按ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ,稀釋度，分別接入分離培養(yǎng)基中，在30°C下進(jìn)行震蕩稀釋分離，采用直接計數(shù)法測定活細(xì)胞數(shù)，當(dāng)活菌數(shù)達(dá)IXlO7 / ml時，停止培養(yǎng)，選擇稀釋倍數(shù)最高的培養(yǎng)物作為稀釋物I ;如此再反復(fù)稀釋分離三次，最后得到稀釋物4即純菌株。經(jīng)16S rRNA基因序列驗證，與氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)的相似性達(dá)99%，鑒定為氧化亞鐵鉤端螺旋菌。該菌株的16S rRNA基因序列已在GenBank注冊，注冊號KF150286。由于As-6菌株的抗砷能力遠(yuǎn)高于已有抗砷菌,具有超強抗砷性能，故命名為超強抗砷菌As-6(見圖)。該菌已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))保藏，保藏號為CCTCC NO:M2013515。保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山，郵編:430072，電話:
(027)-68752319 ;保藏日期:2013 年 10 月 25 日。
[0016](3)菌種保存與活性維持
[0017]按第六代富集物相同的培養(yǎng)方法，每20天轉(zhuǎn)接一次，可長期保存As-6菌并維持其抗砷活性。
[0018]⑷應(yīng)用試驗
[0019]用本發(fā)明選育和分離的超強抗砷菌As-6對含砷量達(dá)43%的金精礦進(jìn)行的預(yù)氧化試驗。試驗溫度30°C,接種量10% (V / V),礦衆(zhòng)濃度20% (w / V),預(yù)氧化系統(tǒng)總體積10L，攪拌速度180轉(zhuǎn)/分鐘，試驗時間7天。原礦和氧化渣中金、砷和其它金屬元素的含量均采用原子吸收光譜法測定。
[0020]試驗結(jié)果:氧化渣與原金精礦相比，含砷量降低了 92.16%，重量下降了 53.02%。氧化洛提金試驗表明，當(dāng)氧化洛濃度25% (w / V),初始氰化鈉濃度為0.15 % (w / V),pH=9.5~10時，20°C下經(jīng)過48小時，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未經(jīng)細(xì)菌預(yù)氧化的金精礦的5倍。試驗結(jié)果表明，該超強抗砷菌對我國難處理高砷金礦資源的高效利用具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0021] 圖:超強抗砷菌As-6【具體實施方式】:[0022](I)菌種選育
[0023]采集高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣，加入2倍體積的稀硫酸水溶液(pH2.0)，緩慢攪拌混溶，制成懸濁液。
[0024]取一只已滅菌的250mL三角瓶，加入150mL培養(yǎng)基1，按5%的接種量接入上述樣品懸濁液，用稀硫酸調(diào)PH至2.0，在30°C下震蕩培養(yǎng)，定期檢測培養(yǎng)液的Fe2+，當(dāng)Fe2+氧化率達(dá)到95%以上時，按配方比例重新向培養(yǎng)液中加入FeSO4.7H20，并用滅菌水補足培養(yǎng)液至原體積(150mL)，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)10天，此為第一代富集物。
[0025]將第一代富集物按2%的接種量，轉(zhuǎn)接到150mL培養(yǎng)基2中，在相同條件下震蕩培養(yǎng)，定期檢測菌密度，待菌密度到達(dá)拐點時終止培養(yǎng)，此為第二代富集物。
[0026]取第二代富集物，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到相同體積的培養(yǎng)基3中，在相同條件下連續(xù)震蕩培養(yǎng)，定期檢測菌密度，直到菌密度達(dá)峰值時停止培養(yǎng)，此為第三代富集物。
[0027]吸取第三代富集物，按15%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基4中，改為攪拌培養(yǎng)，其它條件相同，待菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第四代富集物。
[0028]取第四代培養(yǎng)物，按15%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基5中，在上述相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，檢測菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第五代富集物。
[0029]取第五代培養(yǎng)物，按20%的接種量轉(zhuǎn)接到同樣體積的培養(yǎng)基6中，在相同條件下繼續(xù)攪拌培養(yǎng)，檢測菌密度到達(dá)最高點時停止培養(yǎng)，得到第六代富集物。
[0030](2)菌種分離
[0031]將第六代富集物按10_8、10_9、10_1(1稀釋度，分別接入分離培養(yǎng)基中，在30°C下進(jìn)行震蕩稀釋分離，采用直接計數(shù)法測定活細(xì)胞數(shù)，當(dāng)活菌數(shù)達(dá)IXlO7 / ml時，停止培養(yǎng)，選擇稀釋倍數(shù)最高的培養(yǎng)物作為稀釋物I ;如此再反復(fù)稀釋分離三次，最后得到稀釋物4即As-6純菌。經(jīng)16S rRNA基因序列驗證,與氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)的相似性達(dá)99%，鑒定為氧化亞鐵鉤端螺旋菌。該菌株的16S rRNA基因序列已在GenBank注冊，注冊號KF150286。由于As-6菌株的抗砷能力遠(yuǎn)高于已有抗砷菌，具有超強抗砷性能，故命名為超強抗砷菌As-6 (見圖)。As-6菌返接到培養(yǎng)基6中，72小時即可達(dá)到菌密度峰值，表明該菌對含砷量達(dá)43%的金礦具有很好的適應(yīng)性，抗砷濃度已達(dá)到21.5%。該菌已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))保藏，保藏號為CCTCC NO:M2013515o保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山，郵編:430072，電話:(027)-68752319 ;保藏日期:2013年10月25曰。
[0032](3)菌種保存與活性維持
[0033]按第六代富集物相同的培養(yǎng)方法，每20天轉(zhuǎn)接一次，可長期保存As-6菌并維持其抗砷活性。
[0034](4)應(yīng)用試驗
[0035]用本發(fā)明選育和分離的超強抗砷菌As-6對含砷量達(dá)43%的金精礦進(jìn)行的預(yù)氧化試驗表明，在30°C下，當(dāng)接種量10% (V / V),礦衆(zhòng)濃度20% (w / V),預(yù)氧化系統(tǒng)總體積10L，攪拌速度180轉(zhuǎn)/分鐘，經(jīng)過7天，氧化渣與原礦相比，含砷量降低了 92.16%，重量下降了 53.02%,試驗結(jié)果見表1。氧化洛提金試驗表明，當(dāng)氧化洛濃度25% (w / V),初始氰化鈉濃度為0.15% (w / V)，pH=9.5~10時，20°C下經(jīng)過48小時，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未經(jīng)細(xì)菌預(yù)氧化的金精礦的5倍，試驗結(jié)果見表2。原金精礦和氧化渣中金、砷和其它金屬元素的含量均采用原子吸收光譜法測定。
[0036]本發(fā)明所用培養(yǎng)基配方如下:
[0037]培養(yǎng)基I: (NH4)2S043.0g / L, MgSO4.7Η200.5g/L, KH2PO40.5g/L, Ca(NO3)20.01g/L，F(xiàn)eSO4.7H205g / L，高砷金精礦(Asl9.2% )50g/L。
[0038]培養(yǎng)基2: (NH4)2SO41.5g / L，MgSO4.7Η200.25g / L, K2SO4L Og/L,
0.5g(NH4)2HP04g/L，高砷金精礦(Asl9.2% ) 100g / L。
[0039]培養(yǎng)基3: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7Η200.2g/L，K2S042.0g / L，1.0g(NH4)2HPO4g/L，高砷金精礦(Asl9.2% )200g/L。
[0040]培養(yǎng)基4: (NH4)2SO4L Og/L, MgSO4.7Η200.2g / L，K2S044.0g/L, 2.0g(NH4)2HPO4g /L，高砷金精礦(Asl9.2% )300g/L。
[0041]培養(yǎng)基5:高砷金精礦(Asl9.2% )400g / L，其它成分配比與培養(yǎng)基4相同。
[0042]培養(yǎng)基6:高砷金精礦(Asl9.2% ) 500g/L，其它成分配比與培養(yǎng)基5相同。
[0043]分離培養(yǎng)基=(NH4)2SO4LOg/ L, MgSO4.7H200.2g/L, K2S044.0g / L，
2.0g(NH4) 2HP04g/L, As203150g/L。
[0044]培養(yǎng)基I至6所用的金精礦砷含量為43%,各兀素的質(zhì)量百分比見表1。
[0045]表1細(xì)菌氧化前后金精礦主要元素含量比較)
【權(quán)利要求】
1.超強抗砷菌As-6，其特征在于該菌是從高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣中選育分離所得，其抗砷濃度高達(dá)21.5%,該菌經(jīng)鑒定為氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)，保藏號為CCTCC NO:M2013515。其選育分離步驟為: (1)菌種選育 采集高砷金精礦庫房排水溝酸性泥樣，加入2倍體積的稀硫酸水溶液(pH2.0)，緩慢攪拌混溶，制成懸濁液。在PH2.0和30°C條件下，依次經(jīng)6種配方培養(yǎng)基振蕩或攪拌培養(yǎng)，最后得到第六代富集物。
培養(yǎng)基 1: (NH4)2S043.0g / L, MgSO4.7H200.5g/L, KH2PO40.5g/L, Ca(NO3)20.01g/L,FeSO4.7H205g/L，高砷金精礦(Asl9.2% ) 50g / L。
培養(yǎng)基 2: (NH4) 2S041.5g/L，MgSO4.7H200.25g / L，K2SO4L Og/L, 0.5g (NH4) 2HP04g/L，高砷金精礦(Asl9.2% )100g / L。
培養(yǎng)基 3: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7H200.2g/L，K2S042.0g / L，1.0g (NH4) 2HP04g/L,聞神金精礦(Asl9.2% ) 200g / L0
培養(yǎng)基 4: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7H200.2g/L，K2S044.0g/L, 2.0g (NH4) 2HP04g/L，高砷金精礦(Asl9.2% )300g / L。 培養(yǎng)基5:高砷金精礦(Asl9.2% )400g/L，其它成分配比與培養(yǎng)基4相同。 培養(yǎng)基6:高砷金精礦(Asl9.2% )500g/L，其它成分配比與培養(yǎng)基5相同。 培養(yǎng)基I至6所用高砷金精礦的砷質(zhì)量百分比為43%。 (2)菌種分離 將第六代富集物按10_8、10_9、10,稀釋度，分別接入分離培養(yǎng)基中，在30°C下進(jìn)行震蕩稀釋分離，經(jīng)連續(xù)四次稀釋分離，最終獲得稀釋物4即As-6純菌。
分離培養(yǎng)基:(NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7Η200.2g/L，K2S044.0g / L,2.0g(NH4)2HPO4g/L, As203150g/L。 分離培養(yǎng)基所用高砷金精礦與培養(yǎng)基I至6相同。
2.利用權(quán)利要求1所述菌株對高砷金精礦進(jìn)行預(yù)氧化處理，其特征在于:所用金精礦的砷質(zhì)量百分比為43%，屬超高砷金礦，預(yù)氧化溫度為30°C，接種量10% (v / V)，礦漿濃度20% (w / V)，攪拌速度180轉(zhuǎn)/分鐘，總體積10L，時間為7天。
3.經(jīng)權(quán)利要求1所述菌株預(yù)氧化處理后的超高砷金精礦，其特征在于:氧化渣與原礦相比，含砷量降低了 92.16 %，重量下降了 53.02 %。氧化渣提金試驗表明，當(dāng)氧化渣濃度25% (w / V)，初始氰化鈉濃度為0.15% (w / v)，pH=9.5~10時，20°C下經(jīng)過48小時，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未經(jīng)細(xì)菌預(yù)氧化的金精礦的5倍。
【文檔編號】C22B11/00GK103911316SQ201410030351
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】丁建南, 張國華, 于一尊, 計少石, 胡淼, 何力 申請人:南昌資環(huán)生態(tài)科技有限公司