雜交富集捕獲dna測序文庫洗滌溶液及洗滌方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜交富集捕獲DNA測序文庫洗滌溶液及洗滌方法，僅由檸檬酸鈉緩沖液(SSC)及SDS組成。本發(fā)明的洗滌溶液配方簡單，易于獲得，成本較低且穩(wěn)定易于保存；洗滌方法簡單，易于操作，不需要特殊的儀器；洗滌效果好，背景值低，從而提高了靶向富集的效率；洗滌后的文庫洗脫方法簡單易行，不需要額外的試劑和純化，既減少了進(jìn)一步純化所帶來的損失也縮減了工藝流程的時間。
【專利說明】雜交富集捕獲DNA測序文庫洗滌溶液及洗滌方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種雜交富集捕獲DNA測序文庫洗滌溶液及洗滌方法。

【背景技術(shù)】
[0002]雙鏈核酸分子(如DNA，DNA/RNA，RNA/RNA)以雙螺旋的構(gòu)象存在。這種雙螺旋結(jié)構(gòu)是由雙鏈中相對應(yīng)堿基之間的氫鍵(如A+T/U或G+C)以及堿基堆積中的疏水力來穩(wěn)定的。堿基互補配對原則(雜交)是涉及核酸的所有進(jìn)程的中心原則。在基本的雜交反應(yīng)中，核酸探針或引物被設(shè)計成與靶序列互補結(jié)合。通過雜交誘捕富集基因組DNA測序文庫而進(jìn)行針對目標(biāo)基因組區(qū)域或一組基因的靶向測序就是利用了這一原理。
[0003]核酸雜交的效率和準(zhǔn)確性主要取決于以下三個方面:(I)變性條件(即分離)；
(2)復(fù)性條件(即重新退火)；(3)雜交后的洗滌條件。一旦核酸的互補鏈被分離時，“復(fù)性”或“再退火”的步驟使引物或探針結(jié)合到靶核酸的樣品中。該步驟也有時被稱為“雜交”步驟。在雜交富集DNA測序文庫時，與基因組靶序列相結(jié)合的生物素標(biāo)記的探針將與鏈酶親和素磁珠緊密結(jié)合而被捕獲下來。在這之后，任何沒有結(jié)合的，或者非特異性錯誤結(jié)合的DNA序列將被通過一系列的洗滌反應(yīng)而被除去?；虬行蛄信c捕獲探針之間的特異性結(jié)合很大程度上取決于這些洗滌步驟的苛刻性?；パa性高的DNA雙鏈在這種苛刻的洗滌環(huán)境中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于互補性低的。 因此，提高洗滌的苛刻性可以用于去除探針與基因組DNA之間的非特異性結(jié)合。
[0004]3個主要的可調(diào)節(jié)因素決定了洗滌的苛刻性:1.溫度。隨著溫度的升高，探針與基因組DNA之間的非特異性結(jié)合將被變性，分離。2.鹽濃度。隨著鹽濃度的降低，探針與基因組DNA之間的非特異性結(jié)合將被變性，分離。3.時間。隨著洗滌時間的延長，探針與基因組DNA之間的非特異性結(jié)合將被變性，分離。其他的影響因素包括pH值和洗滌的次數(shù)也會影響洗滌的苛刻性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種能夠以較低成本，簡單，快速，高效的實現(xiàn)對利用鏈霉親和素磁珠和生物素標(biāo)記探針結(jié)合而進(jìn)行的雜交誘捕富集DNA測序文庫進(jìn)行洗滌的洗滌溶液配方及采用此洗滌溶液進(jìn)行洗滌和后續(xù)洗脫測序文庫的方法。為了達(dá)到上述目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明一方面涉及一種雜交誘捕富集DNA測序文庫的洗滌溶液，其特征在于它是僅由檸檬酸鈉緩沖液(SSC)及十二烷基硫酸鈉(SDS)組成，所述的組分是獨立包裝的。
[0007]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，檸檬酸鈉緩沖液包括NaCl,和檸檬酸鈉,其pH值是 6.8-7.2.
[0008]本發(fā)明另一方面還涉及采用上述洗滌溶液進(jìn)行洗滌文庫的方法，
[0009]采用洗滌溶液包括:
[0010]洗滌溶液I:1X SSC，0.1 % SDS ；
[0011]洗滌溶液II:0.1X SSC, 0.1 % SDS ；
[0012]洗滌溶液III:0.2X SSC, 10% SDS
[0013]其特征在于包括如下步驟:
[0014]準(zhǔn)備:對于每個富集反應(yīng)，將Iml洗滌溶液I和2ml洗滌溶液II提前30分鐘置于65°C溫育，其他洗滌溶液置于室溫；
[0015]將利用Invitrogen Dynabeads? M270鏈霉親和素磁珠對生物素標(biāo)記雜交探針進(jìn)行的捕獲反應(yīng)體系于600g快速離心3秒，以確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留；
[0016]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；
[0017]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液I，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘；
[0018]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；
[0019]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘；
[0020]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；
[0021]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘；
[0022]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；
[0023]取下離心管并向其中加入室溫的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于室溫放置旋轉(zhuǎn)混勻器旋轉(zhuǎn)5min ；
[0024]取下離心管后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留；
[0025]將離心管放在磁力分離架上，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液，并用PlO移液槍盡量棄去所有剩余的液體；
[0026]保持離心管置于磁力架上，從磁珠的另一面管壁加入ImL洗滌溶液III，計時30秒后，小心取出并棄去上清液，并用移液槍盡量棄去剩余的液體。
[0027]待磁珠干燥之后，加入22.5 μ L無酶水重懸磁珠，用移液槍上下混勻10次后置于98°C 加熱 1min ；
[0028]加熱后取出樣品，渦旋混合后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留;
[0029]將離心管置于磁力架上待澄清后，立即取出20 μ L含有雜交誘捕富集的DNA文庫樣品上清液用于后續(xù)的富集后擴(kuò)增。
[0030]本洗滌溶液配方及其洗滌方法的優(yōu)勢在于:
[0031]1.配方簡單，易于獲得，成本較低且穩(wěn)定易于保存。
[0032]2.洗滌方法簡單，易于操作，不需要特殊的儀器。
[0033]3.洗滌效果好，背景值低(如圖1)，從而提高了靶向富集的效率(與商品化洗滌溶液及方法相比中靶率可從60%提高到85% )。
[0034]4.洗滌后的文庫洗脫方法簡單易行，不需要額外的試劑洗脫和純化，既減少了進(jìn)一步純化所帶來的損失也縮減了工藝流程的時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0035]圖1、利用本發(fā)明洗滌溶液配方及相應(yīng)洗滌方法與商品化洗滌溶液的對比試驗。非目標(biāo)基因的富集倍數(shù)(背景值)通過實時定量PCR(realtime-qPCR)進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果為三次獨立重復(fù)試驗所得平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean土 SEM)。

【具體實施方式】
[0036]結(jié)合實施實例，詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于下述實施方式，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進(jìn)行實施。
[0037]實施例1
[0038]配制雜交誘捕富集DNA測序文庫的洗滌溶液，它是僅由檸檬酸鈉緩沖液(SSC)及SDS組成。在4°C下可長期保存。
[0039]I)所需試劑:20X SSC (3M NaCl，300mM檸檬酸鈉，調(diào)節(jié)PH值至7.0)
[0040]10% SDS
[0041]2)洗滌溶液 1:1X SSC
[0042]0.1 % SDS
[0043]3)洗滌溶液 I1:0.1X SSC
[0044]0.1 % SDS
[0045]4)洗滌溶液 II1:0.2XSSC
[0046]10% SDS
[0047]采用上述洗滌溶液進(jìn)行洗滌文庫的方法以及后續(xù)文庫的洗脫，按如下的步驟:
[0048] 準(zhǔn)備:對于每個富集反應(yīng)，將Iml洗滌溶液I和2ml洗滌溶液II提前30分鐘置于65°C溫育。其他洗漆溶液置于室溫。
[0049]將利用Invitrogen Dynabeads? M270鏈霉親和素磁珠對生物素標(biāo)記雜交探針進(jìn)行的捕獲反應(yīng)體系于600g快速離心3秒，以確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留。
[0050]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液。
[0051]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液I，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘。
[0052]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液。
[0053]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘。
[0054]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液。
[0055]取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65°C孵育5分鐘。
[0056]將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液。
[0057]取下離心管并向其中加入室溫的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于室溫放置旋轉(zhuǎn)混勻器旋轉(zhuǎn)5min。
[0058]取下離心管后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留。
[0059]將離心管放在磁力分離架上，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液，并用PlO移液槍盡量棄去所有剩余的液體。
[0060]保持離心管置于磁力架上，從磁珠的另一面管壁加入ImL洗滌溶液III (不要弄亂磁珠)，計時30秒后，小心取出并棄去上清液，并用PlO移液槍盡量棄去剩余的液體。
[0061]室溫干燥磁珠約3分鐘?？煽磳嶋H磁珠干燥情況，適當(dāng)延長或者縮短干燥時間。
[0062]待磁珠干燥之后，加入22.5 μ L無酶水重懸磁珠，用移液槍上下混勻10次后置于98°C加熱 1min。
[0063]加熱后取出樣品，渦旋混合后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘
&3甶O
[0064]將離心管置于磁力架上待澄清后，立即取出20 μ L含有雜交誘捕富集的DNA文庫樣品上清液加入到0.2mL PCR管中，用于后續(xù)富集DNA文庫的擴(kuò)增。
[0065]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種雜交誘捕富集DNA測序文庫的洗滌溶液，其特征在于它是僅由檸檬酸鈉緩沖液(SSC)及SDS組成,所述的組分是獨立包裝的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洗滌溶液，檸檬酸鈉緩沖液包括NaCl，和檸檬酸鈉，其pH值是 6.8-7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洗滌溶液，其特征在于包括如下洗滌溶液:
洗滌溶液 I:1X SSC, 0.1 % SDS ；
洗滌溶液 II:0.1X SSC, 0.1 % SDS ； 洗滌溶液 In:0.2X SSC, 10% SDS。
4.采用權(quán)利要求3所述的洗滌溶液進(jìn)行洗滌文庫的方法，其特征在于包括如下步驟: 準(zhǔn)備:對于每個富集反應(yīng)，將Iml洗滌溶液I和2ml洗滌溶液II提前30分鐘置于65°C溫育，其他洗滌溶液置于室溫； 將利用Invitrogen Dynabeads? M270鏈霉親和素磁珠對生物素標(biāo)記雜交探針進(jìn)行的捕獲反應(yīng)體系于600g快速離心3秒，以確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留； 將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；取下離心管并向其中 加入65°C溫育的ImL洗滌溶液I，用移液槍上下混勻10次后，于65。。孵育5分鐘； 將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65。。孵育5分鐘； 將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；取下離心管并向其中加入65°C溫育的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于65。。孵育5分鐘； 將離心管放在磁力分離架上，放置I分鐘，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液；取下離心管并向其中加入室溫的ImL洗滌溶液II，用移液槍上下混勻10次后，于室溫放置旋轉(zhuǎn)混勻器旋轉(zhuǎn)5min ； 取下離心管后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留； 將離心管放在磁力分離架上，待液體澄清后，小心取出并棄去上清液，并用PlO移液槍盡量棄去所有剩余的液體； 保持離心管置于磁力架上，從磁珠的另一面管壁加入ImL洗滌溶液III，計時30秒后，小心取出并棄去上清液,并用移液槍盡量棄去剩余的液體； 待磁珠干燥之后，加入22.5 μ L無酶水重懸磁珠，用移液槍上下混勻10次后置于98°C加熱1min ； 加熱后取出樣品，渦旋混合后于600g快速離心3秒，確保管壁管蓋上沒有磁珠殘留；將離心管置于磁力架上待澄清后，立即取出20 μ L含有雜交誘捕富集的DNA文庫樣品上清液用于后續(xù)的富集后擴(kuò)增。
【文檔編號】C40B40/06GK104178817SQ201410395399
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】邵華武, 邵陽 申請人:邵華武, 邵陽