適用于擴增子測序文庫構建的引物及擴增子測序文庫的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適用于擴增子測序文庫構建的引物及擴增子測序文庫的構建方法。該引物由一條上游引物和一條下游引物構成，且上游引物和下游引物按照從5’端至3’端的順序均包括接頭序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列。本發(fā)明所提供的引物，通過將接頭序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列整合在于一對引物上，使得利用該引物夠經(jīng)一步擴增完成文庫構建，不僅提高測序文庫質量及建庫效率，而且構建所得的擴增子測序文庫因具有常規(guī)測序平臺上所使用的接頭序列以及測序引物序列，使得該測序文庫能夠利用常規(guī)上機測序所用的試劑進行高通量測序，而無需額外提供測序引物以及對所混入的PHiX文庫的測序引物進行變更。
【專利說明】適用于擴增子測序文庫構建的引物及擴增子測序文庫的構 建方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及高通量測序領域，具體而言，涉及一種適用于擴增子測序文庫構建的 引物及擴增子測序文庫的構建方法。

【背景技術】
[0002] 擴增子測序是對特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進行測序，主要包括16S rDNA測序、18S rDNA測序、ITS測序及功能基因檢測等。采用Illumina MiSeq第二代高通 量測序平臺測定的16S/18S/ITS某個高變區(qū)域的序列，來反應環(huán)境樣品在細菌、真菌、古細 菌分類方面物種之間的差異，對研究海洋、土壤、腸道糞便等環(huán)境中的微生物構成有重要的 指導作用；同樣，也可通過對某些功能基因片段的測序，挖掘更多的生物學信息。
[0003] 16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，采用MiSeq測序儀，對 16S rDNA某個高變區(qū)進行測序，以進一步對環(huán)境微生物中的細菌或古細菌的多樣性進行分 析。
[0004] 為完成16S rDNA的測序，首先需要基于Illumina測序儀進行相應的文庫構建，目 前基于Illumina測序平臺的建庫方法主要有兩種，包括兩步擴增建庫方法以及一步擴增 建庫方法。第一種建庫方法為較早的建庫方法，為兩步擴增建庫，即使用兩對引物進行兩輪 PCR進行建庫。第二種方法為Illumina官方推薦的一步擴增方法，該方法目前使用比較廣 泛，即通過一步擴增完成建庫過程。
[0005] 上述兩種建庫方法中，兩步擴增方法雖然可以直接使用Illumina Miseq相配套的 試劑進行測序，但建庫過程中需要經(jīng)過兩次擴增，步驟較為繁瑣，且經(jīng)過兩次擴增引入的污 染較多，使得后續(xù)信息分析準確度降低。一步擴增方法雖然可以較為方便地通過一步PCR 擴增完成建庫，但該方法在進行上機測序時，不能使用Illumina Miseq相配套的試劑進行 測序，需要自定義目的片段的測序引物以及每個樣品的index測序引物，而且，同時還需要 對混入的λ-DNA文庫（PhiX文庫）的相應測序引物進行變更才可進行測序。
[0006] 因此，仍需要對現(xiàn)有的建庫方法進行改進，以便提供一種快捷、污染較少的擴增子 測序文庫構建方法，而且后續(xù)上機測序步驟也比較方便。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種適用于擴增子測序文庫構建的引物及擴增子測序文庫的構 建方法，以解決現(xiàn)有技術中擴增子測序文庫構建方法中所存在的步驟繁瑣或容易污染且后 續(xù)上機測序也不方便的缺陷。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種適用于擴增子測序文庫 構建的引物，該引物僅由一對引物構成，且一對引物中的上游引物和下游引物按照從5'端 至3'端的順序均包括接頭序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列。
[0009] 進一步地，上游引物中的接頭序列為Ρ5端接頭序列，下游引物中的接頭序列為Ρ7 端接頭序列，下游引物中的測序引物序列還包括標簽序列，標簽序列為6?10個堿基按不 同的排列組合所形成的序列。
[0010] 進一步地，引物用于構建16S rDNA v4區(qū)、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測 序文庫。
[0011] 進一步地，當引物用于構建16S rDNA v4區(qū)的擴增子測序文庫時，引物包括：SEQ ID N0.1 所示的上游引物；以及 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24所示的任一條下游引物。
[0012] 進一步地，當引物用于構建18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫時，引物 中的目的片段擴增引物序列為18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種擴增子測序文庫的構建方法，該構建方法 通過利用上述任一對引物經(jīng)一步擴增步驟得到擴增子測序文庫。
[0014] 進一步地，構建方法在一步擴增步驟后，還包括：對擴增產(chǎn)物進行混合，得到混合 樣品；對混合樣品進行電泳純化，得到擴增子測序文庫。進一步地，電泳純化步驟中采用 Qiagen 公司的 QIAquick Gel Extraction Kit 進行純化。
[0015] 進一步地，在得到擴增子測序文庫后，并在進行高通量測序之前，還包括對擴增子 測序文庫進行質檢的步驟。
[0016] 進一步地，擴增子測序文庫利用Illumina Miseq配套試劑進行高通量測序。
[0017] 應用本發(fā)明的技術方案，通過將接頭序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序 列這三種序列整合在上、下游擴增的一對引物上，使得利用該引物夠通過一步擴增完成文 庫構建，不僅提高測序文庫質量及建庫效率，而且構建所得的擴增子測序文庫因具有常規(guī) 測序平臺上所使用的接頭序列以及測序引物序列，使得該測序文庫能夠利用常規(guī)上機測序 所用的試劑進行高通量測序，而無需額外提供測序引物以及對所混入的PHiX文庫的測序 引物進行變更。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：
[0019] 圖1示出了本發(fā)明一種優(yōu)選實施例中所提供的引物結構示意圖；以及
[0020] 圖2示出了本發(fā)明實施例1通過一步擴增后所得到擴增子測序文庫經(jīng)電泳檢測的 結果。

【具體實施方式】
[0021] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0022] 如【背景技術】部分所提到的，在現(xiàn)有技術中存在的擴增子測序文庫的構建方法存在 步驟繁瑣或容易污染且不方便上機操作的缺陷。為了克服上述缺陷，在本發(fā)明一種典型的 實施方式中，提供了一種適用于擴增子測序文庫構建的引物，由圖1所示，該引物僅由一對 引物構成，且這一對引物中的上游引物和下游引物按照從5'端至3'端的順序均包括接頭 序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列。
[0023] 本發(fā)明所提供的引物，通過將接頭序列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列 這三種序列整合在上、下游擴增的一對引物上，使得利用該引物夠通過一步擴增完成文庫 構建，不僅提高測序文庫質量及建庫效率，而且構建所得的擴增子測序文庫因具有常規(guī)測 序平臺上所使用的接頭序列以及測序引物序列，使得該測序文庫能夠利用常規(guī)上機測序所 用的試劑進行高通量測序，而無需額外提供測序引物以及對所混入的PHiX文庫的測序引 物進行變更。
[0024] 本發(fā)明的上述引物中，上游引物中的接頭序列為P5端接頭序列，下游引物中的接 頭序列為P7端接頭序列，下游引物中的測序引物序列還包括標簽序列，標簽序列為6? 10個堿基按不同的排列組合所形成的序列。采用上述接頭序列和標簽序列使得利用本發(fā) 明的上述引物既能一步完成擴增子測序文庫的構建，而且所構建的擴增子測序文庫能夠與 Illumina MiSeq測序平臺的試劑配套使用進行高通量測序。
[0025] 本發(fā)明的上述引物，可用于構建任何目的片段的擴增子測序文庫。既可以是能夠 體現(xiàn)生物多樣性的16S rDNA v4區(qū)、18S rDNA、ITS區(qū)域的擴增子測序文庫，也可以是研究 人員所感興趣的某些功能基因及其基因片段的擴增子測序文庫。不同的擴增子測序文庫， 只需要將上述引物中的目的片度擴增引物替換成所感興趣的基因片段的引物即可。比如， 當引物用于構建16S rDNA v4區(qū)、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫時，引物中 的目的片段擴增引物序列為16S rDNA v4區(qū)、18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
[0026] 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中，當上述引物用于構建16S rDNA v4區(qū)的擴增子測 序文庫時，引物包括：SEQ ID NO. 1所示的上游引物；以及SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23和SEQ ID NO. 24所示的任一條下游引物。
[0027] 利用本發(fā)明所提供的上述用于構建16S rDNA v4區(qū)的擴增子測序文庫的引物，不 僅能夠使16S rDNA v4區(qū)的擴增子測序文庫通過一步擴增步驟完成，而且所構建的文庫能 夠利用Illumina MiSeq測序平臺的配套試劑進行高通量測序，不需要進行測序引物以及 PhiX文庫的變更，使得16S rDNA v4區(qū)擴增子更加方便快捷的完成測序文庫構建以及上機 測序過程。
[0028] 在本發(fā)明另一種典型的實施方式中，還提供了一種擴增子測序文庫的構建方法， 該構建方法中，利用上述任一對引物經(jīng)一步擴增步驟完成擴增子測序文庫的構建。本發(fā)明 的構建方法所用的引物在目的片段擴增引物序列的上游還包括了后續(xù)高通量測序時用于 文庫擴增的兩端接頭引物序列以及測序時所用的測序引物，因而僅通過對目的片度擴增一 步就完成了后續(xù)步驟所用到的引物，而且還能夠與常規(guī)的測序平臺所用的其他試劑配套使 用，不僅高效、快捷地完成擴增子測序文庫的構建，而且也便于后續(xù)上機操作，提高了擴增 子測序的整體效率。
[0029] 在本發(fā)明的上述構建方法中，在一步擴增步驟后，根據(jù)所得的擴增子測序文庫的 質量差異（包括擴增效率以及擴增純度等的不同）決定是否有必要進行純化步驟。在本發(fā) 明中，為了進一步確認所得的擴增子測序文庫的大小以及進一步提高擴增子測序文庫的純 度，在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中，上述構建方法在一步擴增步驟后，還包括：對擴增產(chǎn)物 進行混合，得到混合樣品；對混合樣品進行電泳純化，得到擴增子測序文庫。
[0030] 上述優(yōu)選實施例通過對目的基因片段進行擴增后對得到不同片段的擴增子測序 文庫進行混合，由于不同樣品擴增產(chǎn)物中的標簽序列不同，且片段的擴增子文庫能夠采用 通用的接頭引物序列和測序引物序列來進行后續(xù)上機的高通量測序，因此可以將產(chǎn)物混在 一起；然后進行電泳純化是通過電泳將非特異擴增的片段從目的片段中去除掉，從而使待 測序的擴增子文庫純度更高，得到的測序數(shù)據(jù)質量也更好。
[0031] 在本發(fā)明的上述電泳純化步驟中，本發(fā)明優(yōu)選采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit進行純化，該試劑盒純化效果相比其他同類的純化試劑盒，純度更高。
[0032] 在本發(fā)明的上述構建方法與其他高通量測序文庫構建步驟一樣，在得到擴增子測 序文庫后，并在進行高通量測序之前，還包括對擴增子測序文庫進行質檢的步驟。通過質檢 檢測所構建的文庫的片段大小是否合適，以及濃度大小是否達到上機要求，并根據(jù)濃度的 大小決定上機所使用的濃度。
[0033] 本發(fā)明的上述構建方法中，所得到的擴增子測序文庫由于具有Illumina MiSeq測 序平臺后續(xù)測序所用的文庫擴增引物及測序引物，因而可以利用Illumina Miseq配套試劑 進行高通量測序。
[0034] 下面將結合具體的實施例來說明本發(fā)明的有益效果。
[0035] 應用于Illumina MiSeq測序的16S rDNA v4區(qū)擴增子測序文庫的構建方法，包括 如下實驗步驟：
[0036] (1)根據(jù)樣品16S rDNA DNA濃度，使用無菌水將樣品稀釋至Ing/ μ 1，如果樣品中 存在大量的RNA污染則需要先使用RNase消化后再進行稀釋。
[0037] (2)PCR擴增。使用表1中所示的已經(jīng)合成好的引物進行擴增，其中SEQ ID NO. 1 為擴增的上游引物，其中，第1?21位堿基為上游接頭序列，第22?58位堿基為上游測序 引物序列，第59?77位堿基為上游目的片段擴增引物序列。
[0038] SEQ ID NO. 2至SEQ ID NO. 25為下游引物，其中，第1?24位堿基為下游接頭序 列，第25?30位堿基為標簽序列，第31?64位堿基為下游測序引物序列，第65?84位 堿基為下游目的片段擴增引物序列。
[0039] 上述任一下游引物與SEQ ID NO. 1上游引物組成一對引物對16S rDNA v4區(qū)進行 擴增。
[0040] 表 1 :
[0041]

【權利要求】
1. 一種適用于擴增子測序文庫構建的引物，其特征在于，所述引物由一條上游引物和 一條下游引物構成，且所述上游引物和下游引物按照從5'端至3'端的順序均包括接頭序 列、測序引物序列和目的片段擴增引物序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的引物，其特征在于，所述上游引物中的接頭序列為P5端接頭 序列，所述下游引物中的接頭序列為P7端接頭序列，所述下游引物中的測序引物序列還包 括標簽序列，所述標簽序列為6?10個堿基按不同的排列組合所形成的序列。
3. 根據(jù)權利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物用于構建16S rDNA v4區(qū)、18S rDNA、ITS或功能基因的擴增子測序文庫。
4. 根據(jù)權利要求3所述的引物，其特征在于，當所述引物用于構建16S rDNA v4區(qū)的擴 增子測序文庫時，所述引物包括： SEQ ID NO. 1所示的上游引物；以及 SEQ ID NO. 2.SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、 SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 所示的任一 條下游引物。
5. 根據(jù)權利要求3所述的引物，其特征在于，當所述引物用于構建18S rDNA、ITS或功 能基因的擴增子測序文庫時，所述引物中的所述目的片段擴增引物序列為18S rDNA、ITS或 功能基因上的保守序列。
6. -種擴增子測序文庫的構建方法，其特征在于，所述構建方法通過利用權利要求1 至5中任一項的所述引物經(jīng)一步擴增步驟得到所述擴增子測序文庫。
7. 根據(jù)權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述構建方法在所述一步擴增步驟 后，還包括以下步驟： 對擴增產(chǎn)物進行混合，得到混合樣品； 對所述混合樣品進行電泳純化，得到所述擴增子測序文庫。
8. 根據(jù)權利要求7所述的構建方法，其特征在于，所述電泳純化步驟中采用Qiagen公 司的 QIAquick Gel Extraction Kit 進行純化。
9. 根據(jù)權利要求7所述的構建方法，其特征在于，在得到所述擴增子測序文庫后，并在 進行高通量測序之前，還包括對所述擴增子測序文庫進行質檢的步驟。
10. 根據(jù)權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述擴增子測序文庫利用Illumina Mi seq配套試劑進行高通量測序。
【文檔編號】C40B50/06GK104263726SQ201410499918
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權日:2014年9月25日
【發(fā)明者】王大偉, 朱海浩, 劉運超, 曹志生, 蔣智, 李明洲, 王苗英, 劉倩 申請人:天津諾禾致源生物信息科技有限公司