單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。該構(gòu)建方法包括以下步驟：對(duì)單細(xì)胞中的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；用擴(kuò)增引物對(duì)cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA；對(duì)擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫；其中，擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP。本發(fā)明的上述構(gòu)建方法，通過將預(yù)擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP，使得在接頭連接之后的酶消化步驟能將帶接頭片段中含有預(yù)擴(kuò)增引物的片段打斷，并在后續(xù)高溫預(yù)變性及變性步驟中去除，進(jìn)而減少了帶預(yù)擴(kuò)增引物的片段的擴(kuò)增，使得產(chǎn)出的測(cè)序數(shù)據(jù)中帶有預(yù)擴(kuò)增引物污染的數(shù)據(jù)比例也大大下降，從而大大提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)量。
【專利說明】單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，具體而言，涉及一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建 方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來說，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建是主要的難點(diǎn)，因?yàn)閱渭?xì)胞 中mRNA含量低至10pg，無法通過常規(guī)的RNA轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法來構(gòu)建。因此，目前 市場(chǎng)上能夠利用如此少量的mRNA進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建的產(chǎn)品一般在獲得預(yù)擴(kuò) 增cDNA后米用Illumina公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)〇
[0003] Illumina公司的該試劑盒是采用化學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行片段化，即用轉(zhuǎn)座酶對(duì) cDNA進(jìn)行打斷的方式建庫。單細(xì)胞經(jīng)裂解后，mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行預(yù) 擴(kuò)增后，采用轉(zhuǎn)座酶打斷的方式對(duì)cDNA進(jìn)行片段化處理。于此同時(shí)，轉(zhuǎn)座酶在打斷的同時(shí) 會(huì)在破碎片段的兩端加上接頭，然后再經(jīng)PCR對(duì)片段進(jìn)行富集，該步驟中PCR的引物會(huì)在破 碎片段的兩端帶上標(biāo)簽序列（index)，加標(biāo)簽序列的目的是給不同的樣品帶上不同的標(biāo)簽， 以便從得到的混合測(cè)序數(shù)據(jù)中分離出各樣品所對(duì)應(yīng)的測(cè)序數(shù)據(jù)。Illumina公司的上述DNA 文庫構(gòu)建試劑盒具有能從低至Ing的樣品起始量進(jìn)行文庫構(gòu)建的巨大優(yōu)勢(shì)，但采用上述試 劑盒所構(gòu)建的測(cè)序文庫存在插入峰很寬的問題，大約在300bp?IOOObp之間。文庫峰寬的 寬窄會(huì)對(duì)上機(jī)定量的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響上機(jī)量和產(chǎn)出。文庫峰寬越寬，定量的偏差 就越大。因而存在文庫上機(jī)定量的不準(zhǔn)，數(shù)據(jù)量產(chǎn)出不穩(wěn)定的問題。因?yàn)槿绻菙?shù)據(jù)產(chǎn)出 過量，浪費(fèi)成本；如果產(chǎn)量不足，還需要后期額外加測(cè)，耽誤項(xiàng)目周期。
[0004] 為了克服上述缺陷，現(xiàn)有技術(shù)中采用物理破碎的方式對(duì)反轉(zhuǎn)得到的CDNA進(jìn)行打 斷，使破碎片段較小且相對(duì)均勻，進(jìn)而使得所構(gòu)建的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的峰寬較為集 中；且片段化后的樣品不經(jīng)純化步驟減少了樣品損失不僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量樣品的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 組測(cè)序文庫的構(gòu)建，而且還能增加數(shù)據(jù)量產(chǎn)出的穩(wěn)定性，從而提高了大規(guī)模單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 文庫高通量測(cè)序的可靠性。
[0005] 但在打斷之前都需要經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增的步驟，以使cDNA的量能夠滿足建庫所需，然而 這種物理破碎的方式對(duì)cDNA進(jìn)行打斷，會(huì)使得所構(gòu)建的文庫中含有預(yù)擴(kuò)增的引物污染，約 占數(shù)據(jù)總量的20%，造成數(shù)據(jù)的浪費(fèi)。
[0006] 因此，仍需要對(duì)現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn)，以減少所構(gòu) 建的文庫中的預(yù)擴(kuò)增引物污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，用 以減少所構(gòu)建的文庫中的預(yù)擴(kuò)增引物污染片段。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫 的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：直接對(duì)單細(xì)胞的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;用擴(kuò)增 引物對(duì)cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA ;對(duì)擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建，得到單細(xì)胞的 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫；其中，擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP。
[0009] 進(jìn)一步地，對(duì)cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括：步驟SI，對(duì)cDNA采用物理破 碎的方式進(jìn)行片段化，得到片段化樣品；步驟S2,對(duì)片段化不經(jīng)過純化直接進(jìn)行末端修復(fù)， 同時(shí)添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復(fù)后樣品；步驟S3,對(duì)修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接， 得到帶接頭樣品；步驟S4,對(duì)帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫。
[0010] 進(jìn)一步地，在得到帶接頭樣品之后，以及對(duì)帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增之前，還包括對(duì)帶 接頭樣品進(jìn)行消化的步驟，消化步驟中用ESUR酶進(jìn)行消化。
[0011] 進(jìn)一步地，物理破碎的方式為采用自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀CovariS S220對(duì) cDNA進(jìn)行片段化；優(yōu)選自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)cDNA進(jìn)行片段化時(shí)的參 數(shù)設(shè)置為：循環(huán)數(shù)8%?12%，峰值入射功率170?180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200?220個(gè)； 時(shí)間300?360s ;溫度4?8°C。
[0012] 進(jìn)一步地，自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)cDNA進(jìn)行片段化后得到的 片段化樣品的長度為150?200bp。
[0013] 進(jìn)一步地，在得到片段化樣品之后，以及對(duì)片段化樣品進(jìn)行末端修復(fù)的步驟之 前，還包括對(duì)片段化樣品進(jìn)行濃縮的步驟；優(yōu)選采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNASpeedlllV 離心濃縮系統(tǒng)。
[0014] 進(jìn)一步地，在步驟S2中采用NEB公司的末端修復(fù)酶試劑組合對(duì)片段化樣品不經(jīng)純 化直接進(jìn)行末端修復(fù)，同時(shí)添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，末端修復(fù)酶試劑組合包括IOX的 NEBNext末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液和NEBNext末端制備酶混合物；在步驟S3中采用NEB公司的 平末端/粘性TA末端連接酶混合物和NEBNext接頭對(duì)修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接；在步驟S4 中采用KAPA BIO公司的2X的KaPA HiFi反應(yīng)混合物對(duì)接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增。
[0015] 進(jìn)一步地，當(dāng)片段化樣品的量低至3ng時(shí)，在步驟S3中，對(duì)接頭進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行 接頭連接；優(yōu)選將接頭稀釋至1. 0?2. 0 μ M ;更優(yōu)選稀釋至1. 5 μ M。
[0016] 進(jìn)一步地，在步驟S4中，擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為10?15次，優(yōu)選13次。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上述任一種構(gòu)建方法在研究細(xì)胞異質(zhì)性方面的應(yīng) 用。
[0018] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，在常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過將預(yù)擴(kuò) 增引物中的dTTP替換為dUTP，使得本發(fā)明的在接頭連接之后進(jìn)行的酶消化步驟，不僅能夠 將U型接頭打斷使雙鏈分別帶上接頭序列，而且能將帶接頭片段中含有預(yù)擴(kuò)增引物的片段 打斷，并在后續(xù)文庫擴(kuò)增步驟的高溫預(yù)變性及變性步驟中去除，進(jìn)而減少了帶預(yù)擴(kuò)增引物 的片段的擴(kuò)增，使得產(chǎn)出的測(cè)序數(shù)據(jù)中帶有預(yù)擴(kuò)增引物污染的數(shù)據(jù)比例也大大下降，從而 大大提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0020] 圖1示出了本發(fā)明的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建流程的示意圖；
[0021] 圖2示出了本發(fā)明的實(shí)施例中反轉(zhuǎn)錄得到的片段的大?。?br> [0022] 圖3示出了按照本發(fā)明的方法所構(gòu)建的文庫的大??；
[0023] 圖4示出了本發(fā)明所構(gòu)建的文庫中GC分離度和GC含量圖；以及
[0024] 圖5示出了對(duì)本發(fā)明的文庫中的插入片段的評(píng)估結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0026] 在本發(fā)明中的術(shù)語"單細(xì)胞"是指單一類型細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞；"微量樣品"是指起 始量在3?20ng的cDNA樣品。
[0027] 正如【背景技術(shù)】部分提到的，為了減少所構(gòu)建的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的產(chǎn)出數(shù)據(jù) 中的引物污染數(shù)據(jù)，在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，如圖1所示，提供了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟：對(duì)單細(xì)胞中的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA ;用擴(kuò)增引物對(duì)cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA ;對(duì)擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建， 得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫；其中，擴(kuò)增引物中的dTTP替換為dUTP。
[0028] 本發(fā)明的上述構(gòu)建方法，在常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過將預(yù)擴(kuò) 增引物中的dTTP替換為dUTP，使得本發(fā)明的在接頭連接之后進(jìn)行的酶消化步驟，不僅能夠 將U型接頭打斷使雙鏈分別帶上接頭序列，而且能將帶接頭片段中含有預(yù)擴(kuò)增引物的片段 打斷，并在后續(xù)文庫擴(kuò)增步驟的高溫預(yù)變性及變性步驟中去除，進(jìn)而減少了帶預(yù)擴(kuò)增引物 的片段的擴(kuò)增，使得產(chǎn)出的測(cè)序數(shù)據(jù)中帶有預(yù)擴(kuò)增引物污染的數(shù)據(jù)比例也大大下降，從而 大大提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)量。
[0029] 在本發(fā)明的上述文庫構(gòu)建方法中，在單細(xì)胞樣品裂解后，直接將細(xì)胞中的mRNA反 轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄的步驟通常包括：由細(xì)胞樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA ;對(duì)第 一鏈cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到雙鏈的cDNA。
[0030] 對(duì)上述得到的第一鏈cDNA和雙鏈cDNA最好都經(jīng)過純化的步驟，純化的步驟能夠 使得樣品的純度更高，提高后續(xù)構(gòu)建所得到文庫的質(zhì)量。該步驟中可以采用市售的純化試 劑盒進(jìn)行相應(yīng)的純化步驟，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠進(jìn) 行純化，該純化方法純化效率高，純化速度快，且操作更方便。
[0031] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施例中，對(duì)cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括：步驟 SI，CDNA采用物理破碎的方式進(jìn)行片段化，得到片段化樣品；步驟S2,對(duì)片段化樣品不經(jīng)過 純化直接進(jìn)行末端修復(fù)和添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復(fù)后樣品；步驟S3,對(duì)修復(fù) 后樣品進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭樣品；步驟S4,對(duì)帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 組的測(cè)序文庫。
[0032] 在上述實(shí)施例中，采用物理破碎的方式進(jìn)行片段化，相比化學(xué)破碎的方式（轉(zhuǎn)座 酶隨機(jī)打斷的方式），物理破碎的方式對(duì)單細(xì)胞樣品進(jìn)行片段化具有使破碎得到的片段大 小的較小，且能使破碎片段大小較為集中，片段大小相對(duì)均勻，使得后續(xù)對(duì)文庫定量檢測(cè)的 準(zhǔn)確度大大提高，進(jìn)而使得上機(jī)擴(kuò)增成簇步驟中各插入片段的擴(kuò)增效率相對(duì)均等，減少了 偏差擴(kuò)增現(xiàn)象，使數(shù)據(jù)量產(chǎn)出更穩(wěn)定，進(jìn)而避免因?yàn)閿?shù)據(jù)量產(chǎn)出不足需要額外加測(cè)而耽誤 項(xiàng)目周期或者數(shù)據(jù)量產(chǎn)出過多浪費(fèi)成本。且對(duì)上述片段化樣品不經(jīng)過純化直接進(jìn)行后續(xù)步 驟，能減少樣品損失，使本發(fā)明的上述構(gòu)建方法能夠適用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建。
[0033] 在本發(fā)明又一種優(yōu)選的實(shí)施例中，在上述接頭連接得到帶接頭樣品步驟后，進(jìn)行 USER酶消化的步驟。在現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建方法中，該步驟也存在，但現(xiàn)有技 術(shù)中，預(yù)擴(kuò)增階段所使用的引物中是帶有dTTP的堿基序列，因此USER酶消化的目的僅是為 了將所加的U型接頭打斷，以使雙鏈都帶上接頭序列。而在本發(fā)明中，在步驟中進(jìn)行USER 酶消化的目的不僅為了將U型接頭打開，另一個(gè)更主要的作用是：是為了將目的片段文庫 帶有dUTP的擴(kuò)增引物片段進(jìn)行消化，從而降低預(yù)擴(kuò)增引物的污染，提到擴(kuò)增后文庫中目的 片段的相對(duì)含量，進(jìn)而提到產(chǎn)出數(shù)據(jù)的有效量。
[0034] 在文庫構(gòu)建方法中，對(duì)樣品進(jìn)行物理破碎的方式通常采用超聲破碎，適用于本 發(fā)明的超聲破碎儀包括DNA切割超聲破碎儀Q800R或自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220。物理破碎方式具有重復(fù)性好，得到的片段較小，使所構(gòu)建的文庫的峰寬較窄的優(yōu)點(diǎn)。 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中，采用自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)樣品進(jìn)行片 段化。更優(yōu)選自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)樣品進(jìn)行片段化時(shí)的參數(shù)設(shè)置為： 循環(huán)數(shù)8?12%，峰值入射功率170?180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200?220個(gè)；時(shí)間300? 360s ;溫度 4 ?8°C。
[0035] 在上述自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)cDNA樣品進(jìn)行片段化的步驟 中，得到的片段化樣品的長度為150?200bp。發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)設(shè)置Covaris S220的參數(shù)在上述范圍內(nèi)時(shí)，通?？傻玫介L度為150?200bp的片段化樣品，這使得所構(gòu)建 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的峰寬集中在270?320bp，提高文庫定量的準(zhǔn)確性，從而提高了產(chǎn)出數(shù) 據(jù)量的穩(wěn)定性。
[0036] 在上述采用物理破碎方式得到片段化樣品后，通常還需要經(jīng)過磁珠純化或過吸附 柱純化的方法對(duì)片段化的樣品進(jìn)行純化濃縮。但在本發(fā)明中，當(dāng)片段化樣品的體積大于末 端修復(fù)酶反應(yīng)體系所要求的最小體積時(shí)，在進(jìn)行末端修復(fù)的步驟之前，還包括對(duì)片段化樣 品進(jìn)行濃縮的步驟。此處的濃縮不是用磁珠純化或者過柱子的濃縮方法，而是采用濃縮儀 濃縮的方法，能夠更大程度地既避免片段化的樣品損失。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中，采 用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV 離心濃縮系統(tǒng)。通過濃縮 步驟使片段化樣品的濃度得到相對(duì)提高，并且符合文庫構(gòu)建試劑盒的體系要求。當(dāng)片段化 樣品的體積小于反應(yīng)體系所需的最小體積時(shí)，可通過加高純水稀釋至所需的最小體積。
[0037] 在上述所說的文庫構(gòu)建中，在上述步驟S2中采用NEB公司的末端修復(fù)酶試劑組 合，其末端修復(fù)酶試劑組合包括IOX的NEBNext末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液（IOXNEBNext End Repair Reaction Buffer)和 NEBNext 末端制備酶混合物（NEBNext End Prep Enzyme Mix);經(jīng)發(fā)明人的大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,上述末端修復(fù)酶試劑組合在一步反應(yīng)中完成修復(fù)與加 A 的步驟，方便快捷，減少出錯(cuò)幾率。在上述步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端 連接酶混合物（Blunt/TA Ligase Master Mix)和NEBNext接頭進(jìn)行接頭連接的步驟，該連 接酶混合物對(duì)接頭的連接效率較高，利于增加最終的文庫產(chǎn)量。在步驟S4中采用2 XΚΑΡΑ. BIO公司的KaPAHiFi反應(yīng)混合物進(jìn)行擴(kuò)增，采用這種聚合酶擴(kuò)增穩(wěn)定性好，保真性更高，且 對(duì)于高GC含量模板的擴(kuò)增一樣有效。上述各步驟中所用到的試劑并不僅限于上述幾種，只 要能夠達(dá)與上述幾種效果相當(dāng)或更好的市售試劑或自配制試劑同樣適用于本發(fā)明。
[0038] 在上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫構(gòu)建的過程中，根據(jù)所得到片段化樣品的總量適當(dāng)調(diào)整接 頭的用量。根據(jù)發(fā)明人大量實(shí)驗(yàn)所得的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)片段化樣品的量在低至3ng時(shí)，在進(jìn)行接 頭連接的步驟中，先對(duì)接頭進(jìn)行稀釋至1. 〇?2. O μ M ;優(yōu)選稀釋至1. 5 μ M后再進(jìn)行接頭連 接。將上述接頭濃度稀釋至上述濃度范圍時(shí)，既能與建庫起始量低相匹配，又能減少接頭使 用量，還可以避免接頭污染。這樣，本發(fā)明的這種方法也能夠由相對(duì)較低的起始量實(shí)現(xiàn)單細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建。
[0039] 由于Illumina公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒采用雙標(biāo)簽序列（index)，當(dāng)有多個(gè)樣 品需要上機(jī)時(shí)，無法與其他樣品混合在一個(gè)通道（lane)中進(jìn)行測(cè)序，而需要單獨(dú)占用一個(gè) 通道來進(jìn)行測(cè)序，這樣造成測(cè)序儀器空間的浪費(fèi)和測(cè)序成本的增高。而本發(fā)明通過使用單 端帶有標(biāo)簽序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，使得所構(gòu)建的文庫能夠與其他具有單端標(biāo)簽序列的樣品 的文庫進(jìn)行混合測(cè)序，從而減少資源浪費(fèi)，降低成本。
[0040] 在本發(fā)明的上述擴(kuò)增步驟中，一般擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為10次，在此基礎(chǔ)上，在不同的 樣品測(cè)序文庫的實(shí)際構(gòu)建過程中，可根據(jù)片段化樣品的起始量的多少對(duì)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行調(diào) 整。在本發(fā)明中優(yōu)選上述擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為10?15次，更優(yōu)選13次。將擴(kuò)增次數(shù)控制在上 述范圍內(nèi)，既能實(shí)現(xiàn)對(duì)片段化樣品的有效擴(kuò)增，使其滿足上機(jī)測(cè)序濃度的要求；又不至于造 成片段化樣品的過度擴(kuò)增，造成非特異性擴(kuò)增從而減少測(cè)序數(shù)據(jù)的實(shí)際有效量。
[0041] 由于本發(fā)明的上述構(gòu)建方法能夠有效提高單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的測(cè)序質(zhì)量，提 高所測(cè)數(shù)據(jù)的有效量，這為單細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了一種新的研究手段。因此，本發(fā)明的 上述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法能夠應(yīng)用于細(xì)胞異質(zhì)性的研究。
[0042] 下面將結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0043] 下列實(shí)施例是參照附圖1，以豬卵細(xì)胞樣品進(jìn)行詳細(xì)說明本發(fā)明的構(gòu)建方法。下 列實(shí)施例中所涉及的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，前期反轉(zhuǎn)和預(yù)擴(kuò)增所用的試劑來自 Clontech公司；2XKaPA HiFi反應(yīng)混合物（Master Mix)購自美國ΚΑΡΑ. BIO公司；其他試 劑如無特別說明均為NEB公司的產(chǎn)品；所有水為超純水。
[0044] 實(shí)驗(yàn)一、第一鏈cDNA的合成（在潔凈工作室）
[0045] 1)配制細(xì)胞裂解液：裂解液（Triton-X-100溶液） 19 μ L
[0046] RNA酶抑制劑 IyL
[0047] 總體積 20 μ L。
[0048] 2)單細(xì)胞樣品制備：取1 μ L含單個(gè)豬卵細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至含有2. 5 μ L細(xì)胞裂 解液的無 RNA酶的200 μ L PCR管中，然后立即置于干冰上。
[0049] 3)將單細(xì)胞樣品放置在經(jīng)-20°C預(yù)冷的PCR管架上，向其中加入3'SMART⑶S引 物II A (12 μ M) 1 μ 1?；靹蚋鹘M份，然后瞬時(shí)離心，將反應(yīng)管放在PCR儀中，72°C，孵育3min。 然后將反應(yīng)管放回預(yù)冷的PCR架中。
[0050] 與此同時(shí)，在室溫中混勻以下試劑：
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步 驟： 對(duì)單細(xì)胞中的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ; 用擴(kuò)增引物對(duì)所述cDNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增cDNA ; 對(duì)擴(kuò)增cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建，得到單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫；其中，將擴(kuò)增引物 中的dTTP替換為dUTP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，對(duì)所述cDNA進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建的 步驟包括： 步驟S1，對(duì)所述cDNA采用物理破碎的方式進(jìn)行片段化，得到片段化樣品； 步驟S2,對(duì)所述片段化不經(jīng)過純化直接進(jìn)行末端修復(fù)，同時(shí)添加腺嘌呤脫氧核糖核苷 酸，得到修復(fù)后樣品； 步驟S3,對(duì)所述修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭樣品； 步驟S4,對(duì)所述帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在得到所述帶接頭樣品之后，以及對(duì) 所述帶接頭樣品進(jìn)行擴(kuò)增之前，還包括對(duì)所述帶接頭樣品進(jìn)行消化的步驟，所述消化步驟 中用USER酶進(jìn)行消化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式為采用自動(dòng)聚 焦聲波樣本處理儀Covaris S220對(duì)所述cDNA進(jìn)行片段化；優(yōu)選所述自動(dòng)聚焦聲波樣本處 理儀Covaris S220對(duì)所述cDNA進(jìn)行片段化時(shí)的參數(shù)設(shè)置為：循環(huán)數(shù)8%?12%，峰值入射 功率170?180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200?220個(gè)；時(shí)間300?360s ;溫度4?8°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀 Covaris S220對(duì)所述cDNA進(jìn)行片段化后得到的所述片段化樣品的長度為150?200bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在得到所述片段化樣品之后，以及 對(duì)所述片段化樣品進(jìn)行所述末端修復(fù)的步驟之前，還包括對(duì)所述片段化樣品進(jìn)行濃縮的步 驟；優(yōu)選米用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV離心濃縮系統(tǒng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于， 在所述步驟S2中采用NEB公司的末端修復(fù)酶試劑組合對(duì)所述片段化樣品不經(jīng)純化直 接進(jìn)行末端修復(fù)，同時(shí)添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所述末端修復(fù)酶試劑組合包括10X的 NEBNext末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液和NEBNext末端制備酶混合物； 在所述步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端連接酶混合物和NEBNext接頭 對(duì)所述修復(fù)后樣品進(jìn)行接頭連接； 在所述步驟S4中采用KAPA BI0公司的2X的KaPA HiFi反應(yīng)混合物對(duì)所述接頭樣品 進(jìn)行擴(kuò)增。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述片段化樣品的量低至3ng時(shí)， 在所述步驟S3中，對(duì)所述接頭進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行接頭連接；優(yōu)選將所述接頭稀釋至1. 0? 2. 0 y M ;更優(yōu)選稀釋至1. 5 ii M。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟S4中，所述擴(kuò)增的循環(huán)次 數(shù)為10?15次，優(yōu)選13次。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法在研究細(xì)胞異質(zhì)性方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK104389026SQ201410601383
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】王大偉, 王苗英, 蔣智, 李明洲, 朱海浩, 劉運(yùn)超 申請(qǐng)人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司