一種復(fù)合血管支架的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種復(fù)合血管支架，包括有支架本體和復(fù)合藥物涂層，其中復(fù)合藥物涂層裹設(shè)在支架本體上，支架本體為裸金屬支架或可降解聚合物支架或可降解鎂合金支架或可降解鐵合金支架，裸金屬支架為316L不銹鋼支架，復(fù)合藥物涂層從內(nèi)到外依次是由多巴胺聚合物層、抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子組成的復(fù)合涂層，抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子的層數(shù)為1-10層，抗凝血性藥物為肝素，復(fù)合藥物涂層外依次裹設(shè)有蛋白A層和抗體藥物層，抗體藥物層由抗體CD34組成，有益效果：本實(shí)用新型提供的藥物涂層涂層均勻、耐沖刷、穩(wěn)定、體外捕獲內(nèi)皮組細(xì)胞能力強(qiáng)，可以達(dá)到很好的抑制血栓形成及降低再狹窄的目的，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種復(fù)合血管支架

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及一種血管支架，特別涉及一種復(fù)合血管支架。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，冠狀動(dòng)脈疾病是心血管疾病中最常見的疾病，也是死亡率和發(fā)病率較高的 疾病，其主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血管狹窄。治療冠狀動(dòng)脈疾病最常用的方法是利 用球囊打開血管狹窄，然后永久性放置金屬支撐材料，即眾所周知的支架。然而支架置入術(shù) 后內(nèi)膜的過(guò)度增生會(huì)導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生，單純裸支架再狹窄的發(fā)生率可達(dá)10-30%，故冠狀 動(dòng)脈支架置入術(shù)后再狹窄一直是冠心病介入治療研究中的重中之重，其中以冠脈內(nèi)支架涂 層的研究尤為突出。
[0003] 目前應(yīng)用的藥物涂層支架（Drug-Eluting Stent，DES)如雷帕霉素與紫杉醇涂層 支架，大大減少了再狹窄的發(fā)生率，但目前仍有5%左右發(fā)生。同時(shí)該兩種支架均是通過(guò)抑 制細(xì)胞增殖來(lái)防止再狹窄，雷帕霉素與紫杉醇都是非平滑肌細(xì)胞選擇性藥物，在阻止平滑 肌細(xì)胞增生的同時(shí)也阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，使支架被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或難以被覆 蓋，容易形成血栓。此外，在支架置入動(dòng)脈部分可觀察到不同程度的慢性炎癥存在和近中層 血管平滑肌細(xì)胞的丟失。2006年歐洲心血管年會(huì)引起會(huì)議巨大震動(dòng)和關(guān)注的內(nèi)容是關(guān)于藥 物洗脫支架安全性的臨床試驗(yàn)薈萃分析。長(zhǎng)期隨訪結(jié)果表明，與金屬裸支架比較，藥物支架 置入后遠(yuǎn)期血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)比金屬裸支架增加了 15% -35%，不但沒有降低總死亡率和心 肌梗死的預(yù)后硬終點(diǎn)，反而有增加這些預(yù)后終點(diǎn)的趨勢(shì)。相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn)，其遠(yuǎn)期血栓發(fā)生率 增高的主要原因?yàn)橹Ъ鼙砻鎯?nèi)皮化不完全，部分支架裸露在血液中，而患者停用抗血小板 藥物，使支架內(nèi)血栓發(fā)生率明顯增高。故由于存在上述缺點(diǎn)，導(dǎo)致冠脈內(nèi)支架置入術(shù)后患者 服用雙重或三重抗血小板藥物時(shí)間延長(zhǎng)，從而增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，增加了患者長(zhǎng)期雙 重或三重抗血小板治療的出血風(fēng)險(xiǎn)。而且長(zhǎng)期內(nèi)皮修復(fù)不完全，會(huì)刺激內(nèi)膜增生導(dǎo)致再狹 窄。
[0004] 目前應(yīng)用的DES的不足主要包括：
[0005] 1)內(nèi)皮完整是預(yù)防血栓的最重要的屏障。DES的涂層藥物在抑制平滑肌細(xì)胞過(guò)度 增生的同時(shí)，也抑制正常內(nèi)皮細(xì)胞再生，導(dǎo)致支架植入后血管內(nèi)皮化過(guò)程延遲，增加了遲發(fā) 性血栓形成風(fēng)險(xiǎn)；
[0006] 2)目前支架涂層藥物多使用單一藥物，而再狹窄是由多種發(fā)病機(jī)制參與作用， 支架上所涂藥物不可能在各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，從而限制其抗支架內(nèi)再狹窄（Instent Restenosis，ISR)的作用；
[0007] 3)由于目前常用DES的載體不能降解，在某種程度上也可能會(huì)增加病變血管局部 慢性炎癥的發(fā)生，另外藥物發(fā)揮作用的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)組織的滲透作用越長(zhǎng)，也是造成內(nèi)皮化 延遲的可能因素之一；
[0008] 4)DES的涂層與支架材料表面鍵合弱，涂層很容易被血流快速剝離，難以達(dá)到長(zhǎng)期 抑制平滑肌細(xì)胞增生，避免血管內(nèi)膜過(guò)渡增厚導(dǎo)致的血管再狹窄。
[0009] 綜上所述，臨床上亟待開發(fā)一種新型的能降低血栓形成、防止再狹窄、可降解、耐 沖刷涂層支架以解決目前治療面臨的困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本實(shí)用新型的目的是為了解決現(xiàn)有的臨床所用血管支架不能有效地降低血栓形 成、不能有效地防止血管再狹窄的發(fā)生等諸多問(wèn)題而提供的一種復(fù)合血管支架。
[0011] 本實(shí)用新型提供的復(fù)合血管支架包括有支架本體和復(fù)合藥物涂層，其中復(fù)合藥物 涂層裹設(shè)在支架本體上。
[0012] 支架本體為裸金屬支架或可降解聚合物支架或可降解鎂合金支架或可降解鐵合 金支架。
[0013] 裸金屬支架為316L不銹鋼支架。
[0014] 復(fù)合藥物涂層從內(nèi)到外依次是由多巴胺聚合物層、抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再生 細(xì)胞因子組成的復(fù)合涂層。
[0015] 抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子的層數(shù)為1-10層。
[0016] 抗凝血性藥物為肝素。
[0017] 復(fù)合藥物涂層外依次裹設(shè)有蛋白A層和抗體藥物層。
[0018] 抗體藥物層由抗體⑶34組成。
[0019] 本實(shí)用新型提供的復(fù)合血管支架的制作方法如下所述：
[0020] 第一步、預(yù)處理：首先用拋光機(jī)將支架本體所用鋼片拋光至鏡面；然后將拋光后 的鋼片用去污粉清洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清洗，最后用去離子水超聲清洗；制備凍 干物：多巴胺中氨基和肝素中羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物；鋼片及凍干物紫外線滅菌； 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（1〇禮，ρΗ8· 5)的配置；
[0021] 第二步、鋼片上多巴胺聚合：將凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配好的溶 液中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用鑷子每孔放1枚 鋼片；
[0022] 第三步、結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板 中，Milli-Q超純水清洗，清洗后氮?dú)獯蹈桑?br> [0023] 第四步、進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的包被：將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶于PBS緩沖液 (PH7. 4)中，配置成lOOug/ml溶液，將上述制得的鋼片浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，4°C 條件下反應(yīng)，12小時(shí)后取出鋼片，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?br> [0024] 第五步、層層自組裝包被肝素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子：上步中制得的鋼片表面為血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的等電點(diǎn)為8. 5,通過(guò)調(diào)節(jié)pH值能夠使血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子溶液和肝素鈉溶液分別帶正電、負(fù)電，之后可以一層肝素一層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子再一 層肝素這樣層層靜電吸附直至所需層數(shù)；
[0025] 第六步、包被蛋白A :將蛋白A中加入PBS，配置成lmg/ml溶液，再進(jìn)行稀釋，最終 配置成0. lmg/ml蛋白A溶液，將上步中獲得的316L-DA-(H-V) 10置于蛋白A溶液中，4°C冰 箱中靜置24小時(shí)，將鋼片取出用PBS溶液（pH7. 4)清洗3次，氮?dú)獯蹈桑?br> [0026] 第七步、牛血清白蛋白封閉：將第六步中制得的支架浸入10mg/ml牛血清白蛋白 中，4°C下靜置封閉，取出用PBS清洗5分鐘，氮?dú)獯蹈桑?br> [0027] 第八步、包被⑶34抗體：配置⑶34抗體溶液，將第七步中制得的支架浸入抗體溶 液中，4°C條件下反應(yīng)12小時(shí)，取出用PBS清洗，常溫干燥，獲得成品。
[0028] 進(jìn)行⑶34抗體的突光標(biāo)記和表征：自DA-(H-V) 10-A組中取一枚鋼進(jìn)行突光標(biāo)記。 之前用兔血清封閉，F(xiàn)ITC標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將316L-D-(H-V) 10-S-A與 標(biāo)記物37°C條件下共浴1小時(shí)，常溫下過(guò)夜干燥。固定于載玻片上，送檢免疫熒光。
[0029] 所述溶液的配置：三羥甲基氨基甲烷緩沖液（10mM，pH8. 5)配置：Tris堿0. 121加 80ml Milli-Q water溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH，滅菌；肝素鈉 溶液配置：3mg/ml肝素鈉的Milli-Q water溶液100ml，用0· 1M NaOH及1%醋酸調(diào)節(jié)pH為 4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌。
[0030] 本實(shí)用新型的有益效果：
[0031] 本實(shí)用新型提供的藥物涂層中，所述多巴胺是海洋貽貝黏附蛋白交聯(lián)過(guò)程中的關(guān) 鍵成分，將不銹鋼支架在多巴胺溶液中進(jìn)行浸涂，部分酚羥基與金屬或金屬氧化物形成不 可逆的有機(jī)金屬絡(luò)合物，從而形成強(qiáng)力附著于不銹鋼支架表面的復(fù)合層，解決了藥物涂層 易脫落的問(wèn)題；所述CD34抗體可捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)；所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 可加速內(nèi)皮生長(zhǎng)；所述肝素具有很好的抗凝血性。故而，本實(shí)用新型提供的藥物涂層涂層均 勻、耐沖刷、穩(wěn)定、體外捕獲內(nèi)皮組細(xì)胞能力強(qiáng)，可以達(dá)到很好的抑制血栓形成及降低再狹 窄的目的，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1本實(shí)用新型所述支架的斷面放大示意圖。
[0033] 圖2為涂層支架上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和⑶34抗體含量示意圖。
[0034] 圖3為酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量示意圖。
[0035] 圖4為酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的CD34抗體的含量示意圖。
[0036] 圖5為內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)示意圖。
[0037] 圖6為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞空白對(duì)照示意圖。
[0038] 圖7為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞CD133的陽(yáng)性率示意圖。
[0039] 圖8為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞含激酶插入?yún)^(qū)受體的陽(yáng)性率示意圖。
[0040] 圖9為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞CD34的陽(yáng)性率示意圖。
[0041] 圖10為噻唑藍(lán)法檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖示意圖。
[0042] 1、支架本體2、復(fù)合藥物涂層3、蛋白A層4、抗體藥物層。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 請(qǐng)參閱圖1所示：
[0044] 本實(shí)用新型提供的復(fù)合血管支架包括有支架本體1和復(fù)合藥物涂層2,其中復(fù)合 藥物涂層2裹設(shè)在支架本體1上。
[0045] 支架本體1為裸金屬支架或可降解聚合物支架或可降解鎂合金支架或可降解鐵 合金支架。
[0046] 裸金屬支架為316L不銹鋼支架。
[0047] 復(fù)合藥物涂層2從內(nèi)到外依次是由多巴胺聚合物層、抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再 生細(xì)胞因子組成的復(fù)合涂層。
[0048] 抗凝血性藥物和促進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子的層數(shù)為1-10層。
[0049] 抗凝血性藥物為肝素。
[0050] 復(fù)合藥物涂層2外依次裹設(shè)有蛋白A層3和抗體藥物層4。
[0051] 抗體藥物層4由抗體⑶34組成。
[0052] 本實(shí)用新型提供的復(fù)合血管支架的制作方法如下所述：
[0053] 第一步、預(yù)處理：首先用拋光機(jī)將支架本體1所用鋼片拋光至鏡面；然后將拋光后 的鋼片用去污粉清洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清洗，最后用去離子水超聲清洗；制備凍 干物：多巴胺中氨基和肝素中羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物；鋼片及凍干物紫外線滅菌； 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（1〇禮，ρΗ8· 5)的配置；
[0054] 第二步、鋼片上多巴胺聚合：將凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配好的溶 液中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用鑷子每孔放一枚 鋼片；
[0055] 第三步、結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板 中，Milli-Q超純水清洗，清洗后氮?dú)獯蹈桑?br> [0056] 第四步、進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的包被：將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶于PBS緩沖液 (PH7.4)中，配置成lOOug/ml溶液，將上述制得的鋼片浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，4°C 條件下反應(yīng)，12小時(shí)后取出鋼片，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?br> [0057] 第五步、層層自組裝包被肝素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子：上步中制得的鋼片表面為血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的等電點(diǎn)為8. 5,通過(guò)調(diào)節(jié)pH值能夠使血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子溶液和肝素鈉溶液分別帶正電、負(fù)電，之后可以一層肝素一層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子再一 層肝素這樣層層靜電吸附直至所需層數(shù)；
[0058] 第六步、包被蛋白A :將蛋白A中加入PBS，配置成lmg/ml溶液，再進(jìn)行稀釋，最終 配置成0. lmg/ml蛋白A溶液，將上步中獲得的316L-DA-(H-V) 10置于蛋白A溶液中，4°C冰 箱中靜置24小時(shí)，將鋼片取出用PBS溶液（pH7. 4)清洗3次，氮?dú)獯蹈桑?br> [0059] 第七步、牛血清白蛋白封閉：將第六步中制得的支架浸入10mg/ml牛血清白蛋白 中，4°C下靜置封閉，取出用PBS清洗5分鐘，氮?dú)獯蹈桑?br> [0060] 第八步、包被⑶34抗體：配置⑶34抗體溶液，將第七步中制得的支架浸入抗體溶 液中，4°C條件下反應(yīng)12小時(shí)，取出用PBS清洗，常溫干燥，獲得成品。
[0061] 進(jìn)行⑶34抗體的熒光標(biāo)記和表征：自DA-(H-V) 10-A組中取一枚鋼進(jìn)行熒光標(biāo)記。 之前用兔血清封閉，F(xiàn)ITC標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將316L-D-(H-V) 10-S-A與 標(biāo)記物37°C條件下共浴1小時(shí)，常溫下過(guò)夜干燥。固定于載玻片上，送檢免疫熒光。
[0062] 所述溶液的配置：三羥甲基氨基甲烷緩沖液（10mM，pH8. 5)配置：Tris堿0. 121加 80ml Milli-Q water溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH，滅菌；肝素鈉 溶液配置：3mg/ml肝素鈉的Milli-Q water溶液100ml，用0· 1M NaOH及1%醋酸調(diào)節(jié)pH為 4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌。
[0063] 具體做法如下：
[0064] 材料準(zhǔn)備：鋼板規(guī)格-316L不銹鋼，直徑6mm圓片，厚度1mm，剛好能置于96孔板 中；Tris堿、Milli-Q水、4M鹽酸（即鹽酸濃度為4mol/L)、去污粉、丙酮、乙醇、去離子水、凍 干物、配置好的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、已處理好的鋼片（18片）、滅菌的Milli-Q水、肝 素鈉、0.說(shuō)似0!1、1%醋酸、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、？85緩沖液溶液（?!1值為7.4)、金黃色葡萄 球菌A蛋白、牛血清白蛋白、CD34抗體，制備好的凍干物成分為多巴胺中氨基和肝素中 羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物。
[0065] 儀器準(zhǔn)備：電子天平、100ml容量瓶1個(gè)、量筒lOOmll個(gè)、加樣槍及槍頭、PH計(jì)、PH 試紙（堿性）、PH試紙（酸性）、拋光機(jī)、超聲清洗機(jī)、60°C烘箱、紫外滅菌燈、超凈工作臺(tái)、48 孔板、無(wú)菌鑷子、真空低溫?zé)o菌保存裝置、燒杯（200ml)、燒杯（50ml)、加樣槍（5ml、200ul)、 EP管。
[0066] 制作方法如下：
[0067] 溶液配制：配置三羥甲基氨基甲烷緩沖液（10mM，pH8. 5) :Tris堿0· 121g加80ml Milli-Q水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH，滅菌。多巴胺中氨基和 肝素中羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物，將化合物制備成凍干物備用。
[0068] 鋼片的拋光：用拋光機(jī)拋光至鏡面。
[0069] 拋光后的鋼片處理：將拋光后的鋼片用去污粉清洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清 洗，分別超聲15min。最后去離子水超聲清洗3次，每次15min。清洗后60°C烘箱中干燥 24h。
[0070] 鋼片及凍干物紫外線滅菌。
[0071] 鋼片上多巴胺聚合：在超凈工作臺(tái)中操作。將凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖 液中，配好的溶液中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，將24個(gè)孔每孔中放置0. 25ml配 置好的溶液，用鑷子每孔放1枚鋼片。（1片鋼片約需〇. 25ml溶液，共需聚合3組鋼片，每組 6片，共需4. 5ml溶液。制備的凍干物中共含20mg多巴胺，可配置5ml溶液。）
[0072] 結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將24片鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板中， Milli-Q水清洗3遍，每遍5min，清洗后氮?dú)獯蹈?。取其?枚鋼片，記作肝素-多巴胺組， 真空低溫?zé)o菌保存。余16片鋼片繼續(xù)下述自組裝過(guò)程。
[0073] 進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝素的層層自組裝：配置3mg/ml肝素鈉的Mi 11 i-Q水溶 液l〇〇ml，用0. 1M NaOH及1%醋酸調(diào)節(jié)pH為4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌。配置lug/ml 的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的PBS緩沖液溶液（pH為7. 4) 20ml，滅菌。在48孔板的16個(gè)孔中各 置入0.3ml肝素鈉溶液，將上述吸附有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的鋼板各置入孔中，室溫下靜置 30min。將鋼片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水沖洗3遍，每次5min，氮?dú)獯?干。在48孔板的16個(gè)孔中各置入0. 2ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液，將上述D-Η組鋼片置于 孔中，浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，室溫下靜置30min。將鋼片取出，置入48孔板新的孔 中，之后Milli-Q水沖洗3遍，每次5min，氮?dú)獯蹈?。取其?枚再次紫外線滅菌后低溫干 燥無(wú)菌保存，另8枚鋼片進(jìn)行下一步包被。
[0074] 自組裝金黃色葡萄球菌A蛋白和⑶34抗體：將總量lmg金黃色葡萄球菌A蛋白中 加入lmlPBS，配置成lmg/ml溶液，再取出lOOul稀釋于900ulPBS中，最終配置成0· lmg/ml 金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，滅菌。8枚鋼片每片需要0.25ml，共需2ml。在48孔板的8個(gè) 孔中各置入0. 25ml金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，將最終獲得的鋼片置于孔中，室溫下靜置 30分鐘。將鋼片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水沖洗3遍，每次5分鐘，氮?dú)?吹干。配置l〇mg/ml牛血清白蛋白，滅菌。將上述鋼片浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4°C 下靜置24h封閉，取出用Milli-Q水沖洗清洗5min，氮?dú)獯蹈伞Ｅ渲?ug/ml⑶34抗體溶液， 每枚鋼片約需〇. 2ml抗體溶液，共8枚，約需1. 6ml抗體溶液，需要3. 2ug抗體。將封閉后 的鋼片浸入抗體溶液中，4°C條件下反應(yīng)12h。取出用PBS清洗5min，常溫下過(guò)夜干燥。
[0075] 進(jìn)行⑶34抗體的熒光標(biāo)記和表征：取制好的一枚鋼片進(jìn)行熒光標(biāo)記。之前用兔血 清封閉，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將鋼片與標(biāo)記物37°C條件 下共浴lh，常溫下過(guò)夜干燥。固定于載玻片上，送檢免疫熒光。
[0076] 具體檢測(cè)方法如下：
[0077] -、免疫熒光檢測(cè)涂層支架上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和⑶34抗體含量檢測(cè)：
[0078] (一）主要設(shè)備和產(chǎn)地：
[0079] 1)激光共聚焦顯微鏡Leica公司SP5激光共聚焦顯微鏡
[0080] 2)微量移液槍德國(guó)Eppendorf公司
[0081] 3)細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別蓋玻片美國(guó)corning公司
[0082] 4)濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜上海實(shí)生公司
[0083] (二）試劑：
[0084] 1 X PBS (Sangon 上海生工）
[0085] 牛血清蛋白（美國(guó)BD)
[0086] 洗滌緩沖液（Sangon上海生工）
[0087] 抗體：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（abeam ab46154, 1:100)
[0088] 突光二抗（abeam ab99700, 1:400)
[0089] (三）實(shí)驗(yàn)方法：
[0090] 1、用PBS清洗鋼板。
[0091] 2、用含3%牛血清蛋白的PBS在室溫封閉lh。
[0092] 3、洗滌緩沖液室溫漂洗三次，每次5min。
[0093] 4、加入一抗（⑶34組不加一抗，直接孵育二抗）濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（附：抗體稀 釋比例，P651:100)。
[0094] 5、用PBS在室溫漂洗三次，每次5min。
[0095] 6、加入熒光二抗1 :400,在室溫下避光孵育lh。
[0096] 7、去除二抗。
[0097] 8、用PBS在室溫漂洗三次，每次lOmin。
[0098] 9、在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
[0099] (四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0100] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，D-H[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物](圖中用I表示）， 其中D-(H-V) 10 [316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）10]組（圖 中用II表示）和D-(H-V) 10-A[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子）10_蛋白A]組（圖中用III表示）中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子包被很成功，能明顯檢測(cè)出血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；D-(H-V) 10-A[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子）10-蛋白A]組中⑶34抗體包被很成功。
[0101] 二、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和CD34抗體的含 量
[0102] (一）主要設(shè)備和產(chǎn)地
[0103] 1、80°C低溫冰箱美國(guó)Thermo Forma公司；
[0104] 2、臺(tái)式水平離心機(jī)Eppendorf，5810R德國(guó)；
[0105] 3、Nanopure超純水儀日本SANYO公司；
[0106] 4、AA-200 型電子天平美國(guó) Denver Instrumol/Lent 公司；
[0107] 5、90 - 2型磁力攪拌器上海滬西分析儀器廠
[0108] 6、低溫高速離心機(jī)ThermoForma公司
[0109] 7、酶標(biāo)儀：Biotek 公司，型號(hào)：synergy H4Hybrid Reader
[0110] 8、微量移液槍德國(guó)Eppendorf公司
[0111] 9、燒杯、容量瓶：上海實(shí)生公司
[0112] (二）試劑和材料
[0113] 1、RIPA(完全裂解液）；Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）：50mM，pH7. 4; NP-40 (非離子去污劑）：1 % ;NaCl: 150mM ;EDTA (乙二胺四乙酸二鈉）ImM ;PMSF (蛋白酶抑 制劑）ImM ;Leupeptin (亮抑肽酶）10ug/ml ;Pepstatin (抑肽素）2ug/ml ;
[0114] 2、PI3_Kinase activity ELISA Kit (磷脂酰肌醇3-激酶活動(dòng)酶聯(lián)免疫試劑盒）： 美國(guó) echelon 公司 K-1000 ;
[0115] 3、ATP (三磷酸腺苷）美國(guó)Sigma公司；
[0116] 4、TBST(洗滌緩沖液）：FW ;Tris-Base(三羥甲基氨基甲烷）20mM121. 14、2.4228g/ L ;NaCl、137mM、58. 44、8· 0145g/L ;Tween-20(吐溫 20)0. 1% (V/V)、lml/L、PH = 7· 6。
[0117] (三）實(shí)驗(yàn)方法
[0118] 從_80°C取出處理過(guò)的細(xì)胞（一個(gè)100mm圓盤視野> 5 X 16細(xì)胞），酶管中加60ul RIPA(細(xì)胞裂解液），在 4°C裂解 30min。12000rpm，4°C，離心 10min。
[0119] BCA(牛血清白蛋白）法測(cè)定蛋白濃度（測(cè)定方法詳見"Western Blot (蛋白印跡） BCA(牛血清白蛋白）法測(cè)定蛋白含量"部分），用RIPA(細(xì)胞裂解液）調(diào)整樣本蛋白濃度至 5ug/ul。測(cè)定蛋白樣本濃度與平衡（見表1)。
[0120] 表1.測(cè)定蛋白樣本濃度與平衡表格
[0121]

【權(quán)利要求】
1. 一種復(fù)合血管支架，其特征在于：包括有支架本體和復(fù)合藥物涂層，其中復(fù)合藥物 涂層裹設(shè)在支架本體上，復(fù)合藥物涂層從內(nèi)到外依次是由多巴胺聚合物層、抗凝血性藥物 和促進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子組成的復(fù)合涂層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的支架本體為裸金屬 支架或可降解聚合物支架或可降解鎂合金支架或可降解鐵合金支架。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的裸金屬支架為316L 不銹鋼支架。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的抗凝血性藥物和促 進(jìn)內(nèi)皮再生細(xì)胞因子的層數(shù)為1-10層。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的抗凝血性藥物 為肝素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的復(fù)合藥物涂層外依 次裹設(shè)有蛋白A層和抗體藥物層。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種復(fù)合血管支架，其特征在于：所述的抗體藥物層由抗體 ⑶34組成。
【文檔編號(hào)】C23C22/68GK204050425SQ201420412261
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】宋春莉, 劉斌, 李倩, 楊東輝, 刁鴻英, 張基昌, 費(fèi)瑜, 張靜, 魯洋, 郭子源 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)