專利名稱：交聯(lián)葡萄糖異構酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于通過使結晶酶交聯(lián)而生成的新的水不溶的葡萄糖異構酶。本發(fā)明還涉及制備該水不溶的交聯(lián)葡萄糖異構酶的方法。
在連續(xù)運行的反應器中應用固定不動的酶(即連結在固體載體上的酶)是日益優(yōu)先選用的技術，因為這種技術可以降低酶的費用和最終產物的純化費用。用固定的葡萄糖異構酶使葡萄糖轉化為果糖是常用的方法。
一般來講，酶是水溶性的，因此在連續(xù)操作中有必要采用固定技術。必須采用一種能使酶不溶于水相，同時又能保持其活性的方法使酶結合在一固相上。已提出許多使酶與固體載體結合的方法，其中有將酶吸附、共價連接、交聯(lián)或微膠囊化。另外一種方法是，使產生酶的整個微生物結合到固相上。對于上述技術，在例如Mooo-young，M.(ed)，ComprehensiveBiotechnology，2，Pe-rgamonpress，倫敦1985，p.191-211中，有很好的綜述。
在以前的方法中，是使酶結合到另外制備的載體材料上，這樣做對于底物的化學動力學或流動也許是有益的。但是，在大多數情況下，尤其在大規(guī)模生產(例如在制糖工業(yè))中，載體材料比作為催化劑的酶更貴。另一個方法是，可以使酶與惰性成分(例如凝膠)交聯(lián)而將其固定?？傊?，在現(xiàn)有技術中作為催化劑的酶只構成所用材料重量和體積的一小部分，在各個具體方法中一般只占5%以下，通常為1-2%。
從技術上講，用戊二醛進行交聯(lián)對于例如葡萄糖異構酶的固定具有重要的意義。已知美國食品醫(yī)藥管理局(FDA)已認可戊二醛在食品工業(yè)中可用于固定酶。
其它已經應用的技術還有使酶與離子交換劑相連和把酶吸附在固體載體上。在美國專利4，699，882(K.Visuri;穩(wěn)定的葡萄糖異構酶)中可以找到應用上述方法的實例。然而，在這一現(xiàn)有技術方法中應用的載體比較昂貴，并且該技術還需使用一種大反應器。
工業(yè)上應用固定酶技術所需的費用不一定與所應用的酶有關系。這些費用包括制造工藝設備和建造廠房的費用;載體材料添置(再添置)費用，失活酶材料的處理費用;排空和裝填反應器(或載體再生)的勞務費用;由于反應器遲鈍所需的附加費用。長期操作時常會出現(xiàn)非酶作用的不利副反應，尤其是在果糖生產中。
上述科技文獻中有幾個用戊二醛來交聯(lián)結晶酶的實例。在這些研究中，為了基礎研究目的而對酶結晶進行了交聯(lián)。酶結晶的結構通常是很弱的，以至于在X射線衍射研究中它們不能經受住所應用的射線束;然而使用戊二醛卻?？梢允菇Y晶酶穩(wěn)定，從而能夠用于X射線衍射研究。此外，還為研究結晶酶的穩(wěn)定性和催化劑動力學特性而對結晶酶進行了交聯(lián)。在結晶交聯(lián)成功的情況下，只應用了戊二醛，而介質是由一種溶液構成，在該溶液中各個特定的酶能保持結晶形式?，F(xiàn)在看來，通過戊二醛與酶蛋白反應，可以直接生成一種不溶的結晶。Quiocho和Richards(Proc.Natl.Acad.Sci(美國)52(1964)p.833和Biochemistry5(1966)p.4062)首先將戊二醛用來交聯(lián)羧基肽酶。Bishop和Richards(J.Mol.Biol.33(1968)，p.415～421)用1%戊二醛水溶液于室溫下對結晶狀β-乳球蛋白進行了交聯(lián)。應用所得結晶研究了酶的電學性質。Heas(Biophysic.Journ.8(1968)，p.549-555)應用12%的戊二醛溶液在4%硝酸鈉溶液(PH8)存在下對浴菌酶結晶進行了交聯(lián)。
Dyer、Phillips和Townsend(ThermochimicaActa8(1974)，p.456～464)研究了用戊二醛交聯(lián)的羧基肽酶結晶的熱穩(wěn)定性。Dyer等人發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)使穩(wěn)定性增加。Tuechsen和Ottesen(CarlsbergRes.Commun42(1977)，p.407-420)研究了在硫酸鈉溶液中用戊二醛交聯(lián)的枯草溶菌素結晶的動力學性質。對映低分子量的底物，該結晶的活性強，而對于高分子量的底物(如蛋白質或多肽，它們不能擴散到結晶中)，結晶的活性是不顯著的。
Wong等(Biochem.andBiophysic.ResearchCommunications80(1978)，p.886-890)在硫酸銨溶液中用戊二醛對源于微生物的酸性蛋白酶進行了交聯(lián)。在交聯(lián)中，硫酸銨的存在被認為是技術上的缺點。
Morozov和Morozova(Biopolymers20(1981)，p.451-467)應用2-6%戊二醛溶液，反應時間2-10天，于室溫下對溶菌酶結晶、血紅蛋白結晶和肌紅蛋白結晶進行了交聯(lián)。在2-甲基-2，4-戊二醇(25%)存在下，Lee等(BioorganicChemistry14(1986)，p.202-210)用戊二醛對醇脫氫酶結晶進行了交聯(lián)。
已知用戊二醛得到不溶的酶是困難的，尤其是如果蛋白質含有的賴氨酸較少時則更困難。對此問題通常作這樣的處理在酶中混入一種蛋白質(例如白蛋白)，它可以交聯(lián)產生一種不溶物(G.B.Broun，MethodsinEnzymology，44(1976)，p.263)。但是當需要交聯(lián)的酶為晶狀體時，加入上述無關的惰性蛋白質是不可能的。對于僅用戊二醛無法使結晶體交聯(lián)成為不溶物的情況，目前還沒有交聯(lián)方法。
如以上所提到的，已知可用戊二醛固定葡萄糖異構酶。這樣可以將異構酶交聯(lián)到載體材料上。該方法在工業(yè)上已得到廣泛應用。在該文獻中未曾敘述使葡萄糖異構酶結晶交聯(lián)成為不溶形式的嘗試。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以將葡萄糖異構酶結晶交聯(lián)，并使其保持原來的結晶狀態(tài)而酶的活性仍然很高;最好的操作方法可以使交聯(lián)產物保持同原來的酶一樣的活性。本發(fā)明的產物不溶于任何應用酶技術時可能存在的溶劑中。在工業(yè)異構化方法中，可以用交聯(lián)的結晶酶直接裝填異構化柱。應用新的交聯(lián)的結晶可以在比以前所用的柱小得多、有效得多的柱中進行連續(xù)的異構化處理。熟悉本技術領域的專業(yè)人員明白，本發(fā)明可以應用填充有純的酶而不是與惰性材料結合的酶的柱子，該惰性材料經常占據了柱子大部分空間并且其費用占柱子費用的一大部分。
在本發(fā)明的方法中，用二醛(例如戊二醛)和至少含一個氨基的化合物(例如銨化合物、胺或氨基酸，最好用銨鹽或賴氨酸)使葡萄糖異構酶結晶交聯(lián)。有幾種胺和氨基酸是適用的。同樣明顯的是，在本發(fā)明的方法中，除了戊二醛之外，也可以應用許多其它的二醛和與氨基反應的物質(稱為交聯(lián)劑)。
用本發(fā)明方法制得的固體狀結晶酶的活性是很高的，或者與游離酶的活性實際上是相同的。在連續(xù)的處理過程中，固體狀結晶酶可以用作柱填充劑。固體狀結晶酶很穩(wěn)定，并且能很好地耐受機械壓力。
如果需要，按已知的物理化學方法，還可以使交聯(lián)的結晶進一步結合形成較大的本體，其形狀可以圓的、葉片狀的、帶狀的等。這樣得到的酶制品能夠經得住機械的處理。
熟悉本領域的專業(yè)人員可以認識到，按照本文所述的方法，實際上可以由迄今通常是由于其氨基酸成分而不適用于交聯(lián)的任何結晶酶來制成不溶的酶制品。
下面將更詳細地敘述本發(fā)明的方法。
用作起始有利的結晶狀葡萄糖異構酶的制備將硫酸銨(約10%(重))溶于葡萄糖異構酶溶液(按干燥蛋白質測定，異構酶占1～10%(重))中。在不斷攪拌下，將溶液慢慢冷卻至約1～2℃。異構酶基本上完全結晶(大于95%)?？梢杂昧蛩徭V或硫酸鈉代替硫酸銨作為結晶劑。所用鹽的濃度可以在寬范圍內變化，例如可從5%到25%(重)。結晶過程所需的時間也可以在較寬的范圍內變化，例如可從1小時到數天。制備大的結晶時，最好用逐漸冷卻的方法，并且異構酶要盡可能純。美國專利4，699，882(Visuri敘述了該結晶過程，該專利收編在本申請中作為參考。
在結晶之后，用離心的方法或沉積法將結晶物質從母液中分離出來。如果需要，用硫酸銨、硫酸鎂或其它適用于結晶作用的物質的純溶液洗滌結晶物質。對不含有任何游離的過量母液并且經沉積和離心成為致密形式的結晶物質進行交聯(lián)。該結晶物質的標準活性為10，000GIU/g。它含有20～30%(重)的純的酶蛋白質(按干物質計算)。應該注意，如果將酶結晶干燥，酶結晶就會喪失其結構。
交聯(lián)將結晶物質懸浮在一種在其中該結晶其溶解的鹽溶液中。在該溶液中酶結晶的濃度可以在較寬的范圍內變化，例如可以為2～17%(按干物質計)如果該鹽溶液在開始時不含有銨、合適的胺或氨基酸(例如賴氨酸)，則向該溶液中加入銨鹽。通過加入例如氫氧化鈉溶液，將混合物的PH值調節(jié)到5至9，最好調節(jié)到6至8。酸度用磷酸鹽緩沖液(例如0.05M磷酸鈉)控制，或用堿溶液(例如氫氧化鈉溶液)通過自動PH調節(jié)來控制。加入的胺或氨基酸的濃度可以在較寬的范圍內變化，并且取決于其它成分的濃度。在胺或氨基酸的濃度為最終混合物重量的1～15%時，已制得高產率的本發(fā)明產物。
隨后，將戊二醛加到混合物中以引發(fā)交聯(lián)反應。戊二醛的量可以在較寬的范圍內變化，可以為1～45%(按濕的酶結晶物質計算)。較好的用量取決于例如混合物中所含的胺的濃度。一般來講，較好的濃度是每3g異構酶(按干燥的酶計算)，用3～4.5g戊二醛。反應進行時，要連續(xù)地攪拌溶液;溫度范圍是2～25℃。雖然溫度似乎不很關鍵，但低溫是有益的。反應可以在幾分鐘內很快地發(fā)生。在低溫下，反應時間可以直到20小時。
在反應之后，通過沉積或離心從混合物中分離出不溶的結晶。將結晶物質懸浮在水或合適的鹽溶液中，并且再次離心，以此進行洗滌。反復洗滌數次，直到結晶物質足夠純而可用做催化劑。關于洗滌，最好將細粒狀沉淀沖去。
如果所得的結晶物質是要作為酶過程中的催化劑使用，那么干燥該結晶物質是不合適的。濕的結晶物質可以充分地保持其活性至少6個月，而無需采取任何特殊措施。
最終產物的特征在外觀和大小方面，按本發(fā)明制得的交聯(lián)結晶同原有的原料結晶相似。結晶的大小不很關鍵。直徑為100～200μm或更大些(直至1mm)的結晶特別適合于工業(yè)應用。
本發(fā)明的結晶最重要的性質在于該結晶不溶于水、鹽溶液和糖溶液。本發(fā)明的異構酶結晶不溶于濃的葡萄糖和果糖溶液，甚至在高溫時也不溶，這一點特別重要。在工業(yè)生產中，溫度通常采用60℃，而糖濃度為45%(按重量計)。在上述條件下，以及在任何其它糖濃度和較高的溫度(直至100℃)下，交聯(lián)結晶均是不溶的。交聯(lián)結晶的活性與原有的酶的活性處于相同的等級。本發(fā)明結晶的活性比固定在惰性載體上的酶的活性高許多倍，這在技術上是有益和非常重要的。
把一種酶交聯(lián)化為結晶形式的另一優(yōu)點是，該結晶之內的作用力以及自然地使該結晶保持結晶態(tài)的力，可以十分顯著地將該酶穩(wěn)定化。
表征起始原料和最終產物所用的方法異構酶的活性規(guī)定為每1g干燥酶制品的國際葡萄糖異構酶單位(簡寫為GIU)數。1個單位(GIU)表示在下述條件下能以1μmol/分鐘的速率使葡萄糖轉變?yōu)楣堑拿傅牧科咸烟菨舛葹?.0mole/l，PH為7.0，溫度為60℃。
為了測定活性，將0.1～1g酶制品(原有的結晶物質或充分洗滌的交聯(lián)結晶物質)混合到100ml如前面所述的底物溶液中。在適當的時間(如10分鐘)后，測定溶液中果糖的含量，計算并以上述單位表示活性。選擇酶的用量和反應時間，使生成的果糖少于總糖含量的5%，這是為了使測定結果反映反應開始時的轉變速率。按常規(guī)方法，在105℃干燥樣品至恒重，以測定起始原料和產物的干含量。
異構化工藝過程結晶狀交聯(lián)酶可以按常規(guī)方式用于間歇式異構化過程，在反應之后，用過的酶例如可以用過濾法分離出來，并且如果需要，還可重復使用。
不過，以工業(yè)規(guī)模進行異構化時，最好采用連續(xù)的異構化工藝。在連續(xù)的異構化工藝中，是使待異構化的糖溶液流過酶柱。通過改變保留時間和/或溫度，異構化過程容易控制。在較寬的溫度范圍內，從冰點到超過100℃，酶都是有活性的。低溫下操作的缺點是反應慢，并且糖(葡萄糖和果糖)水合物會結晶析出，而在高溫下，酶和果糖會相當顯著地較快破壞。
連續(xù)異構化一般是這樣進行用100～300μm的交聯(lián)酶結晶裝柱。在各個具體情況下根據所需要的容量改變柱的孔徑和長度。小柱的適宜填充物長度為5～50cm。溫度也可以在較寬的范圍內調整。室溫是非常可行的。如果微生物污染問題較嚴重，可以提高溫度到至少約60℃來消除污染。
通過改變線性流速，可以容易地控制異構化過程。
小柱的線性流速范圍為2～30cm/分鐘。新鮮酶的合適保留時間為1～2分鐘。壓力為1大氣壓。壓降是不明顯的(每50cm長度的柱填充物，壓降小于0.2巴)。保留時間可通過改變柱填充物長度以及流速來調節(jié)。升高溫度可加速異構化反應。
在大部分情況下，常規(guī)工業(yè)化方法的目的是得到糖溶液，其中40～45%的糖是果糖。當酶活性下降時柱隨之老化，此時減慢流速可保持所得糖溶液具有所需組成。
下列實例更詳細地闡明了本發(fā)明。
實例1稱取在10%硫酸銨溶液中結晶的葡萄糖異構酶結晶物質(如美國專利4，699，882所述)850g，并將其加到PH用0.5M磷酸鈉緩沖液調至7.4的1000ml硫酸鹽溶液中。將混合物冷卻至10℃。所得的混合物用螺旋槳式攪拌器以低速(200～400轉/分)連續(xù)攪拌，以減輕結晶的破壞。向混合物中加入160ml25%戊二醛等分溶液。1小時后將201純水加到混合物中使反應中止。立即停止攪拌，用時2小時讓結晶物質沉降于容器底部，傾出母液，注意不要沖出結晶。再次將201純水混合到結晶物質中，然后傾出洗滌水。用水再次洗滌。所得到的用水洗滌過3次的異構酶濕結晶物質可直接用于異構化試驗、活性測定和其它實驗。
所制得的交聯(lián)葡萄糖異構酶呈結晶狀態(tài)(顯微鏡鑒別)。該結晶不溶于水、各種鹽的稀溶液(PH在2～9范圍內)、稀酸(1mol/l)、直至100℃的熱水和熱鹽溶液中，也不溶于直至100℃的濃葡萄糖、果糖和糖溶液中。在所有上述條件下，該結晶的外觀保持不變，而未交聯(lián)的結晶異構酶溶解或以無定形沉淀形式析出。交聯(lián)異構酶的酶活性是原有未交聯(lián)的異構酶活性的52%，即當原有異構酶的活性為40，000GIU/g時，交聯(lián)結晶的活性相應地為20，000GIU/g以上(按干燥的酶蛋白質計算)。
實例2按照實例1的方法于25℃制備以下反應混合物14g異構酶(按純的酶蛋白質計算)10g硫酸銨1.5g戊二醛(約8ml25%戊二醛溶液)0.05M磷酸鈉緩沖液(溶液PH為7.4)100ml水反應1小時后，用實驗室用離心分離機以1000轉/分的轉速離心5分鐘，將游離溶液從混合物中除去。把得到的結晶物質懸浮于200ml純水中，并按上述方法再次離心。按上述方法再次用水洗滌。回收經洗滌的濕的結晶物質，用于進一步研究。該法制得的結晶物質的活性是原結晶物質活性的49%。
實例3～8按實例1的方法，于10℃制備具有與實例2所述相同初始組成的各反應混合物。經不同的反應時間后，中止反應并洗滌結晶物質，然后測定各結晶物質的活性，結果示于以下表Ⅰ中。
表Ⅰ實例反應時間活性(表示為原來結晶物質活性的百分比)實例310分鐘45實例430分鐘46實例560分鐘49實例690分鐘48實例72小時40實例83小時40從以上結果可見，反應能很快完成。而反應時間增加，活性沒有大的變化。
實例9～16按實例1的方法，于10℃制備具有以下初始組成的反應混合物14g葡萄糖異構酶蛋白質(結晶形式)10g硫酸銨90ml0.5M磷酸鈉溶液(如表Ⅱ所示，PH為6.0，7.0，8.0或8.4)0.12g、0.5g、2.0g、3.5g或4.12g戊二醛(如表Ⅱ所示)反應時間為1小時。所得各結晶物質的活性(表示為原來結晶物質活性的百分數)列于表Ⅱ中。
表Ⅱ實例PH戊二醛(g)活性(%)實例96.00.522實例106.03.524實例117.00.1260實例127.02.065實例137.04.1259實例148.00.541實例158.03.544實例168.42.039從以上結果看來，戊二醛的量在相當寬的范圍內變化時，仍可得到較高的活性。酸度明顯地影響結果;雖然在試驗的整個PH范圍內，即PH6.0～8.4，都可以得到有效的制品，但是最佳的PH值為約7.0。
實例17～27按以上各實例進行一系列相似的試驗，但溫度為2℃，反應時間為18小時。反應混合物的組成如下3g異構酶結晶(按干燥蛋白質計算)50ml水(作為介質)7.5g鹽(硫酸鈉、硫酸鎂和/或硫酸銨，見表Ⅲ)
氫氧化鈉(用來調節(jié)PH至7.0，用量不大于2毫克當量，即80mg)0.125～2.5g戊二醛(見表Ⅲ)表Ⅲ鹽(g)實例 (NH4)2SO4MgSO4Na2SO4戊二醛活性(%)實例177.50.50實例187.52.50實例197.50.1250實例207.50.50實例217.50.750實例227.51.250實例230.457.050.7520實例240.906.60.7519實例251.85.70.7528實例263.753.750.7540實例277.50.7560從以結果看來，在沒有銨鹽的情況下進行交聯(lián)時，得不到不溶的結晶，即使戊二醛濃度較高也得不到不溶結晶。即使只用少量的銨鹽，也可以促進不溶結晶的形成。
實例28～38按以下一般方法，用不同的含氮化合物制備不溶的異構酶結晶3g結晶狀異構酶(按干蛋白質計算)7.5g硫酸鎂10mmol含氮化合物(見表Ⅳ)2.5g戊二醛(按100%計算)溫度為2℃，反應時間為18小時表Ⅳ實例含氮化合物用量(g)活性(%)實例28賴氨酸1.8380實例29精氨酸1.7417實例30組氨酸1.5526實例31谷氨酰氨1.4618實例32亮氨酸1.3121實例33異亮氨酸1.3118實例34脯氨酸1.1510實例35甲硫氨酸1.4927實例36苯丙氨酸1.6517實例37色氨酸2.0444實例38三甲銨乙內酯1.1723
從以上結果看來，一些不同的胺對交聯(lián)過程具有相似的作用。
實例39～51按以下一般方案，用不同量的戊二醛和賴氨酸制備不溶的異構酶結晶。
3g結晶狀異構酶(按干燥蛋白質計算)7.5g硫酸鎂0.47～2.34g賴氨酸(見表Ⅴ)用氫氧化鈉溶液將PH調至8.00.5～1.25g戊二醛(100%;見表Ⅴ)將溶液于2℃反應18小時。
表Ⅴ實例戊二醛(g)賴氨酸(g)活性(%)實例390.50.4767實例400.50.9477實例410.51.4060實例420.750.4772實例430.750.9483實例440.751.4092實例450.751.8781實例460.752.3475實例471.250.4768實例481.250.9478實例491.251.4090實例501.251.87102實例511.252.34100從以上結果看來，賴氨酸和戊二醛用量之間的比率會影響不溶結晶的形成，也就是說，在各個戊二醛用量下，都有一個最佳的賴氨酸用量。
實例52～57按以下一般方案，在賴氨酸存在下，于硫酸銨溶液中使異構酶結晶進行交聯(lián)。
10g異構酶結晶置于10%硫酸銨溶液中(即3.72g純的異構酶蛋白質(按干燥物質計算)，0.63g硫酸銨和5.65g水)5g硫酸銨45g水1.25g戊二醛(按100%計算)0～3g賴氨酸(見表Ⅵ)在攪拌前用氫氧化鈉將所有反應充分的PH調至8.0。
混合物于3℃攪拌18小時。
表Ⅵ實例賴氨酸(g)活性(%)實例52040實例530.362實例540.666實例551.272實例561.892實例573.096由以上結果看來，賴氨酸對交聯(lián)結晶的活性具有十分有利的作用。雖然單獨使用硫酸銨可得到滿意的結果，但是當應用賴氨酸時，硫酸銨對結果影響不很大。
實例58～69異構酶和賴氨酸的用量保持不變，其它成分按表Ⅶ所示改變。
3g葡萄糖異構酶(按干態(tài)計算)1g賴氨酸0.01g氫氧化鈉(PH8的溶液)于2℃反應18小時。
表Ⅶ實例戊二醛 MgSO4水反應溶液的總量活性(g)(g)(g)(g)(%)實例580.52.111.918.539實例590.52.715.322.570實例600.54.223.832.570實例610.55.332.742.573實例620.510.257.872.575實例630.516.291.8112.577實例641.252.111.919.2586實例651.252.715.323.2599實例661.254.223.833.25101實例671.255.332.743.2589實例681.2510.257.873.2583實例691.2516.291.8113.2589
從以上結果看來，反應混合物的濃度對最終結果幾乎沒有什么影響。反應成分(酶、賴氨酸(或胺)和戊二醛)之間的重量比例則具有較大的影響。
實例70將水洗過的1g交聯(lián)葡萄糖異構酶物質(按實例56制得;0.4g干物質)混入PH值已調至7.0的100g40%葡萄糖溶液中?；旌衔镉?0℃不斷攪拌。從混合物中間歇地取樣，用旋光計測定樣品的果糖含量，用已糖激酶以酶法測定葡萄糖含量。在3小時內果糖含量上升到溶液總糖含量(葡萄糖+果糖＝100%)的42%。試驗后交聯(lián)異構酶經過濾從混合物中分出并用水洗滌。測定所得結晶物質的活性及其干含量。試驗中未發(fā)現(xiàn)活性酶溶解或消失。用同一批酶可以重復試驗數次。
實例71洗去按實例1所述制得的結晶物中的細粒狀沉淀，并在把結晶材料懸浮于水中并將水傾出(3次)的過程中，將結晶材料軋細。將所得平均大小為100μm的大結晶部分裝入于直徑為2.6cm、高為5cm的圓柱形反應器內。把具有以下組成的葡萄糖溶液于60℃泵入柱內使其通過582g葡萄糖一水合物590g水0.37g Mg SO47H2O0.19g Na HSO3
PH6.9(1MNaOH，用量低于1ml)試驗開始時流速為11ml/分，同時從柱中流出的溶液的果糖含量上升到總糖含量的42%。試驗連續(xù)進行200小時，此后流速須減至9ml/分以保持原有的轉化率(果糖含量為42%)。因此，在這期間酶的活性下降到初始值的81%，在試驗期間未觀察到結晶物質減少或溶解。
實例72～76稱取43.42g水洗過的濕的活性異構酶(按實例67的方法制得;10.0g酶(按干物質計算)。
將200ml按實例71所述方法制得的葡萄糖溶液與該結晶物質相混合。于60℃將混合物攪拌不同時間，然后通過圓形濾紙過濾混合物。留在濾紙上的結晶物質仔細地用水沖洗，以除去所有可溶性物質。在恒溫箱中于105℃將結晶物質干燥，然后稱重。結果列于表Ⅷ中。
表Ⅷ實例攪拌時間試驗后結晶物質的干重(g)實例7210分鐘9.9實例732小時11.0實例744小時10.9實例756小時10.7實例7621小時10.4
從以上結果看來，在常規(guī)工業(yè)操作條件下，按本發(fā)明方法制得的交聯(lián)結晶異構酶不溶于底物溶液中。
實例77將結晶狀交聯(lián)異構酶、固定連結在DEAE纖維素上的異構酶和原來的游離可溶性異構酶都置于完全相同的化學和物理條件下，對它們進行相互比較。選擇條件，使每個酶樣品的活性在合理的短時間內(即10～30小時)能有在可測范圍內的下降。每個酶制品取5g混入150ml0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.0)(含有1.5mmol/lMgSO和2mmol/lNaHSO)中。混合物于70℃振搖數小時。從混合物中間歇地取樣，經由樣品測定剩余異構酶的活性。根據活性降到情況，確定出每個酶樣品的半壽期(即活性降至原有值的1/2時所用的時間)，結果示于表Ⅸ中。
表Ⅸ酶樣品半壽期(h)原來的可溶性異構酶2.2固定在DEAE纖維素上的異構酶3.3結晶狀交聯(lián)結晶異構酶19.0從以上結果看來，交聯(lián)結晶保持其酶活性的能力大大強于游離酶或用已知方法固定的酶。
實例78將結晶狀交聯(lián)異構酶和固定在DEAE纖維素上的異構酶裝入與實例71所述類似的圓柱形反應器內。用泵使葡萄糖溶液連續(xù)地從柱中通過。此葡萄糖溶液除PH調至6.0外，其組成與實例71中的相同。在試驗期間柱溫為60℃。柱中所含酶的活性根據流速和流出溶液的果糖含量進行計算。結果列于表Ⅹ中。
表Ⅹ反應器裝填物活性半壽期〔小時(h)〕結晶狀交聯(lián)異構酶120在DEAE纖維素上固定的異構酶36從以上結果看來，交聯(lián)結晶能很好地保持其酶活性。
實例79～81柱處理法中交聯(lián)結晶與現(xiàn)有技術的固定異構酶的比較將工業(yè)上應用的典型異構酶樣品與本發(fā)明的交聯(lián)結晶裝入垂直的實驗柱內。該交聯(lián)結晶是按實例51所述方法制備的。圓柱形柱的內徑為2.7cm，高為50cm。實驗柱有一個60℃的恒溫水夾層。柱子的下端有一個篩網，以便把酶顆粒保持在柱中，同時能使糖溶液從柱中流過。將各為20g按干燥物計算的每種酶裝入各個柱中。具有實例71組成的葡萄糖底物用可調節(jié)的實驗泵泵入各柱中。每個柱子各用一個泵。底物的溫度調至60℃。測定流出柱子的產物中的葡萄糖和果糖。當底物流速相同時，觀察到經每種不同的酶制品得到不同含量的果糖。各個柱子的流速分別用嘗試法調節(jié)，直到各個產物中果糖的含量同樣是總糖(葡萄糖+果糖)的45%。下表列出了所用的酶以及生成45%果糖時的相應流速。
表Ⅺ實例20g按干燥物質計算的酶底物溶液流速(ml/h)(比較用樣品)SPEZYMEIGI，179芬蘭糖業(yè)公司的市售產品(比較用樣品)SWEETZYMET.197丹麥NOVO公司的市售產品(比較用樣品)TAKASWEET，94Miles-KaliChemie的市售產品79直徑100～200μm的交聯(lián)異構1364酶結晶80直徑500～600μm的交聯(lián)異構1121酶結晶81直徑900～1100μm的交聯(lián)異構1098酶結晶含有市售酶的柱子的流速十分典型地代表了目前工業(yè)實踐中所觀察到的流速。含有交聯(lián)異構酶結晶的柱子其流速高得多。在工業(yè)實踐中，使用高活性的交聯(lián)結晶時采用較小的酶柱就夠了，這樣就可以減少投資和操作費用。
權利要求
1.結晶狀葡萄糖異構酶，其特征在于通過交聯(lián)使結晶狀可溶的葡萄糖異構酶轉變?yōu)樗蝗艿男问健?br> 2.按照權利要求1所述的葡萄糖異構酶，其特征在于在PH范圍為1-10的稀酸和堿溶液中是不溶的。
3.按照權利要求1或2所述的葡萄糖異構酶，其特征在于它在葡萄糖、果糖和其它糖的水溶液中是不溶的。
4.按照權利要求3所述的葡萄糖異構酶，其特征在于該結晶在上述糖溶液中是不溶的，甚至在提高溫度下也是不溶的。
5.按照權利要求1所述的葡萄糖異構酶，其特征在于它可催化它的天然底物(如葡萄糖、果糖和木糖)的異構化，甚至在上述糖的濃溶液中它也可進行催化。
6.按照權利要求1-5所述的葡萄糖異構酶，其特征在于通過化學和物理的作用該結晶結合成較大的圓形、片狀、帶狀的物體或這些物體的可能的混合物。
7.用于連續(xù)生產果糖的反應器，該反應器含有水不溶性、充分純的結晶狀交聯(lián)葡萄糖異構酶。
8.制備水不溶的結晶狀交聯(lián)酶的方法，該方法的特征在于a)將二醛加到結晶狀異構酶懸浮液中，在加入二醛之前或在交聯(lián)反應進行時，加入含有至少一個氨基的化合物，例如銨鹽、胺或氨基酸，以及b)用水或其它液體洗滌交聯(lián)結晶，以除去試劑殘余物。
9.按照權利要求8的方法，其中的酶為葡萄糖異構酶。
10.按照權利要求8的方法，其特征在于二醛為戊二醛。
11.按照權利要求8或9的方法，其特征在于戊二醛的用量為0.4～8%(重)。
12.使底物異構化的方法，其中應用結晶狀交聯(lián)異構酶催化底物轉變?yōu)樗漠悩嬻w。
13.權利要求12的方法，其中所述的底物為葡萄糖、果糖或木糖，并且上述異構酶為葡萄糖異構酶。
14.連續(xù)生產果糖的方法，其中使含有葡萄糖的溶液流經含有水不溶的結晶狀交聯(lián)葡萄糖異構酶的反應器。
全文摘要
本發(fā)明是關于新的水不溶的葡萄糖異構酶，該酶是通過使結晶狀酶交聯(lián)而轉化為固體形式得到的。本發(fā)明還涉及在至少含有一個氨基的化合物存在下，用二醛進行交聯(lián)化反應來制備上述新的結晶狀葡萄糖異構酶的方法，以及這種新的酶制品作為異構化催化劑的應用。
文檔編號C23G5/06GK1038313SQ8810345
公開日1989年12月27日 申請日期1988年6月4日 優(yōu)先權日1988年6月4日
發(fā)明者克拉維·維薩瑞 申請人:科特有限公司