專利名稱：一種保存磁小體的溶液及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種保存磁小體的溶液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁小體(BMPs, Bacterial Magnetic Particles)是趨磁性細(xì)菌合成、分泌的一種新穎的超順磁性納米顆粒，主要由Fe3O4構(gòu)成，且外部具有類細(xì)胞膜的脂膜包被。作為一種真正意義的生物礦化合成材料，自被發(fā)現(xiàn)以來，BMPs由于在基因治療方面表現(xiàn)出的巨大潛力，正受到越來越多研究人員的青睞。BMPs的成分純、形態(tài)獨(dú)特且細(xì)小均勻，通過多聚物連接核酸以后構(gòu)成的基因傳遞復(fù)合物既可以在體外水平進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染以提高轉(zhuǎn)染效率并降低轉(zhuǎn)染毒性，又可以在體內(nèi)運(yùn)送藥物或核酸進(jìn)行癌癥治療或者基因治療，目前已有研究證 明，BMPs可以直接固定治療腫瘤的藥物阿霉素在體內(nèi)發(fā)揮作用。更重要的是，BMPs直接或間接(通過其他媒介)與核酸、藥物、蛋白質(zhì)、酶或抗體連接后，在外界磁場的作用下，連接而成的復(fù)合物可向器官或組織定向、高效傳遞藥物，提高治療水平。目前，BMPs的研究和應(yīng)用領(lǐng)域主要涉及磁轉(zhuǎn)染、基因治療、癌癥治療(如惡性癌癥的熱療)、靶向藥物投送、核磁共振成像、組織修復(fù)、免疫熒光分析等領(lǐng)域。如今，關(guān)于BMPs的研究主要涉及BMPs的高效生產(chǎn)、分離和純化，膜蛋白，形成機(jī)制，抗體(藥物)連接，磁性細(xì)胞分離，免疫熒光分析和mRNA回收等，關(guān)于如何更好地保存BMPs的研究目前未見有文獻(xiàn)報(bào)道。由于BMPs外有脂膜包被，脂膜一旦遭到破壞，磁小體容易被氧化，功能受到極大影響，甚至失去應(yīng)用價(jià)值。由于實(shí)際生產(chǎn)、分離和純化BMPs采用的大多為大規(guī)模培養(yǎng)，而BMPs大規(guī)模的推廣應(yīng)用目前還受到一些因素的影響，因此，如何更好的保存得來不易的BMPs并使其結(jié)構(gòu)和功能保持穩(wěn)定就顯得尤為重要。目前，合成、分泌BMPs的趨磁性細(xì)菌分離、培養(yǎng)困難，國內(nèi)只有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室能夠成功做到。因此，找到珍貴且具有廣闊應(yīng)用前景的磁小體的適宜保存條件迫切而重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種保存磁小體的溶液及其應(yīng)用；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供保存磁小體的方法。本發(fā)明提供的一種保存磁小體的溶液，其磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的保存磁小體的溶液為0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液。上述0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液，其IL的配方為稱7. 9g NaCl,0. 2gKCl，0. 24g KH2PO4 (或 I. 44g Na2HPO4)和 I. 8g K2HPO4,溶于 800ml 蒸餾水中，用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 26,最后加蒸懼水雙蒸水定容至1L。本發(fā)明提供了上述0. OlM的pH值為7. 26磷酸鹽緩沖溶液在保存磁小體中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述0.0IM的pH值為7. 26磷酸鹽緩沖溶液在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種保存磁小體的方法，是將磁小體保存于磷酸鹽緩沖溶液中優(yōu)選地，本發(fā)明提供的保存磁小體的方法是將磁小體保存于0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液中。其中，磁小體在磷酸鹽緩沖液中的保存濃度為I U g/iil-10ii g/iil。優(yōu)選地，將磁小體加入磷酸鹽緩沖液以后形成的BMPs保存溶液的濃度是I U g/Ul時(shí)，保存效果最佳。其中，保存溫度為4°C。其中，保存時(shí)間為l-180d。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液在保存磁小體過程中對(duì)磁小體的結(jié)構(gòu)和功能的影響和干擾最小，將保存的磁小體連接得到的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物可達(dá)到更高的PEI、核酸固定和連接效率，用其轉(zhuǎn)染Hela、Ifep-G2、COS-7和C2C12細(xì)胞效率分別是55. 45%、15. 01%、19. 01%和15. 92%，分別高于常規(guī)方法保存的磁小體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率。同時(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率分別高于相同濃度下不同PH值的PBS保存磁小體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率，因此本發(fā)明提供的0. 0IM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液是目前最高效保存磁小體的溶液。本發(fā)明的PBS保存液容易配制，方便獲得，在實(shí)驗(yàn)室中極易推廣。另外，采用本發(fā)明溶液保存的磁小體用于細(xì)胞基因傳遞時(shí)能夠獲得更高的基因投送效率，能夠很好地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)染或體內(nèi)靶向基因投送，適合推廣使用。總之，本發(fā)明所提供BMPs保存溶液對(duì)于更高效、更長期地保存BMPs，并使其更大范 圍地發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值具有非常實(shí)際的意義。


圖I為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖2為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)H印-G2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖3為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)Cos_7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖4為A、B兩組的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)C2C12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖5為為激光共聚焦顯微鏡掃描的Hela細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染效率對(duì)應(yīng)的綠色熒光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Hela細(xì)胞，白色部分占據(jù)圖片的部分越多，代表成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Hela細(xì)胞越多，即轉(zhuǎn)染效率越高。圖6為為激光共聚焦顯微鏡掃描的Hep_G2細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染效率對(duì)應(yīng)的綠色熒光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Hep-G2細(xì)胞，白色部分占據(jù)圖片的部分越多，代表成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Hep-G2細(xì)胞越多，即轉(zhuǎn)染效率越高。圖7為激光共聚焦顯微鏡掃描的Cos-7細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染效率對(duì)應(yīng)的綠色熒光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Cos-7細(xì)胞，白色部分占據(jù)圖片的部分越多，代表成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的Cos-7細(xì)胞越多，即轉(zhuǎn)染效率越高。圖8為激光共聚焦顯微鏡掃描的C2C12細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染效率對(duì)應(yīng)的綠色熒光通道效果圖，其中圖A為用150mM的pH值為7. 00的NaCl溶液保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果，圖B為用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存保存的BMPs連接BMPs-PEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合獲得的轉(zhuǎn)染效果；圖中白色部分代表在此視野中成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的C2C12細(xì)胞，白色部分占據(jù)圖片的部分越多，代表成功表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的C2C12細(xì)胞越多，即轉(zhuǎn)染效率越高。
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圖9為分別用pH值為5、6、8、9的PBS保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖10為分別用pH值為5、6、8、9的PBS保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物對(duì)Cos-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，實(shí)施例中所用的生物試劑、化學(xué)試劑均為市售。實(shí)施例I保存磁小體的兩種溶液的配制和保存方法配制了 150mM的pH值為I. 00的NaCl溶液和0. OlM的pH值為I. 26的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液。150mM的pH值為I. 00的NaCl溶液的配制方法稱取0. 8775g的NaCl，溶于80ml的雙蒸水中，調(diào)PH值到7. 00，最后加雙蒸水定容至100ml。0. OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖液的配制方法稱7. 9g NaCl,0. 2g KC1,0. 24gKH2PO4 (或I. 44g Na2HPO4)和I. 8g K2HPO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 26,最后加蒸懼水雙蒸水定容至1L。將上述配制的溶液高壓滅菌，Iml分裝，4°C保存待用。秤取純化的500 U g磁小體(BMPs) (BMPs是參照中國專利CN101434921B (申請(qǐng)?zhí)?00710177452. 7)公開的內(nèi)容制備得到)分別保存于500 的上述配制好的PBS和NaCl溶液中，即每500 u I的兩種溶液均各自保存500 U g磁小體，保存溫度4°C，時(shí)間為180d，并要求保存環(huán)境周圍均無外加的或者雜亂的磁場存在。實(shí)施例2連接、孵育BMPs-PEI/DNA三元基因傳遞復(fù)合物(I)將 BMPs (磁小體)、PEI (聚乙烯亞胺)、pDNA (pEGFP-Nl,購自美國 addgene 公司)的濃度分別調(diào)至PEI 2u g/u l,BMPs lug/u l,pDNAlug/u l,0D260/0D230 ^1.80o(2)將0.81^的pDNA和I. 6 ii g的PEI分別稀釋于實(shí)施例I制得的48. 7 U I 0. OlM的PBS (pH值為7. 26)中，輕輕渦旋混勻。接著將PEI的稀釋液逐滴緩慢加入DNA稀釋液中(加入的先后順序不可調(diào)換)，輕柔混勻后室溫靜置孵育lOmin，使PEI與DNA自組裝，形成PEI/DNA 二元納米復(fù)合物。(3)分別取實(shí)施例I中的150mM NaCl和0. OlM PBS溶液保存的濃度為I U g/ Ul的BMPs溶液I yl，，超聲波混勻后加入到步驟(2)中已經(jīng)連接組裝完畢99 u I PEI/DNA復(fù)合物溶液中，再次使用超聲波水浴的方式混勻，室溫靜置孵育20min，讓BMPs與PEI/DNA復(fù)合物充分連接，最終得到100 u lBMPs-PEI/DNA三元納米基因傳遞復(fù)合物溶液，分別標(biāo)記為A組和B組，A組表示連接BMPs-PEI/DNA復(fù)合物 時(shí)加入的BMPs是用150mM的NaCl溶液保存的，B組表示連接BMPs-PEI/DNA復(fù)合物時(shí)加入的BMPs使用0. OlM的pH值7. 26的PBS保存的。實(shí)施例3兩種溶液保存的磁小體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的應(yīng)用效果比較提前12h接種Hela、H印-G2、Cos_7和C2C12(以上細(xì)胞均購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)細(xì)胞于24孔板中，37°C，5%C02，100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞接種密度為Hela 3X IO5/ 孔，H印-G2 4X105/ 孔；Cos-7 4X105/ 孔和 C2C12 2X105/ 孔。待實(shí)施例2中的A和B兩組的BMPs-PEI/DNA三元基因傳遞復(fù)合物連接完畢后，將培養(yǎng)了 12h的融合度達(dá)到近80%的細(xì)胞的舊培養(yǎng)基完全吸去，用0. OlM的PBS (pH值為
7.26)清洗細(xì)胞3次，每孔中加入300 ill的無血清DMEM培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司，貨號(hào)C11995)。將實(shí)施例2中連接好的100 u lBMPs-PEI/DNA三元基因傳遞復(fù)合物逐滴滴加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的一孔，輕搖混勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物可以均勻的散布在細(xì)胞的表面。在細(xì)胞培養(yǎng)板下放置一塊“釹-鐵-硼”磁鐵(該磁鐵由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)中心李穎教授實(shí)驗(yàn)室提供，購自德國Chemicell公司)作用lOmin。該“釹-鐵-硼”磁鐵由釹(Nd)、鐵(Fe)、硼(B)三種稀土元素?zé)T而成，永磁性，磁場強(qiáng)度約300mT。IOmin后將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育lOmin，然后將培養(yǎng)液完全吸去，換入新的含10%胎牛血清(FBS，購于美國GIBCO公司)的完全培養(yǎng)基(不加抗生素)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h，中間24h換液一次。48h后，首先使用激光共聚焦顯微鏡掃描轉(zhuǎn)染的Hela、Ifep-G2、COS-7和C2C12細(xì)胞，觀察記錄轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)情況。掃描后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，收集方法將舊的培養(yǎng)液吸去，用IXPBS清洗細(xì)胞2-3次，然后加入濃度為0. 05%的胰酶消化細(xì)胞2min，加入含10%胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司生產(chǎn))的完全培養(yǎng)基終止胰酶消化。用Iml的移液器輕柔吹打貼壁細(xì)胞，收集至無菌離心管中，IOOOrpm離心5min收集細(xì)胞。棄上清，加入800 的IXPBS重懸細(xì)胞，待流式檢測。檢測細(xì)胞數(shù)目為3 X IO4,檢測時(shí)流式細(xì)胞儀的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為543nm，以檢測細(xì)胞中成功表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目占所有檢測細(xì)胞數(shù)目的比例作為轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物(即實(shí)施例2中的A組)轉(zhuǎn)染Hela、Hep-G2, Cos-7和C2C12細(xì)胞的效率分別是55. 45%、15. 01%、19. 01%和 15. 92% ;用 150mM 的 pH值為 7. 00 的 NaCl 溶液(即實(shí)施例 2 中的B組)保存的BMPs連接的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela、H印-G2、Cos-7和C2C12細(xì)胞的效率分別是49. 46%、11. 38%、15. 30%和12. 73%。具體請(qǐng)參考圖I至圖8。通過比較分析以上不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果可知，相比于150mM的pH值為7.00的NaCl溶液，0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液更加符合保存BMPs所需的外部緩沖環(huán)境或者離子環(huán)境，使BMPs在保存過程中結(jié)構(gòu)和功能受到的影響和干擾最小。因此，使用0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液保存的BMPs連接基因傳遞復(fù)合物時(shí)，可以達(dá)到更高的PEI、核酸固定和連接效率，并進(jìn)一步提高對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。綜上所述，0. OlM的pH值為7. 26的PBS溶液是目前發(fā)現(xiàn)的最高效保存磁小體的溶液。轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞對(duì)應(yīng)的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物中的BMPs、PEI和DNA的質(zhì)量配比不同，具體情況見下表I :表I細(xì)胞轉(zhuǎn)染BMPs、PEI與DNA的試劑配比
權(quán)利要求
1.一種保存磁小體的溶液，其為磷酸鹽緩沖溶液PBS。
2.如權(quán)利要求I所述的溶液，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖溶液PBS的濃度為·0.01M, pH 值為 7. 26。
3.如權(quán)利要求2所述的溶液，其IL的配方為稱7.9gNaCl, 0. 2gKCl,0. 24g KH2PO4或1.44g Na2HPO4,1. 8g K2HPO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 26，最后加蒸餾水雙蒸水定容至1L。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的溶液在保存磁小體中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的溶液在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
6.一種保存磁小體的方法，其特征在于，將磁小體保存于磷酸鹽緩沖溶液中。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將磁小體保存于0.OlM的pH值為7. 26的磷酸鹽緩沖溶液中。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，磁小體在磷酸鹽緩沖液液中的保存濃度為 I u g/ u 1-10 u g/ u I o
9.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，保存溫度為4°C。
10.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，保存時(shí)間為l-180d。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種保存磁小體的溶液及其應(yīng)用，屬于生物材料應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明提供的保存磁小體的溶液為磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，本發(fā)明溶液在保存磁小體過程中對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的影響和干擾最小，將保存的磁小體連接得到的BMPs-PEI/DNA復(fù)合物可達(dá)到更高的PEI、核酸固定和連接效率，用其轉(zhuǎn)染Hela、Hep-G2、Cos-7和C2C12細(xì)胞效率分別高于常規(guī)方法保存的磁小體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率。本發(fā)明提供的BMPs保存溶液對(duì)于更高效、更長期地保存BMPs，并使其更大范圍地發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值具有非常實(shí)際的意義。
文檔編號(hào)C01G49/08GK102730768SQ20121020925
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者康曉龍, 方美英, 楊萬杰 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)