專利名稱：一種水溶性碳納米管及其制備應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種水溶性碳納米管及其制備應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
碳納米管是1991年被日本NEC公司基礎(chǔ)研究室的飯島(Ii jima)在高倍透射電鏡下意外發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)研究這就是多壁碳納米管。1993年，Iijima和IBM公司研究小組幾乎同時(shí)報(bào)道觀察到了單壁碳納米管。自此之后，碳納米管成為了碳納米材料家族的一顆璀璨之星。單壁碳納米管的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用也被世界權(quán)威雜志Nature評為1997年度人類十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一。碳納米管作為一種新型的非病毒基因藥物載體，因其內(nèi)在獨(dú)特的物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)性能，引起了人們的廣泛關(guān)注。碳納米管的應(yīng)用跨越了多個(gè)研究領(lǐng)域，包括復(fù)合材料，納米電子學(xué)，場效應(yīng)發(fā)射器及儲(chǔ)氫等。近年來，出于其有趣的大小，形狀和結(jié)構(gòu)，人們一直致 力于研究碳納米管潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。碳納米管分為單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管(MWNTs)，其中單壁碳納米管是由單層石墨卷曲而成，直徑為I 2nm,長度約從50nm lcm。SWNTs是一種具有十分典型層狀中空結(jié)構(gòu)的一維量子材料。柔韌的一維SWNTs可以彎曲，從而促進(jìn)功能化的SWNTs在一個(gè)細(xì)胞上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且可以改善SWNTs與靶向配體偶聯(lián)的親和力。SWNTs所有原子都暴露在表面上，具有非常大的比表面積，可有效的沿碳納米管側(cè)壁裝載多個(gè)分子。由于Ell能級的躍遷，SffNTs在近紅外(NIR)范圍具有高度的光吸收能力，因而可用于光熱治療。SWNTs固有的物理性能可用于影像和多學(xué)科綜合治療。聚乙烯亞胺(PEI)具有高正電密度，易與DNA或RNA形成非共價(jià)的配合物，這些小的膠體微?？梢酝ㄟ^內(nèi)吞作用被細(xì)胞有效攝取，在細(xì)胞內(nèi)由于”質(zhì)子海綿作用”導(dǎo)致質(zhì)子和水大量涌入，內(nèi)涵體破裂，復(fù)合物被釋放進(jìn)入胞漿。原子力顯微鏡顯示，相比于DNA，PEI與siRNA形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定、粒徑更加均一。更重要的是，不論在有核糖核酸酶的體外還是在有血漿核酸酶存在的體內(nèi)，siRNA都受到了有效保護(hù)而免受核酶降解。生物系統(tǒng)對700 1，IOOnm范圍的近紅外光具有高度透過性，而SWNTs在此范圍內(nèi)具有高吸收的特性，可以利用SWNTs在此范圍內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換特性對腫瘤進(jìn)行激光熱療。將SWNTs抗腫瘤給藥系統(tǒng)和激光熱療聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到更加有效的抗腫瘤作用。但由于單壁碳納米管具有高度疏水表面，不溶于水及常見的有機(jī)溶劑，限制了其在生物體系中的研究和應(yīng)用。為此，迫切需要設(shè)計(jì)并合成出水溶性好、毒性小、生物相容性好、適合作為藥物載體并有效聯(lián)合熱療的單壁碳納米管衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種水溶性碳納米管及其制備應(yīng)用方法，可有效解決現(xiàn)有碳納米管具有高度疏水表面，不溶于水及有機(jī)溶劑的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為在碳納米管分子上通過化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚乙烯亞胺，碳納米管和聚乙烯亞胺的質(zhì)量含量比為I :0. 085-0. 125 ;其制備方法為將碳納米管通過酸處理，得表面帶有羧基的碳納米管，再與氨化試劑反應(yīng)，得表面帶有氨基的碳納米管，再與氮丙啶反應(yīng)，在氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終形成聚乙烯亞胺碳納米管，即水溶性碳納米管。本發(fā)明制備的水溶性碳納米管對碳納米管本身的結(jié)構(gòu)特性沒有破壞，水分散性強(qiáng)，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的一種水溶性碳納米管，是在碳納米管分子上通過化學(xué)鍵連接水溶性聚合物聚乙烯亞胺，所述的碳納米管和聚乙烯亞胺的質(zhì)量含量比為I :0.085-0. 125 ;所述的碳納米管為單壁碳納米管。所述的制備方法為
(1)將碳納米管通過酸處理，得表面帶有羧基的碳納米管；
(2)將表面帶有羧基的碳納米管與氨化試劑反應(yīng)，得表面帶有氨基的碳納米管；
(3)將表面帶有氨基的碳納米管與氮丙啶反應(yīng)，在氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終形成聚乙烯亞胺碳納米管，即水溶性碳納米管。本發(fā)明在具體實(shí)施中可由以下實(shí)施例給出。實(shí)施例I
(1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管；
(2)將50mg表面帶有羧基的碳納米管和2mg二環(huán)己基碳二亞胺加入到20ml乙二胺中，120°C加熱,400r/min攪拌回流48h,充分反應(yīng),使用無水乙醇不斷洗漆，過濾得濾餅，將濾餅在40°C下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管；
(3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ L體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。實(shí)施例2
(1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管；
(2)將50mg表面帶有羧基的碳納米管加入到20ml的氯化亞砜和N'-N'二甲基甲酰胺的混合溶液，所述的氯化亞砜和N'-N' 二甲基甲酰胺的體積比為19 :1，加熱回流攪拌，充分反應(yīng)，用無水四氫呋喃洗滌后，抽濾，加入過量乙二胺充分?jǐn)嚢韬螅叧闉V邊用無水乙醇洗滌20次得濾餅，將濾餅在40°C條件下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管；、(3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O. 5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。實(shí)施例3
(1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管；
(2)將2nM的I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和5nM的N-羥基丁二酰亞胺加入到50ml超純水中，超聲15min后,加入50mg表面帶有羧基的碳納米管,繼續(xù)超、聲30min，所述的混合物pH值保持在5以下，超聲結(jié)束后，用超純水反復(fù)洗滌，過濾得濾餅，將濾餅抽真空干燥；
(3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。實(shí)施例4
(1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管；
(2)將50mg表面帶有羧基的碳納米管和2mg二環(huán)己基碳二亞胺加入到20ml乙二胺中，120°C加熱,AQOr/min攪拌回流48h,充分反應(yīng),使用無水乙醇不斷洗漆，過濾得濾餅，將濾餅在40°C下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管；
(3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，70°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。所述的水溶性碳納米管的粒徑為180_210nm。所述的水溶性碳納米管與抗腫瘤藥物結(jié)合，作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物的多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類藥物的一種或幾種；所述的結(jié)合為超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的一種或幾種。水溶性碳納米管藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體聯(lián)合熱療作為熱療增敏劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的就是構(gòu)建一種單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個(gè)目的就是提供上述載體系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的就是提供上述單壁碳納米管-聚乙烯亞胺聚合物作為基因及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的就是提供上述單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)聯(lián)合熱療在腫瘤治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一個(gè)目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種單壁碳納米管-聚乙烯亞胺聚合物，它是將單壁碳納米管原料經(jīng)過純化處理的基礎(chǔ)上，通過酸處理使單壁碳納米管表面帶有羧基；然后與氨化試劑反應(yīng)，將單壁碳納米管表面連接上反應(yīng)活性較強(qiáng)的氨基后，再與氮丙啶反應(yīng)，在氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終在單壁碳納米管表面形成聚乙烯亞胺(PEI)樹枝狀聚合物(SWNT-PEI)。該單壁碳納米管-聚乙烯亞胺聚合物中，SWNTs和PEI的質(zhì)量含量比為1:0.085-0. 125。本發(fā)明的第二個(gè)目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種SWNT-PEI抗腫瘤載體的制備方法，它包括以下步驟
I)將純化過的SWNTs中加入溶劑A，分散后加熱回流攪拌使其反應(yīng)充分。反應(yīng)完畢后不斷使用溶液B洗滌并過濾。將經(jīng)過上述處理的SWNTs中加入溶劑C，超聲反應(yīng)，反應(yīng)完畢后 不斷使用溶液B洗滌并過濾，將SWNTs濾餅干燥，得到表面帶有羧基的SWNTs(SWNT-COOH)。2)將SWNT-C00H和縮合劑D加入氨化試劑E中，加熱回流攪拌充分反應(yīng)。使用有機(jī)溶劑F不斷洗滌并過濾反應(yīng)產(chǎn)物，將濾餅抽真空干燥，得到表面帶有氨基的SWNTs(SffNT-NH2)0或者將SWNT-C00H加入到混合液G中，加熱回流攪拌充分反應(yīng)。使用溶劑H洗滌多次并抽濾，加入氨化試劑E中充分?jǐn)嚢?，反?yīng)完成后邊抽濾邊用有機(jī)溶劑F充分洗滌，將濾餅抽真空干燥?；蛘邔⒒旌弦篒加入到超純水中，超聲后加入SWNT-C00H到混合液中，繼續(xù)超聲，混合物PH值保持在5以下，防止水解。超聲結(jié)束后，用溶液B反復(fù)洗滌并過濾，將濾餅抽真空干燥。3)將上述的SWNT-NH2、氮丙啶和濃鹽酸在有機(jī)溶劑J中混合均勻，加熱回流攪拌充分反應(yīng)，經(jīng)有機(jī)溶劑J洗滌并過濾后，真空干燥，得到表面接枝形成聚乙烯亞胺的SWNTs聚乙烯亞胺衍生物(SffNT-PEI)。上述步驟I中SWNTs為IOOmg ;溶劑A、B均為IOOml ;加熱回流攪拌條件為400r/min，90-110°C，時(shí)間為2_3h ;超聲條件為80_100KHz，30_50°C，時(shí)間為O. 5_lh ;洗滌過濾條件為最后一次的濾液PH值呈中性，濾膜孔徑為O. I μ m。上述步驟I中溶劑A為稀硝酸；上述步驟I中溶劑B為超純水；上述步驟I中溶劑C為稀鹽酸。上述步驟2中SWNT-C00H為50mg ;縮合劑D為2g ;氨化試劑E為20ml ;加熱攪拌條件為400r/min, 110_120°C，時(shí)間為24_48h ;混合溶液G為20ml ;混合物I中EDC為2nm,NHS為5nm ;洗滌過濾條件為有機(jī)溶劑F或有機(jī)溶劑H洗滌15-20次，濾膜孔徑為O. I μ m ;真空干燥的條件是在40-60°C真空干燥24-48h。上述步驟2中有縮合劑D為二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。上述步驟2中氨化試劑E為乙二胺、1，3-丙二胺、1，6_己二胺中的一種。上述步驟2中有機(jī)溶劑F為無水乙醇。上述步驟2中混合液G為氯化亞砜(SOCl2)與N'-N' 二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液。上述步驟2中有機(jī)溶劑H為無水四氫呋喃(THF)。
上述步驟2中混合液I為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)。上述步驟3中SWNT-NH2為40mg ;氮丙啶為O. 5ml ;濃鹽酸為10-20 μ I ;有機(jī)溶劑J為20ml ;加熱回流攪拌條件為400r/min，30-40°C或60-70°C，時(shí)間為24_72h ;洗滌過濾條件為有機(jī)溶劑J洗滌15-20次，濾膜孔徑為O. I μ m ;真空干燥的條件是在40-60°C真空干燥24-48h。上述步驟3中有機(jī)溶劑J為二氯乙烯或二氯甲烷。本發(fā)明的第三個(gè)目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
單壁碳納米管-聚乙烯亞胺作為藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用，分為以下幾個(gè)步驟I)將制得的單壁碳納米管-聚乙烯亞胺聚合物和抗腫瘤藥物A通過方式B進(jìn)行結(jié)合。
2)將裝載藥物的單壁碳納米管-聚乙烯亞胺聚合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞C和體內(nèi)的抗腫瘤D的評價(jià)。上述步驟I中的抗腫瘤藥物A為難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物，如多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類藥物中的一種或幾種。上述步驟I中的方式B為超聲、攪拌、渦旋、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的一種或幾種。上述步驟2中的腫瘤細(xì)胞C為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2中的腫瘤D為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。本發(fā)明的第四個(gè)通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)聯(lián)合熱療在腫瘤治療中的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩部分
I)將制得的單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)溶于溶液A中，加入到癌細(xì)胞B中進(jìn)行培養(yǎng)，給藥后6h后用光源C照射lmin，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，測定癌細(xì)胞B的存活率。2)將制得的單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)溶于D中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠E體內(nèi)，每次給藥后用光源C照射腫瘤部位lmin，測量荷瘤小鼠E的腫瘤體積大小。上述步驟I中的溶液A為超純水、5%葡萄糖溶液、生理鹽水或緩沖液(RNasefree)。上述步驟I中的癌細(xì)胞B為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟I中的光源C為808nm或980nm波長的近紅外激光中的一種。上述步驟2中的溶液D為超純水、5%葡萄糖溶液、生理鹽水或緩沖液(RNasefree)。上述步驟2中的荷瘤小鼠E為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2中的光源C為808nm或980nm波長的近紅外激光中的一種。 本發(fā)明中的單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)可以更多的分布在腫瘤組織中，與正常組織相比，它可以長期的高濃度的保留在腫瘤組織中，這樣當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄问褂媒t外光源進(jìn)行照射時(shí)能夠在腫瘤組織中產(chǎn)生更多的抗腫瘤活性，并且可以使其裝載的藥物在腫瘤部位濃度提高，但此給藥系統(tǒng)也會(huì)分布在正常的組織器官中，為了避免對正常組織產(chǎn)生損傷，可以通過一些手段來加以改善，比如可以在單壁碳納米管-聚乙烯亞胺藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)上裝載一些具有靶向性質(zhì)的靶頭，也可以使用抗體等手段介導(dǎo)，可以使用臨床手段比如說內(nèi)窺鏡的方式來直接輸送載藥系統(tǒng)到達(dá)靶組織，聚焦光照面積等方式。本發(fā)明作為藥物載體制備治療腫瘤的藥物，經(jīng)過多次試驗(yàn)，均取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下
實(shí)驗(yàn)I
本發(fā)明作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。取本發(fā)明水溶性碳納米管4mg,加入2ml的超純水，IOOKHz超聲2h,4000rpm離心15min,離心3次。加入2mg阿霉素，繼續(xù)超聲2h，使用超濾系統(tǒng)過濾去除未結(jié)合上的阿霉素，將濾膜上的部分重懸，即得單壁碳納米管-聚乙烯亞胺/阿霉素(SWNT-PEI/D0X)載體系統(tǒng)。紫外分光光度計(jì)測定本發(fā)明水溶性碳納米管為載體包封的阿霉素的含量，載藥量為
I.9 mg/ml。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性碳納米管可以有效承載阿霉素，并對阿霉素產(chǎn)生了一定的緩釋作用，可以作為阿霉素的載體使用。實(shí)驗(yàn)2
本發(fā)明水溶性碳納米管作為基因藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。取本發(fā)明水溶性碳納米管4mg，加入2ml的5%葡萄糖溶液(RNase free), IOOKHz超聲2h, 4000rpm離心15min,離心3次。加入siRNA,使SWNTs與siRNA的質(zhì)量比達(dá)到5:1,即構(gòu)建成水溶性單壁碳納米管-聚乙烯亞胺/siRNA (SWNT/siRNA)載體系統(tǒng)。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性碳納米管可以有效吸附siRNA，并對其產(chǎn)生一定程度的保護(hù)，可以作為siRNA的載體使用。實(shí)驗(yàn)3
水溶性單壁碳納米管-聚乙烯亞胺/siRNA (SWNT-PEI/siRNA)給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)2中的水溶性SWNT-PEI/siRNA給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性，將PC_3人前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2,每2 3天傳代一次。收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ 1，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至5 X IO3個(gè)/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細(xì)胞匯合度為50%，加入的實(shí)驗(yàn)2中的SWNT/siRNA載體系統(tǒng)(siRNA濃度為150nM)，不加入實(shí)驗(yàn)2中的SWNT/siRNA為對照組，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。激光組放置在808nm近紅外激光(I. 2-1. 5W)條件下lmin，激光照射結(jié)束后將細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h、48h和72h，對于不光照組而言，則直接將細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h、48h和72h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 μ 1，4 °C放置lh。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150μ1 I Ommo I/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測定每孔的OD值。抑制率的計(jì)算公式抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對照組均為扣除空白對照組后的值。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性碳納米管作為藥物載體時(shí)能裝載藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結(jié)合激光熱療后，能夠更明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)4
實(shí)驗(yàn)2中的水溶性單壁碳納米管-聚乙烯亞胺/siRNA (SWNT-PEI/siRNA)給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)2中的SWNT-PEI/siRNA給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，取PC_3人前列腺瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO7個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，皮下接種與BALB/c裸鼠(雄性，4 6W，18 22g)右前肢上部。小鼠接種腫瘤7天后，取其中24只腫瘤體積>60mm3裸鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下(I)對照組(NS組)生理鹽水；(2)SffNT-PEI 組；(3) SWNT-PEI/siRNA 組；(4) SWNT-PEI/siRNA 激光治療組。siRNA 的給藥劑量為lmg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中激光照射照組使用的光源為808nm綠相光源，功率為I. 2-1. 5W，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為lmin。每3d給藥一次，共給藥6次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱其體重并使用游標(biāo)卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥實(shí)驗(yàn)2的水溶性單壁碳納米管-聚乙烯亞胺/siRNA載體系統(tǒng)時(shí)，裸鼠的腫瘤體積的增加與空白組相比得到了明顯的抑制。合并激光照射后，裸鼠腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還采用其他近紅外源以及抗腫瘤藥物做了類似的實(shí)驗(yàn)，均取得了相同和相類似的結(jié)果，本發(fā)明分組科學(xué)，方法穩(wěn)定可靠，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再一一列舉。本發(fā)明提供了一種水溶性單壁碳納米管及其制備方法，以及其作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體且聯(lián)合近紅外激光熱療的應(yīng)用。本發(fā)明的水溶性單壁碳納米管對碳納米管本身的結(jié)構(gòu)特性沒有破壞，測試結(jié)果表明，本發(fā)明中的單壁碳納米管水溶性衍生物，水分散性強(qiáng)，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。本發(fā)明提供的水溶性單壁碳納米管可以作為一種良好的抗腫瘤藥物或基因的載體，本身有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高等優(yōu)點(diǎn)。測試結(jié)果表明，本發(fā)明提供的水溶性單壁碳納米管作為抗腫瘤藥物或基因的載體時(shí)，粒徑均勻，能夠提高水不溶性抗腫瘤藥物的水溶性，能夠起到一定的緩釋作用，而且還能夠更多的到達(dá)腫瘤組織中。本發(fā)明提供的水溶性單壁碳納米管結(jié)合近紅外激光熱療還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性，測試表明無論是體外還是體內(nèi)在熱療的情況下都可以很好的抑制腫瘤細(xì)胞以及相關(guān)組織的發(fā)生和發(fā)展。預(yù)期可以用于治療腫瘤的一種良好的熱療增敏劑，還可以作為化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)、核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，是藥物制備上的一大創(chuàng)新。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益技術(shù)效果
I)本發(fā)明中的水溶性單壁碳納米管對碳納米管本身的特性無破壞，水分散性強(qiáng)，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。2)本發(fā)明提供的水溶性單壁碳納米管可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大,化學(xué)惰性高,具有緩釋性。3)本發(fā)明提供的水溶性單壁碳納米管結(jié)合熱療還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性，近紅外激光照射時(shí)能夠發(fā)揮抗腫瘤的活性，而不光照時(shí)則副作用很小，可以根據(jù)激光的聚焦等手段來選擇性的殺傷腫瘤組織和細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種水溶性碳納米管，其特征在于，在碳納米管分子上通過化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚乙烯亞胺，所述的碳納米管和聚乙烯亞胺的質(zhì)量含量比為I :0. 085-0. 125 ;所述的碳納米管為單壁碳納米管。
2.權(quán)利要求I所述的水溶性碳納米管的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將碳納米管通過酸處理，得表面帶有羧基的碳納米管； (2)將表面帶有羧基的碳納米管與氨化試劑反應(yīng)，得表面帶有氨基的碳納米管； (3)將表面帶有氨基的碳納米管與氮丙啶反應(yīng)，在氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終形成聚乙烯亞胺碳納米管，即水溶性碳納米管。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性碳納米管的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管； (2)將50mg表面帶有羧基的碳納米管和2mg二環(huán)己基碳二亞胺加入到20ml乙二胺中，120°C加熱,AQOr/min攪拌回流48h,充分反應(yīng),使用無水乙醇不斷洗漆，過濾得濾餅，將濾餅在40°C下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管； (3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ L體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性碳納米管的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管； (2)將50mg表面帶有羧基的碳納米管加入到20ml的氯化亞砜和N'-N'二甲基甲酰胺的混合溶液，所述的氯化亞砜和N'-N' 二甲基甲酰胺的體積比為19 :1，加熱回流攪拌，充分反應(yīng)，用無水四氫呋喃洗滌后，抽濾，加入過量乙二胺充分?jǐn)嚢韬?，邊抽濾邊用無水乙醇洗滌20次得濾餅，將濾餅在40°C條件下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管； (3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性碳納米管的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將IOOmg碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸,超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管； (2)將2nM的I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和5nM的N-羥基丁二酰亞胺加入到50ml超純水中，超聲15min后,加入50mg表面帶有羧基的碳納米管,繼續(xù)超聲30min，所述的混合物pH值保持在5以下，超聲結(jié)束后，用超純水反復(fù)洗滌，過濾得濾餅，將濾餅抽真空干燥； (3)將40mg表面帶有氨基的碳納米管、O. 5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，40°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性碳納米管的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)將IOOmg的碳納米管中加入IOOmL濃度為4mol/L的稀硝酸，分散后110°C加熱，400r/min攪拌回流2h，使其反應(yīng)充分，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌并使用O. I μ m的微孔濾膜過濾后，加入IOOmL濃度為lmol/L的稀鹽酸，超聲反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后不斷用超純水洗滌，過濾得碳納米管濾餅，將碳納米管濾餅干燥，得到表面帶有羧基的碳納米管； (2)將50mg的表面帶有羧基的碳納米管和2mg二環(huán)己基碳二亞胺加入到20ml乙二胺中，120°C加熱，400r/min攪拌回流48h,充分反應(yīng),使用無水乙醇不斷洗漆,過濾得濾餅,將濾餅在40°C下抽真空干燥，得到表面帶有氨基的碳納米管； (3)將40mg的表面帶有氨基的碳納米管、O.5ml氮丙啶和10 μ I體積濃度為37-38%的濃鹽酸在20ml 二氯甲烷中混合均勻，70°C加熱，400r/min攪拌回流48h，充分反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷洗滌20次后過濾，40°C下抽真空干燥，得到聚乙烯亞胺胺碳納米管，即水溶性碳納米管。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水溶性碳納米管，其特征在于，所述的水溶性碳納米管粒徑為 180_210nm。
8.權(quán)利要求I所述的水溶性碳納米管與抗腫瘤藥物結(jié)合作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物的多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類藥物的一種或幾種；所述的結(jié)合為超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明的涉及一種水溶性碳納米管及其制備應(yīng)用方法，可有效解決現(xiàn)有碳納米管具有高度疏水表面，不溶于水及有機(jī)溶劑的問題。解決的技術(shù)方案為在碳納米管分子上通過化學(xué)鍵連接有水溶性聚合物聚乙烯亞胺，碳納米管和聚乙烯亞胺的質(zhì)量含量比為10.085-0.125；其制備方法為將碳納米管通過酸處理，得表面帶有羧基的碳納米管，再與氨化試劑反應(yīng)，得表面帶有氨基的碳納米管，再與氮丙啶反應(yīng)，在氫離子的存在下，氮丙啶不斷的在氨基上進(jìn)行接枝，最終形成聚乙烯亞胺碳納米管，即水溶性碳納米管。本發(fā)明制備的水溶性碳納米管對碳納米管本身的結(jié)構(gòu)特性沒有破壞，水分散性強(qiáng)，毒性低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。
文檔編號C01B31/02GK102701186SQ201210221300
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月30日
發(fā)明者史進(jìn)進(jìn), 張振中, 張紅嶺, 李璐璐, 王蕾, 高巖 申請人:鄭州大學(xué)