使用磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定方法和該測(cè)定方法用試劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法的特征在于，使用磁性二氧化硅顆粒來(lái)測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，在所述磁性二氧化硅顆粒中，在含有60重量%～95重量%的平均粒徑為1nm～15nm的超順磁性金屬氧化物的二氧化硅顆粒的表面，固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定方法和該測(cè)定方法用試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法和該方法中所用的試劑。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及在輔助診斷、輔助確認(rèn)治療效果、確認(rèn)蛋白質(zhì)精制時(shí)和細(xì)胞分離時(shí)的精制度等中應(yīng)用的測(cè)定方法和試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]以外，作為對(duì)含有生物物質(zhì)的試樣、例如生物樣品中的蛋白質(zhì)等進(jìn)行測(cè)定或精制的方法，已知有下述方法:為了使生物樣品中的蛋白質(zhì)等結(jié)合在蛋白質(zhì)所能夠結(jié)合的顆粒表面、并除去生物樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)等以外的雜質(zhì)，對(duì)顆粒進(jìn)行清洗，回收結(jié)合了蛋白質(zhì)等的顆粒，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合量進(jìn)行測(cè)定；或使其在蛋白質(zhì)解離溶液中解離來(lái)進(jìn)行精制。
[0003]此外，由于利用磁力能夠容易地進(jìn)行分離、回收，因而使用了具有磁性的顆粒，例如在專(zhuān)利文獻(xiàn)I中記載了一種磁性二氧化硅顆粒，其是通過(guò)在由氧化鐵構(gòu)成的芯顆粒表面形成二氧化硅覆膜而成的。但是，該磁性顆粒的磁性體為強(qiáng)磁性，即使消除回收時(shí)的磁場(chǎng)，由于強(qiáng)磁性的作用，磁性體本身也會(huì)顯示出一過(guò)性磁場(chǎng)，顆粒彼此發(fā)生自體締合，因此存在清洗性差和/或會(huì)對(duì)接下來(lái)的操作(例如免疫反應(yīng))帶來(lái)不良影響的問(wèn)題。
[0004]進(jìn)一步地，出于解決強(qiáng)磁性所致的磁性體自身的自體締合的目的，例如在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了磁性體使用超順磁性的磁性體的磁性二氧化硅顆粒。但是，對(duì)于該磁性顆粒來(lái)說(shuō)，在粒徑小的情況下，磁性體的含量低，利用磁力對(duì)顆粒進(jìn)行回收時(shí)要花費(fèi)時(shí)間；在粒徑大的情況下，由于比表面積小，因而存在所結(jié)合的蛋白質(zhì)等的量少的問(wèn)題。
[0005]【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】
[0006]【專(zhuān)利文獻(xiàn)】
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2000-256388號(hào)公報(bào)
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2000-40608號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]【發(fā)明所要解決的課題】
[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種使用磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法以及該測(cè)定法用試劑，該磁性二氧化硅顆粒在負(fù)載測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)時(shí)的結(jié)合性優(yōu)異，并且基于磁力的回收性和除去磁力的狀態(tài)下的分散性優(yōu)異，即使進(jìn)行短時(shí)間的清洗工序，在免疫測(cè)定中也能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度。
[0011]【解決課題的手段】
[0012]本發(fā)明人為了達(dá)成上述目的進(jìn)行了深入研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及一種測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于，使用磁性二氧化硅顆粒來(lái)測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì),在所述磁性二氧化硅顆粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒徑為Inm~15nm的超順磁性金屬氧化物的二氧化硅顆粒的表面，固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)；以及涉及上述測(cè)定方法用的試劑，其特征在于，該試劑含有磁性二氧化硅顆粒，該磁性二氧化硅顆粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒徑為Inm~15nm的超順磁性金屬氧化物的二氧化硅顆粒的表面上，固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
[0013]【發(fā)明的效果】
[0014]在本發(fā)明的測(cè)定方法和試劑中，通過(guò)使用磁力回收磁性二氧化硅顆粒能夠進(jìn)行簡(jiǎn)便的B/F分離。此外，由于磁性二氧化硅顆粒含有超順磁性金屬氧化物，因而該磁氣特性使磁選后的顆粒的再分散性優(yōu)異，其結(jié)果，能夠在短時(shí)間內(nèi)高靈敏度地進(jìn)行測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定(檢測(cè))。
【具體實(shí)施方式】
[0015]作為本發(fā)明中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，只要為通常在該領(lǐng)域中進(jìn)行測(cè)定的對(duì)象物質(zhì)就沒(méi)有特別限定，例如可以舉出血清、血液、血漿、尿等生物體體液、淋巴液、血球、各種細(xì)胞類(lèi)等生物體來(lái)源的試樣中所含有的蛋白質(zhì)、脂蛋白、核酸、免疫球蛋白、凝血相關(guān)因子、抗體、酶、激素、癌標(biāo)志物、心臟疾病標(biāo)志物和各種藥物等作為代表性的對(duì)象物質(zhì)。更具體地說(shuō)，可以舉出:例如白蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、蛋白A、C反應(yīng)性蛋白(CRP)等蛋白質(zhì)；例如高比重脂蛋白(HDL)、低比重脂蛋白(LDL)、超低比重脂蛋白等脂蛋白；例如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等核酸；例如堿性磷酸酶、淀粉酶、酸性磷酸酶、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(Y-GTP)、脂肪酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)移酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(GPT)、腎素、蛋白激酶(PK)、酪氨酸激酶等酶；例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白(或它們的例如Fe部、Fab部、F(ab)2部等片段)；例如纖維蛋白原、纖維蛋白分解產(chǎn)物(FDP)、凝血酶原、凝血酶等凝血相關(guān)因子；例如抗鏈球菌素O抗體、抗人B型肝炎病毒表面抗原抗體(HBs抗原)、抗人C型肝炎病毒抗體、抗風(fēng)濕因子等抗體；例如甲狀腺刺激激素(TSH)、甲狀腺激素(FT3、FT4、T3、T4)、副甲狀腺激素(PTH)、人絨毛膜性腺激素(hCG)、雌二醇(E2)等激素；例如α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA19-9、前列腺特異抗原(PSA)等癌標(biāo)志物；例如肌鈣蛋白T(TnT)、人腦利尿鈉肽前體N端片段(NT-proBNP)等心臟疾病標(biāo)志物；例如抗癲癇藥、抗生素、茶堿等藥物；等等。上述物質(zhì)中，優(yōu)選抗體、激素、癌標(biāo)志物、心臟疾病標(biāo)志物等。
[0016]對(duì)于本發(fā)明中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)(模擬物)，只要為能夠與下述鍵合部位結(jié)合的物質(zhì)，即可為任意物質(zhì)，該鍵合部位為與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))所具有的、與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的鍵合部位；換言之，只要具有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)所具有的與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的鍵合部位即可；進(jìn)而換言之，只要為在測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)時(shí)若共存則能與該反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，則可為任意物質(zhì)。
[0017]本發(fā)明中，作為與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))，可以舉出例如通過(guò)“抗原“ 抗體”間反應(yīng)、“糖鏈“蛋白質(zhì)”間反應(yīng)、“糖鏈“凝聚素”間反應(yīng)、“酶“抑制劑”間反應(yīng)、“蛋白質(zhì)“肽鏈”間反應(yīng)、“染色體或核苷酸鏈“核苷酸鏈”間反應(yīng)或者“核苷酸鏈“蛋白質(zhì)”間反應(yīng)等相互反應(yīng)而與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)等，在上述各組合中，在任意一方為測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的情況下，另一方為該測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)。例如，在測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)為“抗原”時(shí)，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)為“抗體”;在測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)為“抗體”時(shí)，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)為“抗原”(下文中在其它上述各組合中也是同樣的)。
[0018]具體地說(shuō)，可以舉出例如:核苷酸鏈(低聚核苷酸鏈、多核苷酸鏈)；染色體；肽鏈(例如C-肽、血管緊張素I等)；蛋白質(zhì)〔例如前降鈣素、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E (IgE)、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白M (IgM)、免疫球蛋白D (IgD)、β 2-微球蛋白、白蛋白、它們的分解產(chǎn)物、鐵蛋白等血清蛋白〕；酶〔例如淀粉酶(例如胰型、唾液腺型、X型等)、堿性磷酸酶(例如肝性、骨性、胎盤(pán)性、小腸性等)、酸性磷酸酶(例如PAP等)、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(例如腎性、胰性、肝性等)、脂肪酶(例如胰型、胃型等)、肌酸激酶(例如CK-1、CK-2、mCK等)、乳酸脫氫酶(例如LDHl?LDH5等)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)移酶(例如ASTm、ASTs等)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)移酶(例如ALTnuALTs等)、膽堿酯酶(例如ChEl?ChE5等)、亮氨酸氨基肽酶(例如C-LAP、AA、CAP等)、腎素、蛋白激酶、酪氨酸激酶等〕和這些酶的抑制劑；激素(例如PTH、TSH、胰島素、LH、FSH、催乳素等)；受體(例如針對(duì)雌激素、TSH等的受體)；配體(例如雌激素、TSH等)；例如細(xì)菌(例如結(jié)核菌、肺炎球菌、白喉菌、腦膜炎雙球菌、淋菌、葡萄球菌、鏈球菌、腸內(nèi)細(xì)菌、大腸菌、幽門(mén)螺桿菌等)、病毒(例如風(fēng)疹病毒、皰疫病毒、肝炎病毒、ATL病毒、AIDS病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、EB病毒、HAV、HBV、HCV、HIV、HTLV等)、真菌(例如念珠菌、隱球菌等)、螺旋體(例如鉤端螺旋體、梅毒螺旋體等)、衣原體、支原體等微生物；來(lái)自該微生物的蛋白質(zhì)或肽或糖鏈抗原；作為支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng)性皮膚炎等的過(guò)敏原因的各種過(guò)敏原(例如來(lái)自下述物質(zhì)的過(guò)敏原等:屋塵；例如美洲塵螨(2 f t 3々f 二)、歐洲塵螨(\ > t 3々F、等螨類(lèi)；例如杉、柏、雀稗、豚草、貓尾草、黃花茅、黑麥等花粉；例如貓、狗、蟹等動(dòng)物；例如米、蛋白等食物；真菌、昆蟲(chóng)、木材、藥齊U、化學(xué)物質(zhì)等)；脂質(zhì)(例如脂蛋白等)；蛋白酶(例如胰島素、纖維蛋白溶酶、絲氨酸蛋白酶等)；腫瘤標(biāo)志物蛋白抗原(例如PSA、PG1、PGII等);糖鏈抗原〔例如AFP(例如LI至L3等)、hCG(hCG家族)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG、甲狀腺球蛋白、粗衰變因子(DAF)、癌胚抗原(例如CEA、NCA、NCA-2、NFA等)、CA 19-9, PIVKA-1 I,CA125、前列腺特異抗原、癌細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊糖鏈的腫瘤標(biāo)志物糖鏈抗原、ABO糖鏈抗原等〕；糖鏈(例如透明質(zhì)酸、葡聚糖、上述糖鏈抗原等所具有的糖鏈等)；與糖鏈結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白、β葡聚糖結(jié)合蛋白等)；磷脂質(zhì)(例如心磷脂等)；脂多糖(例如內(nèi)毒素等)；化學(xué)物質(zhì)(例如Τ3、Τ4、例如三丁基錫、壬基苯酚、4-辛基苯酚、鄰苯二甲酸二正丁酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯、二苯甲酮、八氯苯乙烯、鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯等環(huán)境激素)；施用.接種至人體的各種藥劑和它們的代謝物；適體；核酸結(jié)合性物質(zhì)；以及針對(duì)它們的抗體等。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中使用的抗體也包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶、或通過(guò)化學(xué)分解而產(chǎn)生的Fab、F(ab’)2片段等分解產(chǎn)物。
[0019]作為如上所述的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)，優(yōu)選通過(guò)“抗原“抗體”間反應(yīng)或“糖鏈-蛋白質(zhì)”間反應(yīng)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合。具體地說(shuō)，優(yōu)選為針對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的抗體、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)所結(jié)合的抗原、或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選為針對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的抗體、或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0020]對(duì)于本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒而言，在二氧化硅基體中分散有平均粒徑為Inm?15nm且具有超順磁性的金屬氧化物。[0021]本發(fā)明中的超順磁性金屬氧化物的平均粒徑是利用掃描型電子顯微鏡對(duì)任意200個(gè)超順磁性金屬氧化物進(jìn)行觀察而測(cè)定出的粒徑的平均值。
[0022]超順磁性金屬氧化物的平均粒徑可通過(guò)對(duì)后述超順磁性金屬氧化物制作時(shí)的金屬離子濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)來(lái)控制。并且，利用通常的分級(jí)等方法也可使超順磁性金屬氧化物的平均粒徑為所期望的值。
[0023]超順磁性是指，在外部磁場(chǎng)的存在下物質(zhì)的各原子磁矩排列而被誘發(fā)出的一過(guò)性磁場(chǎng)；若去除外部磁場(chǎng)，則部分排列受損，表示不出磁場(chǎng)。
[0024]作為平均粒徑為Inm?15nm且示出超順磁性的超順磁性金屬氧化物，可以舉出鐵、鈷、鎳和它們的合金等的氧化物，出于對(duì)磁場(chǎng)的感應(yīng)性優(yōu)異的原因，特別優(yōu)選氧化鐵。超順磁性金屬氧化物可以單獨(dú)使用I種，也可以合用2種以上。
[0025]在平均粒徑小于Inm的情況下，難以進(jìn)行合成；在平均粒徑超過(guò)15nm的情況下，所得到的磁性二氧化硅顆粒的磁氣特性為強(qiáng)磁性，在實(shí)際用途方面，即使去除磁場(chǎng)，磁性體本身也顯示出一過(guò)性磁場(chǎng)，顆粒彼此發(fā)生自體締合，存在清洗性差和/或?qū)γ庖叻磻?yīng)等帶來(lái)不良影響的問(wèn)題。
[0026]作為氧化鐵，可以使用公知的各種氧化鐵。氧化鐵中，出于化學(xué)穩(wěn)定性特別優(yōu)異的原因，優(yōu)選磁鐵礦、Y-紅鐵礦、磁鐵礦-α-紅鐵礦中間體氧化鐵(中間酸化鉄)和Y-紅鐵礦-α -紅鐵礦中間體氧化鐵；出于具有較大的飽和磁化度、對(duì)外部磁場(chǎng)的感應(yīng)性優(yōu)異的原因，更優(yōu)選磁鐵礦。
[0027]磁性二氧化硅顆粒中，超順磁性金屬氧化物的含量下限通常為60重量％、優(yōu)選為65重量％，上限通常為95重量％、優(yōu)選為80重量％。超順磁性金屬氧化物的含量小于60重量％的情況下，所得到的磁性二氧化硅顆粒的磁性不充分，因而在實(shí)際用途方面，在分離操作中需要花費(fèi)時(shí)間；若該含量超過(guò)95重量％，則難以合成。
[0028]超順磁性金屬氧化物的制造方法沒(méi)有特別限定，可以通過(guò)以Massart所報(bào)告的方法為基礎(chǔ)的使用水溶性鐵鹽和氨的共沉淀法(R.Massart，IEEE Trans.Magn.1981，17，1247)、或者通過(guò)使用水溶性鐵鹽在水溶液中的氧化反應(yīng)的方法進(jìn)行合成。
[0029]磁性二氧化娃顆粒的平均粒徑優(yōu)選為I μ m?5 μ m、進(jìn)一步優(yōu)選為I?3 μ m。平均粒徑小于Iym的情況下，具有分離回收時(shí)需要花費(fèi)時(shí)間的傾向；若超過(guò)5 μ m，則表面積減小，具有所負(fù)載的物質(zhì)(對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì))的結(jié)合量低、結(jié)合效率降低的傾向。
[0030]本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒的平均粒徑為利用掃描型電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社制造的“JSM-7000F”)對(duì)任意200個(gè)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行觀察而測(cè)定出的粒徑的平均值。
[0031]對(duì)于磁性二氧化硅顆粒的平均粒徑，可通過(guò)調(diào)節(jié)后述的水包油型乳液制作時(shí)的混合條件(剪切力等)來(lái)調(diào)整水包油型乳液的粒徑，由此來(lái)進(jìn)行控制。此外，也可通過(guò)在磁性二氧化硅顆粒的制造時(shí)變更水洗工序的條件或通過(guò)通常的分級(jí)等方法使平均粒徑為所期望的值。
[0032]作為本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒的制造方法，可以舉出例如下述方法:將分散液(Al)或分散液(A2)與溶液(B)混合，制作水包油型乳液，進(jìn)行(烷基)烷氧基硅烷的水解反應(yīng)和縮合反應(yīng)，制造得到在二氧化硅中包含超順磁性金屬氧化物的顆粒；其中，所述分散液(Al)含有平均粒徑為Inm?15nm的超順磁性金屬氧化物顆粒、相對(duì)于上述超順磁性金屬氧化物顆粒100重量％為30重量％?500重量％的(烷基)烷氧基硅烷和分散劑，所述分散液(A2)在分散液(Al)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步含有非水溶性有機(jī)溶劑；所述溶液(B)含有水、水溶性有機(jī)溶劑、非離子型表面活性劑和(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化劑。
[0033]在(烷基)烷氧基硅烷的水解反應(yīng)和縮合反應(yīng)后，利用離心分離和磁石進(jìn)行固液分離，利用水或甲醇進(jìn)行清洗、并進(jìn)行干燥，從而得到磁性二氧化硅顆粒。
[0034]在上文和下文中，(燒基)燒氧基娃燒意味著燒基燒氧基娃燒或燒氧基娃燒。
[0035]作為上述分散劑，可以舉出在分子內(nèi)具有I個(gè)以上羧基的有機(jī)化合物、具有I個(gè)以上磺基的有機(jī)化合物以及具有I個(gè)以上羧基和I個(gè)以上磺基的有機(jī)化合物等。具體地說(shuō)，可以舉出以下示例出的(a-Ι)?(a-5)的有機(jī)化合物等，它們可以單獨(dú)使用I種，也可以將2種以上合用。
[0036](a-1)具有2個(gè)以上羧基的有機(jī)化合物:
[0037]碳原子數(shù)為2?30的脂肪族多元羧酸(草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、丙烷-1，2，3-三羧酸、檸檬酸和十二烷二酸等飽和多元羧酸以及馬來(lái)酸、富馬酸和衣康酸等不飽和多元羧酸等)、碳原子數(shù)為8?30的芳香族多元羧酸(鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對(duì)苯二甲酸、偏苯三酸和苯均四酸等)和碳原子數(shù)為5?30的脂環(huán)式多元羧酸(環(huán)丁烯-1，2- 二羧酸、環(huán)戊烯-1，2- 二羧酸、呋喃-2，3- 二羧酸、雙環(huán)[2，2, I]七-2-烯-2，3- 二羧酸和雙環(huán)[2，2, I]七-2，5- 二烯-2，3- 二羧酸等)等。
[0038](a-2)具有2個(gè)以上磺基的有機(jī)化合物:
[0039]碳原子數(shù)為I?30的脂肪族聚磺酸(甲二磺酸、1，1-乙二磺酸、1，2-乙二磺酸、1，1-丙二磺酸、1，3-丙二磺酸和聚乙烯基磺酸等)、碳原子數(shù)為6?30的芳香族多磺酸(間苯二磺酸、1，4-萘磺酸、I, 5-萘二磺酸、I, 6-萘二磺酸、2，6-萘二磺酸、2，7-萘二磺酸和磺化聚苯乙烯等)、雙(氟磺?；?酰亞胺和碳原子數(shù)為2?10的雙(全氟鏈烷烴磺?；?酰亞胺[雙(三氟甲烷磺酰基)酰亞胺、雙(五氟乙烷磺酰基)酰亞胺、雙(九氟丁烷磺?；?酰亞胺、五氟乙烷磺酰基三氟甲烷磺酰亞胺、三氟甲烷磺?；叻榛酋啺?、九氟丁烷磺?；淄榛酋啺返萞等。
[0040](a-3)分別具有I個(gè)以上的羧基與磺基的有機(jī)化合物:
[0041]碳原子數(shù)為2?30的磺基羧酸(磺基乙酸和磺化琥珀酸等)和碳原子數(shù)為7?30的磺基芳香族單羧酸或多元羧酸(鄰、間或?qū)腔郊姿帷?，4-二磺基苯甲酸、3-磺基鄰苯二甲酸、3，5-二磺基鄰苯二甲酸、4-磺基間苯二甲酸、2-磺基對(duì)苯二甲酸、2-甲基-4-磺基苯甲酸、2-甲基-3，5- 二磺基苯甲酸、4-丙基-3-磺基苯甲酸、4-異丙基-3-磺基苯甲酸、2，4，6-三甲基-3-磺基苯甲酸、2-甲基-5-磺基對(duì)苯二甲酸、5-甲基-4-磺基間苯二甲酸、5-磺基水楊酸和3-氧-4-磺基苯甲酸等)等。
[0042](a-4)具有I個(gè)羧基的有機(jī)化合物:
[0043]碳原子數(shù)為I?30的脂肪族飽和單羧酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、月桂酸、十四酸、硬脂酸和山崳酸等)、碳原子數(shù)為3?30的脂肪族不飽和單羧酸(丙烯酸、甲基丙烯酸、油酸等)、碳原子數(shù)為3?30的羥基脂肪族單羧酸(乙醇酸、乳酸和酒石酸等)、碳原子數(shù)為4?30的脂環(huán)式單羧酸(環(huán)丙烷羧酸、環(huán)戊烷羧酸和環(huán)己烷羧酸等)、碳原子數(shù)為7?30的芳香族單羧酸(苯甲酸、肉桂酸和萘甲酸等)、碳原子數(shù)為7~20的羥基芳香族單羧酸(水楊酸和苯乙醇酸等)和碳原子數(shù)為2~20的全氟羧酸(三氟乙酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、全氟辛酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸和十九氟癸酸等)等。
[0044](a-5)具有I個(gè)磺基的有機(jī)化合物:
[0045]碳原子數(shù)為I~30的脂肪族單磺酸(甲基磺酸、乙烷磺酸、丙烷磺酸、丁烷磺酸、己烷磺酸、癸烷磺酸、十一烷磺酸和十二烷磺酸等)、碳原子數(shù)為6~30的芳香族單磺酸(苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、鄰甲苯磺酸、間甲苯磺酸、4-十二烷基苯磺酸、4-辛基苯磺酸和萘磺酸等)和碳原子數(shù)為I~20的全氟鏈烷烴磺酸(三氟甲基磺酸等)等。
[0046]它們之中，從與(烷基)烷氧基硅烷的相容性的方面出發(fā)，優(yōu)選(a_4)中的碳原子數(shù)為10~30的有機(jī)化合物。
[0047]對(duì)于分散劑的用量，以超順磁性金屬氧化物的重量為基準(zhǔn)優(yōu)選為100重量％~2000重量％、特別優(yōu)選為250重量％~1000重量％。分散劑小于100重量％的情況下，有超順磁性金屬氧化物不易分散在(烷基)烷氧基硅烷溶液中的傾向；若超過(guò)2000重量％，則在后述工序中向水溶液中進(jìn)行分散時(shí)，有不易形成乳液的傾向。
[0048]作為所使用的(烷基)烷氧基硅烷，可以舉出有下述通式(I)所表示的化合物。
[0049]R1i4^Si(OR2)n(I)
[0050]通式(I)中，R1和R2表示被氨基、羧基、羥基、巰基或環(huán)氧丙氧基取代或未被取代的碳原子數(shù)為I~10的I價(jià)烴基。
[0051]作為碳原子數(shù)為I~10的烴基，可以舉出:碳原子數(shù)為I~10的脂肪族烴基(甲基、乙基、正丙基或異丙基、正丁基或異丁基、正戊基或異戊基和乙烯基等)、碳原子數(shù)為6~10的芳香族烴基(苯基等)和碳原子數(shù)為7~10的芳香脂肪族基(芐基等)等。
[0052]通式(I)中的η表示I~4的整數(shù)。其中，在使用η為I的烷基烷氧基硅烷的情況下，需要與η為2~4的(烷基)烷氧基硅烷合用。從反應(yīng)后的顆粒強(qiáng)度和顆粒表面的硅烷醇基量的方面出發(fā)，優(yōu)選η為4。
[0053]作為通式⑴所表示的化合物的具體例，可以舉出:四甲氧基硅烷、四乙氧基硅燒、四異丙氧基硅烷和四丁氧基硅烷等烷氧基硅烷;甲基二甲氧基硅烷和甲基二乙氧基娃燒等烷基烷氧基硅烷；3_氛基丙基二甲氧基硅烷、3_氛基丙基二乙氧基硅烷、Ν_2(氛基乙基)3-氨基丙基三甲氧基硅烷和Ν-2 (氨基乙基)3-氨基丙基三乙氧基硅烷等具有被氨基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；7_羧基-庚基三乙氧基硅烷和5-羧基-戊基三乙氧基硅燒等具有被竣基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_羥基丙基二甲氧基硅烷和3_羥基丙基二乙氧基硅烷等具有被羥基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_疏基丙基二甲氧基硅烷和3-疏基丙基二乙氧基硅烷等具有被疏基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷；3_環(huán)氧丙氧基丙基二甲氧基硅烷和3_環(huán)氧丙氧基丙基二乙氧基硅烷等具有被環(huán)氧丙氧基取代的烷基的燒基烷氧基硅烷等。
[0054](烷基)烷氧基硅烷可以單獨(dú)使用一種，也可以合用2種以上。
[0055]相對(duì)于超順磁性金屬氧化物100重量％，(烷基)烷氧基硅烷的用量通常為30重量％~500重量％、優(yōu)選為40重量％~200重量％。(烷基)烷氧基硅烷小于30重量％的情況下，超順磁性金屬氧化物的表面不易被均勻被覆；若超過(guò)500重量％，則超順磁性金屬氧化物的含有率減小，基于磁力的回收時(shí)間變長(zhǎng)。[0056]相對(duì)于超順磁性金屬氧化物100重量％，水的用量?jī)?yōu)選為500重量％?3000重量％、特別優(yōu)選為800重量％?2000重量％。
[0057]作為非水溶性有機(jī)溶劑，可以舉出在25°C的水中的溶解度為0.1g/水IOOg以下的、碳原子數(shù)為6?16的芳香族烴溶劑(甲苯和二甲苯等)和碳原子數(shù)為5?16脂肪族烴溶劑(正庚烷、正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、癸烷和十氫化萘等)等。它們可以單獨(dú)使用一種，也可以合用2種以上。
[0058]相對(duì)于超順磁性金屬氧化物100重量％，非水溶性有機(jī)溶劑的用量?jī)?yōu)選為200重量％?1000重量％、特別優(yōu)選為250重量％?500重量％。有機(jī)溶劑的用量若小于200重量％，則有超順磁性金屬氧化物的分散性變差的傾向；若超過(guò)1000重量％，則有磁性二氧化硅顆粒的粒徑不均勻的傾向。
[0059]作為水溶性有機(jī)溶劑，可以舉出在25°C的水中的溶解度為IOOg/水IOOg以上的、碳原子數(shù)為I?3的醇(甲醇、乙醇和正丙醇或異丙醇等)、碳原子數(shù)為2?9的二醇(乙二醇和二甘醇等)、酰胺(N-甲基吡咯烷酮等)、酮(丙酮等)、環(huán)狀醚(四氫呋喃和四氫吡喃等)、內(nèi)酯(Y-丁內(nèi)酯等)、亞砜(二甲基亞砜等)和腈(乙腈等)等。
[0060]它們中，從磁性二氧化硅顆粒粒徑均勻性的方面出發(fā)，優(yōu)選碳原子數(shù)為I?4的醇。
[0061]水溶性有機(jī)溶劑可以單獨(dú)使用一種，也可以合用2種以上。
[0062]相對(duì)于水100重量％，水溶性有機(jī)溶劑的用量?jī)?yōu)選為100重量％?500重量％。
[0063]作為非離子型表面活性劑，可以舉出下述的非離子型表面活性劑:高級(jí)醇環(huán)氧烷(下文中簡(jiǎn)稱(chēng)為A0)加成物；碳原子數(shù)為8?24的高級(jí)醇(癸基醇、十二烷基醇、椰子油烷基醇、十八烷基醇和油烯基醇等)的環(huán)氧乙烷(下文中簡(jiǎn)稱(chēng)為E0) I摩爾?20摩爾和/或環(huán)氧丙烷(下文中簡(jiǎn)稱(chēng)為PO) I摩爾?20摩爾加成物(包括嵌段加成物和/或無(wú)規(guī)加成物。以下相同)、具有碳原子數(shù)為6?24的烷基的烷基苯酚的AO加成物；辛基或壬基苯酚的EOl摩爾?20摩爾和/或POl摩爾?20摩爾加成物、聚丙二醇EO加成物和聚乙二醇PO加成物；普朗尼克型表面活性劑等脂肪酸AO加成物；碳原子數(shù)為8?24的脂肪酸(癸烷酸、月桂酸、十四酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和椰子油脂肪酸等)的EOl摩爾?20摩爾和/或POl摩爾?20摩爾加成物等和多元醇型非離子型表面活性劑；碳原子數(shù)為3?36的2元?8元多元醇(甘油、三羥甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨糖醇酐等)的EO和/或PO加成物；上述多元醇的脂肪酸酯及其EO加成物[TWEEN(注冊(cè)商標(biāo))20和TWEEN(注冊(cè)商標(biāo))80等];烷基葡糖苷(N-辛基-β -D-麥芽糖苷、正十二?；崽呛驼粱?β -D-吡喃葡萄糖苷等)；砂糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺和它們的AO加成物(聚氧乙烯脂肪酸烷醇酰胺等)；等等。它們可以單獨(dú)使用一種，也可以合用2種以上。
[0064]相對(duì)于超順磁性金屬氧化物100重量％，非離子型表面活性劑的用量?jī)?yōu)選為100重量％?1000重量％、特別優(yōu)選為300重量％?500重量％。若小于100重量％或超過(guò)1000重量％，則乳液不穩(wěn)定，存在所生成的顆粒的粒度分布變寬的傾向。
[0065]相對(duì)于超順磁性金屬氧化物100重量％，含有非離子型表面活性劑的水溶液的用量?jī)?yōu)選為1000重量％?10000重量％、特別優(yōu)選為1500?4000重量％。若小于1000重量％或超過(guò)10000重量％，則乳液不穩(wěn)定，存在所生成的顆粒的粒度分布變寬的傾向。
[0066]作為(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化劑，可以使用路易斯酸或鹽酸等，具體地說(shuō)，可以使用鹽酸等無(wú)機(jī)酸、乙酸等有機(jī)酸、氨等無(wú)機(jī)堿化合物、乙醇胺等胺化合物。
[0067]相對(duì)于(烷基)烷氧基硅烷的重量，水解用催化劑的用量?jī)?yōu)選為0.01重量％?100重量％、特別優(yōu)選為0.2重量％?50重量％。
[0068]分散液(Al)或分散液(A2)與溶液⑶的混合方法沒(méi)有特別限定，可以使用后述的設(shè)備一次性混合，從磁性二氧化硅顆粒粒徑均勻性的方面出發(fā)，優(yōu)選一邊攪拌溶液(B)一邊滴加分散液(Al)或分散液(A2)的方法。
[0069]作為分散液(Al)或分散液(A2)與溶液⑶混合時(shí)的設(shè)備，只要為通常作為乳化機(jī)、分散機(jī)而市售的設(shè)備就沒(méi)有特別限定，可以舉出例如:均質(zhì)器(IKA社制造)、P0LYTR0N (Kinematica社制造)和TK自動(dòng)均相混合機(jī)(特殊機(jī)化工業(yè)社制造)等分批式乳化機(jī)；Ebara milder (甚原制作所社制造)、TK Filmix、TK管道均相混合機(jī)(特殊機(jī)化工業(yè)社制造)、膠體磨機(jī)(Shinko pantec 社制造)>CLEARMIX (M Technique 社制造)>Thrasher>Trigonal濕式微粉碎機(jī)(三井三池化工機(jī)社制造)、CAPITRON(々Y 卜口 > ) (Eurotec社制造)和精細(xì)流動(dòng)研磨機(jī)(太平洋機(jī)工社制造)等連續(xù)式乳化機(jī)；微射流機(jī)(Mizuho工業(yè)社制造)、Nanomaizer (Nanomaizer社制造)和APV GAULIN (Gaulin社制造)等高壓乳化機(jī)；膜乳化機(jī)(冷化工業(yè)社制造)等膜乳化機(jī)；Vibro Mixer (冷化工業(yè)社制造)等振動(dòng)式乳化機(jī)；超聲波均質(zhì)器(Branson社制造)等超聲波乳化機(jī)等,從粒徑均勻化的方面出發(fā),優(yōu)選APV GAULIN、均質(zhì)器、TK自動(dòng)均相混合機(jī)、Ebara milder、TKFilmix、TK管道均相混合機(jī)和 CLEARMIX。
[0070](烷基)烷氧基硅烷的水解反應(yīng)和縮合反應(yīng)的溫度優(yōu)選為25°C?100°C、進(jìn)一步優(yōu)選為45°C?60°C。此外，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5小時(shí)?5小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為I小時(shí)?2小時(shí)。
[0071]本發(fā)明的磁性二氧化硅顆粒中，由于超順磁性金屬氧化物包含在二氧化硅中、而并不存在于顆粒表面，因而可在其表面進(jìn)行許多測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)、或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的固定化。
[0072]作為在本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒上進(jìn)行測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(以下有時(shí)將它們統(tǒng)一簡(jiǎn)稱(chēng)為負(fù)載用物質(zhì))的固定化的方法，可以舉出使負(fù)載用物質(zhì)物理吸附至上述磁性二氧化硅顆粒的方法；從效率更為良好地對(duì)負(fù)載用物質(zhì)進(jìn)行固定化的方面考慮，優(yōu)選使選自由戊二醛、白蛋白、碳化二亞胺、鏈酶親和素、生物素和具有官能團(tuán)的烷基烷氧基硅烷組成的組中的至少一種有機(jī)化合物結(jié)合在磁性二氧化硅顆粒表面，藉由它們使負(fù)載用物質(zhì)固定于磁性二氧化硅顆粒。這些有機(jī)化合物中，從結(jié)合特定負(fù)載用物質(zhì)的方面考慮，更優(yōu)選具有官能團(tuán)的烷基烷氧基硅烷。
[0073]作為上述燒基燒氧基娃燒所具有的官能團(tuán)，可以舉出氣基、竣基、輕基、疏基和環(huán)氧丙氧基等，在I分子燒基燒氧基娃燒中也可以具有不同種類(lèi)的官能團(tuán)。
[0074]作為使具有官能團(tuán)的烷基烷氧基硅烷結(jié)合在磁性二氧化硅顆粒的表面的方法，可以舉出:使用上述的具有被氨基、羧基、羥基、巰基或環(huán)氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷作為制作磁性二氧化硅顆粒時(shí)的(烷基)烷氧基硅烷的方法；或者在使用不具有這些取代基的(烷基)烷氧基硅烷制作磁性二氧化硅顆粒后，利用具有被氨基、羧基、羥基、巰基或環(huán)氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷對(duì)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行處理的方法；等等。
[0075]作為后者方法的具體例，可以舉出下述方法:將磁性二氧化硅顆粒按照其濃度為I重量％?50重量％分散在溶劑中，向該分散液中添加具有被氨基、羧基、羥基、巰基或環(huán)氧丙氧基取代的燒基的燒基燒氧基娃燒的溶液，在室溫下進(jìn)行I小時(shí)以上的水解反應(yīng)和縮合反應(yīng)。
[0076]該方法中的溶劑可根據(jù)所使用的烷基烷氧基硅烷的溶解性進(jìn)行適宜選擇，在使用可溶于水的具有被氨基、羧基、羥基或巰基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情況下，優(yōu)選使用水或水-醇的混合溶劑等；在使用不易溶解于水的具有被環(huán)氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情況下，優(yōu)選使用乙酸丁酯等。
[0077]相對(duì)于處理前的磁性二氧化硅顆粒，具有被氨基、羧基、羥基、巰基或環(huán)氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的用量?jī)?yōu)選為0.1重量％?5重量％。若小于0.1重量％，則所導(dǎo)入的官能團(tuán)數(shù)可能不充分；若超過(guò)5重量％，則存在進(jìn)一步增加顆粒表面官能團(tuán)量的效果減少的傾向。
[0078]在磁性二氧化硅顆粒的表面結(jié)合戊二醛、白蛋白、碳化二亞胺、鏈酶親和素或生物素的方法沒(méi)有特別限定，例如可如下進(jìn)行結(jié)合。
[0079]對(duì)于具有醛基的戊二醛和具有羧基的生物素，可通過(guò)使其與在表面結(jié)合了具有氨基的烷基烷氧基硅烷的磁性二氧化硅顆粒發(fā)生反應(yīng)而結(jié)合在磁性二氧化硅顆粒的表面。此夕卜，對(duì)于具有氨基的白蛋白和鏈酶親和素以及具有碳化二亞胺基的碳化二亞胺，可通過(guò)使其與在表面結(jié)合了具有羧基的烷基烷氧基硅烷的磁性二氧化硅顆粒發(fā)生反應(yīng)而結(jié)合在磁性二氧化硅顆粒的表面。
[0080]對(duì)于本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法，除了使用上述本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒來(lái)進(jìn)行以外，只有按照該領(lǐng)域中通常進(jìn)行的、文獻(xiàn)[例如，酶免疫測(cè)定法第2版(石川榮治等編集、醫(yī)學(xué)書(shū)院)1982年]中所記載的三明治法、競(jìng)爭(zhēng)法和日本特開(kāi)平6-130063號(hào)公報(bào)中記載的測(cè)定法來(lái)進(jìn)行即可。
[0081]三明治法例如是如下進(jìn)行的:使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣、在表面進(jìn)行了與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))的固定化的磁性二氧化硅顆粒、以及利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))進(jìn)行接觸，在磁性二氧化硅顆粒上形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以及標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載了該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
[0082]具體地說(shuō)，例如，使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與在表面固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒接觸，在磁性二氧化硅顆粒表面形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體，進(jìn)一步使該復(fù)合體與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)接觸，形成負(fù)載于磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以及標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載了該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)即可。在該方法中，使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒反應(yīng)后再使標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，但也可以使標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)反應(yīng)后再與固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒反應(yīng)，還可使它們3個(gè)同時(shí)反應(yīng)。
[0083]上述三明治法中的B/F分離意味著上述標(biāo)記復(fù)合體與未參與標(biāo)記復(fù)合體的形成的標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的分離，具體地說(shuō)，其意味著負(fù)載于磁性二氧化硅顆粒的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、負(fù)載于磁性二氧化娃顆粒的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體、以及上述標(biāo)記復(fù)合體與其它成分(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以外的成分、未參與標(biāo)記復(fù)合體的形成的標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)等)的分離。
[0084]此外，B/F分離工序?yàn)闃?biāo)記復(fù)合體形成后的必要工序，其也可在磁性二氧化硅顆粒表面形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體后進(jìn)行實(shí)施。
[0085]作為競(jìng)爭(zhēng)法的一個(gè)方式是如下進(jìn)行的:使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣、與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))以及在其表面進(jìn)行了測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)的固定化的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，在磁性二氧化硅顆粒上形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載了該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
[0086]具體地說(shuō)，例如，使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，使標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以及磁性二氧化硅顆粒上的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，在磁性二氧化硅顆粒上形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)即可。在該方法中，使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒同時(shí)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，但也可以使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒接觸后再加入標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)從而進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，還可以使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)接觸后再加入負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒從而進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。
[0087]上述競(jìng)爭(zhēng)法中的B/F分離意味著上述標(biāo)記復(fù)合體與未參與標(biāo)記復(fù)合體的形成的其它成分(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)以及標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體)的分離，具體地說(shuō)，其意味著負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)與其它成分(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以外的成分、標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體等)的分離。
[0088]此外，作為競(jìng)爭(zhēng)法的其它方式是如下進(jìn)行的:使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì))以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，在磁性二氧化硅顆粒上形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
[0089]具體地說(shuō)，例如，使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，使磁性二氧化硅顆粒上的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以及標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，在磁性二氧化硅顆粒上形成測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有該標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于該結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)即可。在該競(jìng)爭(zhēng)法中，使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒同時(shí)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，但也可以使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸后加入標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)從而進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，還可以使標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)與負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸后加入測(cè)定對(duì)象物質(zhì)從而進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。
[0090]上述競(jìng)爭(zhēng)法中的B/F分離意味著上述標(biāo)記復(fù)合體與未參與標(biāo)記復(fù)合體的形成的其它成分(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì))的分離，具體地說(shuō)，其意味著負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒、負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的復(fù)合體、以及負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒與標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的復(fù)合體與其它成分(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以外的成分、未參與標(biāo)記復(fù)合體的形成的標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)等)的分離。
[0091]此外，在測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為酶的情況下，也可通過(guò)上述三明治法和競(jìng)爭(zhēng)法以外的使用酶活性方法的方法進(jìn)行測(cè)定，例如可通過(guò)下述方法進(jìn)行測(cè)定:使含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與在表面固定化了負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)(例如，抗體等可與酶結(jié)合的物質(zhì))的磁性二氧化硅顆粒的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，在磁性二氧化硅顆粒上形成酶與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體，對(duì)負(fù)載了復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離后，根據(jù)酶的種類(lèi)添加底物、或者根據(jù)酶的種類(lèi)添加底物和顯色劑、根據(jù)需要進(jìn)一步添加共軛酶，基于該底物的變化或顯色劑的顯色結(jié)果測(cè)定試樣中的酶量。需要說(shuō)明的是，底物、顯色劑、共軛酶使用公知的物質(zhì)即可，例如在酶為過(guò)氧化物酶的情況下，可以使用過(guò)氧化氫與魯米諾發(fā)光試劑等。它們的用量為通常在該領(lǐng)域中使用的范圍即可。上述方法中的B/F分離意味著測(cè)定對(duì)象物質(zhì)與負(fù)載有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的磁性二氧化硅顆粒的復(fù)合體與其它成分(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以外的成分等)的分離。
[0092]本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法中，作為使試樣、磁性二氧化硅顆粒、標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)等進(jìn)行接觸的方法，可以通過(guò)通常所進(jìn)行攪拌、混合等處理使磁性二氧化硅顆粒分散。反應(yīng)時(shí)間根據(jù)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、所使用的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、三明治法、競(jìng)爭(zhēng)法等的不同來(lái)適宜設(shè)定即可，通常為I分鐘?10分鐘、優(yōu)選為I分鐘?5分鐘。
[0093]本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法中的B/F分離例如是如下進(jìn)行的:利用磁性二氧化硅顆粒的磁性，利用磁石等從反應(yīng)槽的外側(cè)等收集磁性二氧化硅顆粒、排出反應(yīng)液，加入清洗液后，拿走磁石，對(duì)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行混合使其分散，并進(jìn)行清洗，由此來(lái)進(jìn)行B/F分離。上述操作可反復(fù)進(jìn)行I?3次。作為清洗液，只要為通常在該領(lǐng)域中使用的清洗液就沒(méi)有特別限定。
[0094]作為為了對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記而使用的標(biāo)記物質(zhì)，可以舉出:例如在酶免疫測(cè)定法(EIA)中使用的堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、熒光素酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等酶類(lèi)；例如在放射免疫測(cè)定法(RIA)中使用的99mTc、1311、1251、14C、3H、32P等放射性同位素；例如在熒光免疫測(cè)定法(FIA)中使用的熒光素、Dansyl、熒光胺、香豆素、萘胺或它們的衍生物、綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)等熒光性物質(zhì)；例如蟲(chóng)熒光素、異魯米諾、魯米諾、雙(2，4，6-三氟苯基)草酸酯等發(fā)光性物質(zhì)；例如苯酚、萘酚、蒽或它們的衍生物等在紫外部具有吸收的物質(zhì)；例如以4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、3-氨基-2，2, 5, 5-四甲基卩比咯燒-1-氧自由基、2，6- 二叔丁基-α - (3，5- 二叔丁基-4-氧代_2，5-環(huán)己二烯-1-亞基)-對(duì)三氧自由基等具有氧基的化合物為代表的具有作為自旋標(biāo)記化劑的性質(zhì)的物質(zhì)等。
[0095]它們中，從靈敏度等方面出發(fā)，優(yōu)選酶、熒光性物質(zhì)，更優(yōu)選堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶，特別優(yōu)選過(guò)氧化物酶。
[0096]為了如上所述使標(biāo)記物質(zhì)與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)等結(jié)合，可利用通常在該領(lǐng)域中使用的方法，例如可利用在本身公知的EIA、RIA或FIA等中通常進(jìn)行的本身公知的標(biāo)記方法[例如:醫(yī)化學(xué)実験講座(醫(yī)藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座)、第8卷、山村雄一監(jiān)修、第I版、中山書(shū)店、1971 ;図説蛍光抗體(圖說(shuō)熒光抗體)、川生明著、第I版、(株)Soft Science社、1983 ;酵素免疫測(cè)定法(酶免疫測(cè)定法)、石川榮治、河合忠、室井潔編、第2版、醫(yī)學(xué)書(shū)院、1982等中記載的戊二醛法、高碘酸法、馬來(lái)酰亞胺法或吡啶基二硫化物法等]等。
[0097]標(biāo)記物質(zhì)的用量根據(jù)所用標(biāo)記物質(zhì)種類(lèi)的不同而不同，因而不能一概而論；例如在使用過(guò)氧化物酶作為標(biāo)記物質(zhì)的情況下，使測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記物質(zhì)按照例如通常為1:1?20的摩爾比、優(yōu)選為1:1?10的摩爾比、進(jìn)一步優(yōu)選為1:1?2的摩爾比含有在例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、凡羅那緩沖液、硼酸緩沖液、Good’ s緩沖液等通常在該領(lǐng)域中使用的緩沖液中來(lái)進(jìn)行使用即可。需要說(shuō)明的是，作為該緩沖液，可以舉出通常在該領(lǐng)域中使用的例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、凡羅那緩沖液、硼酸緩沖液、Good’ s緩沖液等，其PH為不會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)的范圍即可，通常為5?9。此外，在這樣的緩沖液中，只要不會(huì)阻礙目標(biāo)抗原抗體反應(yīng)，也可以含有例如白蛋白、球蛋白、水溶性明膠、聚乙二醇等穩(wěn)定化劑、表面活性劑、糖類(lèi)等。
[0098]作為標(biāo)記物質(zhì)或其活性的測(cè)定方法，可以舉出放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶免疫測(cè)定法(EIA)、熒光免疫測(cè)定法(FIA)和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA和CLEIA)，從短時(shí)間內(nèi)的免疫測(cè)定中的靈敏度的方面出發(fā)，優(yōu)選EIA、CLIA和CLEIA，更優(yōu)選CLEIA。
[0099]對(duì)于本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法，例如在利用三明治法測(cè)定AFP的情況下，可如下進(jìn)行。
[0100]即，例如，可將含有AFP的試樣10 μ L?25 μ L與例如含有0.lmg/mL?lmg/mL的抗AFP抗體負(fù)載至本發(fā)明的磁性二氧化硅顆粒而成的物質(zhì)的磷酸緩沖液等緩沖液(含有磁性二氧化硅顆粒的試劑)40 μ L?50 μ L添加至反應(yīng)槽中，對(duì)該反應(yīng)溶液進(jìn)行攪拌，使磁性二氧化硅顆粒分散，使負(fù)載在磁性二氧化硅顆粒上的抗AFP抗體與AFP接觸、進(jìn)行反應(yīng)，形成復(fù)合體。接下來(lái)，利用磁石等由例如反應(yīng)槽的外側(cè)收集磁性二氧化硅顆粒，排出反應(yīng)液，添加生理食鹽水等清洗液。其后去除磁石，使該磁性二氧化硅顆粒分散、進(jìn)行清洗。該操作可以反復(fù)進(jìn)行I?3次。需要說(shuō)明的是，對(duì)于該清洗操作，在殘留有試樣或含有磁性二氧化硅顆粒的試劑的情況下添加由來(lái)自辣根等的過(guò)氧化物酶(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為P0D)標(biāo)記的抗AFP抗體(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為標(biāo)記試劑)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也可省略該清洗操作。其后例如加入標(biāo)記試劑，對(duì)該反應(yīng)溶液進(jìn)行攪拌，使磁性二氧化硅顆粒分散，使POD標(biāo)記的抗AFP抗體與上述復(fù)合體進(jìn)行反應(yīng)結(jié)合。接下來(lái)，與上述清洗同樣地加入生理食鹽水等清洗液使其分散、進(jìn)行清洗。最后加入例如魯米諾和過(guò)氧化氫，利用化學(xué)發(fā)光計(jì)測(cè)定I秒的化學(xué)發(fā)光積分量，基于該測(cè)定值計(jì)算出試樣中的AFP量。需要說(shuō)明的是，在這種情況下，以預(yù)先規(guī)定的含有AFP的溶液為試樣，利用與上述同樣的操作制作出顯示AFP量與I秒化學(xué)發(fā)光積分量的關(guān)系的校正曲線等，通過(guò)使用該校正曲線可容易地計(jì)算出試樣中的AFP量。
[0101 ] 本發(fā)明的試劑含有上述本發(fā)明的磁性二氧化硅顆粒，其用于上述測(cè)定方法中。具體地說(shuō)，例如可以舉出含有本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒的緩沖液等，作為該緩沖液，優(yōu)選可以舉出通常在免疫測(cè)定等中使用的緩沖液，可以舉出例如1，4-哌嗪二乙烷磺酸/氫氧化鈉緩沖液、MOPS[3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸]/氫氧化鈉緩沖液、三乙醇胺/鹽酸緩沖液和PBS (磷酸緩沖液)等。
[0102]這些緩沖液中的緩沖劑的濃度優(yōu)選為ImM?500mM、進(jìn)一步優(yōu)選為5mM?300mM、特別優(yōu)選為IOmM?200mM。
[0103]上文和下文中，mM表示25°C下的濃度(毫摩爾/升)。
[0104]磁性二氧化硅顆粒的量沒(méi)有特別限定，可根據(jù)所使用的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)的種類(lèi)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的種類(lèi)等進(jìn)行適宜選擇。
[0105]本發(fā)明的試劑優(yōu)選為本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒分散在緩沖液中的形態(tài)。
[0106]本發(fā)明的試劑除了為含有本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒的試劑以外，還可以含有與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)、或利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的含有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的試劑(下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)為標(biāo)記試劑)。該標(biāo)記物質(zhì)可以舉出與上述本發(fā)明的測(cè)定方法項(xiàng)中所記載相同的物質(zhì)，優(yōu)選物也相同。
[0107]在標(biāo)記試劑中，除了與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)、或利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)以外，還可以含有緩沖液等。作為標(biāo)記試劑中使用的緩沖液，優(yōu)選在免疫測(cè)定中通常使用的緩沖液，可以舉出例如與上述含有磁性二氧化硅顆粒的試劑中使用的緩沖液同樣的物質(zhì)，緩沖液中的緩沖劑的濃度也與在上述含有磁性二氧化硅顆粒的試劑中使用的情況相同。
[0108]本發(fā)明的試劑除了含有本發(fā)明中的磁性二氧化硅顆粒的試劑以及標(biāo)記試劑以外，也可以含有化學(xué)發(fā)光試劑，該化學(xué)發(fā)光試劑可基于上述標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行選擇，例如，在標(biāo)記物質(zhì)為POD的情況下，本發(fā)明的試劑含有以2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑為必要構(gòu)成成分的化學(xué)發(fā)光試劑第I液以及以氧化劑和水為必要構(gòu)成成分的化學(xué)發(fā)光試劑第2液。
[0109]作為2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮化合物，例如可使用日本特開(kāi)平2-291299號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)平10-319015號(hào)公報(bào)和日本特開(kāi)2000-279196號(hào)公報(bào)等中記載的公知的2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物和它們的混合物等。
[0110]它們之中，優(yōu)選魯米諾、異魯米諾、N-氨基己基-N-乙基異魯米諾(AHEI)、N_氨基丁基-N-乙基異魯米諾(ABEI)和它們的金屬鹽(堿金屬鹽等)，更優(yōu)選魯米諾及其金屬鹽，特別優(yōu)選魯米諾的鈉鹽。
[0111]化學(xué)發(fā)光試劑中的2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物的含量根據(jù)其種類(lèi)和應(yīng)用的測(cè)定方法、測(cè)定條件等進(jìn)行適宜設(shè)定，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等方面出發(fā)，優(yōu)選為0.5mM?80mM、進(jìn)一步優(yōu)選為1.8mM?40mM、特別優(yōu)選為3.5mM?21mM。[0112]作為化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，可使用例如日本特表昭59-500252號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)昭59-171839號(hào)公報(bào)和日本特開(kāi)平2-291299號(hào)公報(bào)等中記載的公知的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑和它們的混合物等。
[0113]它們之中，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果等方面出發(fā)，優(yōu)選苯酚，更優(yōu)選P-碘苯酚、4_(氰基甲硫基)苯酚和4-氰基甲硫基-2-氯苯酚，特別優(yōu)選4-(氰基甲硫基)苯酚。
[0114]化學(xué)發(fā)光試劑中的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑的含量根據(jù)其種類(lèi)和應(yīng)用的測(cè)定方法、測(cè)定條件等進(jìn)行適宜設(shè)定，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等方面出發(fā)，優(yōu)選為0.1mM?15mM、進(jìn)一步優(yōu)選為0.3mM?7.0mM、特別優(yōu)選為0.6mM?3.4mM。
[0115]在化學(xué)發(fā)光試劑第I液中，除了 2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑以外，還可以含有緩沖液和/或螯合劑等。
[0116]作為緩沖液，可使用例如日本特開(kāi)平10-319015號(hào)公報(bào)和日本特開(kāi)2003-279489號(hào)公報(bào)等中記載的公知的緩沖液等。
[0117]它們之中，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等的方面出發(fā)，優(yōu)選3-[4-(2_羥基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸/氫氧化鈉緩沖液、2-羥基-3-[4- (2-羥基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸.I水合物/氫氧化鈉緩沖液和哌嗪基-1，4-雙(2-羥基-3-丙烷磺酸).2水合物/氫氧化鈉緩沖液，更優(yōu)選3-[4-(2-羥基乙基)-1_哌嗪基]丙烷磺酸/氫氧化鈉緩沖液和2-羥基-3-[4- (2-羥基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸.I水合物/氫氧化鈉緩沖液，特別優(yōu)選3-[4-(2_羥基乙基)-1_哌嗪基]丙烷磺酸/氫氧化鈉緩沖液。
[0118]從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等方面出發(fā)，這些緩沖液中的緩沖劑的含量?jī)?yōu)選為ImM?500mM、進(jìn)一步優(yōu)選為5mM?300mM、特別優(yōu)選為IOmM?200mM。
[0119]作為螯合劑，例如可使用日本特開(kāi)平9-75099號(hào)公報(bào)和日本特開(kāi)2003-279489號(hào)公報(bào)等中記載的公知的螯合劑等。
[0120]它們之中，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等的方面出發(fā)，優(yōu)選四配位螯合齊U，更優(yōu)選乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽(乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、乙二胺四乙酸四鈉、乙二胺四乙酸二鉀和乙二胺四乙酸三鉀等)以及反式-1，2環(huán)己二胺-N，N，N’，N’ -四乙酸(CyDTA)，特別優(yōu)選乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽。
[0121]在含有螯合劑的情況下，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性的方面出發(fā)，以2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物的重量為基準(zhǔn)，其含量?jī)?yōu)選為0.001重量％?4重量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0.01重量％?2重量％、特別優(yōu)選為0.05重量％?I重量％。
[0122]化學(xué)發(fā)光試劑第I液優(yōu)選為液體，并且從酶的熒光強(qiáng)度的方面出發(fā)，優(yōu)選為堿性。第I液的pH優(yōu)選為7?11、進(jìn)一步優(yōu)選為8?10。需要說(shuō)明的是，pH以JISK0400-12-10:2000為基準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定(測(cè)定溫度25°C )。
[0123]化學(xué)發(fā)光試劑第I液可通過(guò)將2，3- 二氫-1，4-酞嗪二酮化合物、化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑以及必要時(shí)的緩沖液和/或螯合劑均勻混合而容易地得到。
[0124]作為化學(xué)發(fā)光試劑第2液所含有的氧化劑，可以舉出例如日本特開(kāi)平8-261943號(hào)公報(bào)和日本特開(kāi)2000-279196號(hào)公報(bào)等中記載的公知的氧化劑等[無(wú)機(jī)過(guò)氧化物(過(guò)氧化氫、過(guò)硼酸鈉和過(guò)硼酸鉀等)、有機(jī)過(guò)氧化物(二烷基過(guò)氧化物和?；^(guò)氧化物等)、過(guò)氧酸化合物(過(guò)氧硫酸和過(guò)氧磷酸等)等]的水溶液。
[0125]它們之中，從保存穩(wěn)定性等的方面出發(fā)，優(yōu)選雙氧水溶液、過(guò)硼酸鈉水溶液和過(guò)硼酸鉀水溶液，更優(yōu)選雙氧水溶液。
[0126]化學(xué)發(fā)光試劑第2液中的氧化劑的濃度根據(jù)其種類(lèi)和所應(yīng)用的測(cè)定方法、測(cè)定條件等進(jìn)行適宜設(shè)定，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果等方面出發(fā)，優(yōu)選為0.5mM~40mM、進(jìn)一步優(yōu)選為1mM~20mM、特別優(yōu)選為2.5mM~10mM。
[0127]作為化學(xué)發(fā)光試劑第2液所含有的水，可以舉出蒸餾水、反滲透水和去離子水等。它們之中，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性等方面出發(fā)，優(yōu)選蒸餾水和去離子水，更優(yōu)選去離子水。
[0128]化學(xué)發(fā)光試劑第2液中，除氧化劑和水以外，還可含有螯合劑等。
[0129]作為螯合劑，可以舉出與作為能夠包含在上述第I液中的螯合劑而示例出的螯合劑同樣的物質(zhì)，優(yōu)選物也相同。
[0130]在含有螯合劑的情況下，從化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)效果和保存穩(wěn)定性的方面出發(fā)，以氧化劑的重量為基準(zhǔn)，其含量?jī)?yōu)選為0.2重量％~100重量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0.5重量％~20重
量％、特別優(yōu)選為1重量％~10重量％。
[0131]化學(xué)發(fā)光試劑第2液可通過(guò)將氧化劑、水和必要時(shí)的螯合劑均勻混合而容易地得到。
[0132]【實(shí)施例】
[0133]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。下文中，只要沒(méi)有特別限定，%表示重量％、份表示重量份。
[0134]制造例1
[0135]在反應(yīng)容器中加入氯化鐵(111)6水合物2.7份、氯化鐵(11)4水合物1.0份和水375份，使其溶解并升溫至50°C，在攪拌下將溫度保持在50°C~55°C，同時(shí)利用I小時(shí)滴加將25%氨水3.8份與水100份混合而成的溶液，滴加后攪拌I小時(shí)，加入油酸10.5份，繼續(xù)攪拌2小時(shí)。冷卻至室溫后，通過(guò)傾潷進(jìn)行固液分離，利用水50份對(duì)吸附了油酸的磁鐵礦顆粒進(jìn)行清洗，該操作進(jìn)行3次。將所得到的吸附了油酸的磁鐵礦顆粒投入到容器中，加入癸烷5.7份和四乙氧基硅烷2.2份進(jìn)行混合，制備分散液(A2-1)。
[0136]向反應(yīng)容器中加入25%氨水溶液39.0份、異丙醇55.4份、山梨糖醇酐單油酸酯
2.9份(三洋化成工業(yè)社制造的“ IONET S-80” )和聚氧乙烯(加成摩爾數(shù)20摩爾)烷基(C16~18)醚(三洋化成工業(yè)社制造的“EMULMIN200”)2.0份，使用CLEARMIX (MTechnique社制造)進(jìn)行混合，升溫至50°C后，一邊在CLEARMIX的轉(zhuǎn)速6000rpm下進(jìn)行攪拌一邊利用I小時(shí)滴加上述分散液(A2-1)，之后在50°C反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)后，在2000rpm下離心分離5分鐘，除去有微粒存在的上清。在所得到的固相中加入水50份使顆粒分散，在1000rpm下離心分離10分鐘后，除去有微粒存在的上清，進(jìn)行10次該操作。接下來(lái)，向所得到的固相中加入水50份使顆粒分散，以500rpm離心分離5分鐘，使大粒徑的顆粒沉降，回收含有具有目標(biāo)粒徑的顆粒的上清(1)。在余下的固相中加入水50份，在500rpm下離心分離5分鐘后回收上清(2)，該操作進(jìn)行2次，對(duì)固相中存在的具有目標(biāo)粒徑的顆粒進(jìn)行回收。接下來(lái)，使用磁石對(duì)上清(1)和(2)進(jìn)行顆粒的磁選，將磁選后的顆粒在80°C下干燥8小時(shí)，得到磁性二氧化硅顆粒(SI)。
[0137]制造例2
[0138]除了將乳化時(shí)的CLEARMIX的轉(zhuǎn)速由6000rpm變?yōu)?500rpm以外，與制造例I同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S2)。
[0139]制造例3
[0140]除了將四乙氧基硅烷的投料量由2.2份變?yōu)?.5份以外，與制造例I同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S3)。
[0141]制造例4
[0142]除了將乳化時(shí)CLEARMIX的轉(zhuǎn)速由6000rpm變?yōu)?500rpm以外，與制造例3同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S4)。
[0143]制造例5
[0144]在磁鐵礦顆粒制作時(shí)，將與25%氨水3.8份混合的水量由100份變?yōu)?3.8份，除此以外，與制造例I同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S5)。
[0145]制造例6
[0146]除了將乳化時(shí)CLEARMIX的轉(zhuǎn)速由6000rpm變?yōu)?500rpm以外，與制造例5同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S6)。
[0147]制造例7
[0148]除了將四乙氧基硅烷的投料量由2.2份變?yōu)?.5份以外，與制造例5同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S7)。
[0149]制造例8
[0150]除了將乳化時(shí)的CLEARMIX的轉(zhuǎn)速由6000rpm變?yōu)?500rpm以外，與制造例7同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S8)。
[0151]制造例9
[0152]在磁鐵礦顆粒制作時(shí)，將與25%氨水3.8份混合的水量由100份變?yōu)?5份，將四乙氧基硅烷的投料量由2.2份變?yōu)?.2份，除此以外，與制造例2同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(S9)。
[0153]比較制造例I
[0154]除了將四乙氧基硅烷的投料量由0.5份變?yōu)?.0份以外，與制造例4同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(Hl)。
[0155]比較制造例2
[0156]除了將四乙氧基硅烷的投料量由1.2份變?yōu)?2.5份以外，與制造例9同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(H2)。
[0157]比較制造例3
[0158]將四乙氧基硅烷的投料量由1.2份變?yōu)?.0份，將乳化時(shí)CLEARMIX的轉(zhuǎn)速由7500rpm變?yōu)?000rpm，除此以外，與制造例9同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(H3)。
[0159]比較制造例4
[0160]將100份的硫酸亞鐵溶解在1000份的水中，攪拌下利用I小時(shí)滴加將氫氧化鈉28.8份溶解在水500份中得到的水溶液，之后一邊攪拌一邊升溫至85°C，將空氣吹入到懸浮液中，進(jìn)行8小時(shí)氧化，進(jìn)行離心分離，將由此得到的磁鐵礦顆粒2.2份與癸烷5.7份和四乙氧基硅烷2.2份混合，得到分散液(R-1)。除了將分散液(A2-1)變?yōu)榉稚⒁?R-1)以夕卜，與制造例2同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(H4)。
[0161]比較制造例5[0162]除了將四乙氧基硅烷的投料量由2.2份變?yōu)?2.5份以外，與比較制造例4同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(H5)。
[0163]比較制造例6
[0164]將平均粒徑50nm的磁鐵礦顆粒(Sigma Aldrich Japan社制造)2.2份與癸燒5.7份和四乙氧基硅烷2.2份混合，得到分散液(R-2)。除了將分散液(Α2-1)變?yōu)榉稚⒁?R-2)以外，與制造例I同樣地得到磁性二氧化硅顆粒(Η6)。
[0165]實(shí)施例1
[0166]通過(guò)下述操作得到由含有磁性二氧化硅顆粒的試劑(抗AFP抗體結(jié)合磁性二氧化娃顆粒試劑)、標(biāo)記試劑(P0D標(biāo)記抗AFP抗體試劑)、化學(xué)發(fā)光試劑第I液和化學(xué)發(fā)光試劑第2液構(gòu)成的本發(fā)明的試劑。
[0167]含有磁性二氧化硅顆粒的試劑的制作:
[0168]在加入了含有I重量％ Y-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液40mL的帶蓋聚乙烯瓶中加入制造例I中制作的磁性二氧化硅顆粒(Sl)40mg，在25°C反應(yīng)I小時(shí)，利用釹磁石進(jìn)行磁性二氧化硅顆粒的磁選后，利用抽吸裝置吸引除去液體。接下來(lái)加入去離子水40mL，蓋上蓋子，將聚苯乙烯瓶緩慢地倒置攪拌2次后，利用釹磁石進(jìn)行磁性二氧化硅顆粒的磁選，之后利用抽吸裝置吸引除去液體，對(duì)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行清洗。該清洗操作進(jìn)行3次。接下來(lái)，將該清洗后的磁性二氧化硅顆粒加入到裝入含有2重量％戊二醛的水溶液40mL的帶蓋聚乙烯瓶中，在25°C反應(yīng)I小時(shí)。接著加入去離子水40mL蓋上蓋子，將聚苯乙烯瓶緩慢地倒置攪拌2次后，利用釹磁石進(jìn)行磁性二氧化硅顆粒的磁選，之后利用抽吸裝置吸引除去液，對(duì)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行清洗。該清洗操作進(jìn)行3次。進(jìn)一步將該清洗后的磁性二氧化硅顆粒加入到帶蓋的聚乙烯瓶中，該瓶中加入有以20μ g/mL的濃度含有抗AFP單克隆抗體(由DAKO Japan社購(gòu)入)的0.02M磷酸緩沖液(pH8.7) 40mL，在25°C反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)后利用釹磁石進(jìn)行磁性二氧化硅顆粒的磁選，之后除去含抗AFP抗體的磷酸緩沖液，制作抗AFP抗體結(jié)合磁性二氧化硅顆粒。將其利用含有1%牛血清白蛋白的0.02M磷酸緩沖液(PH7.0)稀釋至以抗AFP抗體結(jié)合磁性二氧化硅顆粒濃度計(jì)為0.5mg/mL的濃度，制備得到含有磁性二氧化硅顆粒的試劑，冷蔵(2°C?10°C )保存。
[0169]標(biāo)記試劑的制作:
[0170]使用抗AFP多克隆抗體(由DAKO Japan社購(gòu)入)、來(lái)自辣根的POD (東洋紡社制造)，利用文獻(xiàn)(S.Y0SHITAKE，M IMAGAWA，E.1SHIKAWA，et.al.;J.Biochem.，Vol.92，1982，1413-1424)所記載的方法制備POD標(biāo)記抗AFP抗體。將其利用含有1%牛血清白蛋白的0.02M磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋至以POD標(biāo)記抗AFP抗體濃度計(jì)為200nM的濃度，制備標(biāo)記試劑，冷蔵(2°C?10°C )保存。
[0171]化學(xué)發(fā)光試劑第I液的制備:
[0172]將魯米諾的鈉鹽[Sigma Aldrich Japan社制造]0.7g和4_(氰基甲硫基)苯酹
0.1g裝入到IOOOmL量瓶中。投入3-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸/氫氧化鈉緩沖液(10mM、pH8.6)使溶液的容量為IOOOmL,在25°C均勻混合，制備化學(xué)發(fā)光試劑第I液。進(jìn)行冷蔵(2°C?10°C )保存直至用于測(cè)定。
[0173]化學(xué)發(fā)光試劑第2液的制備:
[0174]將過(guò)氧化氫[和光純藥工業(yè)社制造、試劑特級(jí)、濃度30重量％]6.6g裝入到IOOOmL量瓶中。投入去離子水使溶液的容量為IOOOmL,在25°C均勻混合，制備化學(xué)發(fā)光試劑第2液。進(jìn)行冷蔵(2°C?10°C )保存直至用于測(cè)定。
[0175]實(shí)施例2?9和比較例I?6
[0176]除了將磁性二氧化硅顆粒(SI)換為磁性二氧化硅顆粒(S2)?(S9)或(Hl)?(H6)以外，與實(shí)施例1同樣地得到由含有本發(fā)明或比較用磁性二氧化硅顆粒的試劑、標(biāo)記試劑、化學(xué)發(fā)光試劑第I液和化學(xué)發(fā)光試劑第2液構(gòu)成的本發(fā)明的試劑。
[0177]使用所得到的試劑，按下述方法評(píng)價(jià)短時(shí)間內(nèi)免疫測(cè)定中的清洗性和靈敏度，結(jié)果列于表I。此外，對(duì)于所使用的磁性二氧化硅顆粒(SI)?(S9)和(Hl)?(H6)，按以下所示的方法測(cè)定超順磁性金屬氧化物的平均粒徑、磁性二氧化硅顆粒的平均粒徑、超順磁性金屬氧化物的含量，對(duì)磁選性、再分散性和再凝聚性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果一并列于表I。
[0178]<使用本發(fā)明試劑的短時(shí)間內(nèi)免疫測(cè)定中的清洗性和靈敏度的評(píng)價(jià)方法>
[0179]將含有磁性二氧化硅顆粒的試劑0.025mL與利用含有I重量％的牛血清白蛋白的磷酸緩沖液制備的AFP濃度為2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)AFP液0.025mL加入到試驗(yàn)管中進(jìn)行混合，在試驗(yàn)管中于37°C反應(yīng)3分鐘，形成抗AFP抗體結(jié)合磁性二氧化硅顆粒/AFP復(fù)合體。反應(yīng)后，利用釹磁石由試驗(yàn)管的外側(cè)收集磁性二氧化硅顆粒10秒，利用抽吸裝置除去試驗(yàn)管中的液體，使釹磁石由側(cè)面充分遠(yuǎn)離，加入生理食鹽水0.5mL使磁性二氧化硅顆粒分散，磁選后利用抽吸裝置除去液體，進(jìn)行3次清洗操作。
[0180]接著，將標(biāo)記試劑0.025mL注入到試驗(yàn)管中，在試驗(yàn)管中在37°C反應(yīng)3分鐘，形成抗AFP抗體結(jié)合磁性二氧化硅顆粒/AFP/P0D標(biāo)記抗AFP抗體復(fù)合體。反應(yīng)后，利用釹磁石由試驗(yàn)管的外側(cè)收集磁性二氧化硅顆粒10秒，利用抽吸裝置除去試驗(yàn)管中的液體，使釹磁石由側(cè)面充分遠(yuǎn)離，加入生理食鹽水0.5mL使磁性二氧化硅顆粒分散，磁選后利用抽吸裝置除去液體，進(jìn)行2次清洗操作。
[0181]最后，同時(shí)加入化學(xué)發(fā)光試劑第I液0.07mL與化學(xué)發(fā)光試劑第2液0.0lmL,在37°C進(jìn)行43秒發(fā)光反應(yīng),利用發(fā)光檢測(cè)器[Lumat LB9507 (Berthold Japan社制造)]測(cè)定添加化學(xué)發(fā)光試劑43?45秒后的平均發(fā)光量。需要說(shuō)明的是，使用AFP濃度為Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)AFP液來(lái)替換AFP濃度為2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)AFP液，進(jìn)行與上述同樣的操作，用作背景。
[0182]關(guān)于清洗性，按下述基準(zhǔn)由使用AFP濃度為Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫測(cè)定的情況下的平均發(fā)光量進(jìn)行判定。
[0183]O:小于 lOOOOcps
[0184]Δ: lOOOOcps 以上且小于 30000cps
[0185]X:30000cps 以上
[0186]關(guān)于靈敏度，按下述基準(zhǔn)由使用AFP濃度為Ong/mL與2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫測(cè)定的情況下的發(fā)光量的差進(jìn)行判定。
[0187]O:25000cps 以上
[0188]Δ: lOOOOcps 以上且小于 25000cps
[0189]X:小于 lOOOOcps
[0190]<超順磁性金屬氧化物的平均粒徑的測(cè)定方法>
[0191]對(duì)于任意200個(gè)超順磁性金屬氧化物，利用掃描型電子顯微鏡進(jìn)行觀察、測(cè)定粒徑，將其平均值作為平均粒徑。[0192]<磁性二氧化硅顆粒的平均粒徑的測(cè)定方法>
[0193]對(duì)于任意200個(gè)磁性二氧化硅顆粒，利用掃描型電子顯微鏡進(jìn)行觀察、測(cè)定粒徑，將其平均值作為平均粒徑。
[0194]<磁性二氧化硅顆粒中的超順磁性金屬氧化物的含量的測(cè)定方法>
[0195]對(duì)于任意20個(gè)磁性二氧化硅顆粒，利用掃描型電子顯微鏡進(jìn)行觀察，利用能量分散型X射線分光裝置測(cè)定超順磁性金屬氧化物的含量，將其平均值作為含量。
[0196]<磁性二氧化硅顆粒的磁選性的評(píng)價(jià)方法>
[0197]使1.0mg的磁性顆粒二氧化硅顆粒分散在2mL的離子交換水中，裝入到口內(nèi)徑X股抒X t: ι'ι'?'^φ丨0_3mm X φ12_0mm X 35mm的玻璃容器中，在側(cè)面放置IcmX IcmX Icm的
釹磁石，測(cè)定直至初期吸光度為20%為止的時(shí)間，按下述基準(zhǔn)進(jìn)行判定。[0198]〇:小于15秒
[0199]Δ:15秒以上且小于30秒
[0200]X:30 秒以上
[0201 ] <磁性二氧化硅顆粒的再分散性的評(píng)價(jià)方法>
[0202]使1.0mg的磁性顆粒二氧化硅顆粒分散在2mL的離子交換水中，裝入到口內(nèi)徑
X X yI"I1I ilJ=Cp 10.3mm X φ 12.0mm X 35mm 的玻璃容器中，在側(cè)面放置 IcmX IcmX Icm 的
釹磁石，對(duì)磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行完全磁選，除去上清，使釹磁石由側(cè)面充分遠(yuǎn)離，將2mL的離子交換水噴出同時(shí)施加在磁性二氧化硅顆粒上，通過(guò)3次吸液進(jìn)行混合后，在10秒以內(nèi)利用顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)算出凝聚顆粒數(shù)相對(duì)于視野內(nèi)全部顆粒數(shù)的比例，按下述基準(zhǔn)判定再分散性。
[0203]O:凝聚顆粒小于5%
[0204]Δ:凝聚顆粒為5%以上且小于20%
[0205]X:凝聚顆粒為20%以上
[0206]<磁性二氧化硅顆粒的再凝聚性的評(píng)價(jià)方法>
[0207]通過(guò)3次吸液進(jìn)行混合后，將直至利用顯微鏡觀察為止的時(shí)間由10秒以內(nèi)換為5分鐘，除此以外，與上述再分散性的評(píng)價(jià)方法同樣地計(jì)算出凝聚的顆粒數(shù)相對(duì)于視野內(nèi)全部顆粒數(shù)的比例，按下述基準(zhǔn)進(jìn)行判定。
[0208]O:凝聚顆粒小于5%
[0209]Δ:凝聚顆粒為5%以上且小于20%
[0210]X:凝聚顆粒為20%以上
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定對(duì)象物質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于，使用磁性二氧化硅顆粒來(lái)測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，在所述磁性二氧化硅顆粒中，在含有60重量％~95重量％的平均粒徑為Inm~15nm的超順磁性金屬氧化物的二氧化娃顆粒的表面，固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其中，所述磁性二氧化硅顆粒為在其表面固定化有與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))的顆粒，使含有所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與所述磁性二氧化硅顆粒以及利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))進(jìn)行接觸，在所述磁性二氧化硅顆粒上形成所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)以及所述標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有所述標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定所述標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于其結(jié)果測(cè)定所述試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其中，所述磁性二氧化硅顆粒為在其表面固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)的顆粒，使含有所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣、和與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))以及所述磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，在所述磁性二氧化硅顆粒上形成所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)與所述標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有所述標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定所述標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于其結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其中，所述磁性二氧化硅顆粒為在其表面固定化有與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì))的顆粒，使含有所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣與利用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)(標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì))與所述磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行接觸，在所述磁性二氧化硅顆粒上形成所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)與所述標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或其類(lèi)似物質(zhì)的復(fù)合體(標(biāo)記復(fù)合體)，對(duì)負(fù)載有所述標(biāo)記復(fù)合體的磁性二氧化硅顆粒進(jìn)行B/F分離，測(cè)定所述標(biāo)記復(fù)合體中的標(biāo)記物質(zhì)量，基于其結(jié)果測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2~4 的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述B/F分離是利用磁性二氧化硅顆粒的磁性進(jìn)行的。
6.如權(quán)利要求1~5的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述磁性二氧化硅顆粒的平均I立 1-- I μ m ~5 μ m。
7.如權(quán)利要求1~6的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述超順磁性金屬氧化物為氧化鐵。
8.如權(quán)利要求7所述的測(cè)定方法，其中，所述氧化鐵為選自由磁鐵礦、Y-紅鐵礦、磁鐵礦-α -紅鐵礦中間體氧化鐵和Y -紅鐵礦-α -紅鐵礦中間體氧化鐵組成的組中的至少一種氧化鐵。
9.如權(quán)利要求1~8的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，在進(jìn)行所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、所述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者所述與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的固定化之前的所述磁性二氧化硅顆粒的表面上，結(jié)合有選自由戊二醛、白蛋白、碳化二亞胺、鏈酶親和素、生物素和具有官能團(tuán)的烷基烷氧基硅烷組成的組中的至少一種有機(jī)化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)定方法，其中，所述烷基烷氧基硅烷所具有的官能團(tuán)為選自由氨基、羧基、羥基、巰基和環(huán)氧丙氧基組成的組中的至少一種官能團(tuán)。
11.如權(quán)利要求1~10的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，所述與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)為針對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)的抗體、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)所結(jié)合的抗原、或與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
12.—種權(quán)利要求1~11的任意一項(xiàng)所述的測(cè)定方法用試劑，其特征在于，該試劑含有磁性二氧化硅顆粒,該磁性二氧化硅顆粒中,在含有60重量％~95重量％的平均粒徑為Inm~15nm的超順磁性金屬氧化物的二氧化娃顆粒的表面，固定化有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑，其中，所述磁性二氧化硅顆粒的平均粒徑為Ιμπι~5 μ m0
14.如權(quán)利要求12或13所述的試劑，其中，所述超順磁性金屬氧化物為氧化鐵。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑，其中，所述氧化鐵為選自由磁鐵礦、Y-紅鐵礦、磁鐵礦-α -紅鐵礦中間體氧化鐵和Y -紅鐵礦-α -紅鐵礦中間體氧化鐵組成的組中的至少一種氧化鐵。
16.如權(quán)利要求12~15的任意一項(xiàng)所述的試劑，其中，在進(jìn)行測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)或者與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的固定化之前的所述磁性二氧化硅顆粒的表面上，結(jié)合有選自由戊二醛、白蛋白、碳化二亞胺、鏈酶親和素、生物素和具有官能團(tuán)的烷基烷氧基硅烷組成的組中的至少一種有機(jī)化合物。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑，其中，所述烷基烷氧基硅烷所具有的官能團(tuán)為選自由氨基、羧基、羥基、巰基和環(huán)氧丙氧基組成的組中的至少一種官能團(tuán)。
18.如權(quán)利要求12~17的 任意一項(xiàng)所述的試劑，其中，所述與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)為針對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)的抗體、測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)所結(jié)合的抗原、或與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的類(lèi)似物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C01B33/12GK103597353SQ201280028852
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月15日
【發(fā)明者】水野雄介, 宮森將光, 松田真次郎, 櫓曜 申請(qǐng)人:三洋化成工業(yè)株式會(huì)社, 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社