納米硫化鉬抗菌材料及其合成方法、應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納米硫化鉬抗菌材料及其合成方法、應(yīng)用，該合成方法包括以下的步驟：(1)將聚乙二醇固體溶于水中，在超聲池內(nèi)超聲到聚乙二醇完全溶解后，加入七鉬酸銨固體，再次超聲使七鉬酸銨完全溶解，得混合溶液；(2)取硫脲固體溶于水中，攪拌溶解后加入到所述混合溶液中，再次攪拌后置于聚四氟乙烯內(nèi)膽的水熱反應(yīng)釜中，密封，加熱反應(yīng)，得到黑色沉淀，即為納米硫化鉬抗菌材料。本發(fā)明還提供一種納米硫化鉬抗菌材料，按照上述的合成方法制備得到。本發(fā)明又提供一種上述的納米硫化鉬抗菌材料在擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱協(xié)同抗菌中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的合成方法，所得到的納米硫化鉬抗菌材料產(chǎn)率高，易于被細(xì)菌捕獲，且抗菌效果明顯優(yōu)于單一的擬酶催化或者單一的近紅外光熱抗菌。
【專利說明】
納米硫化鉬抗菌材料及其合成方法、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗菌材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種納米硫化鉬抗菌材料及其合成方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌引起的炎癥疾病已經(jīng)嚴(yán)重危害到了人類的健康，臨床中用于抗菌消炎的抗生素類藥物的問世挽救了很多細(xì)菌感染的病人，但無論是天然的還是人工合成的抗生素類藥物在長(zhǎng)期使用或者濫用過程中均會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，同時(shí)，濫用人工合成的抗生素還可能造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而天然抗生素雖然毒性和污染較小，但是加工合成條件苛刻，不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，從而限制了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0003]納米科技的飛速發(fā)展，為解決上述問題提供了全新的思路。納米顆粒不但合成方法簡(jiǎn)單，而且由于其尺寸越小越易于穿越細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后不容易被細(xì)菌外排栗排出的優(yōu)勢(shì)，使其發(fā)展前景變得極為廣闊。
[0004]目前的納米抗菌材料主要涉及金屬納米粒子、碳納米材料、納米聚合物、半導(dǎo)體金屬硫化物/氧化物等。這些納米材料相對(duì)傳統(tǒng)抗生素具有不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、安全性較高和抗菌能力好等的特點(diǎn)，已經(jīng)受到研究者的廣泛的關(guān)注。在基于上述納米抗菌劑所采取的抗菌策略如:物理?yè)p傷細(xì)菌細(xì)胞壁、自由基ROS的氧化作用等，最有效的策略之一是光熱治療，尤其是近紅外(Near Infrared Reflect1n，NIR)光熱治療中，近紅外光波位于生物組織的透明光學(xué)窗口，具有組織穿透深度深的優(yōu)勢(shì)。光熱抗菌治療中將光能轉(zhuǎn)換成熱能，利用熱效應(yīng)破壞細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和成分，從而起到抑制和殺死細(xì)菌的目的。這種治療方式有望克服傳統(tǒng)抗生素耐藥性帶來的各種困擾，具有微創(chuàng)、副作用小的優(yōu)勢(shì)，是一種抗菌治療的綠色療法。在各種近紅外光熱納米抗菌劑中，半導(dǎo)體納米材料由于可選用的合成方法普適性較廣，光熱轉(zhuǎn)換效率高的優(yōu)勢(shì)，使其在抗菌領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景并備受關(guān)注。然而，單一的近紅外光熱抗菌仍然存在一些不足，包括:抗菌過程所需時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，短時(shí)間光照往往不能有效地?fù)p傷細(xì)胞壁并完全殺滅細(xì)菌;有的耐藥菌在熱療中會(huì)產(chǎn)生耐熱性而降低納米材料的抗菌能力，而且連續(xù)的激光能量積累也會(huì)傷及正常細(xì)胞。因此，探尋基于半導(dǎo)體近紅外光熱納米抗菌劑并聯(lián)合其他治療手段，構(gòu)建可高時(shí)效抗耐藥菌感染的納米藥物體系，成為抗耐藥菌領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。
[0005]納米硫化鉬(MoS2)作為類石墨烯二維層狀材料中的一種，具有獨(dú)特的物理性質(zhì)包括較寬的電子能帶特性，尤其是該材料在很多方面與石墨烯類似，具有高的比表面積，易于表面修飾和藥物負(fù)載。此外，由于組成MoS2的鉬和硫元素都是人類和其他動(dòng)植物生存所必需的元素，同時(shí)其生物相容性也優(yōu)于量子點(diǎn)，因而，層狀納米硫化鉬在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用已備受關(guān)注，比如:生物分子和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、基因治療、光熱治療腫瘤和成像、抗菌治療等。
[0006]其中，光熱治療腫瘤方面的研究已成為近年來的研究熱點(diǎn)，這主要是由于MoS2納米片的帶隙結(jié)構(gòu)決定了其在近紅外區(qū)有明顯的吸收，而且光吸收系數(shù)和光熱轉(zhuǎn)換效率高于石墨烯，從而可作為有效的NIR光熱吸收劑;此外，MoS2納米片比表面積大的優(yōu)勢(shì)還可使其作為抗生素的載體有效吸附抗生素并提高了抗菌效果;而且，化學(xué)剝離的MoS2納米片由于尺寸遠(yuǎn)小于塊體，與細(xì)菌的接觸面積大，展現(xiàn)出比塊體更高的抗菌活性。
[0007]在MoS2納米片的幾種主要合成方法中，多數(shù)方法得到的片層產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，尺寸在微米量級(jí)，不易被細(xì)胞吞噬也不易被細(xì)菌有效捕獲。使用較多的正丁基鋰插層法合成過程必須在真空手套箱中進(jìn)行，插層時(shí)間長(zhǎng)且有氫氣產(chǎn)生，納米片尺寸也不易控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在下文中給出關(guān)于本發(fā)明的簡(jiǎn)要概述，以便提供關(guān)于本發(fā)明的某些方面的基本理解。應(yīng)當(dāng)理解，這個(gè)概述并不是關(guān)于本發(fā)明的窮舉性概述。它并不是意圖確定本發(fā)明的關(guān)鍵或重要部分，也不是意圖限定本發(fā)明的范圍。其目的僅僅是以簡(jiǎn)化的形式給出某些概念，以此作為稍后論述的更詳細(xì)描述的前序。
[0009]本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種產(chǎn)率高、易于被細(xì)菌捕獲的納米硫化鉬抗菌材料的合成方法。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0011 ]第一方面，一種納米硫化鉬抗菌材料的合成方法，包括以下的步驟:
[0012](I)將聚乙二醇固體溶于水中，在超聲池內(nèi)超聲到聚乙二醇完全溶解后，加入七鉬酸銨固體，再次超聲使七鉬酸銨完全溶解，得混合溶液；
[0013](2)取硫脲固體溶于水中，攪拌溶解后加入到所述混合溶液中，再次攪拌后置于聚四氟乙烯內(nèi)膽的水熱反應(yīng)釜中，密封，加熱反應(yīng)，得到黑色沉淀，即為納米硫化鉬抗菌材料。
[0014]第二方面，本發(fā)明還提供一種納米硫化鉬抗菌材料，按照上述的合成方法制備得到。
[0015]第三方面，本發(fā)明又提供一種上述的納米硫化鉬抗菌材料在擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱協(xié)同抗菌中的應(yīng)用。
[0016]第四方面，本發(fā)明再提供一種擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱的協(xié)同納米抗耐藥菌組合體系，包括上述的納米硫化鉬抗菌材料、過氧化氫及近紅外激光器。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0018](I)本發(fā)明采用一步水熱合成法結(jié)合聚合物表面修飾手段，不僅可提高納米硫化鉬抗菌材料的產(chǎn)率、生物相容性和分散性，而且能減小其尺寸，結(jié)合片層材料比表面積大的優(yōu)勢(shì)，使其與細(xì)菌的接觸面積更大，從而更容易被細(xì)菌捕獲；
[0019](2)納米硫化鉬抗菌材料的擬酶催化功能可降低H2O2的有效使用濃度，催化低劑量H2O2產(chǎn)生羥基自由基(.0H)的同時(shí)使.0H對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁進(jìn)行有效的破壞，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合NIR熱療來增加耐藥菌對(duì)熱的敏感性，使耐藥菌更容易受到熱的攻擊，從而縮短了光熱抗菌時(shí)間，提高了抗菌時(shí)效，避免了長(zhǎng)時(shí)間激光照射可能引起的各種副作用。
【附圖說明】
[0020]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的一步水熱法合成的MoS2納米片的透射電子顯微鏡圖；
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的協(xié)同抗菌策略的實(shí)驗(yàn)流程圖；
[0023]圖3a為本發(fā)明實(shí)施例提供的一定濃度范圍內(nèi)的MoS2納米片水溶液在近紅外連續(xù)光照過程中的升溫曲線圖；
[0024]圖3b為本發(fā)明實(shí)施例提供的MoS2納米片水溶液在近紅外光照后自然冷卻過程中的溫度變化圖；
[0025]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的MoS2納米片濃度依賴的擬酶催化活性圖；
[0026]圖5a為本發(fā)明實(shí)施例提供的在pH為7(二次水)的條件下，對(duì)苯二甲酸(TA)作為熒光探針檢測(cè).0H的生成時(shí)熒光強(qiáng)度變化圖；
[0027]圖5b為本發(fā)明實(shí)施例提供的在pH為4(醋酸緩沖液)的條件下對(duì)苯二甲酸(TA)作為熒光探針檢測(cè).0H的生成時(shí)熒光強(qiáng)度變化圖；
[0028]圖6a為本發(fā)明實(shí)施例提供的耐氨芐青霉素大腸桿菌在有近紅外光照和無光照時(shí)的變化圖；
[0029]圖6b為本發(fā)明實(shí)施例提供的耐氨芐青霉素枯草芽孢桿菌在有近紅外光照和無光照時(shí)的變化圖；
[0030]圖6c為本發(fā)明實(shí)施例提供的耐氨芐青霉素大腸桿菌的存活率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖；
[0031 ]圖6d為本發(fā)明實(shí)施例提供的耐氨芐青霉素枯草芽孢桿菌的存活率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖；
[0032]圖6e為本發(fā)明實(shí)施例提供的各組抗耐藥菌情況比對(duì)圖；
[0033]圖7a為本發(fā)明實(shí)施例提供的MoS2納米片和耐氨芐青霉素大腸桿菌作用后的掃描電子顯微鏡圖；
[0034]圖7b為本發(fā)明實(shí)施例提供的MoS2納米片和耐氨芐青霉素枯草芽孢桿菌作用后的掃描電子顯微鏡圖；
[0035]圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同濃度MoS2納米片對(duì)人源宮頸癌細(xì)胞A549活性的影響結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。在本發(fā)明的一個(gè)附圖或一種實(shí)施方式中描述的元素和特征可以與一個(gè)或更多個(gè)其它附圖或?qū)嵤┓绞街惺境龅奶卣飨嘟Y(jié)合。應(yīng)當(dāng)注意，為了清楚的目的，附圖和說明中省略了與本發(fā)明無關(guān)的、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的部件和處理的表示和描述?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0037]本發(fā)明提供一種納米硫化鉬抗菌材料的合成方法，包括以下的步驟:
[0038](I)將聚乙二醇固體溶于水中，在超聲池內(nèi)超聲到聚乙二醇完全溶解后，加入七鉬酸銨固體，再次超聲使七鉬酸銨完全溶解，得混合溶液；
[0039](2)取硫脲固體溶于水中，攪拌溶解后加入到所述混合溶液中，再次攪拌后置于聚四氟乙烯內(nèi)膽的水熱反應(yīng)釜中，密封，加熱反應(yīng)，得到黑色沉淀，即為納米硫化鉬抗菌材料。
[0040] 優(yōu)選地，所述黑色沉淀用無水乙醇和二次水反復(fù)洗滌3-5次，配成lmg/mL的水溶液存放。
[0041 ]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，聚乙二醇與水的質(zhì)量體積比為0.3-0.5g: 20mLo
[0042]優(yōu)選地，所述聚乙二醇與七鉬酸銨的質(zhì)量比為0.3-0.5:0.1766。
[0043]優(yōu)選地，所述聚乙二醇與硫脲的質(zhì)量摩爾比為0.3-0.5g: 2mmol。
[0044]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，硫脲與水的摩爾體積比為2mmol: 10-20mL。
[0045]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，再次攪拌的時(shí)間為5-15分鐘，和/或加熱的溫度為160-2000C，反應(yīng)的時(shí)間為10-15小時(shí)。
[0046]采用本發(fā)明的合成方法得到的產(chǎn)品產(chǎn)率高、尺寸可控、生物相容性好、擬酶催化活性高，并易于被細(xì)菌捕獲。
[0047]下面通過具體的實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:
[0048]實(shí)施例1
[0049]納米硫化鉬抗菌材料的一步水熱法合成方法:
[0050]0.5g分子量為20000的聚乙二醇(PEG)固體溶于20mL去離子水中，在超聲池內(nèi)超聲至IjPEG完全溶解后，加入0.1766g七鉬酸銨固體，超聲10分鐘使其完全溶解，得到混合溶液。取2mmo I的硫脲固體溶于I OmL去離子水中，攪拌溶解后加入上述混合溶液中，攪拌1分鐘后置于聚四氟乙烯內(nèi)膽的水熱反應(yīng)釜中，密封，于180°C反應(yīng)12小時(shí)。所得黑色沉淀用無水乙醇和二次水反復(fù)洗滌3-5次，配成lmg/mL的水溶液存放。
[0051 ] 實(shí)施例2
[0052]與實(shí)施例1基本相同，所不同的是:
[0053]所述步驟(I)中，聚乙二醇與水的質(zhì)量體積比為0.4g: 20mLo
[0054]所述聚乙二醇與七鉬酸銨的質(zhì)量比為0.3:0.1766。
[0055]所述聚乙二醇與硫脲的質(zhì)量摩爾比為0.4g:2mmol。
[0056]所述步驟(2)中，硫脲與水的摩爾體積比為2mmol: 15mL。
[0057]所述步驟(2)中，再次攪拌的時(shí)間為5分鐘，和/或加熱的溫度為200°C，反應(yīng)的時(shí)間為10小時(shí)。
[0058]實(shí)施例3
[0059]所述步驟(I)中，聚乙二醇與水的質(zhì)量體積比為0.3g: 20mLo
[0060]所述聚乙二醇與七鉬酸銨的質(zhì)量比為0.4:0.1766。
[0061 ] 所述聚乙二醇與硫脲的質(zhì)量摩爾比為0.3g:2mmol。
[0062]所述步驟(2)中，硫脲與水的摩爾體積比為2mmol:20mL。
[0063]所述步驟(2)中，再次攪拌的時(shí)間為15分鐘，加熱的溫度為160°C，反應(yīng)的時(shí)間為15小時(shí)。
[0064]本發(fā)明還提供一種納米硫化鉬抗菌材料，按照上述的合成方法制備得到。
[0065]本發(fā)明根據(jù)耐藥菌治療的迫切需求，通過簡(jiǎn)單的一步水熱合成法，結(jié)合聚合物聚乙二醇(PEG)表面修飾，解決構(gòu)建產(chǎn)率高、尺寸可控、生物相容性好、擬酶催化活性高和易于被細(xì)菌捕獲的MoS2納米抗菌劑的關(guān)鍵技術(shù)問題。
[0066]參見圖1，本發(fā)明的合成方法得到的納米硫化鉬抗菌材料呈花狀結(jié)構(gòu)，其直徑小于lOOnm，組成花狀結(jié)構(gòu)的片層的尺寸在25-30nm范圍內(nèi)。
[0067]本發(fā)明又提供一種上述的納米硫化鉬抗菌材料在擬酶催化過氧化氫(H2O2)聯(lián)合近紅外光熱協(xié)同抗菌中的應(yīng)用。
[0068]參見圖2，采用本發(fā)明如圖2所示的步驟，說明本發(fā)明構(gòu)建的擬酶催化H2O2聯(lián)合NIR光熱的協(xié)同納米抗耐藥菌體系能夠簡(jiǎn)單高效地抑制耐藥菌。
[0069]本發(fā)明首次將納米MoS2的過氧化物酶擬酶催化劑的功能與其NIR光熱抗菌功能聯(lián)合，針對(duì)單一光熱抗菌中的不足，提出擬酶催化H2O2聯(lián)合NIR光熱協(xié)同抗菌新技術(shù)策略，這一擬酶催化H2O2有效產(chǎn)生.0H并能增敏光熱對(duì)耐藥菌殺傷的策略簡(jiǎn)單高效，縮短了光熱抗菌時(shí)間，避免了長(zhǎng)時(shí)間激光照射可能帶來的各種副作用，大幅度提高了抑菌率，為開發(fā)新型抗耐藥菌納米藥物提供新契機(jī)。
[0070]本發(fā)明提供一種擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱的協(xié)同納米抗耐藥菌組合體系，包括上述的納米硫化鉬抗菌材料、過氧化氫及近紅外激光器。
[0071]采用本發(fā)明的抗菌體系，其抗菌效果明顯優(yōu)于單一的擬酶催化或者單一的近紅外光熱抗菌。
[0072]優(yōu)選地，所述納米硫化鉬抗菌材料的水溶液濃度為lmg/mL，所述H2O2的濃度為100-200μΜ，所述納米硫化鉬抗菌材料的水溶液與H2O2的用量體積比為1:1或者1:2，所述近紅外激光器為近紅外808nm波長(zhǎng)激光器，用于對(duì)加入納米硫化鉬抗菌材料的水溶液和H2O2后的反應(yīng)液進(jìn)行6-10分鐘光照。
[0073]下面通過具體的實(shí)驗(yàn)來說明納米硫化鉬抗菌材料在擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱協(xié)同抗菌中的應(yīng)用效果。
[0074]MoS2納米片的近紅外(NIR)光熱效應(yīng)和過氧化酶擬酶催化活性的研究
[0075](I)NIR光熱效應(yīng)的研究
[0076]具有高的NIR光熱轉(zhuǎn)換效率的MoS2納米片是其用于光熱抗菌治療的基礎(chǔ)。參見圖3a和圖3b，測(cè)試了樣品在808nm連續(xù)激光器照射功率不變時(shí)，30-500ppm濃度范圍的MoS2水溶液在連續(xù)光照10分鐘內(nèi)的升溫曲線，停止光照后自然降溫，用近紅外熱像儀監(jiān)控升降溫過程。圖3b為500ppm的MoS2納米片水溶液在近紅外光照10分鐘后自然冷卻過程的溫度變化圖。發(fā)現(xiàn)該MoS2納米片在808nm處的光熱效應(yīng)對(duì)耐氨芐青霉素革蘭氏陰性大腸桿菌具有一定抑制效果，NIR光熱轉(zhuǎn)換效率高。
[0077](2)過氧化物酶擬酶催化活性的研究
[0078]參見圖4，圖4為MoS2濃度依賴的擬酶催化活性效果，其中四甲基聯(lián)苯胺(TMB)濃度為 ImM ,H2O2 濃度為 1mM。
[0079]擬酶催化活性高是納米MoS2進(jìn)行有效擬酶催化H2O2聯(lián)合光熱抗菌的關(guān)鍵。利用上述一步水熱合成法得到的MoS2為研究對(duì)象，在磷酸氫二鈉和檸檬酸的緩沖體系中，將四甲基聯(lián)苯胺TMB( ImM)和H2O2 (1mM)作為過氧化物酶底物，研究雙底物存在下MoS2催化H2O2氧化TMB的反應(yīng)，通過溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色和TMB吸收值的變化來說明該材料的確具有過氧化物酶擬酶催化活性。同時(shí)，在設(shè)計(jì)的擬酶催化過氧化氫聯(lián)合光熱協(xié)同抗菌體系中，.0H可促使細(xì)菌細(xì)胞壁的有效破裂，而擬酶催化過程恰恰會(huì)促使H2O2有效分解產(chǎn)生.0H。因此，在H2O2+MoS2體系中，加入對(duì)苯二甲酸(TA)的醋酸緩沖溶液，攪拌均勻并避光12小時(shí)后，利用.0H能夠與TA反應(yīng)生成有熒光的2-羥基對(duì)苯二甲酸(TAOH)(激發(fā):315nm，發(fā)射:435nm)，從而根據(jù)產(chǎn)生的熒光峰的強(qiáng)弱來判斷MoS2催化低劑量H2O2并有效產(chǎn)生.0H。類似方法可測(cè)得不加H2O2時(shí)，MoS2+TA以及純TA是否產(chǎn)生熒光，并與TA+H202+MoS2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，得出結(jié)論。
[0080] 參見圖5a和圖5b，TA作為熒光探針檢測(cè).0H的生成過程中，圖5a為pH為7(二次水)的條件下MoS2、TA、MoS2+TA、H202+TA、MoS2+H202+TA五種不同溶液反應(yīng)12小時(shí)后對(duì)TA熒光強(qiáng)度的影響；圖5b為pH為4(醋酸緩沖液)的條件下MoS2、TA、MoS2+TA、H202+TA、MoS2+H202+TA五種不同溶液反應(yīng)12小時(shí)后對(duì)TA熒光強(qiáng)度的影響。擬酶催化引起的熒光強(qiáng)度的增加遠(yuǎn)高于材料自身產(chǎn)生.0H引起的熒光強(qiáng)度的增加，說明擬酶催化H2O2過程中產(chǎn)生了大量的.0H。(其中，H2O2:1OOyM1MoS2:10yg/mL，TA: 0.5mM) JA無熒光，但接觸到.0H后能生成TAOH，而TAOH在315nm的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)下，發(fā)射峰位于435nm，從而可檢測(cè)到.0H的生成。
[0081 ] (3)協(xié)同抗菌體系的具體實(shí)施方案
[0082]選取兩種典型的耐藥菌作為研究對(duì)象:耐氨芐青霉素大腸桿菌(革蘭氏陰性)和枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性)。分別配置這兩種耐藥菌的培養(yǎng)基。于含有50yg/L氨芐青霉素濃度下的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至少三代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株培養(yǎng)菌液用pH為7.0，濃度為0.05M，體積為3mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并稀釋至lxl06CFU/mL濃度。取上述濃度的細(xì)菌稀釋液50yL，加入到350yL的pH為7.0的？83溶液中，混勻后加入5(^上述配好的lmg/mL納米硫化鉬水溶液，震蕩混勻。將實(shí)驗(yàn)過程分為八組:(I)對(duì)照、(II)對(duì)照+光照、
(III)過氧化氫(H2O2)、(IV)H2O2+光照、(V)MoS2、(VI)MoS2+光照、(VII )MoS2+H202和(VIII)MoSdH2O2+光照組。對(duì)于協(xié)同組VI11，加入50yL，ΙΟΟμΜ的H2O2并孵育10分鐘，隨后用近紅外808nm波長(zhǎng)激光器的激光照射1分鐘，控制溫度維持在50 V。取最終反應(yīng)液I OOyL均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上于37 °(:恒溫培養(yǎng)18小時(shí)，記錄細(xì)菌的菌落個(gè)數(shù)。第II1、第IV以及第VII組所用H2O2濃度和作用時(shí)間均與第VIII組一致。相比不加H2O2和近紅外激光處理的對(duì)照組(抑菌率為O)，以及單獨(dú)H2O2和單獨(dú)近紅外光處理過的細(xì)菌組。主要利用平板菌落計(jì)數(shù)法來更真實(shí)準(zhǔn)確地反映細(xì)菌活力的變化，計(jì)算單一治療組和協(xié)同治療組的抑菌率，其協(xié)同抗菌組的抑菌率可達(dá)到97.5%以上。通過掃描電子顯微鏡(SEM)直接觀察細(xì)菌表面與以上各組作用后是否產(chǎn)生破壁或明顯空洞結(jié)構(gòu)。抑菌率=100-細(xì)菌存活率。和醫(yī)用H2O2濃度(166mM-lM)相比，這一組合體系不但可以縮短光熱抗菌時(shí)間，大大降低H2O2的有效使用濃度，而且有效提高了抑菌率。
[0083]對(duì)于第VI11組實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明采用一定濃度范圍的納米硫化鉬水溶液+H2O2+近紅外808nm波長(zhǎng)激光器，激光照射1分鐘，抑菌率可達(dá)到99 %以上。其中，納米硫化鉬的最佳濃度范圍為100-200yg/mL。圖6e所示為H2O2濃度(I ΟΟμΜ)和光照時(shí)間保持不變，改變MoS2濃度時(shí)，第VIII組與其他組相比的抗耐藥菌情況，由圖6e可知，在MoS2濃度為200yg/mL時(shí)的協(xié)同抗菌效率可達(dá)到99%以上。
[0084]對(duì)于第VIII組實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明采用納米硫化鉬水溶液+H2O2+近紅外808nm波長(zhǎng)激光器的激光照射6分鐘，控制溫度維持在50°C，抑菌率可達(dá)到90%以上。
[0085]參見圖6a、圖6b、圖6c和圖6d。平板計(jì)數(shù)法證明擬酶催化過氧化氫聯(lián)合光熱協(xié)同治療策略對(duì)圖6a的耐氨芐青霉素大腸桿菌和圖6b的耐氨芐青霉素枯草芽孢桿菌具有高效抑制作用；實(shí)驗(yàn)中MoS2和H2O2的濃度固定不變。(MoS2:100yg/mL，H202:100yM，材料與細(xì)菌孵育時(shí)間:20分鐘，光照時(shí)間:1分鐘，功率:I W/cm2)。耐氨芐青霉素大腸桿菌的存活率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，由圖6c可知，與對(duì)照組和其他單一治療組比較，協(xié)同治療組VIII對(duì)該細(xì)菌的抑制效率可達(dá)到99% (抑菌率= 100-細(xì)菌存活率)；耐氨芐青霉素枯草芽孢桿菌的存活率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，由圖6d可知，與對(duì)照組和其他單一治療組比較，協(xié)同治療組VIII對(duì)該細(xì)菌的抑制效率可達(dá)到98% (抑菌率=100-細(xì)菌存活率)。
[0086]參見圖7a和圖7b:圖7aSMoS2納米片和耐氨節(jié)青霉素大腸桿菌作用后的掃描電子顯微鏡圖；圖7b為MoS2納米片內(nèi)生孢子型枯草芽孢桿菌作用后的掃描電子顯微鏡圖。本發(fā)明中納米MoS2片與細(xì)菌作用后的形態(tài)，可通過掃描電鏡觀察，觀察發(fā)現(xiàn)，在協(xié)同抗菌治療組中，細(xì)菌表面具有明顯的空腔和破損，有的細(xì)菌還出現(xiàn)了明顯的皺褶。而單一治療組中的MoS2+H202組雖然也能觀察到細(xì)菌表面的破損，但破損程度遠(yuǎn)不及協(xié)同治療(VIII)M0SAH2O2+光照組。而前期分散性良好的PEG修飾的MoS2是其被細(xì)菌有效捕獲的關(guān)鍵前提，因此，可以從單一的MoS2組觀察到MoS2可與細(xì)菌有緊密的接觸，有的細(xì)菌甚至被MoS2緊密包裹。
[0087]參見圖8，不同濃度MoS2納米片對(duì)人源宮頸癌細(xì)胞A549活性的影響。由圖可知，該材料在250yg/毫升的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的毒性很小，細(xì)胞存活率能達(dá)到85%以上，這說明利用水熱合成法制備的MoS2納米片具有好的生物相容性。
[0088]上述的研究表明，本發(fā)明在可控合成和PEG聚合物表面修飾基礎(chǔ)上，構(gòu)建一種新型的納米抗菌體系，該體系具有生物安全性好、擬酶催化活性高、易于被細(xì)菌捕獲、協(xié)同抗耐藥菌效率高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步拓展納米抗菌體系在耐藥菌治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供新思路。協(xié)同抗菌策略可以克服單一納米抗菌治療體系中的諸多問題。本發(fā)明將NIR光熱療法和其他治療手段聯(lián)合，構(gòu)建可高效抗耐藥菌感染的納米藥物體系是制約該材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域深入研究的主要瓶頸。過氧化氫(H2O2)是一種優(yōu)良的醫(yī)用抗菌劑，H2O2分解產(chǎn)生的羥基自由基(.0H)比H2O2殺菌效果更佳。然而，H2O2在有效抗菌濃度時(shí)(170mmOl/L-lmOl/L)會(huì)對(duì)正常組織造成損害，其產(chǎn)生.0H的速度緩慢、效率低，而且易產(chǎn)生耐藥性。MoS2納米片可作為催化劑激活H2O2,使其有效分解為.0H，展現(xiàn)了良好的過氧化物酶擬酶催化活性，其催化活性可通過底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)被H2O2分解產(chǎn)生的.0H快速氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物來直接觀察和驗(yàn)證。而且，納米MoS2可克服天然辣根過氧化物酶的不穩(wěn)定和易被蛋白酶消解等劣勢(shì)。本發(fā)明利用MoS2催化劑的功能并聯(lián)合熱療來構(gòu)建高時(shí)效抗耐藥菌感染的多功能納米MoS2平臺(tái)。.0H可促使細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生氧化應(yīng)激并使細(xì)胞壁有效破裂，這可以彌補(bǔ)光熱抗菌中細(xì)胞壁較厚造成的短期熱療效果差的不足。
[0089]本發(fā)明利用MoS2納米片NIR光熱效應(yīng)好、比表面積大等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，結(jié)合其過氧化物酶擬酶催化劑的功能，為進(jìn)一步推動(dòng)該材料在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用，在實(shí)現(xiàn)產(chǎn)率高、尺寸小于lOOnm、生物相容性好的新型M0S2納米片的可控合成基礎(chǔ)上，利用該材料NIR光熱效應(yīng)好、比表面積大等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，并結(jié)合其過氧化物酶擬酶催化劑的功能，克服單一光熱治療中的不足，建立擬酶催化H2O2聯(lián)合NIR光熱的協(xié)同納米抗耐藥菌體系，研究納米MoS2對(duì)兩種典型革蘭氏陰性和革蘭氏陽性耐藥菌株的抗菌消炎效果，這種協(xié)同抗耐藥菌策略成本低，綠色環(huán)保、無需和貴金屬等抗菌材料復(fù)合，治療過程簡(jiǎn)單高效，為拓展和開發(fā)新型多功能抗耐藥菌感染的納米藥物提供了新思路。
[0090]最后應(yīng)說明的是:雖然以上已經(jīng)詳細(xì)說明了本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，但是應(yīng)當(dāng)理解在不超出由所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種改變、替代和變換。而且，本發(fā)明的范圍不僅限于說明書所描述的過程、設(shè)備、手段、方法和步驟的具體實(shí)施例。本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員從本發(fā)明的公開內(nèi)容將容易理解，根據(jù)本發(fā)明可以使用執(zhí)行與在此所述的相應(yīng)實(shí)施例基本相同的功能或者獲得與其基本相同的結(jié)果的、現(xiàn)有和將來要被開發(fā)的過程、設(shè)備、手段、方法或者步驟。因此，所附的權(quán)利要求旨在在它們的范圍內(nèi)包括這樣的過程、設(shè)備、手段、方法或者步驟。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種納米硫化鉬抗菌材料的合成方法，其特征在于，包括以下的步驟: (1)將聚乙二醇固體溶于水中，在超聲池內(nèi)超聲到聚乙二醇完全溶解后，加入七鉬酸銨固體，再次超聲使七鉬酸銨完全溶解，得混合溶液； (2)取硫脲固體溶于水中，攪拌溶解后加入到所述混合溶液中，再次攪拌后置于聚四氟乙烯內(nèi)膽的水熱反應(yīng)釜中，密封，加熱反應(yīng)，得到黑色沉淀，即為納米硫化鉬抗菌材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述黑色沉淀用無水乙醇和二次水反復(fù)洗滌3-5次，配成lmg/mL的水溶液存放。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步驟(I)中，聚乙二醇與水的質(zhì)量體積比為0.3-0.5g: 20mL;和/或所述聚乙二醇與七鉬酸銨的質(zhì)量比為0.3-0.5:0.1766。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步驟(2)中，硫脲與水的摩爾體積比為2mmol: 10_20mL;和/或所述聚乙二醇與硫脲的質(zhì)量摩爾比為0.3_0.5g: 2mmol。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的合成方法，其特征在于，所述步驟(2)中，再次攪拌的時(shí)間為5-15分鐘，和/或加熱的溫度為160-200°C，反應(yīng)的時(shí)間為10-15小時(shí)。6.一種納米硫化鉬抗菌材料，其特征在于，按照權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的合成方法制備得到。7.根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米硫化鉬抗菌材料，其特征在于，所述納米硫化鉬抗菌材料呈花狀結(jié)構(gòu)，其直徑小于lOOnm，組成花狀結(jié)構(gòu)的片層的尺寸在25-30nm范圍內(nèi)。8.—種權(quán)利要求8或9所述的納米硫化鉬抗菌材料在擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱協(xié)同抗菌中的應(yīng)用。9.一種擬酶催化過氧化氫聯(lián)合近紅外光熱的協(xié)同納米抗耐藥菌組合體系，其特征在于，包括權(quán)利要求8或9所述的納米硫化鉬抗菌材料、過氧化氫及近紅外激光器。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的協(xié)同納米抗耐藥菌組合體系，其特征在于，所述納米硫化鉬抗菌材料的水溶液濃度為1.0mg/mL，所述H2O2的濃度為100-200μΜ，所述納米硫化鉬抗菌材料的水溶液與H2O2的用量體積比為1:1或者1: 2，所述近紅外激光器為近紅外808nm波長(zhǎng)激光器，用于對(duì)加入納米硫化鉬抗菌材料的水溶液和H2O2后的溶液進(jìn)行6-10分鐘光照。
【文檔編號(hào)】B82Y30/00GK105948124SQ201610258244
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】尹文艷, 余杰, 谷戰(zhàn)軍, 趙宇亮
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所