專利名稱：水稻谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶基因、蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學與基因工程領域，更具體地，本發(fā)明涉及水稻谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶基因、其蛋白產(chǎn)物及其應用。谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathioneperoxidase,PHGPx)可直接還原磷脂氫過氧化物，從而有效地保護細胞膜免受氫過氧化物的損傷，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個能還原磷脂氫過氧化物的重要抗氧化酶(Fulvio Ursini等人，Biochimica etBiophysica Acta 839(1985)62-70；Regina Brigelius-Flohe等人，生物化學雜志(The Journal of Biological Chemistry)269(1994)7342-7348.；Kunio Yagi等人，生物化學和生物物理研究通訊(Biochemical andBiophysical Research Communications)219(1996)486-491)。
眾所周知，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，其主要作用是清除H2O2和許多有機氫過氧化物，其作用過程是GPx使H2O2還原為H2O，或使許多有機氫過氧化物(ROOH)還原為相應的醇(ROH)，只是在催化反應中需要還原型谷胱甘肽作為氫供體，而起重要作用的活性部位位于其序列的硒代半胱氨酸(SeCys)上(L.Flohé等人，酶學方法(MethodsEnzymol.)105(1984)114-121)。機體內(nèi)過量的氧自由基如羥自由基可誘發(fā)脂類過氧化，除了直接造成生物膜損傷外，還可通過脂類氫過氧化物與蛋白質(zhì)(包括酶)或核酸反應，使機體組織發(fā)生廣泛性損傷(C.H.Foyer等人，植物、細胞和環(huán)境(Plant,Cell and Environment)17(1994)507-523.)。GPx具有清除脂類氫過氧化物的能力，可以有效地使脂類氫過氧化物對機體的損傷得以減輕(L.Flohé等人，文獻同上)。但是細胞膜上磷脂的過氧化是造成細胞瓦解的最初也是最根本的原因之一，而GPx卻不能還原細胞膜上的磷脂氫過氧化物，說明生物體內(nèi)肯定存在另一種行使這一功能的重要的酶。
1982年Ursini從鼠和豬的不同器官中分離純化出一種“過氧化作用抑制蛋白”，該蛋白能直接保護生物膜上磷脂免受過氧化損傷，并發(fā)現(xiàn)該蛋白是一種含硒酶，在谷胱甘肽的存在下能特異性地還原膜上的磷脂過氧化物，故將其命名為谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶。
PHGPx與GPx在構(gòu)成亞基數(shù)、還原底物特異性、保護生物膜以及激素調(diào)控等方面有著明顯區(qū)別(F.Ursini等人，酶學方法252(1995)38-53)。在構(gòu)成上PHGPx是單亞基蛋白，而GPx是四聚體蛋白。在還原底物的特異性上，PHGPx能還原多種磷脂氫過氧化物尤其是能直接還原磷脂和膽固醇的氫過氧化物，且對H2O2活性低；而GPx能還原H2O2、有機氫過氧化物和游離脂肪酸氫過氧化物，但不能還原磷脂氫過氧化物，對H2O2活性高。這就決定了它們在保護細胞膜方面的功能不同。PHGPx能直接降解脂類過氧化物，哪怕是那些嵌在生物膜上的復雜脂類，而GPx只能與磷脂酶協(xié)同作用來阻止脂類的過氧化。因此PHGPx被認為是保護生物膜免受氧化破壞的主要途徑，而GPx則被認為是在保護膜免受可溶性氫過氧化物的破壞中起作用，或在生物膜的修復過程中與磷脂酶協(xié)同作用。另一顯著的區(qū)別是PHGPx基因的5’不翻譯區(qū)和第一個內(nèi)含子中包含有許多受激素調(diào)控的調(diào)節(jié)元件，如雌激素、黃體酮和糖皮質(zhì)激素反應元件等，而GPx均不具有激素依賴性。
上述結(jié)果是對哺乳動物PHGPx研究所取得的，而對植物PHGPx的研究，時至1995年，以色列人才從培養(yǎng)的柑桔細胞中部分純化出鹽脅迫相關蛋白，測得其分子量約為22,000Da，并具有對卵磷脂氫過氧化物的催化活性，這是第一個也是唯一一個得到證實的植物PHGPx(Talia Beeor-Tzahar等人，F(xiàn)EBS通信366(1995)151-155)。
本發(fā)明的一個目的在于提供水稻PHGPx基因及其蛋白序列。
本發(fā)明的第二個目的在于提供水稻PHGPx基因及其蛋白質(zhì)在制備抗衰老的生物細胞及個體中的應用。
本發(fā)明人將先進的RACE-PCR技術應用于水稻PHGPx基因的克隆，并成功地克隆出水稻PHGPx的全長cDNA，實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。因此，本發(fā)明的一個方面涉及水稻PHGPx的全長cDNA，其長度為921bp，具有SEQ ID NO:1中所示的DNA序列，其中的507bpORF編碼169個氨基酸殘基，3’和5’的非編碼區(qū)分別為344bp和70bp，其多腺苷化信號AAUAUA位于終止密碼子下游95bp處。本發(fā)明還涉及由所述的水稻PHGPx的全長cDNA序列推導的蛋白質(zhì)序列，其具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，本發(fā)明的水稻PHGPx是含有169個氨基酸的多肽，其理論分子量為19,234Da。
本發(fā)明的水稻PHGPx基因可插入表達載體進行表達，因此，本發(fā)明的另一方面涉及能在宿主細胞中表達水稻PHGPx基因的表達載體，所述的表達載體可以是用于在細菌如大腸桿菌中表達的載體，也可以是用于在植物特別是水稻中表達的載體。如下文實施例所述，本發(fā)明人已使水稻PHGPx基因成功地在大腸桿菌中獲得高效表達，經(jīng)用過氧化氫處理表達PHGPx的細胞，與對照相比成活率顯著提高，在10μg/ml的濃度處理2小時其成活率是對照的2.5倍。顯示表達蛋白具有抵抗氧化、清除氧自由基的活性，表明該蛋白可應用于植物轉(zhuǎn)基因工程，來制備提高抗衰老的生物細胞及個體。
以下將參照附圖以實施例描述本發(fā)明，應理解的是實施例僅舉例描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。


圖1示出本發(fā)明的的水稻PHGPx與其它動植物PHGPx的氨基酸序列同源性比較，圖中RI、CI、SP、TB、TM、HU和PO分別代表水稻、柑桔、菠菜、煙草、番茄、人和豬的PHGPx的氨基酸序列。
圖2示出本發(fā)明的PHGPx在大腸桿菌中表達的策略。
圖3A示出如實施例5所示本發(fā)明的水稻PHGPx在大腸桿菌中的表達，圖3B示出重組蛋白的純化，圖中，M為蛋白質(zhì)分子量標準，泳道1-6為篩選到的6個表達克隆，泳道7為Ni-NTA樹脂親和層析純化得到的重組蛋白。
圖4示出用于在水稻中表達PHGPx的植物表達載體pUBIBIAPHGPx的構(gòu)建策略。
實施例1 帶有雙接頭的水稻苗cDNA文庫的構(gòu)建將水稻栽培品種中丹2號(購自中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所)在溫室自然光下培養(yǎng)至3葉期，收集葉片，采用Promega公司的PolyATtractSystem 1000提取mRNA，用Clontech的MarathonTMcDNA擴增試劑盒合成cDNA，再連上接頭，構(gòu)建成兩端帶有接頭的水稻苗cDNA文庫。1．水稻mRNA的提取用Promega公司PolyATtractSystem 1000提取水稻葉片的mRNA，具體操作步驟如下1)稱取中丹2號3葉期葉片0.5克，在液氮中充分研磨，將研磨后的粉末移至50ml離心管中，立即加入2ml抽提緩沖液，用勻漿器充分勻漿后加入4ml預熱至70℃的稀釋緩沖液，顛倒混勻。
2)加入5μl生物素化的寡聚(dT)核苷酸探針，搖勻后于70℃溫浴5min。
3)移至50ml離心管中，室溫下12,000rpm離心10min。
4)離心終止后小心將上清移入含有2ml SA-PMPs磁球的錐形管中，上下顛倒混勻，室溫放置2min后，用磁鐵吸附SA-PMPs磁球，直至溶液澄清，并小心棄去上清。
5)用2ml SSC(0.5×)重懸顆粒，并將懸浮液移至該試劑盒配備的mRNA User管中，用磁鐵再次吸附SA-PMPs磁球顆粒，小心吸去SSC溶液。重復洗滌2次。
6)加入2ml無RNase的超純水，混勻，然后用磁鐵吸附磁球顆粒，
直至溶液澄清。
7)將含有mRNA的上清轉(zhuǎn)移至一新管中，加1/10體積3M NaAc(PH5.0)和等體積異丙醇，混勻后-20℃放置過夜。
8)4℃12,000rpm離心10min，棄去上清，用70％乙醇離心洗滌沉淀。
9)真空干燥沉淀15分鐘左右，用適量體積的超純水懸浮沉淀使終濃度為0.5～1.0μg/μl,-70℃保存?zhèn)溆谩?.cDNA文庫的構(gòu)建根據(jù)Clontech公司MarathonTMcDNA擴增試劑盒的操作程序，先以水稻mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，然后以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈，再將雙鏈cDNA兩頭連上接頭構(gòu)成兩端帶有接頭的cDNA文庫，具體操作步驟如下1)在0.5ml微量離心管中加入下列反應物RNA樣品(polyA+)(1μg) 4μlcDNA合成引物(10μM)1μl5×第一鏈緩沖液2μldNTP混合物(10mM) 1μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶(20μ/μl) 1μl加水將總體積補足10μl。
其中cDNA合成引物的序列為5’-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)30N-1N-3’。
2)輕輕吹打混勻并稍加離心后，于42℃空氣浴1小時以合成cDNA。然后將反應管放置在冰上以中止第一鏈合成反應。
3)在第一鏈反應管中加入下列反應物ddH2O 48.4μl第二鏈緩沖液(5×) 16μl
dNTP混合物(10mM) 6μl第二鏈酶混合液(20×) 4μl總體積80μl，混勻后16℃溫浴1.5小時。
4)加入2μl(10單位)T4 DNA聚合酶，混勻后16℃反應45分鐘。
5)加4μl EDTA/Glycogen混合液以終止第二鏈合成反應。
6)加入100μl苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分混合后14,000rpm離心10min。
7)將上層水相移入新管中，加入100μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，振蕩混勻后14,000rpm離心10min。
8)將上層水相移入新管中，加入1/2體積的4M醋酸銨和2.5倍體積乙醇，混勻后14,000rpm室溫離心20min以沉淀合成的雙鏈cDNA。
9)用300μl80％乙醇離心洗滌沉淀，空氣中干燥10min后，用10μ無菌水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?．接頭連接按Clontech公司的操作程序，將Marathon cDNA接頭連接至上述合成的雙鏈cDNA的兩端，具體步驟如下1)在0.5ml微量離心管中加入下列反應物雙鏈cDNA5μlMarathon cDNA接頭(10μM)2μl5×DNA連接緩沖液2μlT4 DNA連接酶(1unit/μl)1μl總體積為10μl，混勻后16℃連接過夜。
其中Marathon cDNA接頭的序列為5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’3’-H2N-CCCGTCCA-PO4-5’。
2)70℃處理5分鐘滅活連接酶后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈cDNA的濃度及質(zhì)量，結(jié)果為2μl樣品電泳后的帶的總量約0.5μg，估算所得雙鏈cDNA的濃度約0.25μg/μl。至此，已構(gòu)建成了一個兩端含有接頭的水稻苗雙鏈cDNA文庫。實施例2 用RACE-PCR擴增全長水稻PHGPx基因根據(jù)動植物PHGPx中高度保守的一段氨基酸序列VNVASQCG(Yuval Eshdat等人，植物生理學(Physiologia Plantarum)100(1997)234-240；M.Shure等人，細胞(1983)35:225-233)以及水稻所偏愛的密碼子合成了一套適合克隆水稻PHGPx基因的23nt的簡并引物用于3’RACE-PCR擴增，然后再根據(jù)3’RACE-PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，合成引物進行5’RACE-PCR，最后進行首尾(end-to-end)PCR，擴增出全長水稻PHGPx基因。1.3’RACE-PCR擴增水稻PHGPx基因的3’端根據(jù)氨基酸保守序列由賽百盛公司合成了用于3’RACE-PCR的5’端引物RP2，其序列為5’-GT(AGCT)AA(CT)GT(AGCT)GC(AGCT)(AT)(GC)(AGCT)CA(AG)TG(TC)GG-3’。用Clontech公司的MarathonTMcDNA擴增試劑盒進行3’RACE-PCR擴增，其具體步驟如下1)將下列反應物加入0.5ml PCR反應管中10×PCR緩沖液5μlMgCl2(25mM) 5μldNTPs(10mM) 1μlEx Taq(2.5μ/μl)1μl水稻cDNA(約0.2ng/l) 5μl合成引物RP2(20pmol/μl) 1μl接頭引物AP2(20pmol/μl) 1μl
ddH2O31μl總體積為50μl。
其中接頭引物AP2的序列為5’-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3’。
混勻后，按下列程序進行PCR擴增94℃ 30s；94℃ 5s；72℃2.5min(5個循環(huán))；94℃ 5s；70℃2.5min(5個循環(huán))；94℃ 5s；68℃2.5min(20個循環(huán))。
2)3’RACE-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈現(xiàn)兩條帶，一條分子量稍大，約750bp，另一條分子量較小，約650bp。
3)將PCR產(chǎn)物用Promega公司的WizardPCR擴增DNA純化試劑盒分離純化后，分別克隆進Takaka公司的pMD18T-Vector上，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選出單克隆，將插入較大片段的命名為pM3RB6，較小片段的為pM3RS10。
4)將pM3RB6交Takaka公司用末端終止法進行雙向測序，其結(jié)果表明該片段長為740bp，其所含編碼區(qū)編碼132個氨基酸，與已知的動植物PHGPx蛋白的C端具有較高的同源性?？梢哉J為該片段是水稻中存在的PHGPx基因的3’端部分。
2、5’RACE-PCR擴增水稻PHGPx基因的5’端根據(jù)用3’RACE-PCR擴增出的水稻PHGPx基因3’端的序列，合成了用于5’RACE-PCR的3’端引物RP1，其序列為5’-AGGGACTGGTCGCAGTCGAGTATCT-3’。5’RACE-PCR的具體操作步驟除引物不同，即采用上述合成引物RP1和接頭引物AP1(序列為5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)外，均與3’RACE-PCR步驟相同。將PCR產(chǎn)物走瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示一條約550bp的帶，該片段經(jīng)Promega公司的WizardPCR擴增DNA純化試劑盒純化后插入Takaka公司的pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選出單克隆并命名為pM5R18。由Takara公司采用末端終止法雙向測序，結(jié)果讀出了539bp的序列，其中最長的閱讀框架編碼156個氨基酸。該序列的3’端與pM3RB6插入片段的5’端有357bp是重疊的，表明該片段中含有水稻PHGPx基因的5’端部分。若將3’RACE-PCR所擴片段與5’RACE-PCR所擴片段拼接起來，則完整的閱讀框架編碼169個氨基酸，與動物PHGPx基因所編碼氨基酸數(shù)目一致，表明已獲得全長閱讀框架的水稻PHGPx基因。3．全長PHGPx基因cDNA的獲得根據(jù)5’RACE-PCR所擴出的水稻PHGPx基因5’端部分序列，合成了20個核苷酸的寡聚引物，其序列為5’-GGGAGAGGGATTTCGATTTT-3’，以Clontech公司MarathonTM cDNA合成引物為3’引物，對水稻雙鏈cDNA文庫進行常規(guī)PCR擴增，以獲得完整的PHGPx基因cDNA克隆。其PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示單一條帶，大小約為900bp。進而按常規(guī)實驗方法將該片段克隆進pMD18-T載體，并測定了全長DNA序列。結(jié)果讀出了921bp，其中的507bp ORF編碼169個氨基酸殘基，3’和5’的非編碼區(qū)分別為344bp和70bp，其多腺苷化信號AAUAUA位于終止密碼子下游95bp處。結(jié)果表明獲得了全長的PHGPx基因的cDNA序列，將該基因命名為ricPHGPx。實施例3 水稻PHGPx全長cDNA序列及其特征根據(jù)上述結(jié)果，將全長921bp的cDNA序列進行了特征序列分析和同源性比較，并采用Southern和Northern雜交法分析了該基因在基因組中的存在形式和組織特異性表達特征。1．全長cDNA序列及其同源性分析用RACE-PCR克隆出的ricPHGPx全長cDNA為921bp，閱讀框架編碼含有169個氨基酸的多肽，其理論分子量為19,234Da。根據(jù)同源序列比較，其氨基酸序列與人睪丸(R.Steven Esworthy等人，Gene(1994),144:317-318.)和豬心(Regina Brigelius-Flohe等人，生物化學雜志(The Journal of Biological Chemistry)269(1994)7342-7348)PHGPx分別有50％和49％的同源性，與植物中的柑桔(DoronHolland等人，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)(1993)21:923-927)、菠菜(Manabu Sugimoto等人，生物科學生物技術生物化學(Biosci.Biotech.Biochem.)61(1997)1379-1381)、煙草(M.C.Criqui等人，植物分子生物學18(1992)623-627)和番茄(D.Nathalie等人，歐洲生物化學雜志(European Journal of Biochemistry)253(1998)455-451)PHGPx的同源性分別為63％,63％,62％和63％(圖1)。哺乳動物PHGPx活性中心的催化殘基是硒代半胱氨酸(SeCys)，由終止密碼子UGA所編碼，而水稻PHGPx的活性中心是由位于第44位的半胱氨酸構(gòu)成，其密碼子為UGU，這與其它植物(柑桔Cys-41，菠菜Cys-44，煙草Cys-43，番茄Cys-43)中的情形相似。這些結(jié)果進一步表明該cDNA編碼一個新的植物PHGPx基因。
此外，通過查詢Prosite數(shù)據(jù)庫(A.Bairoch等人，核酸研究(增刊)(Nucleic Acids Research(Suppl))1991 2241-2245)發(fā)現(xiàn)，ricPHGPx中存在兩個Asn糖基化位點(分別位于氨基酸殘基50-53,134-137處)，一個PKC磷酸化位點(位于氨基酸殘基16-18處)，三個CK2磷酸化位點(分別位于氨基酸殘基6-9,11-14,16-19處)和兩個十四烷基化位點(分別位于氨基酸殘基2-7,125-130處)。2.PHGPx基因在水稻基因組中的存在形式從中丹2號的4周齡水稻葉片中根據(jù)尿素-苯酚方法(M.Shure等人，細胞35(1983)225-233)提取基因組DNA。用PHGPx基因內(nèi)部沒有切割位點的限制性內(nèi)切酶SalⅠ,HindⅢ,BglⅡ和ApaⅠ分別酶解10μg基因組DNA，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離后，將DNA轉(zhuǎn)至尼龍膜Hybond-N+上。按常規(guī)方法(J.Sambrook等人，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)，將該膜在65℃下預雜交(預雜交液5×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,0.1mg/ml鮭魚精DNA)1小時后，加入用隨機引物標記法由[α-32P]dCTP標記的PHGPx cDNA探針，于65℃雜交12小時。雜交后用含有0.1％SDS和2×SSC的洗膜液在室溫下漂洗10分鐘；然后再用0.1％SDS,0.2×SSC的洗膜液于65℃洗膜兩次，每次30分鐘；最后再用0.1％SDS,0.2×SSC的洗膜液于65℃洗膜30分鐘，膜晾干后加X光片于-80℃放射自顯影。
根據(jù)放射自顯影的結(jié)果，在高度嚴謹條件下上述4種內(nèi)切酶的酶解產(chǎn)物雜交后均顯示一條帶。與DNA的標準分子量片段相比，SalⅠ片段約為14kb,HindⅢ、BglⅡ和ApaⅠ分別為2.2kb、4.5kb和9.0kb。這一結(jié)果表明PHGPx基因在水稻基因組中以單拷貝形式存在，這一結(jié)果與其它植物PHGPx基因的情況是一致的。據(jù)已有的報道，番茄PHGPx是單拷貝基因(D.Nathalie等人，文獻同上)，煙草PHGPx基因最多只有兩個拷貝(M.C.Criqui等人，文獻同上)，向日葵PHGPx基因有1-2個拷貝(P.Roeckel-Drevet等人，植物生理學(Physiologiaplantarum)103(1998)385-394)。3.PGHPx基因在水稻組織中的特異性表達用苯酚-SDS法(R.D.Palmiter等人，生物化學雜志(Journal ofBiochemistry)13(1974)3606-3610)分別從10天齡水稻幼苗及開花后10天的成熟水稻的不同組織提取總RNA，經(jīng)1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，用堿固定法(J.Liu等人，植物分子生物學29(1995)685-689)將RNA(各20μg)轉(zhuǎn)移至尼龍膜Hybond-N+上，將該膜在預雜交液(1％SDS,1MnaCl,10％硫酸葡聚糖，0.1mg/ml鮭魚精DNA)中，65℃預雜交1小時，加入與上述Southern雜交相同的cDNA探針，在65℃下雜交12小時，洗膜條件及放射自顯影操作也與上述Southern雜交條件相同。
雜交結(jié)果顯示，在開花后10天的成熟植株的不同組織中，旗葉中PHGPx的轉(zhuǎn)錄水平最高，莖中次之，而根和種子中的含量則較低，10天齡的水稻幼苗中PHGPx的轉(zhuǎn)錄水平約為旗葉中的一半。根據(jù)25S和17S rRNA的位置，可以計算出所得雜交帶的長度約為1000堿基，與PHGPx的cDNA全長相當。
上述結(jié)果表明PHGPx mRNA在成熟組織中的分布具有明顯的組織特異性。旗葉中水平最高，莖部次之，而根和種子中則很低，這一分布恰好與植物體內(nèi)氧自由基的分布規(guī)律相一致(C.Jacyn Baker等人，植物病理學年度綜述1995,33:299-321)。植物體內(nèi)氧自由基主要來源于光合作用過程中的光合電子傳遞鏈，光合作用強的組織(如綠色葉片，尤其是旗葉)中氧自由基含量很高，而幾乎不進行光合作用的根和種子中氧自由基的含量則較低，本研究所發(fā)現(xiàn)的正常生長的水稻中旗葉中的PHGPx表達量最高，預示著PHGPx可能在消除植物體內(nèi)的氧自由基方面起著重要作用。實施例4 氧化脅迫誘導ricPHGPx基因在水稻中的高效表達為了探討ricPHGPx的功能，本發(fā)明首先用H2O2和Al3+處理兩周齡的水稻苗，然后提取總RNA，進行Northern雜交，檢測ricPHGPx的表達量來評價ricPHGPx基因?qū)寡趸{迫的活性。在H2O2處理實驗中，剪取兩周齡水稻的苗部，浸泡在含有10mM H2O2和1％吐溫20的水溶液(為了減少H2O2分解所造成的誤差，每隔2小時更換一次浸泡液)中，分別在零時刻(浸泡前)和浸泡3,6,12,24,48小時后取樣，而在AlCl3處理實驗中，待水稻長至2周齡時，向培養(yǎng)液中加入AlCl3溶液至Al3+終濃度為50μM，同樣分別在零時刻(加入Al3+前)和加入Al3+后3,6,12,24,48小時后剪取水稻的苗部。對上述樣品用苯酚-SDS法提取總RNA，采用與上述研究組織分布相同的方法，進行探針標記和Northern雜交。各總RNA的樣品用量均為10μg。
Northern雜交結(jié)果顯示，正常生長的水稻幼苗組織中ricPHGPx表達量較低，用H2O2及Al3+處理后，其表達量顯著上升。H2O2浸泡3小時后已能觀察到ricPHGPx含量的變化，在所取樣品的48小時內(nèi)一直保持上升趨勢，在48小時時其表達量已達到處理前的31倍。用Al3+處理后ricPHGPx mRNA的水平明顯上升，3小時后達到項峰，約為處理前的5倍，隨后開始緩慢下降，至48小時后仍高于正常水平。
上述雜交結(jié)果表明H2O2能誘導水稻幼苗中ricPHGPx表達量的上升，并且這種誘導隨著氧化脅迫的存在能持續(xù)較長時間，在48小時內(nèi)一直保持上升趨勢，暗示著ricPHGPx量的提高可能貢獻于清除由于氧化脅迫而誘導產(chǎn)生的自由基。另一方面Al能和抑制植物根系生長，對Al毒性產(chǎn)生的機制之一可能是通過脂類過氧化反應在植物體內(nèi)誘導產(chǎn)生氧化脅迫而對植物產(chǎn)生傷害(K.D.Richards等人，植物生理學(Plant Physiology)116(1998)409-418)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)水稻PHGPx的mRNA水平在Al處理3小時后上升至正常水平的5倍，而后緩慢下降，說明為了對付Al所誘發(fā)的氧化脅迫，水稻體內(nèi)的PHGPx表達量增加，而后的緩慢下降可能是由于水稻體內(nèi)的金屬硫蛋白等金屬結(jié)合蛋白的表達量上升從而部分緩解了Al毒性所致(K.D.Richards等人，文獻同上；L.H.Yu等人，基因206(1998)29-35)。
上述結(jié)果充分說明PHGPx在緩解水稻氧化脅迫中起著重要作用。實施例5 ricPHGPx在大腸桿菌中的高效表達及其抗H2O2活性為了表明ricPHGPx基因的功能，本發(fā)明將ricPHGPx基因插入Qiagen公司的pQE30的BamHⅠ和HindⅢ位點之間，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，獲得了高效表達，用H2O2處理表達ricPHGPx的細胞，在10μg/ml H2O2的濃度下，其細胞存活率是對照細胞的2.5倍，顯示出該基因的表達產(chǎn)物能提高細胞對H2O2的抗性，從而一定在清除氧自由基方面起著非常重要的作用。1、ricPHGPx在大腸桿菌中的高效表達如圖2所示，將ricPHGPx插入Qiagen公司的pQE-30高效表達載體的多克隆位點來表達ricPHGPx基因。利用pQE-30表達載體可以表達出在其產(chǎn)物的5’端附加6個連續(xù)組氨酸的融合蛋白，這6個連續(xù)的組氨酸構(gòu)成了Ni-NTA凝膠特異結(jié)合的位點，因此可利用親和層析來純化表達產(chǎn)物。為了保證表達蛋白與原蛋白在氨基酸序列上的一致性，本發(fā)明人在ricPHGPx基因的5’端與6個His序列間設計了一段腸肽酶(Enterokinase)識別位點的堿基序列，該序列編碼Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，腸肽酶可識別此位點，并在Lys后面將肽鏈切斷，這樣表達出的基因產(chǎn)物可與原編碼氨基酸序列一致。按照圖2所示的技術路線，合成一對引物，按分子克隆常規(guī)實驗程序(Sambrook等，文獻同上)用PCR擴增出兩端帶有特定位點的基因序列，連接進pQE-30載體的BamHⅠ和HindⅢ之間，構(gòu)建成帶有ricPHGPx基因的表達載體，命名為pRPHGPl，并通過DNA序列分析，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。接著將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，并用含100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB平板篩選重組子，將篩出的重組子經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定和PCR鑒定后，用于誘導表達分析。
將篩選并經(jīng)鑒定確認的重組子，接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，然后按1∶10比例接種到4ml LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至A600=0.6～0.9，加入8μl 1M的IPTG溶液(IPTG終濃度為2mM)，誘導3小時后取1ml菌液離心收集菌體，按Qiagen提供的方法提取細胞可溶性蛋白，進行12.5％SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖3A所示，所有篩選的6個克隆均有ricPHGPx基因的高效表達，經(jīng)凝膠掃描分析，重組蛋白的表達量約占細胞總可溶性蛋白的36.42％。另一方面根據(jù)Qiagen提供的少量純化法提取ricPHGPx蛋白，如圖3B所示親和層析純化出單一電泳帶，根據(jù)標準分子量標記的所作出的標準曲線，計算重組蛋白表觀分子量為22.35kD，略大于理論值19.23kD，說明ricPHGPx中的確存在著蛋白質(zhì)修飾反應。2．表達ricPHGPx基因昀劂干菌細胞具有抗H2O2活性過氧化氫在一定濃度下對大腸桿菌有致死作用。為了測定轉(zhuǎn)入水稻PHGPx基因的大腸桿菌對H2O2的抗性，本發(fā)明將ricPHGPx克隆進pQE30，構(gòu)成pRPHGP質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，并命名為JP6菌株，同時將空白質(zhì)粒pQE30轉(zhuǎn)化JM109，作為對照，命名為JC6菌株。然后將培養(yǎng)過夜的JP6和JC6菌液按1∶100接種于新鮮LB培養(yǎng)液，37℃200rpm培養(yǎng)至A600=0.2后分別加入H2O2溶液至終濃度分別為0,5,10,20,50,100μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2小時后，取100μl菌液進行適當稀釋后布LB平板，平板于37℃培養(yǎng)16小時后取出進行菌落計數(shù)，以計算細菌的存活率。存活率按下列公式計算 結(jié)果如表1所示。在H2O2濃度為20μg/ml時，含有ricPHGPx基因的大腸桿菌的存活率是對照的近4倍，充分表明ricPHGPx基因的存在可以明顯提高該菌株對H2O2的抗性。
表1 表達與不表達水稻PHGPx的大腸桿菌對H2O2抗性的差異
實施例6 含有水稻PHGPx基因的植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的制備本實施例是將本發(fā)明的ricPHGPx基因編碼區(qū)克隆入植物表達載體中，通過基因槍轟擊或農(nóng)桿菌侵染的方法將其導入水稻中，制作過量表達的水稻株系，來提高水稻抗病、抗衰老以及抗逆的能力。實驗方案為1.水稻幼胚愈傷組織的獲得1)取授粉后10-12天的水稻幼穗，消毒處理后分離幼胚；2)將幼胚接種于MS或N6脫分化培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。含有ricPHGPx基因的植物表達載體的構(gòu)建如實施例1所述，設計并合成PCR引物，用PCR法擴增ricPHGPx基因。將ricPHGPx基因克隆到質(zhì)粒載體pUC19中，構(gòu)建成載體pUCPHGPx。將質(zhì)粒載體pB121.1(本發(fā)明人的實驗室保存)經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后產(chǎn)生的約2.0kb片段(含有β-GUS基因和NOS-終止子序列)克隆到質(zhì)粒pCAMBIA3300(本發(fā)明人的實驗室保存)中，構(gòu)建成載體pCAMGUSBIA。將HindⅢ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pUBA(本發(fā)明人的實驗室保存)后所產(chǎn)生的約2.0kb片段(含有泛素啟動子)克隆到載體pCAMGUSBIA中，得到新的載體pCAMUBI。將擴增的ricPHGPx基因連接到pCAMUBI上，構(gòu)建成目的載體pUBIBIAPHGPx。整個載體構(gòu)建過程參見圖4。目的基因的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得用基因槍轟擊或農(nóng)桿菌侵染的方法將質(zhì)粒載體pUBIBIAPHGPx轉(zhuǎn)入水稻幼胚愈傷組織中，通過抗性篩選獲得正確整合并穩(wěn)定表達PHGPx基因的水稻植株。SEQ ID NO:1GGGAGAGGGATTTCGATTTTTTTTTCTCCACGGCGAAATCCGCGAGGCGGAGGAGGAGGA 60GGAGGGCGAGATGGGGGCGGCGGAATCCGTGCCGGAGACCTCCATACACGAATTCACCGT120M G A A E S V P E T S I H E F T V 17CAAGGATTGCAACGGCAAGGAGGTGAGCCTGGAGATGTACAAGGGGAAGGTGCTAATCGT180K D C N G K E V S L E M Y K G K V L I V 37CGTCAACGTCGCCTCCAAATGTGGGTTCACGGAGACCAACTACACGCAGCTGACGGAGCT240V N V A S K C G F T E T N Y T Q L T E L 57CTATCAGAAACACAGGGACAAAGATTTTGAGATTCTAGCATTTCCCTGCAATCAGTTCTT300Y Q K H R D K D F E I L A F P C N Q F L 77GCGACAAGAGCCAGGATCTGACCAGCAAATAAAGGATTTTGCTTGCACAAGATTTAAAGC360R Q E P G S D Q Q I K D F A C T R F K A 97TGAATATCCCGTTTTTCAGAAGGTGCGTGTAAATGGTCCTGATGCTGCACCACTTTACAA420E Y P V F Q K V R V N G P D A A P L Y K 117ATTTTTGAAAGCTAGCAAGCCTGGCTTGTTTGGATCTAGAATCAAGTGGAACTTTACCAA480F L K A S K P G L F G S R I K W N F T K 137ATTTCTTATTGATAAGAATGGCAAAGTCATTAACAGATACTCGACTGCGACCAGTCCCTT540F L I D K N G K V I N R Y S T A T S P L 157GTCTTTTGAGAAAGACATCCTGAAGGCGCTCGAGGATTAGATCTCGTACCCTCCCCCATC600S F E K D I L K A L E D * 169CTTCATTTGCAGAAGTAGGCAAAGTATCTGGTTGTAATATCTAGACCTATGGGATGCTCA660ATAGTGAATTTTTGCAATATATTCCTTCTTTTGTGTAGTGTATTTGTTGTCTTTATATAT720TATTATATTGTAAGTAGAGGTTGGCTGGTTGGGTAGGCACTGTTTTGTCTATACTGGTTT780TATATGGCTTGGCTTGAAAATTTGTTTAGAAACCTAAGACATTATTATCAACGTGTAATA840TCGACAAGTTGAAATTGTATGTAGCGTAAGGTTTGTGTTTGCACTGTAAAAAAAAAAAAA900AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 92權利要求
1．一種多核苷酸，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2．一種多肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3．如權利要求1所示的多核苷酸，其為水稻谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶的基因。
4．含有權利要求1所述的多核苷酸序列的表達載體。
5．如權利要求4所述的表達載體，其為原核表達載體。
6．如權利要求4所述的表達載體，其為真核表達載體。
7．用權利要求4的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8．如權利要求7所述的宿主細胞，其為大腸桿菌。
9．如權利要求7所述的宿主細胞，其為水稻細胞。
10．一種制備具有抗衰老、抗病以及抗逆的轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括將權利要求1所述的多核苷酸導入水稻植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶基因,及其編碼的谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組表達載體,以及含有這種表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的水稻谷胱甘肽磷脂氫過氧化物酶基因可用于保護細胞膜免受磷脂氫過氧化的損傷,制作延遲衰老的轉(zhuǎn)基因植株,特別是延遲衰老、提高光合效率的轉(zhuǎn)基因水稻。
文檔編號C07K14/415GK1324817SQ0010931
公開日2001年12月5日 申請日期2000年5月19日 優(yōu)先權日2000年5月19日
發(fā)明者劉進元, 李文君, 趙南明, 段芮, 范靜華, 徐振彪, 張日清 申請人:清華大學