專利名稱：抗內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)工程蛋白的制作方法
癌細(xì)胞形成的腫瘤體惡性增大需要充分的營(yíng)養(yǎng)供給，本發(fā)明所涉及的基因產(chǎn)物是以阻礙腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給系統(tǒng)為機(jī)理治療癌癥。開(kāi)展的過(guò)程包括基因克隆，定點(diǎn)突變等分子生物技術(shù)和細(xì)胞生物技術(shù)。
血液循環(huán)支撐著人體生命的存在和繼續(xù)。血液循環(huán)系統(tǒng)由血管構(gòu)成。最小的血管其細(xì)度達(dá)到剛好可以通過(guò)一個(gè)紅細(xì)胞，這種血管稱之為毛細(xì)血管。它密布全身形成網(wǎng)絡(luò)，將氧氣和營(yíng)養(yǎng)輸送到體內(nèi)的各個(gè)角落。
成年人的血管在正常生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定，不再延伸發(fā)展。所以健康人的血液循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的范圍是固定不變的，它的不正常加減(延伸或短路)都可能引起病癥。血管堵塞形成局部斷流(短路)的病態(tài)表現(xiàn)為大腦中風(fēng)和心肌梗塞等疾病。而血液循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的異常延伸可導(dǎo)致腫瘤惡性發(fā)展(1，2)。癌細(xì)胞因圍繞它周?chē)拿?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受癌細(xì)胞分泌物質(zhì)的刺激開(kāi)始分裂，它們穿過(guò)基底膜和間質(zhì)就象入侵的癌細(xì)胞一樣去入侵鄰近的癌細(xì)胞組織并在癌細(xì)胞組織內(nèi)部生成新的毛細(xì)血管。癌細(xì)胞在得到新生血管輸送養(yǎng)料的供應(yīng)下快速生長(zhǎng)。因其快速生長(zhǎng)大量消耗氧氣，形成癌細(xì)胞組織內(nèi)部局部的空間性的缺氧狀態(tài)(3)。而缺氧狀態(tài)可刺激癌細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)等(4，5)。這些生長(zhǎng)因子激發(fā)新一輪的血管增長(zhǎng)。它的不斷循環(huán)形成腫瘤組織的惡性增長(zhǎng)。所以抑制血管生長(zhǎng)，確切而言抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)已成為目前治療癌癥的新希望(6，7)。
如上所述心肌梗塞和癌癥從病態(tài)方面看是兩種不同的病癥，可從血管組織學(xué)上它們是血液流通網(wǎng)絡(luò)消長(zhǎng)的結(jié)果。在探討抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)的過(guò)程中，又一次聯(lián)系起癌癥和心肌梗塞。
纖溶酶在體內(nèi)直接分解血栓可開(kāi)通心肌梗塞起到治療效果(8)，而纖溶酶的水解物又可生成血管生長(zhǎng)抑素(angiostatin)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到治療癌癥的作用(9)。本發(fā)明的目的是從人體凝血和溶栓系統(tǒng)中探索新的血管生長(zhǎng)抑制物質(zhì)。
我們知道在臨床上治療心肌梗塞不使用纖溶酶直接作為藥物，而是使用纖溶酶激活劑，如尿激酶，鏈激酶和tPA等(10，11)。發(fā)明人注意到tPA即組織型纖溶酶激活劑有兩個(gè)特點(diǎn)；其一，tPA和血管內(nèi)皮細(xì)胞有結(jié)合能力(12)。其二，tPA分子中有和血管生長(zhǎng)抑素的構(gòu)造相似之處(13，14)。這兩點(diǎn)展示了tPA分子內(nèi)可能包含有抗內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)能。最終發(fā)明人通過(guò)分子克隆從tPA分子中提煉出了抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的有效成分AAA蛋白(anti-angiogenic agent)。并進(jìn)一步地通過(guò)點(diǎn)突變?nèi)〉昧溯^強(qiáng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的基因產(chǎn)物。
電腦程序協(xié)助的分析表明，tPA分子中第174氨基酸至263氨基酸序列和血管生長(zhǎng)抑素高度相似。該部分氨基酸序列所對(duì)應(yīng)的基因可從人肝臟mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)酵反應(yīng)和PCR方法克隆。所得cDNA片段經(jīng)修飾在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)蛋白。
人肝臟mRNA 3 μg和200 ng引物(dT)17，2.5 mM DTT，2mMMgC12及0.5 mM dNTP混合。全部體積15μL。所用的水均經(jīng)過(guò)DEPC(diethylpyrocarbonate)處理。該混合液加熱至70℃，5分鐘后，快速放入0℃的冰中。10分鐘后，升溫到42℃，加入200單位的逆轉(zhuǎn)酵開(kāi)始反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。所生成的cDNA作為模板被直接用于PCR反應(yīng)。反應(yīng)液共0.1mL。組成為上述cDNA模板5μL，20mM Tris(pH8.8)，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，10mMKCl，0.1％ Triton X-100，0.2 mM dNTP，兩個(gè)引物各100 ng和5單位的Pfu DNA合成酶。兩引物的序列為PN1TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTAC和PClG-GGTGGAGCAGGAGGGCACATC。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃，0.5分鐘，42℃，0.5分鐘和68℃，1分鐘。重復(fù)30次。之后進(jìn)行第二次PCR。
第二次PCR的任務(wù)是在所擴(kuò)增的基因片段兩端安裝克隆位點(diǎn)。反應(yīng)溶液的條件及PCR程序和第一次的PCR反應(yīng)有以下不同。DNA模板5μL為第一次PCR反應(yīng)終了的溶液，PCR反應(yīng)程序只重復(fù)10次，兩個(gè)引物分別為PNde-1GGAATTCATATG＋PNl和PBam-1CCGGGATCCTTA＋PC1，下劃線部分為酵內(nèi)切位點(diǎn)Nde I和Bam HI以進(jìn)行克隆，同時(shí)這兩個(gè)引物的設(shè)計(jì)上還為克隆基因片段加入了蛋白合成開(kāi)始點(diǎn)ATG(包含于Nde I識(shí)別區(qū)內(nèi))和蛋白合成終止信號(hào)TAA(即互補(bǔ)TTA緊挨著B(niǎo)am HI克隆位點(diǎn))。所成的帶有克隆位點(diǎn)的DNA片段，經(jīng)過(guò)Agarose電泳提純，酒精沉淀，干燥后溶入50μL的內(nèi)切酵溶液中，加Nde I和Bam HI酶，37℃反應(yīng)約18小時(shí)。反應(yīng)后，用T4DNA結(jié)合酶和同被Nde I，BamHI反應(yīng)的pET-11結(jié)合(15)，形成在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒?？寺〉腄NA片段并通過(guò)下述的點(diǎn)突變篩選出較強(qiáng)的AAA蛋白基因進(jìn)行表達(dá)(圖1)。該基因在基因庫(kù)GenBank中的登記確認(rèn)號(hào)為AF282882。
定點(diǎn)突變使用一對(duì)DNA引物每次對(duì)一個(gè)氨基酸實(shí)行置換突變。并使用目前復(fù)制精確度最高的PfuDNA合成酵對(duì)基因進(jìn)行改造。每個(gè)試管只含50μL的反應(yīng)溶液。反應(yīng)溶液成分為50 mM Tris(pH 8.5)，25 mMKCl，1.5 mM MgSO4，0.2 mM dNTP，50ng質(zhì)粒和75ng的引物。反應(yīng)溶液加熱至94℃后加入2.5單位的Pfu DNA合成酶。反應(yīng)程序?yàn)?4℃，0.5分鐘，40℃，1分鐘，68℃，15分鐘。反應(yīng)重復(fù)18次。
丙胺酸掃描突變系列丙胺酸掃描突變(alanine scan)是有選擇地把特定的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸匪?16)。這里注重把帶電荷的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸匪帷?br> E3 GATATACATATGTCCGCCGGAAACAGTGACTGN5 GTCCGAGGGAGCCAGTGACTGCTACTTTGD9 GAGGGAAACAGTGCCTGCTACTTTGGGAATGN12CTGCTACTTTGGGGCCGGGTCAGCCTAC
R17GGGTCAGCCTACGCCGGCACGCACAGCH20CTACCGTGGCACGGCCAGCCTCACCGAGE24CACAGCCTCACCGCCTCGGGTGCCTCCN33GCCTCCCGTGGGCCTCCATGATCCTGK40GATCCTGATAGGCGCCGTTTACACAGCACQ46GTTTACACAGCAGCCAACCCCAGTGCCN47GTTTACACAGCACAGGCCCCCCAGTGCCCAGQ51GAACCCCAGTGCCCGCCGCACTGGGCCTGK57CTGGGCCTGGGCGCCCATAATTACTGCH58GGCCTGGGCAAAGCCAATTACTGCCGGN59CTGGGCAAACATGCCTACTGCCGGAATR62CATAATTACTGCGCCAATCCTGATGGGN63CATAATTACTGCCGGGCCCCTGATGGGGATGD65CGGAATCCTGCCGGGGATGCCAATCD67GAATCCTGATGGGGCCGCCAATCCCTGK69GATGGGGATGCCGCCCCCTGGTGCCACH73TCCCTGGTGCGCCGTGCTGAAGAACK76GCCACGTGCTGGCCAACCGCAGGCTGN77CGTGCTGAAGGCCCGCAGGCTGACGR78GTGCTGAAGAACGCCAGGCTGACGTGR79CTGAAGAACCGCGCCCTGACGTGGGAGE83AGGCTGACGTGGGCCTACTGTGATGTGD86GTGGGAGTACTGTGCCGTGCCCTCCTGC定點(diǎn)突變系列K67V GAATCCTGATGGGGTGGCCAATCCCTGH73Y TCCCTGGTGCTACGTGCTGAAGAACN77P CGTGCTGAAGCCCCGCAGGCTGACG下劃線部分顯示突變位點(diǎn)，各數(shù)字對(duì)應(yīng)從AAA蛋白N-末端的氨基酸計(jì)數(shù)，互補(bǔ)引物的DNA序列省略。各個(gè)突變位置如圖2所示。反應(yīng)完畢后直接向各反應(yīng)液中加入15單位的內(nèi)切酵Dpn I，37℃反應(yīng)1小時(shí)。然后只取其中的5μL，傳導(dǎo)入鈣處理的克隆用大腸桿菌株DH5中篩選突變質(zhì)粒。
表達(dá)蛋白質(zhì)的菌株為BL21(DE3)。該菌株首先被傳導(dǎo)入表達(dá)DnaY的pDC952質(zhì)粒(17，18)，然后傳導(dǎo)入含AAA基因的表達(dá)質(zhì)粒。從LB(Luria Broth)平板上取單個(gè)菌落體殖入LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)(37℃)。然后以1∶50稀釋加入新鮮的LB培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期中部(在590nm的吸光度約0.45～0.5)時(shí)，加入終濃度0.5 mM 的IPTG(isopropylthio-β-galactoside)，誘導(dǎo)2小時(shí)。
生產(chǎn)AAA蛋白的工程菌株還可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)。方法以5升培養(yǎng)器為例程序如下準(zhǔn)備四種溶液。
其一，基礎(chǔ)培養(yǎng)液0.1 M Tris(pH7.6)，NaCl 1g/L，YE 20g/L。
其二，糖溶液50％蔗糖。
其三，維生素溶液尼亞新(菸酸胺)3g/L，B1 6g/L，B6 0.7g/L，核黃素0.2g/L，生物素(維生素H)25mg/L，folic acid 20mg/L和DL-pantothenic acid 2.7g/L。
其四，微量礦物質(zhì)溶液FeCl330g/L，CuSO42g/L，MnCl21.5g/L，CoCl22g/L，Na3Citrate 75g/L，Na2MoO41.5g/L，ZnCl21g/L和H3BO3300mg/L。
把3.92升的基礎(chǔ)培養(yǎng)液預(yù)熱至37℃，加入80mL的AAA工程菌過(guò)夜培液，2小時(shí)后加入82mL糖溶液，10mL維生素溶液和8mL的微量礦物質(zhì)溶液。之后每隔1.5小時(shí)重復(fù)加入以上溶液。當(dāng)吸光度(590nm)達(dá)到10時(shí)，每1小時(shí)重復(fù)加入以上溶液。這樣培養(yǎng)9小時(shí)后吸光度可達(dá)到30左右(圖3)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中pH始終控制在7.5～7.8左右，空氣注入量為每分鐘10升以上。為了消除泡沫在每升培養(yǎng)液中加入0.1mL的消泡劑如Anti Foam 289(Sigma)等。
表達(dá)的細(xì)胞通過(guò)常規(guī)的超音波或高壓粉粹(20,000psi)提取AAA蛋白包涵體。包涵體經(jīng)過(guò)高鹽洗液(25 mM Tris，1M NaCl，0.1％吐溫-20，2.5％甘油，5 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)，pH 7.8)和低鹽溶液(10 mM Tris，0.1％吐溫-20，2.5％甘油，pH7.8)之后，溶解于變性溶液中(0.1 M Tris，8M尿素，0.1％吐溫-20，1 mM EDTA，0.1Mβ-ME(2-mercaptoethanol)，pH8.0)。把溶解后的AAA蛋白進(jìn)行變性狀態(tài)下的提純。
變性狀態(tài)下的蛋白提純的優(yōu)點(diǎn)為可避免活性下提純時(shí)對(duì)蛋白活性的損害。而且變性狀態(tài)下的提純不需低溫操作等優(yōu)勢(shì)。分離提純柱直徑為5厘米。填充劑為SephadexG-75M，體積為1.5升。使用前在0.1MTris(pH8)和8尿素溶液中侵泡平衡20小時(shí)。每次可分離的總蛋白量約為0.7克。分離溶液為0.1 M Tris(pH8)，8M尿素和5 mM β-ME。AAA蛋白出現(xiàn)在最后一個(gè)波峰里(280nm)。
純化后的AAA蛋白隨后被加入含有還原及氧化劑的復(fù)性溶液中進(jìn)行活性化反應(yīng)。復(fù)性溶液的成分為0.1 M Tris(pH9.0)，0.19 mM GSH(reduced glutathionine)，0.9 mM GSSG(oxidized glutathionine)，0.1％吐溫-20和0.5M的精氨酸。蛋白含量為每升0.1克，室溫(20～25℃)，反應(yīng)24小時(shí)。
活性后的AAA蛋白被濃縮。使用可通過(guò)5 KDa分子量以下的超過(guò)濾膜或者通過(guò)硫胺(290g/L)沉淀。除鹽和緩沖液交換采用成品除鹽柱PD-10(Pharmacia)或Sephadex G-25M和PBS(phosphate-buffered saline)溶液。圖4(左)展示純化復(fù)性后的AAA蛋白的還原性電泳。一個(gè)為天然蛋白，一個(gè)為點(diǎn)突變蛋白。根據(jù)DNA序列計(jì)算所得的它們的分子量為10KDa。AAA蛋白電泳位置符合理論值。
內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性測(cè)定使用BCE細(xì)胞(19)。細(xì)胞培育液為90％DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，10％FBS血清和1ng/mL的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)。使用24孔培養(yǎng)板，每孔植入8,000～10,000只BCE細(xì)胞和0.5mL上述培養(yǎng)液。在不同的孔中加不同濃度的受檢藥物。在37℃，5％CO2，100％濕度，培養(yǎng)3～5日。以藥物對(duì)BCE生長(zhǎng)抑制的程度衡量抗內(nèi)皮細(xì)胞活性大小。相對(duì)于對(duì)照組生長(zhǎng)的半抑制率為IC50。圖4(右)為篩選生長(zhǎng)抑制蛋白的一組實(shí)例。通過(guò)突變體和天然型蛋白的比較可以看出突變體的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性增強(qiáng)。AAA蛋白(WP)為組氨酸及天冬醯胺酸分別被色氨基酸及比咯氨酸組織氨基酸置換的突變體。
AAA蛋白在tPA中的部位，以及血管生長(zhǎng)抑素(angiostatin)在纖溶酶中的位置都具有賴氨酸結(jié)合能力。賴氨酸的結(jié)合功能是否提供AAA蛋白的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性，使用AMCHA(trans-aminomethylcyclohexane-carboxylic acid，Sigma)進(jìn)行了測(cè)量(圖5)。AMCHA可穩(wěn)固地和賴氨酸結(jié)合部位結(jié)合，并覆蓋該部位。
操作概要是將AAA蛋白和兩倍量的AMCHA混合，在22～25℃，搖動(dòng)(100rpm)1.5小時(shí)。然后加入0.1 M Ammonium bicarbonate溶液，使用Sephadex G-75SF分離柱提純。游離態(tài)AMCHA經(jīng)酸性水透析(pH3.5)除去。圖5展示AMCHA結(jié)合的AAA蛋白的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性和非結(jié)合體AAA蛋白的比較。它們的活性無(wú)明顯區(qū)別。說(shuō)明AAA蛋白的賴氨酸結(jié)合功能和抗內(nèi)皮細(xì)胞活性是相互獨(dú)立的。
另外，使用賴氨酸親合柱如Lysine-agarose可以測(cè)定AAA蛋白的賴氨酸結(jié)合功能。同時(shí)，如有必要還可以用它進(jìn)一步純化AAA蛋白。緩沖液為50mM磷酸鈉(pH7.8)。使用6-amino-n-caproic acid解離蛋白。解離AAA蛋白的濃度為100～150mM，解離AAA突變體(WP)的濃度為75～100mM。
進(jìn)一步地探索了還原型蛋白和復(fù)性蛋白的活性關(guān)系。這里使用活性相對(duì)較強(qiáng)的突變體AAA蛋白(WP)。還原方法如下將0.1mg AAA蛋白(WP)加入無(wú)血清的DMEM中，總體積0.3mL。然后，添加30μL的250 mM DTT(dithiothreitol)溶液，在25℃反應(yīng)20分鐘。最后和70μL的450 mM Iodoacetamide溶液合并，在4℃對(duì)著100mL DMEM溶液透析兩次。
使用兩個(gè)不同濃度的測(cè)量結(jié)果顯示還原的蛋白反而比復(fù)性的蛋白的活性略高(圖6)。此現(xiàn)象提示AAA蛋白的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性不完全依賴復(fù)性的立體構(gòu)造，而在于把活性位點(diǎn)有效地突顯出來(lái)。
綜合上述發(fā)現(xiàn)組織型纖溶酶激活劑分子中存在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)功能。該功能被克隆并在大腸菌中大量表達(dá)。其分子量為10kDa，易被提純，并在還原狀態(tài)下可保持活性等優(yōu)點(diǎn)。該蛋白的抗內(nèi)皮細(xì)胞功能獨(dú)立于組織型纖溶酶激活劑原有的和溶栓反應(yīng)有關(guān)的功能。
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圖1.AAA蛋白的表達(dá)質(zhì)粒AAA蛋白的基因片段被克隆于pET1la的NdeI和BamHI部位，處于T7戶動(dòng)子下游受IPTG調(diào)控。所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列根據(jù)國(guó)際常規(guī)IUPAC方法表示。T7戶動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控區(qū)，T7結(jié)尾區(qū)域以及基因的開(kāi)始和終止點(diǎn)皆用下劃線表示。圖2.AAA蛋白定點(diǎn)突變部位圖中間所示為AAA蛋白的一級(jí)構(gòu)造序列。左邊為丙胺酸掃描突變(A-scan)位點(diǎn)。右邊為定點(diǎn)突變生成的氨基酸。圖3.AAA工程菌株的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)AAA蛋白工程菌株在5升培養(yǎng)液中的高密度發(fā)酵。縱軸顯示的細(xì)胞吸光度為培養(yǎng)液經(jīng)100倍稀釋后的測(cè)量值(590nm)的換算值。圖4.AAA蛋白的抗內(nèi)皮細(xì)胞活性左圖所示為CoomassieblueR-250染色的還原型電泳圖(16％PAGE)。純化的蛋白各10μg。
右圖是AAA蛋白對(duì)BCE細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線。圖示為3次試驗(yàn)測(cè)量的平均值。圖5. 賴氨酸結(jié)合能力和抗內(nèi)皮細(xì)胞活性通過(guò)和AMCHA結(jié)合，蛋白的賴氨酸結(jié)合區(qū)被覆蓋。AMCHA結(jié)合的及未結(jié)合的蛋白對(duì)BCE生長(zhǎng)的抑制比較。所示為使用AAA蛋白(WP)測(cè)量3次的平均值。圖6. 還原蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用比較AAA蛋白(WP)還原型和復(fù)性型在同劑量情況下對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞BCE生長(zhǎng)的抑制作用。所示為5組實(shí)驗(yàn)的平均值。
權(quán)利要求
醫(yī)藥制品中含有組織型纖溶酶激活劑的蛋白片段。該片段大約為10KDa，具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性。1. 一種新的抗血管增生制劑AAA蛋白分子量為10KDa，對(duì)應(yīng)于組織型纖溶酶激活劑的第174至263氨基酸部分。
2. 第1項(xiàng)所形成的AAA蛋白分子的第1至6氨基酸被置換的分子。
3. 第1項(xiàng)所形成的AAA蛋白分子的第62至83氨基酸區(qū)域被置換的分子。
4. 由第2項(xiàng)和第3項(xiàng)合成的分子。
5. 第1至4項(xiàng)所言及分子的C-末端的兩個(gè)氨基酸被置換的分子。
6. 第5項(xiàng)所涉及的分子C-末端和其他抗血管增生劑如內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素(endostatin)等進(jìn)行基因融合取得的多功能MFD(multi-functionaldomains)蛋白。
7. 第6項(xiàng)所言及的分子中AAA部分被其相似結(jié)構(gòu)體所取代的分子。
全文摘要
通過(guò)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)分析和基因片段克隆,從組織型纖溶酶激活劑分子中提煉出了抗血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效成分,AAA蛋白。該蛋白在大腸菌中被大量表達(dá),分子量為10kDa。它的活性不受AMCHA影響,顯示其功能與溶栓過(guò)程中作用的賴氨酸親合力無(wú)關(guān)。而且該蛋白在還原狀態(tài)下仍然保持抗內(nèi)皮細(xì)胞活性。這是首次從組織型纖溶酶激活劑發(fā)現(xiàn)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)功能,并為治療癌癥等血管增生性疾病提供了一個(gè)新的制劑。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1336382SQ00109958
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月28日
發(fā)明者竇德獻(xiàn) 申請(qǐng)人:竇德獻(xiàn)