專利名稱：一種新型重組葡激酶及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域。
天然葡激酶(Staphylokinase，Sak)是金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白水解酶，由136個氨基酸組成。Sak本身并不是酶，它在人血漿中與纖溶酶原(plasminogen，plg)形成1∶1復合物，該復合物被血塊表面痕量的纖溶酶(plasmin，plm)激活為Sak·plm，Sak·plm是高效的纖溶酶原激活劑，激活游離的plg形成plm，催化血栓主要基質纖維蛋白降解，從而溶解血栓。由于Sak激活plg具有纖維蛋白專一性，而且對陳舊性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比其他溶栓藥物更強，因此Sak是一種高效特異的溶栓劑(Collen D at al.Nature Medicine.4.279-284(1998))。目前，國內外有數家公司生產重組葡激酶，但在基因結構上有所不同。比利時Collen D.等研究的重組葡激酶已進行急性心肌梗塞(AMI)溶栓治療的臨床II期試驗，我國成都世新中心也完成了AMI溶栓治療的I期臨床試驗，效果良好。上海醫(yī)科大學于1994年自行構建了Sak基因，實現了在大腸桿菌中的高效表達，并完成了中試研究，已申報臨床試用，即將試用于治療急性腦梗塞。但是，Sak是異體蛋白，用于人體有較強的抗原性，雖然臨床試用中還未發(fā)現有嚴重過敏反應，然而大部分病人用藥二周后，出現高滴度的中和抗體，阻礙了Sak的重復使用(Declerck PJ et al.ThrombHaemost.71.129-133(1994))。而且，在重組葡激酶的研究過程中發(fā)現，葡激酶易形成二聚體、甚至多聚體。聚合體的形成導致Sak免疫原性的增強。
在利用溶栓藥物進行溶栓治療的同時，通常聯合應用肝素、阿斯匹林等抗凝血酶、抗血小板藥物，以促進溶栓，并防止再梗塞。近年來，溶栓輔助藥的研究引人注目。Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)序列是對抗血小板聚集的功能序列，可競爭結合血小板膜凝聚有關的糖蛋白膜受體IIb/IIIa，從而阻止纖維蛋白原與受體結合，阻斷血栓再形成(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Nichols AJ et al.Trends Pharmacol Sci.13.413-417.(1992))。在一定構象限制下，將RGD/KGD序列導入溶栓藥物，如尿激酶cDNA基因的一定部位，其表達產物具有溶栓、防栓的雙重功能(Smith J et al.J Biol Chem.270.30486-30490.(1995))?；赗GD/KGD序列，還發(fā)展了許多化學模擬物，如Tirofiban，Lamifiban，Lefradafiban，Orbofiban，Xemilofiban，Integrilin等，亦可封閉IIb/IIIa受體，與溶栓藥物合用，再梗塞發(fā)生率顯著降低(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Verstraete M et al.49.856-884.(1995))。
本發(fā)明的目的是提供一種防止二聚體形成并具有防栓、溶栓雙重功能的新型葡激酶蛋白質結構及其制備方法。本發(fā)明應用結構生物學設計新型Sak分子結構，并利用基因工程手段生產，所得產品除了具有高效、特異的溶栓功能外，尚具有低聚合性能和抗血小板聚集等新特性，并且制備過程簡便、安全，產品得率、純度、活性均與野生型Sak基本相同。
本發(fā)明采用下述技術方案(1)Sak是一橢球狀分子，從第21個氨基酸殘基起，分別由五條、兩條β折疊股構成的β折疊片包裹在一個由12個殘基構成的α螺旋上，而N端20個氨基酸伸向球體外，非常柔韌，其功能難以從晶體結構推測。Sak呈明顯的親疏水性的不對稱性，且活性區(qū)主要在親水一側(Zhan CH etal.
Acta Crys t.D52.564-565.(1996)；Rabi jns A et al.Nat.
Struct.Biol.5.(1997))。根據上述r-Sak精確的三維結構模型，通過計算機分子對接手段，預測了r-Sak二聚體可能的結合方式，建立二聚體的三維結構模型。二聚體主要通過疏水相互作用與氫鍵結合，且結合界面在非活性一側。
(2)由此設計了突變體RGD/KGD-Sak的分子結構，并利用PCR
定點突變技術改變野生型Sak基因堿基序列，使其含有RGD/KGD編碼序列。即以質粒pST-Sak為模板，上游引物、突變引物、下游引物進行三輪PCR擴增，獲得RGD/KGD-Sak基因，然后與質粒pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證是否發(fā)生預計位置的突變。
(3)突變體RGD/KGD-Sak基因與原核表達載體pLY-4重組，形成表達質粒，轉化大腸桿菌，溫度誘導RGD/KGD-Sak基因表達。表達產物以包涵體的形式存在于工程菌內。
(4)發(fā)酵技術用低營養(yǎng)培養(yǎng)基M9CA培養(yǎng)工程菌，溫度誘導前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等進行補料，發(fā)酵參數為溫度30-42℃，氧容量為50％-80％，pH＝6-8，攪拌速度隨DO升高而降低；(5)工程菌發(fā)酵后用高壓破碎，離心收集包涵體，包涵體經緩沖液洗滌，尿素溶解，稀釋復性，然后用凝膠過濾和離子交換二步法純化產品。
(6)與野生型Sak性質比較表明，突變體RGD-Sak纖溶活性與野生型相似，形成聚合體的能力明顯降低，并且能顯著抑制ADP誘導的血小板的聚集，具有溶栓、防栓雙重功能。
實施例1.r-Sak半成品的鑒定Sak半成品由上海醫(yī)科大學提供(970923)，原純度達98％以上，-70℃保存。
還原性、非還原性SDS-PAGE—按Laemmli方法進行。
樣品溶解液含0.0625M Tris-HCl(pH6.7)，2％SDS，10％甘油，5％巰基乙醇，0.001％溴酚蘭。
樣品處理和點樣取半成品1瓶(3mg/瓶，-70℃保存3月以上)，溶于3ml雙蒸水中，點樣量為10μl。
凝膠染色考馬斯亮蘭或銀染色。
凝膠中蛋白質帶掃描以Pharmacia公司的ImageMasterRVDS進行掃描，并用所附軟件分析各蛋白質條帶含量。
電泳結束后，以考馬斯亮蘭染色，在相對分子量約15.5KD、31KD、46KD、62KD處出現濃集的條帶。
翻轉酪蛋白凝膠板法測定活性—上述凝膠依次用2.5％TritonX-100溶液和蒸餾水充分洗滌，覆蓋于含纖維蛋白原、人纖溶酶原及凝血酶的瓊脂凝膠板上，37℃保溫8h后，在上述分子量相應位置均有清亮的透明溶解帶。表明r-Sak半成品儲存過程中有形成聚合體的傾向，且聚合物非常穩(wěn)定，并保持一定活性。2.葡激酶二聚體的分子模擬及突變體的合理設計分子對接軟件是美國Rockefeller大學Vakser IA開發(fā)的GRAMMV1.03，在SGI 02圖形工作站上進行模建工作。
為了確定Sak二聚體的結合區(qū)，在Sak單體X射線衍射晶體結構基礎上，以GRAMM V1.03軟件進行分子對接，選擇一分子Sak為受體，另一分子Sak為配體，以Sak受體搜索與配體Sak的結合區(qū)。按作者推薦的整體高分辨率對接參數進行對接(表1)，搜索了10個復合物的結構。
表1整體高分辨率對接參數Table 1 The parameters for high-resolution generic dockingMatching mode(generic/helix)...........................mmode＝genericGridstep...........................................................eta＝1.7Repulsion(attraction is always-1)......................ro＝30Attraction double range(fraction of single range)...fr＝0Potential range type(atom radius，grid step).....crang＝atom radiusProjection(blackwhite.gray)..........................ccti＝grayRepresention(all，hydrophobic).......................crep＝allNumber of matches to output.............................maxm＝10Angle for rotations，deg(10，12，15，18，20，30，0-no rot)ai＝10靜電勢及疏水性分析表明，Sak單體呈明顯的親疏水性的不對稱性。Silence等通過隨機突變的研究表明，決定活性的氨基酸主要位于親水一側(Silence K et al.J Biol Chem.270.27192-27198.(1995))。Sak的疏水面有兩個主要的疏水區(qū)(HydrophobicRegion，HR)，分別位于47-56(HR1)，104-113(HR2)位殘基處，其中的HR2疏水性更強。在模建的二聚體結構模型中，疏水區(qū)相互作用顯示重要作用，并有HR1-HR2、HR2-HR2兩種結合方式。由于HR1靠近活性區(qū)，因此若兩分子Sak通過HR1-HR2結合，則一分子Sak的活性區(qū)將被遮蔽，可能僅保留一分子Sak的活性若以HR2-HR2的方式結合，活性似乎不會受到很大影響。
蛋白質相互作用的界面通常有600-1300A-2，每個蛋白質提供10-30個接觸殘基，但是，界面中存在所謂“熱點區(qū)”，僅3-5個氨基酸就提供了80％左右的結合能，改變這些殘基，復合物的結合能力將顯著下降(Li B et al，Science.270.1657-1660.(1995))。因此，二聚體無論以何種方式結合，只要改變HR2的主要結合殘基，就可能阻止二聚體的形成。Phe111位于HR2的核心區(qū)，是強疏水性氨基酸，且遠離活性區(qū)，本發(fā)明將其替換為強極性氨基酸Asp，以破壞疏水作用，并期望能保持活性。同時，鑒于RGD/KGD序列肽可抑制血小板聚集，而正好位于β-折疊的loop區(qū)，構象比較自由，因此本發(fā)明將Lys109改變?yōu)锳rg或保持不變，形成RGD/KGD序列。3.RGD/KGD-Sak基因的克隆及原核表達質粒的構建質粒pST-SAK為模板，以上游引物、突變引物進行第一輪擴增，351bp擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，與下游引物再次以質粒pST-Sak為模板進行第二輪擴增。純化后，所得408bp片段為模板，以上游引物、下游引物進行第三輪擴增，產物經Klenow酶補平，EcoRI、BamHI酶解后與pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析證實已發(fā)生設計的突變，由基康生物技術公司用ABI377測序儀完成序列分析。然后用EcoRI、BamHI將RGD/KGD-Sak基因切出，連入表達載體的相應位點。
上游引物5’...CGC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC...3’下游引物5’...CGC GGA TCC TTA TTT CTT TTC...3’突變引物5’...TAA ATC TGG GAC GAC GTC ACC ACG TTC TGT
TAT AGG...3’引入PstI位點以便于篩選寡核苷酸由美國Johns Hopkins大學DNA合成組制備。
目的基因與表達載體重組，轉化大腸桿菌JF1125，提取質粒，以相應酶酶解鑒定，獲得特征性片段，證實獲得陽性克隆。
表達質粒轉化大腸桿菌JF1125，經溫度誘導表達，SDS-PAGE分析表達產物。電泳結束后，一半進行考馬斯亮蘭染色，可見誘導后細菌裂解液在分子量約15.5KD處有一濃集的條帶，經掃描，重組蛋白約占全菌總蛋白的50％；另一半洗去SDS后，貼在酪蛋白凝膠板上，37℃孵育數小時后，相當于15.5KD處有一明顯的透亮區(qū)，即此部位的酪蛋白已溶解，表明RGD/KGD-Sak具有纖溶活性。菌體經壓榨離心后，15.5KD條帶主要位于沉淀中，而上清中幾乎未見此條帶，說明表達產物以包涵體形式存在。4.工程菌的誘導表達篩選高表達菌株作為工程菌，然后以10L發(fā)酵罐進行低密度發(fā)酵，溫度誘導后，離心收集菌體，PBS洗滌后，-70℃保存待用。10L發(fā)酵液得濕菌80g。濕菌用PB緩沖液懸浮，以高壓勻漿泵壓榨，離心后，SDS-PAGE結果表明，目的蛋白存在于沉淀溶解物行內，于分子量15.5Kda處染色很深，而上清液行內相同部位幾乎未見染色，表明RGD/KGD-Sak主要以包涵體形式存在。5.包涵體的分離、溶解與復性80g壓榨破菌，離心，得包涵體20g。包涵體經洗滌，離心后，以8M尿素溶解，室溫作用至澄清透明。超離后棄沉淀，取上清稀釋復性。6.Sephadex G-10及S-Sepharose FF柱層析超濾濃縮后，先以Sephadex G-10凝膠過濾，然后以10倍柱體積PB緩沖液平衡S-Sepharose FF色譜柱，凝膠過濾后溶液直接上柱，Waters色譜儀控制流速和檢測蛋白峰。上樣結束后，以PB緩沖液洗至基線，0～1MNaCl梯度洗脫，收集洗脫組分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并測定蛋白濃度。7.純度鑒定及分子量測定樣品進行15％SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS掃描測定純度、分子量。純度95％以上，分子量約15.5KD。8.生物學活性測定分別以酪蛋白凝膠板溶圈法、發(fā)色底物法測定。比活性9-10萬HU/mg左右。9.Sak·纖溶酶復合物和RGD/KGD-Sak·纖溶酶復合物的Km和Kcat值測定分別將2μM纖溶酶原與22μM Sak或RGD/KGD-Sak在pH7.4，0.1MPB，37℃的條件下，混合反應30min，形成與纖溶酶的復合物。然后取催化量復合物，在pH7.4，0.1MPB，37℃條件下，按以下體系反應0-10min，每隔30s記錄405nM OD值，每個不同的纖溶酶原濃度重復三次，取平均值。
反應體系終濃度Sak·纖溶酶(RGD/KGD-Sak·纖溶酶) 5nM發(fā)色底物S-2390 1mM纖溶酶原 1-30μMRGD/KGD-Sak.plasmin激活纖溶酶原的反應符合米氏方程(表2)。
表1 RGD/KGD-Sak.plasmin、Sak.plasmin激活纖溶酶原的酶促動力學常數比較Table 1 Kinetic analysis of activation of plasminogen by SakmoietiesKm(umol.l-Kcat(s-1) Kcat/Km1)Sak.plasmin 6.42 1.03 0.16RGD/KGD-12.501.41 0.11Sak.plasmin10.聚合能力檢測實驗野生型Sak為對照，以生理鹽水溶解，取30mg/ml、3mg/ml高、低二種蛋白質濃度，室溫靜置。每24h取樣，電泳鑒定。
在二種蛋白質濃度下，RGD/KGD-Sak比野生型Sak的聚合能力顯著降低。11.豚鼠致敏試驗分別以滅菌生理鹽水溶解重組野生型Sak或突變體RGD/KGD-Sak，配成濃度0.25萬單位/ml供致敏用。每次給藥，均重新開瓶配制新鮮溶液。取健康豚鼠8只，分二組，4只/組，分別間日腹腔注射r-Sak或RGD/KGD-Sak致敏豚鼠三次(劑量0.125萬單位/只)，14日后行第一次iv攻擊，21日行第二次iv攻擊(劑量0.25萬單位/只)。并取健康未致敏豚鼠2只，靜脈注射上述樣品(劑量0.25萬單位/只)，觀察有無同類反應，以排除供試品藥理、毒理作用的干擾。
野生型r-Sak組3只豚鼠呈IV級陽性反應，1只呈II級陽性反應。
RGD/KGD-Sak1只豚鼠呈I級陽性反應，其余無明顯反應。
以上結果表明與野生型r-Sak相比，RGD/KGD-Sak的免疫原性顯著下降。12.血小板聚集抑制試驗將用0.1體積，110mM枸櫞酸三鈉抗凝的新鮮血液低速離心(150g，10min)，得富含血小板的血漿(HRP)。在連續(xù)攪拌條件下，RGD-Sak(終濃度2μM)與HRP 37℃孵育2min后，向HRP中加入ADP(終濃度20μM)作為誘導劑，以雙通道血小板聚集儀測定5min內血小板的聚集率。分別以2μM野生型r-Sak、生理鹽水為對照。
結果顯示，RGD/KGD-Sak組的聚集率(5％±2％，n＝3)明顯低于r-Sak組(58％±3％，n＝3)和生理鹽水組(59％±3％，n＝3)。表明RGD/KGD-Sak有很強的抑制ADP誘導的血小板聚集的能力。13.動物溶栓實驗應用本發(fā)明所制備的RGD/KGD-Sak進行動物溶栓實驗，證實RGD/KGD-Sak保持了與野生型Sak一致的溶栓性能。(1) RGD/KGD-Sak治療實驗性兔股動脈血栓，用動脈造影顯示，治療前股動脈中段以下不顯影，靜脈注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分鐘后再造影，股動脈充盈完全，循環(huán)恢治療前股動脈中段以下不顯影，靜脈注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分鐘后再造影，股動脈充盈完全，循環(huán)恢復，與野生型Sak組一致，而對照組未見股動脈充盈。治療組6只，野生型Sak組3只，空白對照組3只。(2) RGD/KGD-Sak治療實驗性家兔前房積血眼內注射RGD/KGD-Sak10-20μg，4小時后可見前房血凝塊溶解，紅細胞沉降后與房水形成一界面，至24小時，眼內積血以被清除。與野生型Sak組一致，而對照組兔前房積血未見明顯變化。治療組6只，野生型Sak組4只，對照組4只。
附圖
為RGD/KGD-Sak的氨基酸序列，斜體為突變位點。
權利要求
1.一種新型重組葡激酶，其特征在于改變野生型Sak二聚體結合面，即47-56位氨基酸(HR1)、104-113位氨基酸(HR2)區(qū)的疏水性氨基酸，然后構建重組表達質粒，制備新型葡激酶分子。
2.按權利要求1所述的新型重組葡激酶，其特征在于所述新型葡激酶分子的蛋白質結構為野生型Sak肽鏈的Lys109-Gly110-Phe111替換為Arg109-Gly110-Asp111(RGD)或Lys109-Gly110-Asp111(KGD)。
3.一種新型重組葡激酶的制備方法，其特征在于采用下列步驟(1)質粒pST-Sak為模板，以上游引物、突變引物、下游引物進行三輪PCR擴增，與質粒pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證是否發(fā)生預計位置的突變；(2)突變體RGD/KGD-Sak基因與原核表達載體重組，形成表達質粒，轉化大腸桿菌，溫度誘導RGD/KGD-Sak基因表達。表達產物以包涵體的形式存在于工程菌內；(3)發(fā)酵技術用低營養(yǎng)培養(yǎng)基擴增工程菌，溫度誘導前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等進行補料，發(fā)酵參數為溫度30-42℃，氧容量為50％-80％，pH＝6-8，攪拌速度隨DO升高而降低；工程菌發(fā)酵后用高壓破碎，離心收集包涵體，包涵體經緩沖液洗滌，尿素或鹽酸胍溶解，稀釋復性后用凝膠過濾，離子交換二步法純化RGD/KGD-Sak產品。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域,具體涉及一種低聚合能力兼具防栓功能的新型重組葡激酶(RGD/KGD－Sak)的蛋白質結構和制備方法。根據對重組葡激酶單體、二聚體三維結構及其生化特性的分析,設計了新型葡激酶分子結構。通過PCR定點突變構建突變體RGD/KGD－Sak基因,然后與原核表達載體pLY－4重組,轉化大腸桿菌,篩選高表達工程菌。工程菌經發(fā)酵擴增,破碎細菌,離心收集包涵體,復性后經二步法純化RGD/KGD－Sak。所得產品凍干后,形成聚合體的能力顯著下降,并能顯著抑制ADP誘導的血小板的聚集,具有溶栓、防栓雙重功能。
文檔編號C07K14/31GK1264736SQ0011162
公開日2000年8月30日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權日2000年1月28日
發(fā)明者宋后燕, 宋鋼 申請人:上海醫(yī)科大學