專利名稱：一種從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase簡(jiǎn)稱SOD)的方法，特別是涉及一種從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的方法。
1969年McCord等人發(fā)現(xiàn)牛血紅細(xì)胞中的一種淡蘭色含銅蛋白具有酶活性，能催化超氧陰離子發(fā)生岐化反應(yīng)，由此命名為超氧化物岐化酶。到現(xiàn)在，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)SOD的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年，發(fā)現(xiàn)有四類SOD存在，即Cu.Zn-SOD；Fe-SOD；Mn-SOD；在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外液中發(fā)現(xiàn)的一種具有SOD活性的因子，簡(jiǎn)稱Ec-SOD，即胞外SOD。
超氧化物岐化酶由于其特殊的作用，能夠?qū)Ｒ磺宄蹶庪x子，故凡由于超氧陰離子過多而導(dǎo)致的疾患，都可用SOD防治。超氧陰離子既有對(duì)物體有利的一面，也有不利的一面。它能使病毒失活，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜，殺傷細(xì)胞，以及改變關(guān)節(jié)等處潤(rùn)滑液的粘性。超氧陰離子與某些疾病密切相關(guān)，它能引起組織發(fā)生炎癥、再灌流損傷綜合癥、老年性白內(nèi)障、放射性膀胱炎等放射性疾病以及紅斑狼瘡等免疫性疾病。試驗(yàn)證明，給予外源性SOD可以減輕和延緩這些疾病，也可以治愈一些疾病。當(dāng)機(jī)體衰老時(shí)，超氧陰離子是使細(xì)胞遭受頻繁損傷的原因之一，故SOD可用于抗衰老。脂褐素(即老年色素)是細(xì)胞質(zhì)不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物，SOD可作為化妝品的添加劑，用以防止或減少老年斑在皮膚中的產(chǎn)生，并同時(shí)具有防曬作用和抗炎效果。目前SOD在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。
現(xiàn)在，人們已經(jīng)從不同的來源中提取到了SOD，有動(dòng)物來源的SOD、植物來源的SOD和微生物來源的SOD。從動(dòng)物來源的SOD有各種血液SOD、臟器SOD；從植物來源的SOD有大豆SOD、玉米SOD等；從微生物來源的SOD有酵母SOD等。雖然有如此多種類的SOD出現(xiàn)，但是真正能夠達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)的非常少。
目前，經(jīng)過多年的研究，國(guó)內(nèi)外從動(dòng)物的血液中提取SOD的方法非常多，采用得比較多的方法一般是將新鮮的動(dòng)物血液離心收集血紅細(xì)胞，劇烈攪拌使其溶血，溶血后加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，一般都是收集50％到90％的沉淀，利用高速離心機(jī)離心去除大部分雜蛋白，再用三氯甲烷、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，進(jìn)一步除去雜蛋白，經(jīng)過除鹽、除去殘留的硫酸銨，最后再經(jīng)過柱層析系統(tǒng)(一般部經(jīng)過兩次柱層析)，才能分離得到較高比活的SOD。這種工藝比較復(fù)雜，因?yàn)槭褂昧税嘿F的柱層析系統(tǒng)、柱填料和高速離心機(jī)，而且，經(jīng)過柱層析后，使產(chǎn)品的收率大大降低，這樣就顯著提高了產(chǎn)品的成本，提純工藝的周期也很長(zhǎng)。
本發(fā)明的目的就是提供一種生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低廉的從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的方法。
本方法步驟如下1、將新鮮的動(dòng)物血液(豬、牛、羊、雞等)中加入0.2-0.5％(重量比)的檸檬酸鈉抗凝劑，低溫(4-8℃)放置30-100分鐘，待溶液分層，去掉大部分上清；2、溫度梯度處理對(duì)上清液進(jìn)行3-6級(jí)溫度梯度處理，初級(jí)溫度為40-50℃，終級(jí)溫度為70-80℃，每?jī)杉?jí)間溫度梯度差為5-10℃，上清液每級(jí)溫度梯度處理都是先由室溫迅速升溫至某級(jí)溫度、保持10-30分鐘后再迅速降至室溫，每級(jí)降溫后都低速離心(4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)10-30分鐘，除去沉淀；3、對(duì)上清液進(jìn)行兩級(jí)鹽析首先加入硫酸銨，使鹽析液飽和度為45-70％，充分?jǐn)嚢枞芙?，低?4-8℃)放置12-36小時(shí)后，低速(4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)離心10-30分鐘，去除沉淀；繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨使鹽析液飽和度為85-95％，充分?jǐn)嚢枞芙?，低?4-8℃)放置12-36小時(shí)后，低速(4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)離心10-30分鐘，收集沉淀(記為沉淀1)；上清液再低溫(4-8℃)放置12-36小時(shí)，用G4磨沙漏斗進(jìn)行抽濾，收集沉淀(記為沉淀2)；4、用濃度為0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸鉀緩沖液分別溶解步驟3的兩組沉淀，超濾(10000M)去除硫酸銨即得比活和純度略有不同的兩組SOD酶。
以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的原料是牛血。
經(jīng)試驗(yàn)測(cè)試表明，本發(fā)明制得的高純度SOD酶凍干產(chǎn)品的存放期達(dá)到三年以上。
小白鼠喂養(yǎng)試驗(yàn)20只雌雄各半，體重18-22克，按0.5ml/10克體重，1次灌胃，觀察7天，結(jié)果無一死亡，也未見精神、皮毛等異常，證明SOD無毒性或毒性極低。
SOD的紫外吸收光譜經(jīng)過上海分析儀器廠730型分光光度計(jì)對(duì)SOD的紫外掃描，測(cè)得牛血Cu.Zn-SOD的最大吸收值為261nm，A261/A280＝1.34。
以上數(shù)據(jù)證明用此種方法獲得的SOD酶與有關(guān)文獻(xiàn)(McCord，J.M.&Fridovich，I.Superoside dismutase，J.Biol.Chem，1969，244，6049)報(bào)道的SOD酶相一致。
SOD的電泳測(cè)定一、瓊脂糖平板凝膠電泳結(jié)果氨基黑10B染色出現(xiàn)二個(gè)點(diǎn)，活性染色出現(xiàn)五個(gè)明亮斑域?；钚匀旧娪竞蟮哪z平板，在嚴(yán)格避光的1.225×10-3mol/L四氮唑硝基藍(lán)(NBT)溶液(內(nèi)含核黃素2.8×10-5mol/L)及2.8×10-3mol/L四甲基乙二胺溶液(用PH＝7.8，3.6×10-3mol/L磷酸鉀鹽緩沖液配制)中浸泡15-20分鐘，然后反平板置熒光箱中光照至藍(lán)色背景與無色明亮斑域清晰可辨。
二、丙烯酰胺圓盤電泳結(jié)果氨基黑10B出現(xiàn)兩條帶，活性染色出現(xiàn)明顯斑域。
電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的SOD酶為電泳純，從而達(dá)到了發(fā)明目的。
采用改良的連苯三酚法測(cè)定，具體測(cè)定方法見文獻(xiàn)生物化學(xué)生物物理進(jìn)展，1996，4，71-73。
1、溫度梯度法除血紅蛋白
從以上的表中可以看出，整個(gè)溫度梯度處理過程中，酶的比活提高了近10倍，而酶的收率達(dá)到了96.70％(5650/5843)。
2、兩級(jí)硫酸銨鹽析測(cè)上清液測(cè)試結(jié)果組1一級(jí)鹽析50％飽和度硫酸銨，二級(jí)鹽析90％飽和度硫酸銨
組2一級(jí)鹽析55％飽和度硫酸銨，二級(jí)鹽析90％飽和度硫酸銨
組3一級(jí)鹽析60％飽和度硫酸銨，二級(jí)鹽析95％飽和度硫酸銨
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組4一級(jí)鹽析65％飽和度硫酸銨，二級(jí)鹽析90％飽和度硫酸銨
說明組3的雜蛋白去除得徹底，而且沉淀2的比活明顯高于沉淀1，但是沉淀2的收率有沉淀1高，表面上看來在生產(chǎn)中容易出現(xiàn)矛盾，實(shí)際上，我們可以同時(shí)生產(chǎn)出供兩種用途的SOD產(chǎn)品。SOD在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用需要高純度、高比活，而在化妝品和食品保健品行業(yè)就不需要很高比活的SOD產(chǎn)品，我們現(xiàn)在的工藝技術(shù)正好能夠同時(shí)滿足這兩個(gè)行業(yè)的需要。
整個(gè)加熱過程中酶的比活提高將近10倍，而酶的收率達(dá)到96％以上，說明這個(gè)溫度梯度法除血紅蛋白的效果是比較好的，比單純地在某一溫度下加熱的效果要好得多。整個(gè)過程中，由于采用了溫度梯度處理法及兩級(jí)鹽析，僅使用低速離心機(jī)(4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)即可達(dá)到去除沉淀而酶的收率高等目的。
綜上所述，本發(fā)明所述的從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的制備方法具有工藝簡(jiǎn)便、周期短、成本低、酶的收率及比活高等優(yōu)點(diǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述及的制備方法，實(shí)施例采用四級(jí)溫度梯度進(jìn)行去除沉淀處理；1、將新鮮的牛血10000ml中加入38g檸檬酸抗凝劑，低溫4℃放置50分鐘，待溶液分層，去掉大部分上清，得4500ml沉淀；2、將沉淀由室溫迅速加溫至50℃，保溫15分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4400ml上清液；3、上清液迅速加溫至60℃，保溫10分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4300ml上清液；4、上清液迅速加溫至70℃，保溫10分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4100ml上清液；5、上清液迅速加溫至75℃，保溫5分鐘后迅速降至室溫，4500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后去除沉淀，得4000ml上清液；6、上清液中加入硫酸銨使飽和度達(dá)60％，充分?jǐn)嚢枋沽蛩徜@完全溶解，低溫(4℃)放置24小時(shí)，離心(4500轉(zhuǎn)/分鐘)20分鐘，除去沉淀；7、上清液中再加入硫酸銨使飽和度達(dá)95％，充分?jǐn)嚢枋沽蛩徜@完全溶解，低溫(4℃)放置24小時(shí)，離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)20分鐘，收集沉淀(標(biāo)為沉淀1)；上清液再低溫(4℃)放置24小時(shí)后用G4磨砂漏斗進(jìn)行抽濾，收集沉淀(標(biāo)為沉淀2)；8、用0.05M磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液50ml分別溶解沉淀1和沉淀2，完全溶解后超濾(10000M)去除殘留的硫酸銨，分別得到345.7mg和168mg純度和比活略有不同的兩組高純度的SOD，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同前。實(shí)施例21、新鮮的豬血10000ml中加入32g檸檬酸抗凝劑，低溫6℃放置30分鐘，待溶液分層，去掉大部分上清，得4700ml沉淀；2、將沉淀由室溫迅速加溫至55℃，保溫10分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4500ml上清液；3、上清液迅速加溫至65℃，保溫10分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4350ml上清液；4、上清液迅速加溫至75℃，保溫8分鐘后迅速降至室溫，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后去除沉淀，得4000ml上清液；5、上清液中加入硫酸銨使飽和度達(dá)55％，充分?jǐn)嚢枋沽蛩徜@完全溶解，低溫(6℃)放置18小時(shí)，離心(4500轉(zhuǎn)/分鐘)15分鐘，除去沉淀；6、上清液中再加入硫酸銨使飽和度達(dá)90％，充分?jǐn)嚢枋沽蛩徜@完全溶解，低溫(6℃)放置18小時(shí)，離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)15分鐘，收集沉淀(標(biāo)為沉淀1)；上清液再低溫(6℃)放置18小時(shí)后用G4磨砂漏斗進(jìn)行抽濾，收集沉淀(標(biāo)為沉淀2)；7、用0.1M的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液30ml分別溶解沉淀1和沉淀2，完全溶解后超濾(10000M)去除殘留的硫酸銨，分別得到361.4mg和156.5mg純度和比活略有不同的兩組高純度的SOD。
權(quán)利要求
一、一種從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的方法，步驟如下1.將新鮮的動(dòng)物血液中加入重量比為0.2-0.5％的檸檬酸鈉抗凝劑，低溫4-8℃放置30-100分鐘，待溶液分層，去掉大部分上清；2.溫度梯度處理對(duì)上清液進(jìn)行3-6級(jí)溫度梯度處理，初級(jí)溫度為40-50℃，終級(jí)溫度為70-80℃，每?jī)杉?jí)間溫度梯度差為5-10℃，上清液每級(jí)溫度梯度處理都是先由室溫迅速升溫至某級(jí)溫度、保持10-30分鐘后再迅速降至室溫，每級(jí)降溫后都低速4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-30分鐘，除去沉淀；3.對(duì)上清液進(jìn)行兩級(jí)鹽析首先加入硫酸銨，使鹽析液飽和度為45-70％，充分?jǐn)嚢枞芙?，低?-8℃放置12-36小時(shí)后，低速4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-30分鐘，去除沉淀；繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨使鹽析液飽和度為85-95％，充分?jǐn)嚢枞芙?，低?-8℃放置12-36小時(shí)后，低速4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-30分鐘，收集沉淀，記為沉淀1；上清液再低溫4-8℃放置12-36小時(shí)，用G4磨沙漏斗進(jìn)行抽濾，收集沉淀，記為沉淀2；4.用濃度為0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸鉀緩沖液分別溶解步驟3的兩組沉淀，10000M超濾去除硫酸銨即得比活和純度略有不同的兩組SOD酶。
二、如權(quán)利要求一所述的一種從動(dòng)物血液中提取高純度銅鋅超氧化物岐化酶的方法，其特征在于所述的動(dòng)物血液可以來自豬、牛、羊、雞等家禽及牲畜。
全文摘要
本明涉及一種從動(dòng)物血液中提取高純度超氧化物岐化酶的方法,本方法包括如下步驟:在動(dòng)物血液中加入抗凝劑,去除沉淀,對(duì)上清進(jìn)行3～6級(jí)的溫度梯度處理,再去除沉淀,對(duì)上清液用硫酸銨進(jìn)行兩級(jí)不同飽和度鹽析,并對(duì)最終的沉淀用緩沖液洗脫除去殘留的鹽析液,最后得純度及比活都比較高的SOD酶。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、成本低、酶的收率及比活都比較高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/30GK1274754SQ0011776
公開日2000年11月29日 申請(qǐng)日期2000年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月3日
發(fā)明者趙長(zhǎng)富, 潘智勇, 劉寧, 韓素珍 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)研究所